JPH0576384A - 抗ヒト神経成長因子モノクローナル抗体 - Google Patents
抗ヒト神経成長因子モノクローナル抗体Info
- Publication number
- JPH0576384A JPH0576384A JP3241136A JP24113691A JPH0576384A JP H0576384 A JPH0576384 A JP H0576384A JP 3241136 A JP3241136 A JP 3241136A JP 24113691 A JP24113691 A JP 24113691A JP H0576384 A JPH0576384 A JP H0576384A
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- JP
- Japan
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- growth factor
- nerve growth
- monoclonal antibody
- human nerve
- ngf
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】遺伝子工学的に生産したヒトＮＧＦを認識す
る、抗ヒトＮＧＦモノクロ−ナル抗体を作製することを
目的とする。 【構成】融合型ヒトＮＧＦを抗原としてマウスを免疫
し、免疫された脾臓細胞をミエロ−マと細胞融合するこ
とでハイブリド−マを得る。その中より抗ヒトＮＧＦ抗
体を産生するものをスクリ−ニングし、クロ−ニングを
行なう。クロ−ンの培養上清液あるいは復水より抗ヒト
ＮＧＦモノクロ−ナル抗体を得る。
る、抗ヒトＮＧＦモノクロ−ナル抗体を作製することを
目的とする。 【構成】融合型ヒトＮＧＦを抗原としてマウスを免疫
し、免疫された脾臓細胞をミエロ−マと細胞融合するこ
とでハイブリド−マを得る。その中より抗ヒトＮＧＦ抗
体を産生するものをスクリ−ニングし、クロ−ニングを
行なう。クロ−ンの培養上清液あるいは復水より抗ヒト
ＮＧＦモノクロ−ナル抗体を得る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は遺伝子組換え大腸菌で生
産したヒトの神経成長因子（Nerve GrowthFactor, 以下
ＮＧＦと略す）を特異的に認識するモノクロ−ナル抗体
およびそれを用いたヒトＮＧＦの検出方法に関するもの
である。
産したヒトの神経成長因子（Nerve GrowthFactor, 以下
ＮＧＦと略す）を特異的に認識するモノクロ−ナル抗体
およびそれを用いたヒトＮＧＦの検出方法に関するもの
である。
【０００２】
【従来の技術】ＮＧＦは、交感神経細胞の生存と分化に
関わるタンパク質であり、現在までにマウス、ウシ、ニ
ワトリ等から単離されている。マウスＮＧＦは分子量約
14万で、α、β、γのサブユニットからなるが、βサブ
ユニットのみが神経成長因子としての生物活性を有して
いる。このマウスβＮＧＦの遺伝子と類似した遺伝子が
ヒトの遺伝子ライブラリ−から単離され、これから推定
されたヒトＮＧＦの118個のアミノ酸配列もまたマウス
βＮＧＦと類似していることが示された。しかし、これ
までに人体からのヒトＮＧＦの単離に成功した例がない
ことから、その存在量はごく微量と考えられ、遺伝子工
学による大量生産が検討されている。
関わるタンパク質であり、現在までにマウス、ウシ、ニ
ワトリ等から単離されている。マウスＮＧＦは分子量約
14万で、α、β、γのサブユニットからなるが、βサブ
ユニットのみが神経成長因子としての生物活性を有して
いる。このマウスβＮＧＦの遺伝子と類似した遺伝子が
ヒトの遺伝子ライブラリ−から単離され、これから推定
されたヒトＮＧＦの118個のアミノ酸配列もまたマウス
βＮＧＦと類似していることが示された。しかし、これ
までに人体からのヒトＮＧＦの単離に成功した例がない
ことから、その存在量はごく微量と考えられ、遺伝子工
学による大量生産が検討されている。
【０００３】遺伝子組換え体によって生産されたタンパ
ク質の検出は、抗血清やモノクロ−ナル抗体でなされる
場合が多い。この際、目的のタンパク質の検出には、２
−メルカプトエタノ−ルとＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリ
ウム）により変性処理したタンパク質を検出するウエス
タンブロット法が一般に用いられている。これは、遺伝
子工学的に生産されたヒトＮＧＦについても同様であ
る。
ク質の検出は、抗血清やモノクロ−ナル抗体でなされる
場合が多い。この際、目的のタンパク質の検出には、２
−メルカプトエタノ−ルとＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリ
ウム）により変性処理したタンパク質を検出するウエス
タンブロット法が一般に用いられている。これは、遺伝
子工学的に生産されたヒトＮＧＦについても同様であ
る。
【０００４】現在知られている抗ＮＧＦモノクロ−ナル
抗体としては、市販されているベ−リンガ−・マンハイ
ム山之内社製の抗マウスＮＧＦモノクロ−ナル抗体と、
東ソ−の抗ＮＧＦモノクロ−ナル抗体（特開平２−２１
９５９３）がある。前者は、マウスＮＧＦの他、ウシや
ラットのＮＧＦにも反応し、マウスＮＧＦに対する中和
活性がある。後者は、ヒトとマウスのＮＧＦに反応し、
両ＮＧＦに対して中和活性があると報告されている。両
抗体は、ＮＧＦの検出、定量用試薬や阻害剤として使用
されている。
抗体としては、市販されているベ−リンガ−・マンハイ
ム山之内社製の抗マウスＮＧＦモノクロ−ナル抗体と、
東ソ−の抗ＮＧＦモノクロ−ナル抗体（特開平２−２１
９５９３）がある。前者は、マウスＮＧＦの他、ウシや
ラットのＮＧＦにも反応し、マウスＮＧＦに対する中和
活性がある。後者は、ヒトとマウスのＮＧＦに反応し、
両ＮＧＦに対して中和活性があると報告されている。両
抗体は、ＮＧＦの検出、定量用試薬や阻害剤として使用
されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】我々は、既に遺伝子組
換え大腸菌によるヒトＮＧＦの遺伝子工学的生産方法に
ついて特許を出願（特願平２−３８３５８）している。
従来技術で述べた抗マウスＮＧＦモノクロ−ナル抗体
は、我々の遺伝子組換え大腸菌が生産した融合型ヒトＮ
ＧＦに対し非常に低い親和性しか示さなかった。そこ
で、遺伝子組換え大腸菌ＨＢ１０１［ｐＴＲＬＮＧＦ］
（微工研菌寄第１１２８３号）が生産した融合型ヒトＮ
ＧＦを抗原とし、ヒトＮＧＦを認識する新たなモノクロ
−ナル抗体を作製することにした。
換え大腸菌によるヒトＮＧＦの遺伝子工学的生産方法に
ついて特許を出願（特願平２−３８３５８）している。
従来技術で述べた抗マウスＮＧＦモノクロ−ナル抗体
は、我々の遺伝子組換え大腸菌が生産した融合型ヒトＮ
ＧＦに対し非常に低い親和性しか示さなかった。そこ
で、遺伝子組換え大腸菌ＨＢ１０１［ｐＴＲＬＮＧＦ］
（微工研菌寄第１１２８３号）が生産した融合型ヒトＮ
ＧＦを抗原とし、ヒトＮＧＦを認識する新たなモノクロ
−ナル抗体を作製することにした。
【０００６】本発明は、ヒトＮＧＦの検出に使用可能
な、抗ヒトＮＧＦモノクロ−ナル抗体を提供するもので
ある。
な、抗ヒトＮＧＦモノクロ−ナル抗体を提供するもので
ある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】抗原には、遺伝子組換え
大腸菌ＨＢ１０１［ｐＴＲＬＮＧＦ］が生産した融合型
ヒトＮＧＦを用いた。このプラスミドｐＴＲＬＮＧＦ
は、トリプトファン調節遺伝子につながったトリプトフ
ァンオペロンのtrpLポリペプタイドのＮ末端側の６個の
アミノ酸とグルタミン酸とフェニルアラニンの合計８個
のアミノ酸をコ−ドする遺伝子にヒトＮＧＦをコ−ドす
る遺伝子が連結された遺伝子を、融合型ヒトＮＧＦとし
て大腸菌菌体内で発現させることの可能なものである。
融合型ヒトＮＧＦの調製方法の一例を次に示す。遺伝子
組換え大腸菌ＨＢ１０１［ｐＴＲＬＮＧＦ］を培養して
得られた菌体を、超音波処理等で破砕し、その破砕液を
遠心分離した際の沈殿物を塩酸グアニジンや尿素等で可
溶化し、次に可溶化剤を除去するためにＰＢＳ（リン酸
塩緩衝液）等に透析して、抗原として用いる融合型ヒト
ＮＧＦを調製した。
大腸菌ＨＢ１０１［ｐＴＲＬＮＧＦ］が生産した融合型
ヒトＮＧＦを用いた。このプラスミドｐＴＲＬＮＧＦ
は、トリプトファン調節遺伝子につながったトリプトフ
ァンオペロンのtrpLポリペプタイドのＮ末端側の６個の
アミノ酸とグルタミン酸とフェニルアラニンの合計８個
のアミノ酸をコ−ドする遺伝子にヒトＮＧＦをコ−ドす
る遺伝子が連結された遺伝子を、融合型ヒトＮＧＦとし
て大腸菌菌体内で発現させることの可能なものである。
融合型ヒトＮＧＦの調製方法の一例を次に示す。遺伝子
組換え大腸菌ＨＢ１０１［ｐＴＲＬＮＧＦ］を培養して
得られた菌体を、超音波処理等で破砕し、その破砕液を
遠心分離した際の沈殿物を塩酸グアニジンや尿素等で可
溶化し、次に可溶化剤を除去するためにＰＢＳ（リン酸
塩緩衝液）等に透析して、抗原として用いる融合型ヒト
ＮＧＦを調製した。
【０００８】該抗原による免疫は、該抗原とアジュバン
トの混合物を、マウスの皮下、静脈、または腹腔に１回
あたり40〜100μｇ、10日〜１ヵ月毎に４〜６回注射す
ることで行うことが可能である。
トの混合物を、マウスの皮下、静脈、または腹腔に１回
あたり40〜100μｇ、10日〜１ヵ月毎に４〜６回注射す
ることで行うことが可能である。
【０００９】細胞融合は、ケラ−とミルスタインらの方
法に準じて行なえる。融合パ−トナ−は、マウスバルブ
シ−（BALB/c）由来のエックス６３（X63）細胞、ピ−
スリ−ユ−ワン（P3U1）細胞、エヌエスワン（NS-1）細
胞およびエスピ−ツ−（SP2）細胞などのミエロ−マ細
胞を利用できる。予め培養した該ミエロ−マ細胞に対し
て該抗原で免疫したマウスの脾臓細胞を２〜10倍混合し
て遠心分離した後、上清液を除去してミエロ−マ細胞と
脾臓細胞との混合ペレットを得る。このペレットを良く
ほぐして、予め37℃で加温した30〜50％ＰＥＧ（ポリエ
チレングリコ−ル；分子量1000〜4000）を加え30〜37℃
で反応させる。次いで、血清を含まない培地を滴下混合
して反応を止める。更に血清を含まない培地を多量に添
加混合した後、遠心分離により細胞を回収する。該細胞
をＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン
含有）培地に懸濁し、96ウェルプレ−トに分注して37℃
で培養する。培養３〜４日後より２〜３日毎に培養液の
半量を吸引除去して新鮮なＨＡＴ培地を添加して、ハイ
ブリド−マのみを増殖させる。該ハイブリド−マが充分
に増殖した後に、該抗原を用いた免疫定量（Enzyme Lin
ked ImmunosorbentAssay、以下ＥＬＩＳＡと略す）法に
より、抗ヒトＮＧＦ抗体産生ハイブリド−マをスクリ−
ニングする。そしてスクリ−ニング陽性ハイブリド−マ
を限界希釈法によってクロ−ニングし、出現したクロ−
ンについても上記ＥＬＩＳＡ法によりスクリ−ニングを
行ない、抗ヒトＮＧＦ抗体産生クロ−ンを得る。尚、遺
伝子組換え菌を用いて生産したヒトＮＧＦを検出するた
めには、その抗体が大腸菌由来タンパク質を認識しては
ならない。従ってクロ−ンのスクリ−ニングでは、抗体
がヒトＮＧＦを認識し、大腸菌由来タンパク質と交差反
応を示さないものを選ぶ必要がある。
法に準じて行なえる。融合パ−トナ−は、マウスバルブ
シ−（BALB/c）由来のエックス６３（X63）細胞、ピ−
スリ−ユ−ワン（P3U1）細胞、エヌエスワン（NS-1）細
胞およびエスピ−ツ−（SP2）細胞などのミエロ−マ細
胞を利用できる。予め培養した該ミエロ−マ細胞に対し
て該抗原で免疫したマウスの脾臓細胞を２〜10倍混合し
て遠心分離した後、上清液を除去してミエロ−マ細胞と
脾臓細胞との混合ペレットを得る。このペレットを良く
ほぐして、予め37℃で加温した30〜50％ＰＥＧ（ポリエ
チレングリコ−ル；分子量1000〜4000）を加え30〜37℃
で反応させる。次いで、血清を含まない培地を滴下混合
して反応を止める。更に血清を含まない培地を多量に添
加混合した後、遠心分離により細胞を回収する。該細胞
をＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン
含有）培地に懸濁し、96ウェルプレ−トに分注して37℃
で培養する。培養３〜４日後より２〜３日毎に培養液の
半量を吸引除去して新鮮なＨＡＴ培地を添加して、ハイ
ブリド−マのみを増殖させる。該ハイブリド−マが充分
に増殖した後に、該抗原を用いた免疫定量（Enzyme Lin
ked ImmunosorbentAssay、以下ＥＬＩＳＡと略す）法に
より、抗ヒトＮＧＦ抗体産生ハイブリド−マをスクリ−
ニングする。そしてスクリ−ニング陽性ハイブリド−マ
を限界希釈法によってクロ−ニングし、出現したクロ−
ンについても上記ＥＬＩＳＡ法によりスクリ−ニングを
行ない、抗ヒトＮＧＦ抗体産生クロ−ンを得る。尚、遺
伝子組換え菌を用いて生産したヒトＮＧＦを検出するた
めには、その抗体が大腸菌由来タンパク質を認識しては
ならない。従ってクロ−ンのスクリ−ニングでは、抗体
がヒトＮＧＦを認識し、大腸菌由来タンパク質と交差反
応を示さないものを選ぶ必要がある。
【００１０】得られたクロ−ンからモノクロ−ナル抗体
を得る方法としては次のような方法がある。該クロ−ン
を予めプリスタンを投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔
へ移植し、10〜14日後に復水を採取することで抗体が得
られる。また、該クロ−ンを動物細胞培養装置などで培
養することでも抗体を生産できる。そして抗体は、復水
または細胞培養液から硫安分画、イオン交換クロマトグ
ラフィ−などの工程を経て精製することができる。
を得る方法としては次のような方法がある。該クロ−ン
を予めプリスタンを投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔
へ移植し、10〜14日後に復水を採取することで抗体が得
られる。また、該クロ−ンを動物細胞培養装置などで培
養することでも抗体を生産できる。そして抗体は、復水
または細胞培養液から硫安分画、イオン交換クロマトグ
ラフィ−などの工程を経て精製することができる。
【００１１】
【実施例】以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。
するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。
【００１２】１．モノクロ−ナル抗体の作製 １）抗原の調製 大腸菌ＨＢ１０１［ｐＴＲＬＮＧＦ］（微工研菌寄第１
１２８３号）を40ｍｌのＭ９培地（NH4Cｌ 1 g,Na2HPO4
6 g, KH2PO4 3 g, NaCｌ 0.5 g, CaCｌ2・2H2O0.015 g,
MgSO4・7H2O 0.5 g, カザミノ酸 2.5 g, グルコ-ス 5
g, 酵母エキス1.5 g, トリプトファン0.04 g, プロリン
0.1 g, チアミン 0.1 g, アンピシリン 50 mg, 水 1
ｌ, pH 7.0)に接種し、37℃で一晩培養した。翌日、大
腸菌培養液を、400ｍｌの新鮮なＭ９（−Trp）培地（前
記したＭ９培地より酵母エキス、トリプトファンを除
く）へ移し、37℃で培養した。6.5時間培養後、３−β
−インド−ルアクリル酸（濃度； 15mg／ｌ）およびカ
ザミノ酸（濃度；2.5ｇ／ｌ）を添加し、更に37℃で１
晩培養した。培養後の菌体を遠心分離により回収し、Ｐ
ＢＳで洗浄した後、純水40ｍｌに懸濁し超音波処理によ
り破砕した。その破砕液を遠心分離して沈殿物を回収
し、塩酸グアニジンで可溶化した後、ＰＢＳに透析した
ものを融合型ヒトＮＧＦ抗原として用いた。
１２８３号）を40ｍｌのＭ９培地（NH4Cｌ 1 g,Na2HPO4
6 g, KH2PO4 3 g, NaCｌ 0.5 g, CaCｌ2・2H2O0.015 g,
MgSO4・7H2O 0.5 g, カザミノ酸 2.5 g, グルコ-ス 5
g, 酵母エキス1.5 g, トリプトファン0.04 g, プロリン
0.1 g, チアミン 0.1 g, アンピシリン 50 mg, 水 1
ｌ, pH 7.0)に接種し、37℃で一晩培養した。翌日、大
腸菌培養液を、400ｍｌの新鮮なＭ９（−Trp）培地（前
記したＭ９培地より酵母エキス、トリプトファンを除
く）へ移し、37℃で培養した。6.5時間培養後、３−β
−インド−ルアクリル酸（濃度； 15mg／ｌ）およびカ
ザミノ酸（濃度；2.5ｇ／ｌ）を添加し、更に37℃で１
晩培養した。培養後の菌体を遠心分離により回収し、Ｐ
ＢＳで洗浄した後、純水40ｍｌに懸濁し超音波処理によ
り破砕した。その破砕液を遠心分離して沈殿物を回収
し、塩酸グアニジンで可溶化した後、ＰＢＳに透析した
ものを融合型ヒトＮＧＦ抗原として用いた。
【００１３】２）免疫 ＢＡＬＢ／ｃ、♀、６週令マウスに以下の方法で免疫を
行なった。融合型ヒトＮＧＦ84〜166μｇ／ｍｌ、アジ
ュバントペプチド30μｇ／ｍｌになるように調製した混
合液を、10〜14日間隔で合計５回、マウス１頭あたり0.
5ｍｌずつ腹腔内接種した。５回目の免疫から１ヵ月後
に、上記混合液をマウス１頭あたり0.5ｍｌずつ腹腔内
接種し最終免疫を行なった。
行なった。融合型ヒトＮＧＦ84〜166μｇ／ｍｌ、アジ
ュバントペプチド30μｇ／ｍｌになるように調製した混
合液を、10〜14日間隔で合計５回、マウス１頭あたり0.
5ｍｌずつ腹腔内接種した。５回目の免疫から１ヵ月後
に、上記混合液をマウス１頭あたり0.5ｍｌずつ腹腔内
接種し最終免疫を行なった。
【００１４】３）脾臓細胞の調製 最終免疫から３日後にマウスより無菌的に摘出した脾臓
を、ＥＲＤＦ−ＲＤ１培地（極東製薬工業社製）の入っ
たシャ−レに回収し、シャ−レを２〜３枚換えて脾臓を
培地で洗浄した後、ピンセットの背で脾臓を押し潰し、
脾臓細胞を培地中に浮遊させた。脾臓細胞浮遊液を15ｍ
ｌ遠心管に移し、２〜３分放置し組織片を沈殿させた。
脾臓細胞を含む上清液を別の遠心管に回収して 1600rp
m、５分間遠心し、上清液を除去した。細胞をＥＲＤＦ
−ＲＤ１培地 10ｍｌに懸濁し、細胞濃度を計数後、融
合に供した。
を、ＥＲＤＦ−ＲＤ１培地（極東製薬工業社製）の入っ
たシャ−レに回収し、シャ−レを２〜３枚換えて脾臓を
培地で洗浄した後、ピンセットの背で脾臓を押し潰し、
脾臓細胞を培地中に浮遊させた。脾臓細胞浮遊液を15ｍ
ｌ遠心管に移し、２〜３分放置し組織片を沈殿させた。
脾臓細胞を含む上清液を別の遠心管に回収して 1600rp
m、５分間遠心し、上清液を除去した。細胞をＥＲＤＦ
−ＲＤ１培地 10ｍｌに懸濁し、細胞濃度を計数後、融
合に供した。
【００１５】４）ミエロ−マの調製 融合用のミエロ−マとしてＰ３Ｕ１細胞を使用した。Ｐ
３Ｕ１細胞は、融合の１週間前より10％ＦＢＳ（牛胎児
血清）添加ＥＲＤＦ−ＲＤ１培地を用いて、培養を開始
した。融合当日、培養器より遠心管へＰ３Ｕ１細胞を移
して 1000rpm、５分間遠心し、上清液を除去した。細胞
をＥＲＤＦ−ＲＤ１培地 10ｍｌに懸濁し、細胞濃度を
計数後、融合に供した。
３Ｕ１細胞は、融合の１週間前より10％ＦＢＳ（牛胎児
血清）添加ＥＲＤＦ−ＲＤ１培地を用いて、培養を開始
した。融合当日、培養器より遠心管へＰ３Ｕ１細胞を移
して 1000rpm、５分間遠心し、上清液を除去した。細胞
をＥＲＤＦ−ＲＤ１培地 10ｍｌに懸濁し、細胞濃度を
計数後、融合に供した。
【００１６】５）細胞融合 脾臓細胞とＰ３Ｕ１細胞を５：１の割合で混合して、18
00rpm、５分間遠心し、上清液を除去した。細胞を遠心
管壁面に薄く分散させた後、37℃に加温した50％PEG150
0／75mM HEPES １ｍｌを1分間かけて滴下、混合した。
更にＥＲＤＦ−ＲＤ１培地 １ｍｌを1分間かけて滴下、
混合した。最後にＥＲＤＦ−ＲＤ１培地８ｍｌを３分間
かけて滴下、混合後、1000rpm、５分間遠心し、上清液
を除去した。脾臓細胞濃度が５×106個／ｍｌとなるよ
うにＨＡＴ培地に懸濁し、96ウェルプレ−トの各ウェル
に100μｌずつ分注した。培養４および６日目にＨＡＴ
培地を50μｌずつ添加し、８および10日目に上清液100
μｌを除去し、ＨＡＴ培地100μｌを添加した。以後、
２あるいは３日毎にＨＴ培地（ＨＡＴ培地よりアミノプ
テリンを除いたもの）で培地交換をしながら、ハイブリ
ド−マが増殖するまで培養を続けた。
00rpm、５分間遠心し、上清液を除去した。細胞を遠心
管壁面に薄く分散させた後、37℃に加温した50％PEG150
0／75mM HEPES １ｍｌを1分間かけて滴下、混合した。
更にＥＲＤＦ−ＲＤ１培地 １ｍｌを1分間かけて滴下、
混合した。最後にＥＲＤＦ−ＲＤ１培地８ｍｌを３分間
かけて滴下、混合後、1000rpm、５分間遠心し、上清液
を除去した。脾臓細胞濃度が５×106個／ｍｌとなるよ
うにＨＡＴ培地に懸濁し、96ウェルプレ−トの各ウェル
に100μｌずつ分注した。培養４および６日目にＨＡＴ
培地を50μｌずつ添加し、８および10日目に上清液100
μｌを除去し、ＨＡＴ培地100μｌを添加した。以後、
２あるいは３日毎にＨＴ培地（ＨＡＴ培地よりアミノプ
テリンを除いたもの）で培地交換をしながら、ハイブリ
ド−マが増殖するまで培養を続けた。
【００１７】６）ハイブリド−マのスクリ−ニング 肉眼で観察できる程度にハイブリド−マのコロニ−が大
きくなった段階で、ＥＬＩＳＡ法により、培養上清液中
の抗ヒトＮＧＦ抗体の有無を調べた。
きくなった段階で、ＥＬＩＳＡ法により、培養上清液中
の抗ヒトＮＧＦ抗体の有無を調べた。
【００１８】融合型ヒトＮＧＦ溶液（10〜30μｇ／ｍ
ｌ）をＥＬＩＳＡ用96ウェルプレ−トに50μｌ／ウェル
で添加し、37℃、１時間反応させた。溶液を除去しＰＢ
Ｓでウェル内を３回洗浄した後、４倍希釈したブロック
エ−ス（大日本製薬社製）を200μｌ／ウェルで添加
し、37℃、１時間反応させた。溶液を除去しＰＢＳでウ
ェル内を３回洗浄した後、ハイブリド−マが産生した抗
体を含む培養上清液を50μｌ／ウェルで添加し、37℃、
１〜２時間反応させた。溶液を除去しＰＢＳでウェル内
を３回洗浄した後、ビオチン化２次抗体（フナコシ社
製）を50μｌ／ウェルで添加し、37℃、１時間反応させ
た。溶液を除去しＰＢＳでウェル内を３回洗浄した後、
あらかじめ調製したアビジン−ビオチン化ペルオキシダ
−ゼ複合体（フナコシ社製）の溶液を50μｌ／ウェルで
添加し、37℃、30分間反応させた。溶液を除去しＰＢＳ
でウェル内を３回洗浄した後、ο-フェニレンジアミン
と0.015％過酸化水素を含む0.1Ｍくえん酸緩衝液（pH5.
4）を50μｌ／ウェルで添加し、室温で10〜15分間放置
した後、各ウェルの412nmの吸光度を測定し、陽性ウェ
ル（吸光度の高いウェル）のハイブリド−マを選んだ。
ｌ）をＥＬＩＳＡ用96ウェルプレ−トに50μｌ／ウェル
で添加し、37℃、１時間反応させた。溶液を除去しＰＢ
Ｓでウェル内を３回洗浄した後、４倍希釈したブロック
エ−ス（大日本製薬社製）を200μｌ／ウェルで添加
し、37℃、１時間反応させた。溶液を除去しＰＢＳでウ
ェル内を３回洗浄した後、ハイブリド−マが産生した抗
体を含む培養上清液を50μｌ／ウェルで添加し、37℃、
１〜２時間反応させた。溶液を除去しＰＢＳでウェル内
を３回洗浄した後、ビオチン化２次抗体（フナコシ社
製）を50μｌ／ウェルで添加し、37℃、１時間反応させ
た。溶液を除去しＰＢＳでウェル内を３回洗浄した後、
あらかじめ調製したアビジン−ビオチン化ペルオキシダ
−ゼ複合体（フナコシ社製）の溶液を50μｌ／ウェルで
添加し、37℃、30分間反応させた。溶液を除去しＰＢＳ
でウェル内を３回洗浄した後、ο-フェニレンジアミン
と0.015％過酸化水素を含む0.1Ｍくえん酸緩衝液（pH5.
4）を50μｌ／ウェルで添加し、室温で10〜15分間放置
した後、各ウェルの412nmの吸光度を測定し、陽性ウェ
ル（吸光度の高いウェル）のハイブリド−マを選んだ。
【００１９】７）クロ−ニング 陽性ウェル中のハイブリド−マを限界希釈法によりクロ
−ニングした。
−ニングした。
【００２０】クロ−ニングを行なうハイブリド−マを、
10％ＦＢＳ添加ＥＲＤＦ−ＲＤ１培地に17〜18個／ｍｌ
の濃度で懸濁した。その際、フィ−ダ−細胞として脾臓
細胞を１×106個／ｍｌの濃度で添加した。尚、脾臓細
胞は、ＢＡＬＢ／ｃ、♀、マウスより採取した。10％Ｆ
ＢＳ添加ＥＲＤＦ−ＲＤ１培地を50μｌ／ウェルで添加
しておいた96ウェルプレ−トに、上記のハイブリド−マ
調製液を50μｌ／ウェルで添加し、培養した。コロニ−
が１つだけ出現したウェルの培養上清液をＥＬＩＳＡ法
により調べ、抗ヒトＮＧＦ抗体を産生しているクロ−ン
を選んだ。上記した手順で３個の陽性ハイブリド−マを
クロ−ニングし、ハイブリド−マ１−７−７８（微工研
菌寄第１２５０８号(FERM P-12508)）、ハイブリド−マ
２４−１３（微工研菌寄第１２５０９号(FERM P-1250
9)）、およびハイブリド−マ２５−１１（微工研菌寄第
１２５１０号(FERM P-12510)）の合計３個の抗ヒトＮＧ
Ｆ抗体産生クロ−ンを得た。
10％ＦＢＳ添加ＥＲＤＦ−ＲＤ１培地に17〜18個／ｍｌ
の濃度で懸濁した。その際、フィ−ダ−細胞として脾臓
細胞を１×106個／ｍｌの濃度で添加した。尚、脾臓細
胞は、ＢＡＬＢ／ｃ、♀、マウスより採取した。10％Ｆ
ＢＳ添加ＥＲＤＦ−ＲＤ１培地を50μｌ／ウェルで添加
しておいた96ウェルプレ−トに、上記のハイブリド−マ
調製液を50μｌ／ウェルで添加し、培養した。コロニ−
が１つだけ出現したウェルの培養上清液をＥＬＩＳＡ法
により調べ、抗ヒトＮＧＦ抗体を産生しているクロ−ン
を選んだ。上記した手順で３個の陽性ハイブリド−マを
クロ−ニングし、ハイブリド−マ１−７−７８（微工研
菌寄第１２５０８号(FERM P-12508)）、ハイブリド−マ
２４−１３（微工研菌寄第１２５０９号(FERM P-1250
9)）、およびハイブリド−マ２５−１１（微工研菌寄第
１２５１０号(FERM P-12510)）の合計３個の抗ヒトＮＧ
Ｆ抗体産生クロ−ンを得た。
【００２１】２．抗体の反応性の検討 上記したクロ−ン１−７−７８の産生する抗体の反応性
を検討した。
を検討した。
【００２２】１）クロ−ン１−７−７８の培養および培
養上清液の回収 クロ−ン１−７−７８を１０％ＦＢＳ添加ＥＲＤＦ−Ｒ
Ｄ１培地に懸濁し、Ｔ型フラスコ中で培養した。クロ−
ンが底一面に増殖し、培地が黄変した段階で培養上清液
を回収した。
養上清液の回収 クロ−ン１−７−７８を１０％ＦＢＳ添加ＥＲＤＦ−Ｒ
Ｄ１培地に懸濁し、Ｔ型フラスコ中で培養した。クロ−
ンが底一面に増殖し、培地が黄変した段階で培養上清液
を回収した。
【００２３】２）ウエスタンブロット法による抗体の反
応性の検討 抗体検定用の試料には、マウスＮＧＦ（東洋紡績社
製）、融合型ヒトＮＧＦ、遺伝子組換え菌抽出タンパク
質、および宿主大腸菌抽出タンパク質を用いた。
応性の検討 抗体検定用の試料には、マウスＮＧＦ（東洋紡績社
製）、融合型ヒトＮＧＦ、遺伝子組換え菌抽出タンパク
質、および宿主大腸菌抽出タンパク質を用いた。
【００２４】試料をＳＤＳと２-メルカプトエタノ−ル
存在下で100℃、３分間の加熱処理後、急冷し、15％ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を行った。泳動後、ホラ
イズブロット(アト−社製）を用いて、ゲル中のタンパ
ク質をクリアブロット・Ｐ膜(アト−社製）上に転写し
た。
存在下で100℃、３分間の加熱処理後、急冷し、15％ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を行った。泳動後、ホラ
イズブロット(アト−社製）を用いて、ゲル中のタンパ
ク質をクリアブロット・Ｐ膜(アト−社製）上に転写し
た。
【００２５】転写後の膜をブロックエ−ス原液に浸し、
37℃、１時間反応させた。膜を溶液より取りだし、0.01
％ツィ−ン添加ＰＢＳで３回洗浄した後、上記培養上清
液に浸し37℃、１〜２時間反応させた。膜を溶液より取
りだし、0.01％ツィ−ン添加ＰＢＳで３回洗浄した後、
ビオチン化２次抗体溶液に浸し、37℃、１時間反応させ
た。膜を溶液より取りだし、0.01％ツィ−ン添加ＰＢＳ
で３回洗浄した後、あらかじめ調製したアビジン−ビオ
チン化ペルオキシダ−ゼ複合体溶液に浸し、37℃、30分
間反応させた。膜を溶液より取りだし、0.01％ツィ−ン
を含むＰＢＳで３回洗浄した後、３，３’-ジアミノベ
ンジジン四塩酸塩と0.015％過酸化水素を含むＰＢＳに
浸し、室温で約10分間反応させた。膜を蒸留水で３回洗
浄して酵素反応を止め、発色パタ−ンを検討した。結果
を図１に示す。マウスＮＧＦ、融合型ヒトＮＧＦおよび
遺伝子組換え菌抽出液タンパク質のレ−ン（図１の１
１、１２および１３）では各ＮＧＦの分子量に相当する
位置に発色が認められたが、宿主大腸菌抽出タンパク質
のレ−ン（図１の１４）では発色が認められなかった。
これより抗体は融合型ヒトＮＧＦと反応し、大腸菌抽出
タンパク質とは反応しないことが確認できた。このこと
は、上記抗体を用いたウエスタンブロット法により遺伝
子組換え体から抽出したタンパク質中に存在するヒトＮ
ＧＦを特異的に検出できることを示している。また抗体
はヒトＮＧＦだけでなく、マウスＮＧＦとも反応するこ
とも確認できた。
37℃、１時間反応させた。膜を溶液より取りだし、0.01
％ツィ−ン添加ＰＢＳで３回洗浄した後、上記培養上清
液に浸し37℃、１〜２時間反応させた。膜を溶液より取
りだし、0.01％ツィ−ン添加ＰＢＳで３回洗浄した後、
ビオチン化２次抗体溶液に浸し、37℃、１時間反応させ
た。膜を溶液より取りだし、0.01％ツィ−ン添加ＰＢＳ
で３回洗浄した後、あらかじめ調製したアビジン−ビオ
チン化ペルオキシダ−ゼ複合体溶液に浸し、37℃、30分
間反応させた。膜を溶液より取りだし、0.01％ツィ−ン
を含むＰＢＳで３回洗浄した後、３，３’-ジアミノベ
ンジジン四塩酸塩と0.015％過酸化水素を含むＰＢＳに
浸し、室温で約10分間反応させた。膜を蒸留水で３回洗
浄して酵素反応を止め、発色パタ−ンを検討した。結果
を図１に示す。マウスＮＧＦ、融合型ヒトＮＧＦおよび
遺伝子組換え菌抽出液タンパク質のレ−ン（図１の１
１、１２および１３）では各ＮＧＦの分子量に相当する
位置に発色が認められたが、宿主大腸菌抽出タンパク質
のレ−ン（図１の１４）では発色が認められなかった。
これより抗体は融合型ヒトＮＧＦと反応し、大腸菌抽出
タンパク質とは反応しないことが確認できた。このこと
は、上記抗体を用いたウエスタンブロット法により遺伝
子組換え体から抽出したタンパク質中に存在するヒトＮ
ＧＦを特異的に検出できることを示している。また抗体
はヒトＮＧＦだけでなく、マウスＮＧＦとも反応するこ
とも確認できた。
【００２６】３）ドットブロット法による抗体の反応性
の検討 マウスＮＧＦについて、ＳＤＳと２-メルカプトエタノ
−ル存在下で100℃、３分間の変性処理を行なったもの
と未処理のものを試料として、抗体の反応性を検討し
た。
の検討 マウスＮＧＦについて、ＳＤＳと２-メルカプトエタノ
−ル存在下で100℃、３分間の変性処理を行なったもの
と未処理のものを試料として、抗体の反応性を検討し
た。
【００２７】ニトロセルロ−ス膜に、上記２種のＮＧＦ
溶液（200μｇ／ｍｌ程度）を滴下し、室温に30分間放
置して、風乾させた後、上記したクリアブロット・Ｐ膜
に転写後の膜と同様な処理を行なった。対照として培養
上清液中の抗体の代わりに、抗マウスＮＧＦモノクロ−
ナル抗体（５μｇ／ｍｌ、ベ−リンガ−・マンハイム山
之内社製）を用いた。結果を図２に示す。図２におい
て、Ａは抗ヒトＮＧＦモノクロ−ナル抗体を反応させた
場合、Ｂは抗マウスＮＧＦモノクロ−ナル抗体を反応さ
せた場合である。これより本発明の抗体は変性処理を行
なったマウスＮＧＦには反応し（図２（Ａ）の黒丸２２
で示す発色）、未処理のマウスＮＧＦには反応しない
（図２（Ａ）の点線で示す丸２１）ことが確認できた。
一方、対照の抗マウスＮＧＦモノクロ−ナル抗体は未処
理のマウスＮＧＦには反応し（図２（Ｂ）の黒丸２１で
示す発色）、変性処理を行なったマウスＮＧＦには反応
しなかった（図２（Ｂ）の点線で示す丸２２）。
溶液（200μｇ／ｍｌ程度）を滴下し、室温に30分間放
置して、風乾させた後、上記したクリアブロット・Ｐ膜
に転写後の膜と同様な処理を行なった。対照として培養
上清液中の抗体の代わりに、抗マウスＮＧＦモノクロ−
ナル抗体（５μｇ／ｍｌ、ベ−リンガ−・マンハイム山
之内社製）を用いた。結果を図２に示す。図２におい
て、Ａは抗ヒトＮＧＦモノクロ−ナル抗体を反応させた
場合、Ｂは抗マウスＮＧＦモノクロ−ナル抗体を反応さ
せた場合である。これより本発明の抗体は変性処理を行
なったマウスＮＧＦには反応し（図２（Ａ）の黒丸２２
で示す発色）、未処理のマウスＮＧＦには反応しない
（図２（Ａ）の点線で示す丸２１）ことが確認できた。
一方、対照の抗マウスＮＧＦモノクロ−ナル抗体は未処
理のマウスＮＧＦには反応し（図２（Ｂ）の黒丸２１で
示す発色）、変性処理を行なったマウスＮＧＦには反応
しなかった（図２（Ｂ）の点線で示す丸２２）。
【００２８】以上より、本発明の抗体は公知の抗体と反
応性が異なる新規な抗体であることが明らかになった。
応性が異なる新規な抗体であることが明らかになった。
【００２９】
【発明の効果】本発明により抗ヒトＮＧＦモノクロ−ナ
ル抗体を得ることができ、この抗体を用いれば、従来の
モノクロ−ナル抗体では検出できないヒトＮＧＦを検出
することが可能になる。
ル抗体を得ることができ、この抗体を用いれば、従来の
モノクロ−ナル抗体では検出できないヒトＮＧＦを検出
することが可能になる。
【図１】抗ヒトＮＧＦモノクロ−ナル抗体のウエスタン
ブロット分析結果を示す図。
ブロット分析結果を示す図。
【図２】抗ヒトＮＧＦモノクロ−ナル抗体と抗マウスＮ
ＧＦモノクロ−ナル抗体のドットブロット分析結果を示
す図であり、Ａは抗ヒトＮＧＦモノクロ−ナル抗体を反
応させた場合、Ｂは抗マウスＮＧＦモノクロ−ナル抗体
を反応させた場合である。
ＧＦモノクロ−ナル抗体のドットブロット分析結果を示
す図であり、Ａは抗ヒトＮＧＦモノクロ−ナル抗体を反
応させた場合、Ｂは抗マウスＮＧＦモノクロ−ナル抗体
を反応させた場合である。
１１…マウスＮＧＦ、１２…融合型ヒトＮＧＦ、１３…
遺伝子組換え菌抽出タンパク質、１４…宿主大腸菌抽出
タンパク質、、２１…未処理マウスＮＧＦの反応結果を
示す丸、２２…変性処理マウスＮＧＦの反応結果を示す
丸。
遺伝子組換え菌抽出タンパク質、１４…宿主大腸菌抽出
タンパク質、、２１…未処理マウスＮＧＦの反応結果を
示す丸、２２…変性処理マウスＮＧＦの反応結果を示す
丸。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 5/20 15/06 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 清水 範夫 埼玉県比企郡鳩山町赤沼2520番地 株式会 社日立製作所基礎研究所内
Claims (5)
- 【請求項１】融合型ヒト神経成長因子を抗原として作製
した抗ヒト神経成長因子モノクロ−ナル抗体。 - 【請求項２】請求項１記載の融合型ヒト神経成長因子
が、ヒト神経成長因子のＮ末端上流側に、トリプトファ
ンオペロンのtrpLポリペプタイドのＮ末端側６個のアミ
ノ酸とグルタミン酸とフェニルアラニンの合計８個のア
ミノ酸を付加したものであること。 - 【請求項３】請求項１記載の融合型ヒト神経成長因子
が、遺伝子組換え大腸菌により生産されたものであるこ
と。 - 【請求項４】請求項１記載の抗ヒト神経成長因子モノク
ロ−ナル抗体が、変性処理した神経成長因子を認識する
抗体であること。 - 【請求項５】請求項１記載の抗ヒト神経成長因子モノク
ロ−ナル抗体を用いたウエスタンブロット法によって、
遺伝子組換え体から抽出したタンパク質中に存在するヒ
ト神経成長因子を特異的に検出する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3241136A JPH0576384A (ja) | 1991-09-20 | 1991-09-20 | 抗ヒト神経成長因子モノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3241136A JPH0576384A (ja) | 1991-09-20 | 1991-09-20 | 抗ヒト神経成長因子モノクローナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0576384A true JPH0576384A (ja) | 1993-03-30 |
Family
ID=17069815
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3241136A Pending JPH0576384A (ja) | 1991-09-20 | 1991-09-20 | 抗ヒト神経成長因子モノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0576384A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7601818B2 (en) | 2003-07-15 | 2009-10-13 | Amgen, Inc. | Human anti-NGF neutralizing antibodies as selective NGF pathway inhibitors |
| US9260514B2 (en) | 2003-07-15 | 2016-02-16 | Amgen Inc. | Methods of treating conditions caused by increased expression of nerve growth factor (NGF) or increased sensitivity to NGF using anti-NGF neutralizing antibodies as selective NGF pathway inhibitors |
| US10323086B2 (en) | 2002-12-24 | 2019-06-18 | Rinat Neuroscience Corp. | Methods for treating osteoarthritis pain by administering a nerve growth factor antagonist and compositions containing the same |
| US11008386B2 (en) | 2002-12-24 | 2021-05-18 | Rinat Neuroscience Corp. | Anti-NGF antibodies and methods using same |
-
1991
- 1991-09-20 JP JP3241136A patent/JPH0576384A/ja active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10323086B2 (en) | 2002-12-24 | 2019-06-18 | Rinat Neuroscience Corp. | Methods for treating osteoarthritis pain by administering a nerve growth factor antagonist and compositions containing the same |
| US11008386B2 (en) | 2002-12-24 | 2021-05-18 | Rinat Neuroscience Corp. | Anti-NGF antibodies and methods using same |
| US7601818B2 (en) | 2003-07-15 | 2009-10-13 | Amgen, Inc. | Human anti-NGF neutralizing antibodies as selective NGF pathway inhibitors |
| US7795413B2 (en) | 2003-07-15 | 2010-09-14 | Amgen, Inc. | Nucleic acids encoding human anti-NGF neutralizing antibodies as selective NGF pathway inhibitors |
| US8106167B2 (en) | 2003-07-15 | 2012-01-31 | Amgen Inc. | Human anti-NGF neutralizing antibodies as selective NGF pathway inhibitors |
| US8198410B2 (en) | 2003-07-15 | 2012-06-12 | Amgen Inc. | Human anti-NGF neutralizing antibodies as selective NGF pathway inhibitors |
| US9260514B2 (en) | 2003-07-15 | 2016-02-16 | Amgen Inc. | Methods of treating conditions caused by increased expression of nerve growth factor (NGF) or increased sensitivity to NGF using anti-NGF neutralizing antibodies as selective NGF pathway inhibitors |
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