JP2852672B2 - 抗ヒトジストロフィンモノクローナル抗体及びそれを産生するハイブリドーマ - Google Patents

抗ヒトジストロフィンモノクローナル抗体及びそれを産生するハイブリドーマ

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JP2852672B2 JP1318487A JP31848789A JP2852672B2 JP 2852672 B2 JP2852672 B2 JP 2852672B2 JP 1318487 A JP1318487 A JP 1318487A JP 31848789 A JP31848789 A JP 31848789A JP 2852672 B2 JP2852672 B2 JP 2852672B2
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Description

【発明の詳細な説明】 [産業上の利用分野] 本発明は、正常ヒトは持つが、遺伝病であるデュシャ
ンヌ型筋ジストロフィー(DMD、Duchenne Muscular Dus
trophy)に罹患したヒトにおいては欠損又は欠陥を生じ
ているタンパク質であるジストロフィン(DMDタンパク
質)と特異的に反応するモノクローナル抗体及び外モノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。本
発明のモノクローナル抗体は、デュシャンヌ型筋ジスト
ロフィー症の診断薬としての用途を有する。
[従来の技術] デュシャンヌ型筋ジストロフィー症は、ほぼ男子のみ
に発生する遺伝病であり、この病気に特有の欠損あるい
は欠陥を生じている遺伝子はX染色体上に存在してお
り、その塩基配列は既に明らかにされている(Cell、50
巻、509頁、1987年)。この遺伝子のコードするタンパ
ク質を特異的に認識する抗体を作製すれば、本疾患に特
有であるジストロフィンの欠損あるいは欠陥等を検出す
ることができるため、臨床的に非常に有用となる。
これは既にホフマンらにより試みられている(Cell、
51巻、919頁、1987年;Nature 330巻、754頁、1987年)
が、これらの方法は、ヒトとはアミノ酸配列において1
割異なるマウスのジストロフィン遺伝子をもとにして得
られたフュージョンタンパクを動物に免疫して得られた
ポリクローナル抗体を用いているため、次のような欠点
を有している。すなわち、i)ジストロフィン以外のタ
ンパク質に反応するような抗体を含む、ii)動物に免疫
して得られた免疫血清のため、常に同一の品質の抗体が
得られるとは限らず、用いる抗血清のロットが変わると
実験結果が変動するおそれがある、iii)マウスジスト
ロフィンに対する抗体を含む。このような理由からこれ
らのポリクローナル抗体は、ヒトのジストロフィンを検
出するために用いるのに適当なものであるとは言えな
い。
[発明が解決しようとする課題] 従って、本発明の目的は、ヒトのジストロフィンに高
度な特異性を有し、しかも同一の品質の抗体を恒常的に
供給することができる抗ヒトジストロフィン抗体を提供
することである。
[課題を解決するための手段] 本願発明者らは、ヒトのジストロフィン遺伝子がコー
ドするアミノ酸配列の一部を合成し、それを免疫源とし
て用いて幾多の実験を重ねた結果、ヒトジストロフィン
と特異的に反応するモノクローナル抗体を作製すること
に成功し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、LISLESEERGELERILADLEEENRNLQA
EYDRLKQQHEHKGLSPLPSPPEMで示されるアミノ酸配列を有
するポリペプチドの少なくとも一部分と特異的に反応す
る、ハイブリドーマ4−4C5(FERM P−11106)により産
生されるモノクローナル抗体4−4C5である、抗ヒトジ
ストロフィンモノクローナル抗体を提供する。
さらにまた、本発明は、上記本発明のモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマを提供する。
[発明の効果] 本発明により、ヒトジストロフィンに対して特異性の
高い新規な抗ヒトジストロフィンモノクローナル抗体及
びそれを産生するハイブリドーマが提供された。本発明
のモノクローナル抗体を用いれば、デュシャンヌ型筋ジ
ストロフィー症の臨床診断を極めて明瞭、簡便に行なう
ことが可能となる。また、同一の抗体を恒常的に大量に
提供することが可能であるので、本発明はデュシャンヌ
型筋ジストロフィー症の治療、診断に大いに貢献する。
[発明の具体的説明] 上述のように、本発明の抗体は、ヒトジストロフィン
に対して特異的に反応するモノクローナル抗体である。
本発明の、抗ヒトジストロフィンモノクローナル抗体
は、ヒトジストロフィン遺伝子によりコードされるアミ
ノ酸配列のうちアミノ酸番号3495〜3544から成るポリペ
プチド(以下、DMD4と言うことがある)の少なくとも一
部分と特異的に反応する。この部分は以下のアミノ酸配
列を有する。
LISLESEERGELERILADLEEENRNLQAEYDRLKQQHEHKGLSPLPSPPE
−NH2 式中、アミノ酸残基の略称は、 A アラニン R アルギニン N アスパラギン D アスパラギン酸 Q グルタミン E グルタミン酸 G グリシン H ヒスチジン I イソロイシン L ロイシン K リジン M メチオニン P プロリン S セリン Y チロシン を表す) この部分と特異的に反応するモノクローナル抗体は、ヒ
トジストロフィンに対する特異性が特に高いので好まし
い。
本発明のハイブリドーマ及びその産生するモノクロー
ナル抗体は、基本的に以下の方法により得ることが可能
であり、具体的には下記実施例に詳述する方法により得
られたものである。
すなわち、先ずヒトジストロフィン遺伝子によりコー
ドされるアミノ酸配列を有するポリペプチド又はその一
部分(好ましい例として上記DMD4)を例えばマウスのよ
うな動物に免疫する。免疫は常法に従って行なうことが
でき、ポリペプチドを単独で、若しくはアジュバントと
共に動物に投与することによって、又はポリペプチドの
分子量が小さい場合には適当な担体に結合した後に上記
と同様に投与することによって行なうことができる。
次いで、免疫された動物の抗体産生細胞、例えば脾細
胞と、ミエローマ細胞のような腫瘍細胞株とをポリエチ
レングリコール(PEG)等のような融合剤で融合してハ
イブリドーマを作製する。次いでハイブリドーマをHAT
培地のような選択培地を用いて選択し、限界希釈法等の
適当な方法でモノクローナル化して培養する。その培養
上清を適当な免疫測定法、例えば酵素免疫的な測定法で
分析し、目的とする抗ヒトジストロフィン抗体を産生し
ているか否かを調べ、抗ヒトジストロフィン抗体を産生
しているクローンを選択する。これらの各工程は、公知
の方法、例えば、ケーラーとミルシュタイン、Nature 2
56 495(1975)、シエーラー、Nature 285 446(1980)
に記載された方法により行なうことができる。
本発明のモノクローナル抗体は、その培養上清により
常法に基づき、例えば、塩析、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等の分離、精製手
段により回収することができる。また、大量に取得する
場合には前記ハイブリドーマを、組織適合性動物又は胸
腺欠損ヌードマウス等の腹腔内に移植して増殖させ、産
生された腹水中に含まれる該モノクローナル抗体を分離
精製回収すれば良い。
本発明のモノクローナル抗体は、ヒトジストロフィン
と特異的に反応し、一方、ヒトジストロフィンは健常人
には存在するがデュシャンヌ型筋ジストロフィー患者で
は欠損あるいは欠陥等を生じているので、本発明のモノ
クローナル抗体は健常人の組織又はその由来物とのみ特
異的に反応し、デュシャンヌ型筋ジストロフィー患者の
組織又はその由来物とは特異的に反応しない。従って、
本発明のモノクローナル抗体は、デュシャンヌ型筋ジス
トロフィーの診断薬として用いることができる。
[実施例] 以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明す
る。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるもので
はない。
実施例1 抗ヒトジストロフィンモノクローナル抗体産生ハイブリ
ドーマ4−4C5細胞の作製 ヒトジストロフィン遺伝子によりコードされるアミノ
酸配列より合成されたDMD4(アミノ酸番号3495−3544)
ペプチド100μgをフロイントの完全アジュバントと共
にBALB/cマウスに腹腔内投与した。2週間間隔でこれを
3回繰返した。この3週間後、最終免疫としてDMD4ペプ
チド100μgを静脈内投与し、3日後摘出した脾臓をケ
ーラーとミルシュタインの常法に従って細胞融合に供し
た。他方の親細胞としては、マウス骨髄腫細胞株である
P3−X63−Ag8−UI(P3U1)を用い、融合剤としてポリエ
チレングリコールを用いた。
このようにして融合した細胞はHAT培地に懸濁し96穴
のマイクロカルチャープレートに分注して培養した。約
2週間後、ハイブリドーマが増殖してきたウェルの培養
上清について以下のような方法によってDMD4ペプチドに
特異的なモノクローナル抗体を産生しているハイブリド
ーマを選択した。すなわち、リン酸緩衝液(PBS)にDMD
4ペプチドを2μg/mlの濃度で溶解し、96穴マイクロア
ッセイプレートに分注し、4℃で一晩放置して固定し
た。次に非結合のDMD4ペプチド溶液を除去し、0.05%
Tween 20を含むPBS洗浄した後、0.5%のBSAを含むPBSを
分注し、1時間、37℃に放置してブロッキングした。0.
05% Tween 20を含むPBSで洗浄後、ハイブリドーマ培養
上清を5μl各ウェルに分注し、1時間37℃に放置し
た。続いて同様に洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗マウ
ス免疫グロブリン抗体(DAK0社製)を1000倍に希釈した
ものを50μl分注し、1時間、37℃に放置した。最後に
同様に洗浄した後、ペルオキシダーゼ基質(ABTS−過酸
化水素系)50μlを加え、吸光度を測定した。
以上のようにして選択されたハイブリドーマのうちク
ローン4−4C5細胞がDMD4ペプチドと特異的に反応し
た。なお、このハイブリドーマ4−4C5細胞は微工研に
寄託され、その受託番号は微工研菌寄第11106号であ
る。
実施例2 抗ヒトジストロフィン抗体の調整 実施例1で得られたハイブリドーマ4−4C5細胞1x107
個を、プリスタン0.5ml投与後2週間のBALB/cマウスに
腹腔内投与した。約10日後、マウス腹腔内に腹水が貯留
してくるが、この腹水中に抗ヒトジストロフィン抗体が
高濃度に含まれている。採取した腹水は50%硫酸アンモ
ニウム塩析の後、セファデックスG−200(ファルマシ
ア社製)によるゲルろ過クロマトグラフィーで分離し
た。図に示すクロマトグラムが得られ、その第2ピーク
が求める抗ヒトジストロフィンモノクローナル抗体4−
4C5であった。
抗ヒトジストロフィンモノクローナル抗体4−4C5は
以下の特徴を有していた。
i)免疫グロブリンのアイソタイプ:γ1,κ ii)分子量:約15万ダルトン iii)分子吸光係数:E280nm=14.0 実施例3 抗ヒトジストロフィンモノクローナル抗体を用いたウェ
スタンブロッティング 正常ヒト筋肉組織及びデュシャンヌ型筋ジストロフィ
ー症患者筋肉組織より、10%SDS、5%2−メルカプト
エタノール及び5%グリセリン溶液で抽出した抽出液を
6%ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し、これをさ
らにニトロセルロース膜に転写してヒトジストロフィン
の転写膜を調製した。この転写膜と、実施例2で得られ
た抗ヒトジストロフィンモノクローナル抗体4−4C5抗
体を4時間反応させた。0.05% Tween 20を含むPBSで洗
浄後、ビオチン化抗マウス免疫グロブリン抗体(ベクタ
ステインABCキット、ベクター社製)と30分間反応させ
た。同様に、洗浄後、アビジンDHとビオチン化ペルオキ
シダーゼHの複合物と30分間反応させた。同様に洗浄
後、ペルオキシダーゼ不溶性基質(4−クロロナフトー
ル−過酸化水素系)を加えて発色させた。
その結果、正常ヒト筋肉組織抽出液による転写膜には
約420キロダルトンのバンドが明瞭に得られたが、デュ
シャンヌ型筋ジストロフィー症患者筋肉組織抽出液によ
る転写膜には約420キロダルトンのジストロフィンのバ
ンドは全く得られなかった。
実施例4 抗ジストロフィンモノクローナル抗体による組織免疫化
学染色 正常ヒト筋肉組織及びデュシャンヌ型筋ジストロフィ
ー患者筋肉組織より組織切片を調製し、実施例2で得ら
れた抗ヒトジストロフィンモノクローナル抗体4−4C5
抗体を反応させた。洗浄後、FITC標識抗マウス免疫グロ
ブリン抗体(ダゴ社製)を反応させ、蛍光顕微鏡で観察
した。
その結果、正常ヒト筋肉組織の切片においてはジスト
ロフィンが含まれる筋肉細胞の膜部分が明瞭に染色され
たが、デュシャンヌ型筋ジストロフィー症患者筋肉組織
の切片においては全く染色されなかった。
【図面の簡単な説明】
図は本発明のモノクローナル抗体を精製した際のゲルろ
過クロマトグラムを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 FI C12R 1:91) (72)発明者 江口 新比古 神奈川県川崎市川崎区鈴木町1―1 味 の素株式会社中央研究所内 (56)参考文献 欧州公開331514(EP,A1) Biomedical Resear ch,10[5](1989年10月)p.405 −409 (58)調査した分野(Int.Cl.6,DB名) C12N 15/00 - 15/90 BIOSIS(DIALOG) WPI(DIALOG)

Claims (2)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】LISLESEERGELERILADLEEENRNLQAEYDRLKQQHE
    HKGLSPLPSPPEMで示されるアミノ酸配列を有するポリペ
    プチドの少なくとも一部分と特異的に反応する、ハイブ
    リドーマ4−4C5(FERM P−11106)により産生されるモ
    ノクローナル抗体4−4C5である、抗ヒトジストロフィ
    ンモノクローナル抗体。
  2. 【請求項2】請求項1記載のモノクローナル抗体を産生
    するハイブリドーマ4−4C5(FERM P−11106)。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Biomedical Research,10[5](1989年10月)p.405−409

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