JP2639684B2 - 抗ｃｐｂ▲ｉｉ▼モノクローナル抗体 - Google Patents
抗ｃｐｂ▲ｉｉ▼モノクローナル抗体Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒト胎盤より分離精製した抗血液凝固活性
を有する物質（以下CPB IIと略称する）に対して特異的
なモノクローナル抗体、これを産生するハイブリドーマ
およびその利用に関する。
を有する物質（以下CPB IIと略称する）に対して特異的
なモノクローナル抗体、これを産生するハイブリドーマ
およびその利用に関する。
細胞融合技術は、ケーラーとミルスタインの報告（Na
ture,495〜497頁,1975年）以来急速に発展した。すなわ
ち、哺乳動物の脾細胞とミエローマ（骨髄腫）細胞とを
融合させた雑種細胞（ハイブリドーマ）は、用いた脾細
胞の性質に応じて種々の抗体を産生することが知られて
いる。そしてこのハイブリドーマの性質を利用してクロ
ーニングをすることにより、種々の蛋白質、ホルモン等
の生体物質に対するモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマを作製すること、並びにモノクローナル抗体
を生産する試みがなされている（E.Dale Servier et a
l,Clinical Chemistry,Vol.27,No.11,1797〜1806,198
1）。
ture,495〜497頁,1975年）以来急速に発展した。すなわ
ち、哺乳動物の脾細胞とミエローマ（骨髄腫）細胞とを
融合させた雑種細胞（ハイブリドーマ）は、用いた脾細
胞の性質に応じて種々の抗体を産生することが知られて
いる。そしてこのハイブリドーマの性質を利用してクロ
ーニングをすることにより、種々の蛋白質、ホルモン等
の生体物質に対するモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマを作製すること、並びにモノクローナル抗体
を生産する試みがなされている（E.Dale Servier et a
l,Clinical Chemistry,Vol.27,No.11,1797〜1806,198
1）。
一方、本出願人は先にヒトの胎盤から抗血液凝固活性
を有する物質（CPB II）を分離精製することに成功し、
特許出願した（特開昭61−243778号）。CPB IIは下記の
性質を有する医薬として有用な物質である。
を有する物質（CPB II）を分離精製することに成功し、
特許出願した（特開昭61−243778号）。CPB IIは下記の
性質を有する医薬として有用な物質である。
分子量（SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法，還元状態及び非還元状態） 73,000±2,000 等電点（アンフォライトを用いる等電点カラム電気
泳動法） 6.2〜6.6 安定性 イ 50℃、30分加熱処理で失活 ロ pH5.5〜8.5で安定（37℃） ハ 血漿中37℃、15分で安定 作 用 イ カルシウム再加凝固時間を延長 ロ プロトロンビン時間を延長 ハ 活性化部分トロンボプラスチン時間を延長 アミノ酸分析 アミノ酸分析で、アスパラギン酸、スレオニン、セリ
ン、グルタミン酸、プロリン、グリシン、アラニン、1/
2シスチン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイ
シン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、リジ
ン及びアルギニンの存在が認められる。
法，還元状態及び非還元状態） 73,000±2,000 等電点（アンフォライトを用いる等電点カラム電気
泳動法） 6.2〜6.6 安定性 イ 50℃、30分加熱処理で失活 ロ pH5.5〜8.5で安定（37℃） ハ 血漿中37℃、15分で安定 作 用 イ カルシウム再加凝固時間を延長 ロ プロトロンビン時間を延長 ハ 活性化部分トロンボプラスチン時間を延長 アミノ酸分析 アミノ酸分析で、アスパラギン酸、スレオニン、セリ
ン、グルタミン酸、プロリン、グリシン、アラニン、1/
2シスチン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイ
シン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、リジ
ン及びアルギニンの存在が認められる。
CPB IIの製造法は、その一例を後記実施例１に示した
が、要約すれば以下のとおりである。
が、要約すれば以下のとおりである。
まず、ヒト胎盤から胎盤ホモジネートを調製し、遠心
分離をおこなう。ホモジナイズ操作は、胎盤より羊膜等
を切除した後、生理食塩水にて充分洗浄し、ワーリング
ブレンダー及びポリトロンを用いておこなう。得られた
ホモジネートを遠心分離に付し、上清及び沈渣を得る。
分離をおこなう。ホモジナイズ操作は、胎盤より羊膜等
を切除した後、生理食塩水にて充分洗浄し、ワーリング
ブレンダー及びポリトロンを用いておこなう。得られた
ホモジネートを遠心分離に付し、上清及び沈渣を得る。
こうして得られた胎盤ホモジネート沈渣は、緩衝液で
充分洗浄し、再度遠心分離して、洗浄沈渣を分取し、以
後の抽出操作に付す。即ち、洗浄沈渣は、EDTA、EGTA、
シュウ酸、クエン酸、ニトリロ三酢酸ナトリウム、リン
酸等のキレート剤を含む緩衝液及び／又は、トリトンＸ
−100、ルブロール、SDS、デオキシコール酸等の界面活
性剤を含む緩衝剤に浸し、４℃〜８℃にて一晩放置後、
遠心分離して上清を集め抽出液を得る。この場合、抽出
は、キレート剤及び界面活性剤の両方を用いて行うこと
もできる。
充分洗浄し、再度遠心分離して、洗浄沈渣を分取し、以
後の抽出操作に付す。即ち、洗浄沈渣は、EDTA、EGTA、
シュウ酸、クエン酸、ニトリロ三酢酸ナトリウム、リン
酸等のキレート剤を含む緩衝液及び／又は、トリトンＸ
−100、ルブロール、SDS、デオキシコール酸等の界面活
性剤を含む緩衝剤に浸し、４℃〜８℃にて一晩放置後、
遠心分離して上清を集め抽出液を得る。この場合、抽出
は、キレート剤及び界面活性剤の両方を用いて行うこと
もできる。
一方、胎盤ホモジネート上清は、更に50,000〜100,00
0gの超遠心分離して沈渣部分であるマイクロゾーム分画
を得る。このマイクロゾーム分画を洗浄後、上記と同様
にして、キレート剤及び／又は界面活性剤抽出を行った
後、超遠心分離して上清を集め抽出液を得る。
0gの超遠心分離して沈渣部分であるマイクロゾーム分画
を得る。このマイクロゾーム分画を洗浄後、上記と同様
にして、キレート剤及び／又は界面活性剤抽出を行った
後、超遠心分離して上清を集め抽出液を得る。
このようにして得られた抽出液は、硫安分画に付され
る。硫安分画は、先づ、上記抽出液に35％飽和となるよ
うに固形硫安を加えて遠心分離し上清を分取する。次い
で、上清に対し85％飽和となるように硫安を加えて遠心
分離し、沈渣を分取することによりおこなわれる。
る。硫安分画は、先づ、上記抽出液に35％飽和となるよ
うに固形硫安を加えて遠心分離し上清を分取する。次い
で、上清に対し85％飽和となるように硫安を加えて遠心
分離し、沈渣を分取することによりおこなわれる。
得られた硫安分画は、更に公知の分離・精製手段、例
えば透析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル過、
吸着クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、
等電点カラム電気泳動法、レクチン又は抗体を用いたア
フィニティー・クロマトグラフィー等を単独又は組合せ
用いることにより精製され、CPB IIが得られる。例え
ば、キレート剤又は／及び界面活性剤は抽出液を硫安分
画して得られた画分を充分透析し、この透析液をDEAE−
トヨパールを用いる直線濃度勾配法により溶出させ、活
性画分を透析した後、活性画分を濃縮し、セファデック
スＧ−100を用いるゲル過させることによりCPB IIを
得る。
えば透析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル過、
吸着クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、
等電点カラム電気泳動法、レクチン又は抗体を用いたア
フィニティー・クロマトグラフィー等を単独又は組合せ
用いることにより精製され、CPB IIが得られる。例え
ば、キレート剤又は／及び界面活性剤は抽出液を硫安分
画して得られた画分を充分透析し、この透析液をDEAE−
トヨパールを用いる直線濃度勾配法により溶出させ、活
性画分を透析した後、活性画分を濃縮し、セファデック
スＧ−100を用いるゲル過させることによりCPB IIを
得る。
しかし、胎盤中のCPB IIは微量であり、また通常使用
される各種クロマト法では、CPB IIとの特異的結合が充
分ではなく、高純度のCPB IIを取得することは困難であ
り、加えて工程が長く回収率も満足のいくものではなか
った。
される各種クロマト法では、CPB IIとの特異的結合が充
分ではなく、高純度のCPB IIを取得することは困難であ
り、加えて工程が長く回収率も満足のいくものではなか
った。
従って、高純度のCPB IIを簡便に高回収率で取得する
特異的精製法の開発が望まれていた。また抗血液凝固剤
としての用途において、CPB IIの作用メカニズムの解
明、血中濃度の測定等の手段として、CPB IIの高感度検
出法の開発も望まれていた。
特異的精製法の開発が望まれていた。また抗血液凝固剤
としての用途において、CPB IIの作用メカニズムの解
明、血中濃度の測定等の手段として、CPB IIの高感度検
出法の開発も望まれていた。
本発明者らは、これらの問題点を解決すべく鋭意研究
を重ねた結果、細胞融合によりCPB IIに対して特異的な
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得、こ
のハイブリドーマを利用してCPB IIに特異的なモノクロ
ーナル抗体を取得できること、さらに該モノクローナル
抗体を利用すればCPB IIの高純度精製、免疫学的定量が
できることを見い出し本発明を完成した。
を重ねた結果、細胞融合によりCPB IIに対して特異的な
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得、こ
のハイブリドーマを利用してCPB IIに特異的なモノクロ
ーナル抗体を取得できること、さらに該モノクローナル
抗体を利用すればCPB IIの高純度精製、免疫学的定量が
できることを見い出し本発明を完成した。
すなわち本発明は、CPB IIに対して特異的なモノクロ
ーナル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマ、該モノクローナル抗体を免疫吸着剤として使用
することを特徴とするCPB IIの精製法、並びに該モノク
ローナル抗体の標識体を使用することを特徴とするCPB
IIの免疫学的測定法を提供するものである。
ーナル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマ、該モノクローナル抗体を免疫吸着剤として使用
することを特徴とするCPB IIの精製法、並びに該モノク
ローナル抗体の標識体を使用することを特徴とするCPB
IIの免疫学的測定法を提供するものである。
CPB IIに対して特異的なモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマは、例えば次の如くして製造される。
すなわち、（１）抗原としてCPB IIを用いて免疫した動
物から抗体産生細胞を調製し、（２）別に骨髄腫細胞を
調製し、（３）これらの細胞を融合させ、（４）得られ
たハイブリドーマを選択的に増殖させ、（５）該ハイブ
リドーマから抗体産生ハイブリドーマを検索し、（６）
クローニングにより目的とするモノクローナル抗体産生
ハイブリドーマを得る。次に各工程について説明する。
るハイブリドーマは、例えば次の如くして製造される。
すなわち、（１）抗原としてCPB IIを用いて免疫した動
物から抗体産生細胞を調製し、（２）別に骨髄腫細胞を
調製し、（３）これらの細胞を融合させ、（４）得られ
たハイブリドーマを選択的に増殖させ、（５）該ハイブ
リドーマから抗体産生ハイブリドーマを検索し、（６）
クローニングにより目的とするモノクローナル抗体産生
ハイブリドーマを得る。次に各工程について説明する。
（１） 抗体産生細胞の調製 抗体産生細胞の調製は、常法に準じて行えばよく、抗
原であるCPB IIで動物を免疫し、その動物の抗体産生細
胞を取得する方法によればよい。動物としては、マウ
ス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジなどが例示さ
れ、抗体産生細胞としては脾臓、リンパ節、末梢血液等
から分離した細胞などが使用される。免疫方法として
は、フロイントのコンプリートアジュバントを併用する
方法が使用される。
原であるCPB IIで動物を免疫し、その動物の抗体産生細
胞を取得する方法によればよい。動物としては、マウ
ス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジなどが例示さ
れ、抗体産生細胞としては脾臓、リンパ節、末梢血液等
から分離した細胞などが使用される。免疫方法として
は、フロイントのコンプリートアジュバントを併用する
方法が使用される。
（２） 骨髄腫細胞の調製 細胞融合に使用する骨髄腫細胞は、特に限定されず、
多くの哺乳動物の細胞株が利用できるが、抗体産生細胞
の調製に用いた動物と同種の動物の細胞株を使用するの
が好ましい。用いる細胞株は、細胞融合の後に、未融合
の骨髄腫細胞が選択培地で生存できず、ハイブリドーマ
だけが増殖できるようにすることによって、未融合細胞
と融合細胞とを分けることを考慮して、特定の薬剤抵抗
性を有するものが好ましい。例えば８−アザグアニン抵
抗性の細胞は、HAT培地中で生育できない性質を有する
ため好んで用いられる。具体的には、マウス骨髄腫細胞
株PAI、P3−X63−Ag8,P3−X63−Ag8−U1,P3−NSI/1−Ag
4−1,X63−Ag8−6.5.3.,SP2/0−Ag14,F0,S194/5XX0.BU.
1,MPC11−45.6.TG.1.7等が用いられる。
多くの哺乳動物の細胞株が利用できるが、抗体産生細胞
の調製に用いた動物と同種の動物の細胞株を使用するの
が好ましい。用いる細胞株は、細胞融合の後に、未融合
の骨髄腫細胞が選択培地で生存できず、ハイブリドーマ
だけが増殖できるようにすることによって、未融合細胞
と融合細胞とを分けることを考慮して、特定の薬剤抵抗
性を有するものが好ましい。例えば８−アザグアニン抵
抗性の細胞は、HAT培地中で生育できない性質を有する
ため好んで用いられる。具体的には、マウス骨髄腫細胞
株PAI、P3−X63−Ag8,P3−X63−Ag8−U1,P3−NSI/1−Ag
4−1,X63−Ag8−6.5.3.,SP2/0−Ag14,F0,S194/5XX0.BU.
1,MPC11−45.6.TG.1.7等が用いられる。
（３） 細胞融合 細胞融合は、通常MEM培地、RPMI1640培地、IMDM培地
などの培地中で、骨髄腫細胞と抗体産生細胞を混合（混
合比は通常1:4〜1:10）することにより行われる。融合
促進剤としては、平均分子量1,000〜6,000のポリエチレ
ングリコール（PEG）が使用できる。PEGの使用濃度は通
常30〜50％である。更に近年開発された高電圧パルスに
よる電気融合装置を用いる細胞融合法がある。細胞の種
類により融合条件を若干変えるとPEGを用いた融合より
優れた融合効率が得られる。
などの培地中で、骨髄腫細胞と抗体産生細胞を混合（混
合比は通常1:4〜1:10）することにより行われる。融合
促進剤としては、平均分子量1,000〜6,000のポリエチレ
ングリコール（PEG）が使用できる。PEGの使用濃度は通
常30〜50％である。更に近年開発された高電圧パルスに
よる電気融合装置を用いる細胞融合法がある。細胞の種
類により融合条件を若干変えるとPEGを用いた融合より
優れた融合効率が得られる。
（４） ハイブリドーマの選択的増殖 細胞融合を終えた細胞は、10％FCS含有IMDM培地など
で適当に希釈し、遠心分離する。沈渣を選択培地（たと
えば、HAT培地）で浮遊し、96ウェルマイクロプレート
に接種した後、５％炭酸ガス培養装置で培養する。選択
培地で生育してくる細胞はハイブリドーマである。
で適当に希釈し、遠心分離する。沈渣を選択培地（たと
えば、HAT培地）で浮遊し、96ウェルマイクロプレート
に接種した後、５％炭酸ガス培養装置で培養する。選択
培地で生育してくる細胞はハイブリドーマである。
（５） 抗体産生ハイブリドーマの検索 抗体産生ハイブリドーマの検索は、常法に従えばよ
く、特に限定されない。たとえば、ハイブリドーマの増
殖した培養液を採取し、CPB IIと反応させたのち、酵
素、ケイ光物質、発光物質などでラベルした第２抗体と
の反応により検索できる。
く、特に限定されない。たとえば、ハイブリドーマの増
殖した培養液を採取し、CPB IIと反応させたのち、酵
素、ケイ光物質、発光物質などでラベルした第２抗体と
の反応により検索できる。
（６） クローニング 抗体産生ハイブリドーマを含むことを確認した培養ウ
ェル中の細胞の限界希釈法などによりクローニングを行
い、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得る。
ェル中の細胞の限界希釈法などによりクローニングを行
い、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得る。
以上の操作によってCPB IIに特異的なモノクローナル
抗体産生ハイブリドーマCPB II−H29、CPB II−H76、CP
B II−H311、CPB II−H511を得た。これらのハイブリド
ーマはそれぞれCPB IIに特異的なモノクローナル抗体を
産生する新規な細胞である。そこでこれらの細胞は工業
技術院微生物工業技術研究所にBP−1753（CPB−II H2
9）,BP−1754（CPB−II H76）,BP−1755（CPB−II H31
1）及びBP−1756（CPB−II H511）として寄託した。
抗体産生ハイブリドーマCPB II−H29、CPB II−H76、CP
B II−H311、CPB II−H511を得た。これらのハイブリド
ーマはそれぞれCPB IIに特異的なモノクローナル抗体を
産生する新規な細胞である。そこでこれらの細胞は工業
技術院微生物工業技術研究所にBP−1753（CPB−II H2
9）,BP−1754（CPB−II H76）,BP−1755（CPB−II H31
1）及びBP−1756（CPB−II H511）として寄託した。
CPB IIに特異的なモノクローナル抗体は、上記で得ら
れた抗体産生ハイブリドーマを利用することにより調製
される。すなわち、抗体産生ハイブリドーマを適当な培
地中で培養することにより、その培養上清から本発明モ
ノクローナル抗体が得られる。また、モノクローナル抗
体を大量に製造するには、骨髄腫細胞の由来動物と同種
の動物にプリスタン（2,6,10,14−テトラメチルペンタ
デカン）などの鉱物油を腹腔内投与した後、抗体産生ハ
イブリドーマを接種することにより、インビボで抗体産
生ハイブリドーマを大量に増殖させる方法が用いられ
る。この方法によれば、接種した動物の血清および腹水
中に高濃度のモノクローナル抗体が生ずる。モノクロー
ナル抗体の分離精製は、通常の血清からの抗体の精製に
使用されている方法に従って実施できる。
れた抗体産生ハイブリドーマを利用することにより調製
される。すなわち、抗体産生ハイブリドーマを適当な培
地中で培養することにより、その培養上清から本発明モ
ノクローナル抗体が得られる。また、モノクローナル抗
体を大量に製造するには、骨髄腫細胞の由来動物と同種
の動物にプリスタン（2,6,10,14−テトラメチルペンタ
デカン）などの鉱物油を腹腔内投与した後、抗体産生ハ
イブリドーマを接種することにより、インビボで抗体産
生ハイブリドーマを大量に増殖させる方法が用いられ
る。この方法によれば、接種した動物の血清および腹水
中に高濃度のモノクローナル抗体が生ずる。モノクロー
ナル抗体の分離精製は、通常の血清からの抗体の精製に
使用されている方法に従って実施できる。
斯くして得られた本発明モノクローナル抗体は、使用
する抗体産生ハイブリドーマの種類によりCPB II−A29,
CPB II−A76,CPB II−A311,CPB II−A511の４種類存在
する。これらのモノクローナル抗体は、表１に示す性質
を有する。なお表１中、分子量はSDS−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法により、等電点は等電点電気泳動法
（LKB−カラム等電点泳動装置）により、免疫グロブリ
ンサブクラスはオクタローニーの二重免疫拡散法〔ウサ
ギポリクローナル抗体（マイルズ社製）使用〕により測
定した。
する抗体産生ハイブリドーマの種類によりCPB II−A29,
CPB II−A76,CPB II−A311,CPB II−A511の４種類存在
する。これらのモノクローナル抗体は、表１に示す性質
を有する。なお表１中、分子量はSDS−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法により、等電点は等電点電気泳動法
（LKB−カラム等電点泳動装置）により、免疫グロブリ
ンサブクラスはオクタローニーの二重免疫拡散法〔ウサ
ギポリクローナル抗体（マイルズ社製）使用〕により測
定した。
本発明モノクローナル抗体を免疫吸着剤として利用す
ることによって、CPB IIを精製する方法は、例えば本発
明モノクローナル抗体をデキストランゲル、アガロース
ゲル、ポリビニルゲル等の不溶性担体に結合させ、該モ
ノクローナル抗体結合担体を免疫吸着剤として用い、カ
ラムクロマトグラフィーに付すことにより実施される。
不溶性担体とモノクローナル抗体との結合は、ブロムシ
アン法やエポキシ、アミノ、カルボキシル、もしくはホ
ルミル基等を介して結合させることができる。
ることによって、CPB IIを精製する方法は、例えば本発
明モノクローナル抗体をデキストランゲル、アガロース
ゲル、ポリビニルゲル等の不溶性担体に結合させ、該モ
ノクローナル抗体結合担体を免疫吸着剤として用い、カ
ラムクロマトグラフィーに付すことにより実施される。
不溶性担体とモノクローナル抗体との結合は、ブロムシ
アン法やエポキシ、アミノ、カルボキシル、もしくはホ
ルミル基等を介して結合させることができる。
このモノクローナル抗体結合不溶性担体からなるカラ
ムに粗CPB IIを添加し、カラムに吸着したCPB IIを溶出
させることにより高純度のCPB IIが得られる。
ムに粗CPB IIを添加し、カラムに吸着したCPB IIを溶出
させることにより高純度のCPB IIが得られる。
本発明モノクローナル抗体の標識体を利用するCPB II
の免疫測定法は、例えば本発明モノクローナル抗体を酵
素、各種のアイソトープ、蛍光物質等の標識剤で標識
し、これにCPB IIを含む試料を加え、CPB IIと標識体と
の免疫反応生成物の標識量を測定することによって実施
される。また一般的な方法としてELISA法を用いること
もできる。
の免疫測定法は、例えば本発明モノクローナル抗体を酵
素、各種のアイソトープ、蛍光物質等の標識剤で標識
し、これにCPB IIを含む試料を加え、CPB IIと標識体と
の免疫反応生成物の標識量を測定することによって実施
される。また一般的な方法としてELISA法を用いること
もできる。
本発明のハイブリドーマはCPB IIに対して特異的なモ
ノクローナル抗体を産生する。そしてこのモノクローナ
ル抗体を用いれば、CPB IIの分離精製工程を短縮でき、
極めて高純度のCPB IIを高回収率で得ることができる。
さらに、モノクローナル抗体と結合させた不溶性担体
は、洗浄すれば再使用可能であり、精製工程の短縮だけ
でなく、経済的であることから工業的に極めて有用であ
る。
ノクローナル抗体を産生する。そしてこのモノクローナ
ル抗体を用いれば、CPB IIの分離精製工程を短縮でき、
極めて高純度のCPB IIを高回収率で得ることができる。
さらに、モノクローナル抗体と結合させた不溶性担体
は、洗浄すれば再使用可能であり、精製工程の短縮だけ
でなく、経済的であることから工業的に極めて有用であ
る。
また、本発明の抗CPB IIモノクローナル抗体は、血液
の凝固線溶系の異常疾患の治療におけるCPB IIの免疫定
量に使用できる。
の凝固線溶系の異常疾患の治療におけるCPB IIの免疫定
量に使用できる。
次に実施例を挙げて本発明を説明する。
実施例１ 抗CPB IIモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの製
造： （１） 抗原（CPB II）の精製 （ｉ） ヒト胎盤５個（約2,500g）より、膜等を除去
し、生理食塩水で充分洗浄後ミンチする。これに50mMト
リス−塩酸緩衝液（pH7.4）２を加え、ワーリングブ
レンダーを用いて破砕し、次いで更に、ポリトロン（Po
lytron）で磨砕する。得られたホモジネートを7,000rpm
15分間遠心分離し、沈渣を分取した。得られた沈渣に再
度50mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.4）２を加え、ポリ
トロンでホモジナイズし、7,000rpm15分間遠心分離して
洗浄沈渣を得た。この操作を数回繰り返し、血液成分を
除去して、洗浄沈渣約900gを得た。
造： （１） 抗原（CPB II）の精製 （ｉ） ヒト胎盤５個（約2,500g）より、膜等を除去
し、生理食塩水で充分洗浄後ミンチする。これに50mMト
リス−塩酸緩衝液（pH7.4）２を加え、ワーリングブ
レンダーを用いて破砕し、次いで更に、ポリトロン（Po
lytron）で磨砕する。得られたホモジネートを7,000rpm
15分間遠心分離し、沈渣を分取した。得られた沈渣に再
度50mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.4）２を加え、ポリ
トロンでホモジナイズし、7,000rpm15分間遠心分離して
洗浄沈渣を得た。この操作を数回繰り返し、血液成分を
除去して、洗浄沈渣約900gを得た。
（ii） （ｉ）で得た沈渣900gに、50mM EDTAを含む50m
Mトリス−塩酸緩衝液（pH7.4）を約２加え、ワーリン
グブレンダーでホモジナイズする。このホモジネートを
４℃にて、一夜撹拌後7,000rpm15分間遠心分離して、抽
出液２を得た。
Mトリス−塩酸緩衝液（pH7.4）を約２加え、ワーリン
グブレンダーでホモジナイズする。このホモジネートを
４℃にて、一夜撹拌後7,000rpm15分間遠心分離して、抽
出液２を得た。
（iii） （ii）で得た抽出液に固形硫安を加え、35％
飽和とし、４℃で30分〜数時間放置後、7,000rpm15分間
遠心分離し上清を分取した。この上清に更に硫安を加
え、85％飽和とし、４℃で２時間放置した後7,000rpm15
分間遠心分離し、沈渣を分取した。得られた沈渣を20mM
トリス−塩酸緩衝液の少量に溶かし、同緩衝液に対し、
４℃で一夜、充分に透析した。透析中に生じた沈澱は、
7,000rpm15分間遠心分離して除き、透析液390mlを得
た。
飽和とし、４℃で30分〜数時間放置後、7,000rpm15分間
遠心分離し上清を分取した。この上清に更に硫安を加
え、85％飽和とし、４℃で２時間放置した後7,000rpm15
分間遠心分離し、沈渣を分取した。得られた沈渣を20mM
トリス−塩酸緩衝液の少量に溶かし、同緩衝液に対し、
４℃で一夜、充分に透析した。透析中に生じた沈澱は、
7,000rpm15分間遠心分離して除き、透析液390mlを得
た。
（iV） 得られた透析液を、29mMトリス−塩酸緩衝液
（pH7.4）で平衡化したDEAE−トヨパール（φ5.5×19c
m）に吸着させ、同緩衝液にて充分洗浄した後、０〜0.3
M塩化ナトリウムを含む同緩衝液４を用い、直線濃度
勾配により１分画20mlとなる様に溶出させた。活性画分
は、ほぼ0.2M塩化ナトリウム濃度付近にて溶出され、20
0mlの活性画分を得た。
（pH7.4）で平衡化したDEAE−トヨパール（φ5.5×19c
m）に吸着させ、同緩衝液にて充分洗浄した後、０〜0.3
M塩化ナトリウムを含む同緩衝液４を用い、直線濃度
勾配により１分画20mlとなる様に溶出させた。活性画分
は、ほぼ0.2M塩化ナトリウム濃度付近にて溶出され、20
0mlの活性画分を得た。
（Ｖ） 得られた活性画分をダイアフローメンブランフ
ィルタ−YM−10を用いて濃縮した。
ィルタ−YM−10を用いて濃縮した。
濃縮液をセファデックスＧ−100を用いるゲル過
（φ4.5×75cm）に付し、生理食塩水で１分画8mlになる
ように溶出させ、活性画分70〜82を集め、これを限外
過により濃縮して、CPB II 14mlに（蛋白重量59.3mg、L
owry法）を得た。
（φ4.5×75cm）に付し、生理食塩水で１分画8mlになる
ように溶出させ、活性画分70〜82を集め、これを限外
過により濃縮して、CPB II 14mlに（蛋白重量59.3mg、L
owry法）を得た。
（２） 免疫脾細胞の調製 上述の如く精製したCPB II 100μｇをフロイント・コ
ンプリート・アジュバントに乳濁化させ、BALB/c系マウ
スの腹腔内に投与した。
ンプリート・アジュバントに乳濁化させ、BALB/c系マウ
スの腹腔内に投与した。
以後、２週間の間隔で50μｇのCPB IIとアジュバント
乳濁液を２回投与し、最後にCPB II 50μｇのみを投与
した免疫を完了した。
乳濁液を２回投与し、最後にCPB II 50μｇのみを投与
した免疫を完了した。
３日後にマウスを殺し、脾臓を検出、細断した後100
メッシュのナイロン網で過し、脾臓の単離細胞を得
た。
メッシュのナイロン網で過し、脾臓の単離細胞を得
た。
（３） ハイブリドーマの調製 得られた免疫脾細胞に低張液（155mM塩化アンモニウ
ム）を加え赤血球を溶血した後Iscove's Modified Dulb
ecco's Medium（IMDM）で細胞を洗った。マウス骨髄腫
細胞PAIはIMDMで２回洗った。両細胞数を計測し、脾細
胞とPAI細胞の割合を５対１にして遠心した。上清を捨
て、細胞沈渣に融合用緩衝液（マンニトール0.25M,CaCl
2 0.1mM,MgCl2 0.1mM,トリス−塩酸0.2mM,pH7.2）を加
えよく撹拌した後遠心する。この操作を２回繰返した。
細胞沈渣に融合用緩衝液を加え細胞密度を４×107/mlに
調製した。細胞融合装置（島津製作所SSH−１型）の電
極間に100〜200μ滴下し1MHz,40Vで10秒間電圧をかけ
た後300V,1/60秒で数回電気パルスをかけた。５分間静
置した後IMDMで電極間の細胞を洗い出し遠心管に移した
後1,000rpm8分間遠心した。
ム）を加え赤血球を溶血した後Iscove's Modified Dulb
ecco's Medium（IMDM）で細胞を洗った。マウス骨髄腫
細胞PAIはIMDMで２回洗った。両細胞数を計測し、脾細
胞とPAI細胞の割合を５対１にして遠心した。上清を捨
て、細胞沈渣に融合用緩衝液（マンニトール0.25M,CaCl
2 0.1mM,MgCl2 0.1mM,トリス−塩酸0.2mM,pH7.2）を加
えよく撹拌した後遠心する。この操作を２回繰返した。
細胞沈渣に融合用緩衝液を加え細胞密度を４×107/mlに
調製した。細胞融合装置（島津製作所SSH−１型）の電
極間に100〜200μ滴下し1MHz,40Vで10秒間電圧をかけ
た後300V,1/60秒で数回電気パルスをかけた。５分間静
置した後IMDMで電極間の細胞を洗い出し遠心管に移した
後1,000rpm8分間遠心した。
沈渣を10％FCS添加IMDMで浮遊し再度遠心して上清を
捨てた。
捨てた。
ヒボキサンチン10-4M、アミノプテリン４×10-7M及び
チミジン1.6×10-5Mを加えた（HAT−）10％FCS添加IMDM
を用い沈渣を細胞密度４×10-6/mlになるように再浮遊
し、96ウェルマイクロプレートに100μずつ分注し
た。３〜４日ごとに培地50μ追加し、細胞の増殖を見
た。
チミジン1.6×10-5Mを加えた（HAT−）10％FCS添加IMDM
を用い沈渣を細胞密度４×10-6/mlになるように再浮遊
し、96ウェルマイクロプレートに100μずつ分注し
た。３〜４日ごとに培地50μ追加し、細胞の増殖を見
た。
HAT選択により、ハイブリドーマのみ増殖することを
確認した。
確認した。
（４） 抗体産生ハイブリドーマの検索 ハイブリドーマが増殖したウェルの培養液を採取し酵
素免疫法により、CPB IIに対する抗体産生ハイブリドー
マを調べた。まず、96ウェルマイクロプレート（イムノ
プレートＩ、ヌンク社製）にCPB IIを0.1μg/100μ／
ウェル分注し、25℃で18時間静置し吸着させる。次いで
検体である培養液を100μ／ウェル注入し、25℃で２
時間反応させる。0.05％Tween20を含むリン酸緩衝食塩
水（PBS−Tween）で３回洗浄後、ワサビパーオキシダー
ゼ標識ヤギ抗マウスIgG（カペル社製）を100μ／ウェ
ル加え、２時間後PBS−Tweenで３回洗浄する。これに、
0.001％過酸化水素、0.4mg/mlオルトフェニルレンジア
ミン（シグマ社製）の0.1Mクエン酸−水酸化ナトリウム
緩衝液（pH4.0）を加え、波長492nmの吸光度を測定し
た。
素免疫法により、CPB IIに対する抗体産生ハイブリドー
マを調べた。まず、96ウェルマイクロプレート（イムノ
プレートＩ、ヌンク社製）にCPB IIを0.1μg/100μ／
ウェル分注し、25℃で18時間静置し吸着させる。次いで
検体である培養液を100μ／ウェル注入し、25℃で２
時間反応させる。0.05％Tween20を含むリン酸緩衝食塩
水（PBS−Tween）で３回洗浄後、ワサビパーオキシダー
ゼ標識ヤギ抗マウスIgG（カペル社製）を100μ／ウェ
ル加え、２時間後PBS−Tweenで３回洗浄する。これに、
0.001％過酸化水素、0.4mg/mlオルトフェニルレンジア
ミン（シグマ社製）の0.1Mクエン酸−水酸化ナトリウム
緩衝液（pH4.0）を加え、波長492nmの吸光度を測定し
た。
検体中、CPB IIに対する抗体が存在したウェルにのみ
発色が観察されるので、発色したウェルの細胞を採取し
た。
発色が観察されるので、発色したウェルの細胞を採取し
た。
（５） CPB IIに対するうモノクローナル抗体産生細胞
のクローニング マウスの腹腔にIMDMを注射して採取した腹腔細胞をフ
ィーダー細胞として使用した。
のクローニング マウスの腹腔にIMDMを注射して採取した腹腔細胞をフ
ィーダー細胞として使用した。
10％FCS添加IMDMに浮遊した腹腔細胞（１×105個/m
l）を96ウェルマイクロプレートに100μずつ分注し
た。翌日、抗体産生ハイブリドーマを５個/mlに調製
し、各ウェルに100μずつ分注した。３日ごとに培地
を交換し適当な量まで細胞が増殖したウェルから順に培
養上清を採取し、上記と同一の方法により、抗体産生を
確認した。陽性のウェルは再度クローニングし、抗CPB
IIモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得た。これ
らのハイブリドーマは、４種類得られ、前記表１の如く
それぞれ産生する抗CPB IIモノクローナル抗体の種類に
より、CPB II−H29,CPB II−H76,CPB II−H311,CPB II
−H511と命名した。
l）を96ウェルマイクロプレートに100μずつ分注し
た。翌日、抗体産生ハイブリドーマを５個/mlに調製
し、各ウェルに100μずつ分注した。３日ごとに培地
を交換し適当な量まで細胞が増殖したウェルから順に培
養上清を採取し、上記と同一の方法により、抗体産生を
確認した。陽性のウェルは再度クローニングし、抗CPB
IIモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得た。これ
らのハイブリドーマは、４種類得られ、前記表１の如く
それぞれ産生する抗CPB IIモノクローナル抗体の種類に
より、CPB II−H29,CPB II−H76,CPB II−H311,CPB II
−H511と命名した。
実施例２ 抗CPB IIモノクローナル抗体の調製： ７週令以上のBALB/c系マウスにプリスタン（アルドリ
ッチ社製）0.5mlを腹腔内投与し、約１週間後、上記で
得たハイブリドーマ１×106個／マウス腹腔内接種し
た。約10日後、マウス腹腔より腹水を採取した。これを
3,000rpm、10分間遠心分離し、上清を分取しその5mlに
硫酸アンモニウムを終濃度が50％飽和濃度になるように
加え、４℃で60分間撹拌する。次いで、10,000rpm、20
分間遠心分離し、沈渣を0.1Mトリス−塩酸緩衝液（pH
8）に溶かし同緩衝液に対して透析した。これに等量の
1.5Mグリシン−3M塩化ナトリウム緩衝液（pH8.9）を加
えた後、同緩衝液で平衡化したProtein A Sepharose CL
−4B（ファルマシア社製）カラムクロマトグラフィーに
付した。
ッチ社製）0.5mlを腹腔内投与し、約１週間後、上記で
得たハイブリドーマ１×106個／マウス腹腔内接種し
た。約10日後、マウス腹腔より腹水を採取した。これを
3,000rpm、10分間遠心分離し、上清を分取しその5mlに
硫酸アンモニウムを終濃度が50％飽和濃度になるように
加え、４℃で60分間撹拌する。次いで、10,000rpm、20
分間遠心分離し、沈渣を0.1Mトリス−塩酸緩衝液（pH
8）に溶かし同緩衝液に対して透析した。これに等量の
1.5Mグリシン−3M塩化ナトリウム緩衝液（pH8.9）を加
えた後、同緩衝液で平衡化したProtein A Sepharose CL
−4B（ファルマシア社製）カラムクロマトグラフィーに
付した。
モノクローナル抗体の溶出は、0.1Mクエン酸緩衝液
（pH4）で行い、抗CPB IIモノクローナル抗体を得た。C
PB II−H29を用いた場合は、CPB II−A29を22.2mg、CPB
II−H76を用いた場合は、CPB II−A76を7.8mg、CPB II
−H311を用いた場合は、CPB II−A311を16mg、CPB II−
H511を用いた場合は、CPB II−A511を29mg得た。これら
の抗CPB IIモノクローナル抗体は、前記表１の性質を示
した。
（pH4）で行い、抗CPB IIモノクローナル抗体を得た。C
PB II−H29を用いた場合は、CPB II−A29を22.2mg、CPB
II−H76を用いた場合は、CPB II−A76を7.8mg、CPB II
−H311を用いた場合は、CPB II−A311を16mg、CPB II−
H511を用いた場合は、CPB II−A511を29mg得た。これら
の抗CPB IIモノクローナル抗体は、前記表１の性質を示
した。
実施例３ 免疫吸着クロマトグラフィーによるCPB IIの精製： （１） 抗CPB IIモノクローナル抗体の担体への結合 ブロムシアン活性化セファロース4B（0.4g）を、1mM
塩酸、0.1M重炭酸ナトリウム−0.5M塩化ナトリウム（pH
8.3）緩衝液で順次洗浄し、ブロムシアン活性化セファ
ロース4Bのカップリング緩衝液（1.5ml）溶液を調製し
た。
塩酸、0.1M重炭酸ナトリウム−0.5M塩化ナトリウム（pH
8.3）緩衝液で順次洗浄し、ブロムシアン活性化セファ
ロース4Bのカップリング緩衝液（1.5ml）溶液を調製し
た。
これに、精製モノクローナル抗体CPB II−A76 2mgの
カップリング緩衝液（1ml）溶液を加え、室温で２時間
振とうグラスフィルターで脱水した。更に、0.1Mトリス
−塩酸緩衝液（pH8.0）10mlを加え、室温で２時間振と
うし、残った活性部位をブロックした。
カップリング緩衝液（1ml）溶液を加え、室温で２時間
振とうグラスフィルターで脱水した。更に、0.1Mトリス
−塩酸緩衝液（pH8.0）10mlを加え、室温で２時間振と
うし、残った活性部位をブロックした。
得られた抗体結合セファロース4Bを、0.1Mトリス−塩
酸−0.5M塩化ナトリウム緩衝液（pH8.3）、0.1M酢酸−
0.5M塩化ナトリウム緩衝液（pH4.0）で交互に３回洗浄
し、0.1Mトリス−塩酸緩衝液（pH7.4）で平衡化し、抗
体カラム76を得た。
酸−0.5M塩化ナトリウム緩衝液（pH8.3）、0.1M酢酸−
0.5M塩化ナトリウム緩衝液（pH4.0）で交互に３回洗浄
し、0.1Mトリス−塩酸緩衝液（pH7.4）で平衡化し、抗
体カラム76を得た。
（２） 抗体カラムによるCPB IIの精製 上記で作製した抗体カラム76に、実施例１−（ｉ）−
（ii）で得た粗CPB II溶液をかけ、平衡化に用いた緩衝
液で充分洗浄した。
（ii）で得た粗CPB II溶液をかけ、平衡化に用いた緩衝
液で充分洗浄した。
CPB IIの溶出は、0.1M酢酸−0.15M塩化ナトリウム
緩衝液（pH3.5）を用いる方法、あるいは0.2Mグリシ
ン−塩酸緩衝液（pH2.3）を用いる方法で行うことがで
きる。
緩衝液（pH3.5）を用いる方法、あるいは0.2Mグリシ
ン−塩酸緩衝液（pH2.3）を用いる方法で行うことがで
きる。
CPB IIは、素通り画分には認められず、溶出画分から
80％以上の回収率で精製することができた。
80％以上の回収率で精製することができた。
尚、精製結果は回収率で表２に示した。CPB IIの測定
は、実施例４の方法で行った。
は、実施例４の方法で行った。
実施例４ 抗CPB IIモノクローナル抗体を用いるCPB IIの測定： S.Yoshitakaらの方法〔J.Biochem.92,1413−1424,198
2〕に準じてホースラディッシュ（西洋わさび）ペルオ
キシダーゼ（以下HRPと略す）を、抗CPB IIモノクロー
ナル抗体に結合させた。このHRP標識抗CPB IIモノクロ
ーナル抗体を用いて、以下の如くELISA法によりCPB II
の測定を行った。96ウェル平底マイクロプレートの各ウ
ェルに0.05M炭酸ナトリウム（pH9.6）に溶解したモノク
ローナル抗体を100μずつ添加し、25℃で２時間コー
ティングした。PBS−Tweenで洗浄後、試料の0.1Mトリス
−塩酸、25mM EDTA、0.05％ Tween20（pH7.4）緩衝液溶
液100μを加えた。25℃で一晩反応させた後、PBS−Tw
eenで洗浄し、HRP標識モノクローナル抗体のPBS−Tween
希釈溶液を100μ加え、25℃で２時間反応させた。PBS
−Tweenで洗浄後、100μの基質溶液（オルトフェニレ
ンジアミン0.4mg/mlおよび0.01％過酸化水素の0.1Mクエ
ン酸リン酸緩衝液、pH5.0）を添加し、25℃で30分間反
応させた。4.5M硫酸50μを加えて反応を停止させた
後、492nmにおける吸光度を測定した。その結果、表３
に示す如く、コーティング用モノクローナル抗体として
CPB II−A29を用い、標識用モノクローナル抗体としてC
PB II−A76,CPB II−A311,CPB II−A511を用いた場合、
及びコーティング用モノクローナル抗体としてCPB II−
A511を用い、標識用モノクローナル抗体としてCPB II−
A29,CPB II−A76を用いた場合には、１〜100ng/mlの範
囲のCPB IIを検出できる。
2〕に準じてホースラディッシュ（西洋わさび）ペルオ
キシダーゼ（以下HRPと略す）を、抗CPB IIモノクロー
ナル抗体に結合させた。このHRP標識抗CPB IIモノクロ
ーナル抗体を用いて、以下の如くELISA法によりCPB II
の測定を行った。96ウェル平底マイクロプレートの各ウ
ェルに0.05M炭酸ナトリウム（pH9.6）に溶解したモノク
ローナル抗体を100μずつ添加し、25℃で２時間コー
ティングした。PBS−Tweenで洗浄後、試料の0.1Mトリス
−塩酸、25mM EDTA、0.05％ Tween20（pH7.4）緩衝液溶
液100μを加えた。25℃で一晩反応させた後、PBS−Tw
eenで洗浄し、HRP標識モノクローナル抗体のPBS−Tween
希釈溶液を100μ加え、25℃で２時間反応させた。PBS
−Tweenで洗浄後、100μの基質溶液（オルトフェニレ
ンジアミン0.4mg/mlおよび0.01％過酸化水素の0.1Mクエ
ン酸リン酸緩衝液、pH5.0）を添加し、25℃で30分間反
応させた。4.5M硫酸50μを加えて反応を停止させた
後、492nmにおける吸光度を測定した。その結果、表３
に示す如く、コーティング用モノクローナル抗体として
CPB II−A29を用い、標識用モノクローナル抗体としてC
PB II−A76,CPB II−A311,CPB II−A511を用いた場合、
及びコーティング用モノクローナル抗体としてCPB II−
A511を用い、標識用モノクローナル抗体としてCPB II−
A29,CPB II−A76を用いた場合には、１〜100ng/mlの範
囲のCPB IIを検出できる。
また、コーティング用モノクローナル抗体としてCPB
II−A29を用い、標識用モノクローナル抗体として、CPB
II−A511を用いた場合の検量線は、図１に示す如く極
めて感度が高く、しかも良好な直線性を示した。
II−A29を用い、標識用モノクローナル抗体として、CPB
II−A511を用いた場合の検量線は、図１に示す如く極
めて感度が高く、しかも良好な直線性を示した。
図１は、実施例４のCPB II測定法におけるCPB II濃度と
吸光度（492nm）との関係を示す図面である。 図1:コーティング用モノクローナル抗体としてはCPB II
−A29を使用し、標識用モノクローナル抗体としてはCPB
II−A76及びA511を使用した。
吸光度（492nm）との関係を示す図面である。 図1:コーティング用モノクローナル抗体としてはCPB II
−A29を使用し、標識用モノクローナル抗体としてはCPB
II−A76及びA511を使用した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ 33/577 5/00 Ｂ
Claims (4)
- 【請求項１】下記の性質、 分子量（SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法，還元状態及び非還元状態） 73,000±2,000 等電点（アンフォライトを用いる等電点カラム電気
泳動法） 6.2〜6.6 安定性 イ 50℃、30分加熱処理で失活 ロ pH5.5〜8.5で安定（37℃） ハ 血漿中37℃、15分で安定 作 用 イ カルシウム再加凝固時間を延長 ロ プロトロンビン時間を延長 ハ 活性化部分トロンボプラスチン時間を延長 アミノ酸分析 アミノ酸分析で、アスパラギン酸、スレオニン、セリ
ン、グルタミン酸、プロリン、グリシン、アラニン、1/
2シスチン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイ
シン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、リジ
ン及びアルギニンの存在が認められる。 を有するヒト胎盤由来の抗血液凝固活性物質CPB IIに対
して特異的なモノクローナル抗体。 - 【請求項２】請求項１記載の抗血液凝固活性物質CPB II
に対して特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマ。 - 【請求項３】請求項１記載の抗血液凝固活性物質CPB II
に対して特異的なモノクローナル抗体を免疫吸着剤とし
て使用することを特徴とする請求項１記載の抗血液凝固
活性物質CPB IIの精製法。 - 【請求項４】請求項１記載の抗血液凝固活性物質CPB II
に対して特異的なモノクローナル抗体の標識体を使用す
ることを特徴とする請求項１記載の抗血液凝固活性物質
CPB IIの免疫学的測定法。
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