JP2613188B2 - 抗ｐｃｉモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ - Google Patents
抗ｐｃｉモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト胎盤より分離
精製した抗血液凝固活性を有する物質（以下ＰＣＩと略
称する）に対して特異的なモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマに関する。
精製した抗血液凝固活性を有する物質（以下ＰＣＩと略
称する）に対して特異的なモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマに関する。
【０００２】
【従来の技術】細胞融合技術は、ケーラーとミルスタイ
ンの報告（Ｎａｔｕｒｅ，４９５〜４９７頁，１９７５
年）以来急速に発展した。すなわち、哺乳動物の脾細胞
とミエローマ（骨髄腫）細胞とを融合させた雑種細胞
（ハイブリドーマ）は、用いた脾細胞の性質に応じて種
々の抗体を産生することが知られている。そしてこのハ
イブリドーマの性質を利用してクローニングをすること
により、種々の蛋白質、ホルモン等の生体物質に対する
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製す
ること、並びにモノクローナル抗体を生産する試みがな
されている（Ｅ．Ｄａｌｅ Ｓｅｒｖｉｅｒ ｅｔ ａ
ｌ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．
２７，Ｎｏ．１１，１７９７〜１８０６，１９８１）。
ンの報告（Ｎａｔｕｒｅ，４９５〜４９７頁，１９７５
年）以来急速に発展した。すなわち、哺乳動物の脾細胞
とミエローマ（骨髄腫）細胞とを融合させた雑種細胞
（ハイブリドーマ）は、用いた脾細胞の性質に応じて種
々の抗体を産生することが知られている。そしてこのハ
イブリドーマの性質を利用してクローニングをすること
により、種々の蛋白質、ホルモン等の生体物質に対する
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製す
ること、並びにモノクローナル抗体を生産する試みがな
されている（Ｅ．Ｄａｌｅ Ｓｅｒｖｉｅｒ ｅｔ ａ
ｌ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．
２７，Ｎｏ．１１，１７９７〜１８０６，１９８１）。
【０００３】一方、本出願人は先にヒトの胎盤から抗血
液凝固活性を有する物質（ＰＣＩ）を分離精製すること
に成功し、特許出願した（特願昭６０−２１７５１２号
公報）。ＰＣＩは下記の性質を有する医薬として有用な
物質である。 （１）分子量（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法，還元状態） ３４，０００±２，０００ （２）等電点（アンフォライトを用いる等電点カラム電
気泳動法） ４．７±０．１ （３）安定性 イ）５０℃、３０分加熱処理で失活 ロ）pH４〜１０で安定 ハ）血漿中３７℃、３０分で安定 （４）作用 イ）カルシウム再加凝固時間を延長 ロ）プロトロンビン時間を延長 ハ）活性化部分トロンボプラスチン時間を延長 （５）アミノ酸分析 アミノ酸分析で、アスパラギン酸、スレオニン、セリ
ン、グルタミン酸、プロリン、グリシン、アラニン、１
／２シスチン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロ
イシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、リ
ジン及びアルギニンの存在が認められる。
液凝固活性を有する物質（ＰＣＩ）を分離精製すること
に成功し、特許出願した（特願昭６０−２１７５１２号
公報）。ＰＣＩは下記の性質を有する医薬として有用な
物質である。 （１）分子量（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法，還元状態） ３４，０００±２，０００ （２）等電点（アンフォライトを用いる等電点カラム電
気泳動法） ４．７±０．１ （３）安定性 イ）５０℃、３０分加熱処理で失活 ロ）pH４〜１０で安定 ハ）血漿中３７℃、３０分で安定 （４）作用 イ）カルシウム再加凝固時間を延長 ロ）プロトロンビン時間を延長 ハ）活性化部分トロンボプラスチン時間を延長 （５）アミノ酸分析 アミノ酸分析で、アスパラギン酸、スレオニン、セリ
ン、グルタミン酸、プロリン、グリシン、アラニン、１
／２シスチン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロ
イシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、リ
ジン及びアルギニンの存在が認められる。
【０００４】ＰＣＩの製造法は、その一例を後記実施例
１に示したが、要約すれば以下のとおりである。まず、
ヒト胎盤から胎盤ホモジネートを調製し、遠心分離を行
う。ホモジナイズ操作は、胎盤より羊膜等を切除した
後、生理食塩水にて充分洗浄し、ワーリングブレンダー
及びポリトロンを用いて行う。得られたホモジネートを
遠心分離に付し、上清及び沈渣を得る。
１に示したが、要約すれば以下のとおりである。まず、
ヒト胎盤から胎盤ホモジネートを調製し、遠心分離を行
う。ホモジナイズ操作は、胎盤より羊膜等を切除した
後、生理食塩水にて充分洗浄し、ワーリングブレンダー
及びポリトロンを用いて行う。得られたホモジネートを
遠心分離に付し、上清及び沈渣を得る。
【０００５】こうして得られた胎盤ホモジネート沈渣
は、緩衝液で充分洗浄し、再度遠心分離して洗浄沈渣を
分取し、以後の抽出操作に付す。即ち、洗浄沈渣は、Ｅ
ＤＴＡ、ＥＧＴＡ、シュウ酸、クエン酸、ニトリロ三酢
酸ナトリウム、リン酸等のキレート剤を含む緩衝液及び
／又は、トリトンＸ−１００、ルブロール、ＳＤＳ、デ
オキシコール酸等の界面活性剤を含む緩衝液に浸し、４
℃〜８℃にて一晩放置後、遠心分離して上清を集め抽出
液を得る。この場合、抽出は、キレート剤及び界面活性
剤の両方を用いて行うこともできる。
は、緩衝液で充分洗浄し、再度遠心分離して洗浄沈渣を
分取し、以後の抽出操作に付す。即ち、洗浄沈渣は、Ｅ
ＤＴＡ、ＥＧＴＡ、シュウ酸、クエン酸、ニトリロ三酢
酸ナトリウム、リン酸等のキレート剤を含む緩衝液及び
／又は、トリトンＸ−１００、ルブロール、ＳＤＳ、デ
オキシコール酸等の界面活性剤を含む緩衝液に浸し、４
℃〜８℃にて一晩放置後、遠心分離して上清を集め抽出
液を得る。この場合、抽出は、キレート剤及び界面活性
剤の両方を用いて行うこともできる。
【０００６】一方、胎盤ホモジネート上清は、更に５
０，０００〜１００，０００ｇの超遠心分離して沈渣部
分であるマイクロゾーム分画を得る。このマイクロゾー
ム分画を洗浄後、上記と同様にして、キレート剤及び／
又は界面活性剤抽出を行った後、超遠心分離して上清を
集め抽出液を得る。
０，０００〜１００，０００ｇの超遠心分離して沈渣部
分であるマイクロゾーム分画を得る。このマイクロゾー
ム分画を洗浄後、上記と同様にして、キレート剤及び／
又は界面活性剤抽出を行った後、超遠心分離して上清を
集め抽出液を得る。
【０００７】このようにして得られた抽出液は、硫安分
画に付される。硫安分画は、先ず上記抽出液に３５％飽
和となるように固形硫安を加えて遠心分離し上清を分取
する。次いで、上清に対し８５％飽和となるように硫安
を加えて遠心分離し、沈渣を分取することにより行われ
る。。
画に付される。硫安分画は、先ず上記抽出液に３５％飽
和となるように固形硫安を加えて遠心分離し上清を分取
する。次いで、上清に対し８５％飽和となるように硫安
を加えて遠心分離し、沈渣を分取することにより行われ
る。。
【０００８】得られた硫安分画は、更に公知の分離・精
製手段、例えば透析、イオン交換クロマトグラフィー、
ゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、疎水性クロマトグ
ラフィー、等電点カラム電気泳動法、レクチン又は抗体
を用いたアフィニティー・クロマトグラフィー等を単独
又は組合わせ用いることにより精製され、ＰＣＩが得ら
れる。例えば、キレート剤又は／及び界面活性剤は抽出
液を硫安分画して得られた画分を充分透析し、この透析
液をＤＥＡＥ−トヨパールを用いる直線濃度勾配法によ
り溶出させ、活性画分を透析した後、ブルーセファロー
スを通過させる。次いで活性画分を濃縮し、セファデッ
クスＧ−１００を用いてゲル濾過させることによりＰＣ
Ｉを得る。
製手段、例えば透析、イオン交換クロマトグラフィー、
ゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、疎水性クロマトグ
ラフィー、等電点カラム電気泳動法、レクチン又は抗体
を用いたアフィニティー・クロマトグラフィー等を単独
又は組合わせ用いることにより精製され、ＰＣＩが得ら
れる。例えば、キレート剤又は／及び界面活性剤は抽出
液を硫安分画して得られた画分を充分透析し、この透析
液をＤＥＡＥ−トヨパールを用いる直線濃度勾配法によ
り溶出させ、活性画分を透析した後、ブルーセファロー
スを通過させる。次いで活性画分を濃縮し、セファデッ
クスＧ−１００を用いてゲル濾過させることによりＰＣ
Ｉを得る。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】しかし、胎盤中のＰＣ
Ｉは微量であり、また通常使用される各種クロマト法で
は、ＰＣＩとの特異的結合が充分ではなく、高純度のＰ
ＣＩを取得することは困難であり、加えて工程が長く回
収率も満足のいくものではなかった。従って、高純度の
ＰＣＩを簡便に高回収率で取得する特異的精製法の開発
が望まれていた。また、抗血液凝固剤としての用途にお
いて、ＰＣＩの作用メカニズムの解明、血中濃度の測定
等の手段として、ＰＣＩの高感度検出法の開発も望まれ
ていた。
Ｉは微量であり、また通常使用される各種クロマト法で
は、ＰＣＩとの特異的結合が充分ではなく、高純度のＰ
ＣＩを取得することは困難であり、加えて工程が長く回
収率も満足のいくものではなかった。従って、高純度の
ＰＣＩを簡便に高回収率で取得する特異的精製法の開発
が望まれていた。また、抗血液凝固剤としての用途にお
いて、ＰＣＩの作用メカニズムの解明、血中濃度の測定
等の手段として、ＰＣＩの高感度検出法の開発も望まれ
ていた。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、これらの
問題点を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、細胞融合に
よりＰＣＩに対して特異的なモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマを得、このハイブリドーマを利用し
てＰＣＩに特異的なモノクローナル抗体を取得できるこ
と、更に該モノクローナル抗体を利用すればＰＣＩの高
純度精製、免疫学的定量ができることを見出し本発明を
完成した。
問題点を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、細胞融合に
よりＰＣＩに対して特異的なモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマを得、このハイブリドーマを利用し
てＰＣＩに特異的なモノクローナル抗体を取得できるこ
と、更に該モノクローナル抗体を利用すればＰＣＩの高
純度精製、免疫学的定量ができることを見出し本発明を
完成した。
【００１１】すなわち本発明は、下記の性質； （１）分子量（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法，還元状態） ３４，０００±２，０００ （２）等電点（アンフォライトを用いる等電点カラム電
気泳動法） ４．７±０．１ （３）安定性 イ）５０℃、３０分加熱処理で失活 ロ）pH４〜１０で安定 ハ）血漿中３７℃、３０分で安定 （４）作用 イ）カルシウム再加凝固時間を延長 ロ）プロトロンビン時間を延長 ハ）活性化部分トロンボプラスチン時間を延長 （５）アミノ酸分析 アミノ酸分析で、アスパラギン酸、スレオニン、セリ
ン、グルタミン酸、プロリン、グリシン、アラニン、１
／２シスチン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロ
イシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、リ
ジン及びアルギニンの存在が認められる。 を有するヒト胎盤由来の抗血液凝固活性物質に対して特
異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを
提供するものである。
動法，還元状態） ３４，０００±２，０００ （２）等電点（アンフォライトを用いる等電点カラム電
気泳動法） ４．７±０．１ （３）安定性 イ）５０℃、３０分加熱処理で失活 ロ）pH４〜１０で安定 ハ）血漿中３７℃、３０分で安定 （４）作用 イ）カルシウム再加凝固時間を延長 ロ）プロトロンビン時間を延長 ハ）活性化部分トロンボプラスチン時間を延長 （５）アミノ酸分析 アミノ酸分析で、アスパラギン酸、スレオニン、セリ
ン、グルタミン酸、プロリン、グリシン、アラニン、１
／２シスチン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロ
イシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、リ
ジン及びアルギニンの存在が認められる。 を有するヒト胎盤由来の抗血液凝固活性物質に対して特
異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを
提供するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】ＰＣＩに対して特異的なモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマは、例えば次の如
くして製造される。すなわち、（１）抗原としてＰＣＩ
を用いて免疫した動物から抗体産生細胞を調製し、
（２）別に骨髄腫細胞を調製し、（３）これらの細胞を
融合させ、（４）得られたハイブリドーマを選択的に増
殖させ、（５）該ハイブリドーマから抗体産生ハイブリ
ドーマを検索し、（６）クローニングにより目的とする
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得る。次に各
工程について説明する。
ーナル抗体を産生するハイブリドーマは、例えば次の如
くして製造される。すなわち、（１）抗原としてＰＣＩ
を用いて免疫した動物から抗体産生細胞を調製し、
（２）別に骨髄腫細胞を調製し、（３）これらの細胞を
融合させ、（４）得られたハイブリドーマを選択的に増
殖させ、（５）該ハイブリドーマから抗体産生ハイブリ
ドーマを検索し、（６）クローニングにより目的とする
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得る。次に各
工程について説明する。
【００１３】（１）抗体産生細胞の調製 抗体産生細胞の調製は、常法に準じて行えばよく、抗原
であるＰＣＩで動物を免疫し、その動物の抗体産生細胞
を取得する方法によればよい。動物としては、マウス、
ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジなどが例示され、
抗体産生細胞としては脾臓、リンパ節、末梢血液等から
分離した細胞などが使用される。免疫方法としては、フ
ロイントのコンプリートアジュバントを併用する方法が
使用される。
であるＰＣＩで動物を免疫し、その動物の抗体産生細胞
を取得する方法によればよい。動物としては、マウス、
ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジなどが例示され、
抗体産生細胞としては脾臓、リンパ節、末梢血液等から
分離した細胞などが使用される。免疫方法としては、フ
ロイントのコンプリートアジュバントを併用する方法が
使用される。
【００１４】（２）骨髄腫細胞の調製 細胞融合に使用する骨髄腫細胞は、特に限定されず、多
くの哺乳動物の細胞株が利用できるが、抗体産生細胞の
調製に用いた動物と同種の動物の細胞株を使用するのが
好ましい。用いる細胞株は、細胞融合の後に、未融合の
骨髄腫細胞が選択培地で生存できず、ハイブリドーマだ
けが増殖できるようにすることによって、未融合細胞と
融合細胞とを分けることを考慮して、特定の薬剤抵抗性
を有するものが好ましい。例えば８−アザグアニン抵抗
性の細胞は、ＨＡＴ培地中で生育できない性質を有する
ため好んで用いられる。具体的には、マウス骨髄腫細胞
株ＰＡＩ、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ
８−Ｕ１、Ｐ３−ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１、Ｘ６３−Ａ
ｇ８−６．５．３．、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＦＯ、Ｓ
１９４／５ＸＸＯ．ＢＵ．１、ＭＰＣ１１−４５．６．
ＴＧ．１．７等が用いられる。
くの哺乳動物の細胞株が利用できるが、抗体産生細胞の
調製に用いた動物と同種の動物の細胞株を使用するのが
好ましい。用いる細胞株は、細胞融合の後に、未融合の
骨髄腫細胞が選択培地で生存できず、ハイブリドーマだ
けが増殖できるようにすることによって、未融合細胞と
融合細胞とを分けることを考慮して、特定の薬剤抵抗性
を有するものが好ましい。例えば８−アザグアニン抵抗
性の細胞は、ＨＡＴ培地中で生育できない性質を有する
ため好んで用いられる。具体的には、マウス骨髄腫細胞
株ＰＡＩ、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ
８−Ｕ１、Ｐ３−ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１、Ｘ６３−Ａ
ｇ８−６．５．３．、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＦＯ、Ｓ
１９４／５ＸＸＯ．ＢＵ．１、ＭＰＣ１１−４５．６．
ＴＧ．１．７等が用いられる。
【００１５】（３）細胞融合 細胞融合は、通常ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ １６４０培
地、ＩＭＤＭ培地などの培地中で、骨髄腫細胞と抗体産
生細胞を混合（混合比は通常１：４〜１：１０）するこ
とにより行われる。融合促進剤としては、平均分子量
１，０００〜６，０００のポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）が使用できる。ＰＥＧの使用濃度は通常３０〜５
０％である。
地、ＩＭＤＭ培地などの培地中で、骨髄腫細胞と抗体産
生細胞を混合（混合比は通常１：４〜１：１０）するこ
とにより行われる。融合促進剤としては、平均分子量
１，０００〜６，０００のポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）が使用できる。ＰＥＧの使用濃度は通常３０〜５
０％である。
【００１６】（４）ハイブリドーマの選択的増殖 細胞融合を終えた細胞は、１０％ＦＣＳ含有ＩＭＤＭ培
地などで適当に希釈し、遠心分離する。沈渣を選択培地
（例えば、ＨＡＴ培地）で浮遊し、９６ウエルマイクロ
プレートに接種した後、５％炭酸ガス培養装置で培養す
る。選択培地で生育してくる細胞はハイブリドーマであ
る。
地などで適当に希釈し、遠心分離する。沈渣を選択培地
（例えば、ＨＡＴ培地）で浮遊し、９６ウエルマイクロ
プレートに接種した後、５％炭酸ガス培養装置で培養す
る。選択培地で生育してくる細胞はハイブリドーマであ
る。
【００１７】（５）抗体産生ハイブリドーマの検索 抗体産生ハイブリドーマの検索は、常法に従えばよく、
特に限定されない。例えば、ハイブリドーマの増殖した
培養液を採取し、ＰＣＩと反応させたのち、酵素、蛍光
物質、発光物質などでラベルした第２抗体との反応によ
り検索できる。
特に限定されない。例えば、ハイブリドーマの増殖した
培養液を採取し、ＰＣＩと反応させたのち、酵素、蛍光
物質、発光物質などでラベルした第２抗体との反応によ
り検索できる。
【００１８】（６）クローニング 抗体産生ハイブリドーマを含むことを確認した培養ウエ
ル中の細胞を限界希釈法などによりクローニングを行
い、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得る。以
上の操作によってＰＣＩに特異的なモノクローナル抗体
産生ハイブリドーマＰＣＩ−Ｈ３９、ＰＣＩ−Ｈ４６、
ＰＣＩ−Ｈ１６７、ＰＣＩ−Ｈ１６９、ＰＣＩ−Ｈ１７
６、ＰＣＩ−Ｈ１８０を得た。これらのハイブリドーマ
はそれぞれＰＣＩに特異的なモノクローナル抗体を産生
する新規な細胞である。そこでこれらの細胞について工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託すべく手続を行っ
たが、６１微寄文第１４１５号として拒否された。
ル中の細胞を限界希釈法などによりクローニングを行
い、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得る。以
上の操作によってＰＣＩに特異的なモノクローナル抗体
産生ハイブリドーマＰＣＩ−Ｈ３９、ＰＣＩ−Ｈ４６、
ＰＣＩ−Ｈ１６７、ＰＣＩ−Ｈ１６９、ＰＣＩ−Ｈ１７
６、ＰＣＩ−Ｈ１８０を得た。これらのハイブリドーマ
はそれぞれＰＣＩに特異的なモノクローナル抗体を産生
する新規な細胞である。そこでこれらの細胞について工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託すべく手続を行っ
たが、６１微寄文第１４１５号として拒否された。
【００１９】ＰＣＩに特異的なモノクローナル抗体は、
上記で得られた抗体産生ハイブリドーマを利用すること
により調製される。すなわち、抗体産生ハイブリドーマ
を適当な培地中で培養することにより、その培養上清か
ら本発明モノクローナル抗体が得られる。また、モノク
ローナル抗体を大量に製造するには、骨髄腫細胞の由来
動物と同種の動物にプリスタン（２，６，１０，１４−
テトラメチルペンタデカン）などの鉱物油を腹腔内投与
した後、抗体産生ハイブリドーマを接種することによ
り、インビボで抗体産生ハイブリドーマを大量に増殖さ
せる方法が用いられる。この方法によれば、接種した動
物の血清及び腹水中に高濃度のモノクローナル抗体が生
ずる。モノクローナル抗体の分離精製は、通常の血清か
らの抗体の精製に使用されている方法に従って実施でき
る。
上記で得られた抗体産生ハイブリドーマを利用すること
により調製される。すなわち、抗体産生ハイブリドーマ
を適当な培地中で培養することにより、その培養上清か
ら本発明モノクローナル抗体が得られる。また、モノク
ローナル抗体を大量に製造するには、骨髄腫細胞の由来
動物と同種の動物にプリスタン（２，６，１０，１４−
テトラメチルペンタデカン）などの鉱物油を腹腔内投与
した後、抗体産生ハイブリドーマを接種することによ
り、インビボで抗体産生ハイブリドーマを大量に増殖さ
せる方法が用いられる。この方法によれば、接種した動
物の血清及び腹水中に高濃度のモノクローナル抗体が生
ずる。モノクローナル抗体の分離精製は、通常の血清か
らの抗体の精製に使用されている方法に従って実施でき
る。
【００２０】斯くして得られた本発明を利用したモノク
ローナル抗体は、使用する抗体産生ハイブリドーマの種
類によりＰＣＩ−Ａ３９、ＰＣＩ−Ａ４６、ＰＣＩ−Ａ
１６７、ＰＣＩ−Ａ１６９、ＰＣＩ−Ａ１７６及びＰＣ
Ｉ−Ａ１８０の６種類存在する。これらのモノクローナ
ル抗体は、表１に示す性質を有する。なお表１中、分子
量はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
り、等電点は等電点電気泳動法（ＬＫＢ−カラム等電点
電気泳動装置）により、免疫グロブリンサブクラスはオ
クタローニーの二重免疫拡散法〔ウサギポリクローナル
抗体（マイルズ社製）使用〕により測定した。
ローナル抗体は、使用する抗体産生ハイブリドーマの種
類によりＰＣＩ−Ａ３９、ＰＣＩ−Ａ４６、ＰＣＩ−Ａ
１６７、ＰＣＩ−Ａ１６９、ＰＣＩ−Ａ１７６及びＰＣ
Ｉ−Ａ１８０の６種類存在する。これらのモノクローナ
ル抗体は、表１に示す性質を有する。なお表１中、分子
量はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
り、等電点は等電点電気泳動法（ＬＫＢ−カラム等電点
電気泳動装置）により、免疫グロブリンサブクラスはオ
クタローニーの二重免疫拡散法〔ウサギポリクローナル
抗体（マイルズ社製）使用〕により測定した。
【００２１】
【表１】
【００２２】本発明を利用したモノクローナル抗体を免
疫吸着剤として利用することによって、ＰＣＩを精製す
る方法は、例えば本発明モノクローナル抗体をデキスト
ランゲル、アガロースゲル、ポリビニルゲル等の不溶性
担体に結合させ、該モノクローナル抗体結合担体を免疫
吸着剤として用い、カラムクロマトグラフィーに付すこ
とにより実施される。不溶性担体とモノクローナル抗体
との結合は、ブロムシアン法やエポキシ、アミノ、カル
ボキシル、もしくはホルミル基等を介して結合させるこ
とができる。このモノクローナル抗体結合不溶性担体か
らなるカラムに粗ＰＣＩを添加し、カラムに吸着したＰ
ＣＩを溶出させることにより高純度のＰＣＩが得られ
る。
疫吸着剤として利用することによって、ＰＣＩを精製す
る方法は、例えば本発明モノクローナル抗体をデキスト
ランゲル、アガロースゲル、ポリビニルゲル等の不溶性
担体に結合させ、該モノクローナル抗体結合担体を免疫
吸着剤として用い、カラムクロマトグラフィーに付すこ
とにより実施される。不溶性担体とモノクローナル抗体
との結合は、ブロムシアン法やエポキシ、アミノ、カル
ボキシル、もしくはホルミル基等を介して結合させるこ
とができる。このモノクローナル抗体結合不溶性担体か
らなるカラムに粗ＰＣＩを添加し、カラムに吸着したＰ
ＣＩを溶出させることにより高純度のＰＣＩが得られ
る。
【００２３】本発明を利用したモノクローナル抗体の標
識体を利用するＰＣＩの免疫測定法は、例えば本発明モ
ノクローナル抗体を酵素、各種のアイソトープ、蛍光物
質等の標識剤で標識し、これにＰＣＩを含む試料を加
え、ＰＣＩと標識体との免疫反応生成物の標識量を測定
することによって実施される。また一般的な方法として
ＥＬＩＳＡ法を用いることもできる。
識体を利用するＰＣＩの免疫測定法は、例えば本発明モ
ノクローナル抗体を酵素、各種のアイソトープ、蛍光物
質等の標識剤で標識し、これにＰＣＩを含む試料を加
え、ＰＣＩと標識体との免疫反応生成物の標識量を測定
することによって実施される。また一般的な方法として
ＥＬＩＳＡ法を用いることもできる。
【００２４】
【発明の効果】本発明のハイブリドーマは、ＰＣＩに対
して特異的なモノクローナル抗体を産生する。そしてこ
のモノクローナル抗体を用いれば、ＰＣＩの分離精製工
程を短縮でき、極めて高純度のＰＣＩを高回収率で得る
ことができる。更に、モノクローナル抗体と結合させた
不溶性担体は、洗浄すれば再使用可能であり、精製工程
の短縮だけでなく、経済的であることから工業的に極め
て有用である。また、本発明を利用した抗ＰＣＩモノク
ローナル抗体は、血液の凝固線溶系の異常疾患の治療に
おけるＰＣＩの免疫定量に使用できる。
して特異的なモノクローナル抗体を産生する。そしてこ
のモノクローナル抗体を用いれば、ＰＣＩの分離精製工
程を短縮でき、極めて高純度のＰＣＩを高回収率で得る
ことができる。更に、モノクローナル抗体と結合させた
不溶性担体は、洗浄すれば再使用可能であり、精製工程
の短縮だけでなく、経済的であることから工業的に極め
て有用である。また、本発明を利用した抗ＰＣＩモノク
ローナル抗体は、血液の凝固線溶系の異常疾患の治療に
おけるＰＣＩの免疫定量に使用できる。
【００２５】
【実施例】次に実施例を挙げて本発明を説明する。
【００２６】実施例１ 抗ＰＣＩモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの製
造： （１）抗原（ＰＣＩ）の精製 （ｉ）ヒト胎盤５個（約２，５００ｇ）より、膜等を除
去し、生理食塩水で充分洗浄後ミンチする。次いでワー
リングブレンダーを用いて破砕し、これに更に、５０mM
トリス−塩酸緩衝液（pH７．４）２ｌを加え、ポリトロ
ン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）で磨砕する。得られたホモジネ
ートを７，０００rpm １５分間遠心分離し、沈渣を分取
した。得られた沈渣に再度５０mMトリス−塩酸緩衝液
（pH７．４）２ｌを加え、ポリトロンでホモジナイズ
し、７，０００rpm １５分間遠心分離して洗浄沈渣を得
た。この操作を数回繰り返し、血液成分を除去して、洗
浄沈渣９３０ｇを得た。
造： （１）抗原（ＰＣＩ）の精製 （ｉ）ヒト胎盤５個（約２，５００ｇ）より、膜等を除
去し、生理食塩水で充分洗浄後ミンチする。次いでワー
リングブレンダーを用いて破砕し、これに更に、５０mM
トリス−塩酸緩衝液（pH７．４）２ｌを加え、ポリトロ
ン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）で磨砕する。得られたホモジネ
ートを７，０００rpm １５分間遠心分離し、沈渣を分取
した。得られた沈渣に再度５０mMトリス−塩酸緩衝液
（pH７．４）２ｌを加え、ポリトロンでホモジナイズ
し、７，０００rpm １５分間遠心分離して洗浄沈渣を得
た。この操作を数回繰り返し、血液成分を除去して、洗
浄沈渣９３０ｇを得た。
【００２７】（ii）（ｉ）で得た沈渣９００ｇに、５０
mMＥＤＴＡを含む５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．
４）を約２ｌ加え、ワーリングブレンダーでホモジナイ
ズする。このホモジネートを４℃にて、一夜攪拌後７，
０００rpm １５分間遠心分離して、抽出液２ｌを得た。
mMＥＤＴＡを含む５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．
４）を約２ｌ加え、ワーリングブレンダーでホモジナイ
ズする。このホモジネートを４℃にて、一夜攪拌後７，
０００rpm １５分間遠心分離して、抽出液２ｌを得た。
【００２８】(iii) （ii）で得た抽出液に固形硫安を加
え、３５％飽和とし、４℃で３０分〜数時間放置後、
７，０００rpm １５分間遠心分離し上清を分取した。こ
の上清に更に硫安を加え、８５％飽和とし、４℃で２時
間放置した後７，０００rpm １５分間遠心分離し、沈渣
を分取した。得られた沈渣を２０mMトリス−塩酸緩衝液
の少量に溶かし、同緩衝液に対し、４℃で一夜充分に透
析した。透析中に生じた沈澱は、７，０００rpm １５分
間遠心分離して除き、透析液３９０mlを得た。
え、３５％飽和とし、４℃で３０分〜数時間放置後、
７，０００rpm １５分間遠心分離し上清を分取した。こ
の上清に更に硫安を加え、８５％飽和とし、４℃で２時
間放置した後７，０００rpm １５分間遠心分離し、沈渣
を分取した。得られた沈渣を２０mMトリス−塩酸緩衝液
の少量に溶かし、同緩衝液に対し、４℃で一夜充分に透
析した。透析中に生じた沈澱は、７，０００rpm １５分
間遠心分離して除き、透析液３９０mlを得た。
【００２９】(iv)得られた透析液を、２０mMトリス−塩
酸緩衝液（pH７．４）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパー
ル（φ５．５×１９cm）に吸着させ、同緩衝液にて充分
洗浄した後、０〜０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝
液４ｌを用い、直線濃度勾配により１分画２０mlとなる
様に溶出させた。活性画分は、ほぼ０．１５Ｍ塩化ナト
リウム濃度付近にて溶出され、３８０mlの活性画分を得
た。
酸緩衝液（pH７．４）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパー
ル（φ５．５×１９cm）に吸着させ、同緩衝液にて充分
洗浄した後、０〜０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝
液４ｌを用い、直線濃度勾配により１分画２０mlとなる
様に溶出させた。活性画分は、ほぼ０．１５Ｍ塩化ナト
リウム濃度付近にて溶出され、３８０mlの活性画分を得
た。
【００３０】（ｖ）得られた活性画分を、０．１Ｍリン
酸緩衝液（pH７．０）に対し、４℃で一夜充分に透析
し、同緩衝液にて平衡化したブルーセファロース（φ
２．５×１２cm）カラムを通過させた。Ａ280の吸収を
示す通過画分（４８０ml）を集め、これをダイアフロー
メンブランフィルターＹＭ−１０を用いて濃縮した。
酸緩衝液（pH７．０）に対し、４℃で一夜充分に透析
し、同緩衝液にて平衡化したブルーセファロース（φ
２．５×１２cm）カラムを通過させた。Ａ280の吸収を
示す通過画分（４８０ml）を集め、これをダイアフロー
メンブランフィルターＹＭ−１０を用いて濃縮した。
【００３１】(vi)（ｖ）で得た濃縮液をセファデックス
Ｇ−１００を用いるゲル濾過（φ４．５×７５cm）に付
し、生理食塩水で１分画８mlになるように溶出させ、活
性画分８８〜１０４を集め、これを限外濾過により濃縮
して、ＰＣＩ１４．５ml（蛋白重量１３６．１mg，Ｌｏ
ｗｒｙ法）を得た。当該ＰＣＩは、分析の結果、前述の
性質を示すものであった。なお、各精製段階において得
た蛋白の収量を下に示す。 工程 蛋白重量（mg） (ii) 工程（ＥＤＴＡ抽出） ７２２６ (iii）工程（硫安分画、透析） ３１８４ (iv) 工程（ＤＥＡＥ−トヨパール吸着） ５３１ (v) 工程（ブルーセファロース吸着） １６３ (iv) 工程（セファデックスＧ−１００吸着） １３６
Ｇ−１００を用いるゲル濾過（φ４．５×７５cm）に付
し、生理食塩水で１分画８mlになるように溶出させ、活
性画分８８〜１０４を集め、これを限外濾過により濃縮
して、ＰＣＩ１４．５ml（蛋白重量１３６．１mg，Ｌｏ
ｗｒｙ法）を得た。当該ＰＣＩは、分析の結果、前述の
性質を示すものであった。なお、各精製段階において得
た蛋白の収量を下に示す。 工程 蛋白重量（mg） (ii) 工程（ＥＤＴＡ抽出） ７２２６ (iii）工程（硫安分画、透析） ３１８４ (iv) 工程（ＤＥＡＥ−トヨパール吸着） ５３１ (v) 工程（ブルーセファロース吸着） １６３ (iv) 工程（セファデックスＧ−１００吸着） １３６
【００３２】（２）免疫脾細胞の調製 上述の如く精製したＰＣＩ１００μg をフロイント・コ
ンプリート・アジュバントに乳濁化させ、ＢＡＬＢ／Ｃ
系マウスの腹腔内に投与した。以後、２週間の間隔で５
０μg のＰＣＩとアジュバント乳濁液を２回投与し、最
後にＰＣＩ５０μg のみを投与し免疫を完了した。３日
後にマウスを殺し、脾臓を摘出、細断した後１００メッ
シュのナイロン網で濾過し、脾臓の単離細胞を得た。
ンプリート・アジュバントに乳濁化させ、ＢＡＬＢ／Ｃ
系マウスの腹腔内に投与した。以後、２週間の間隔で５
０μg のＰＣＩとアジュバント乳濁液を２回投与し、最
後にＰＣＩ５０μg のみを投与し免疫を完了した。３日
後にマウスを殺し、脾臓を摘出、細断した後１００メッ
シュのナイロン網で濾過し、脾臓の単離細胞を得た。
【００３３】（３）ハイブリドーマの調製 得られた免疫脾細胞に低張液（１５５mM塩化アンモニウ
ム）を加え赤血球を溶血した後Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏ
ｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ
（ＩＭＤＭ）で細胞を３回洗い、マウス骨髄腫細胞ＰＡ
ＩはＩＭＤＭで３回洗った。両細胞数を計測し、脾細胞
とＰＡＩ細胞の割合を５対１にして遠心した。上清を捨
て、細胞沈渣を充分解きほぐした後ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）４，０００を培地で希釈した４５％液を
０．５ml滴下して融合を行った。３７℃、３０秒間静置
した後、ＩＭＤＭ１mlを１分間かけて静かに添加した。
続いて１０mlを５分間かけて加え、最終４０mlにした遠
心管１，０００rpm ８分間遠心した。沈渣を１０％Ｆｅ
ｓ添加ＩＭＤＭで浮遊し再度遠心して上清を捨てた。ヒ
ポキサンチン１０-4Ｍ、アミノプテリン４×１０-7Ｍ及
びチミジン１．６×１０-5Ｍを加えた（ＨＡＴ−）１０
％ＦＣＳ添加ＩＭＤＭを用い沈渣を再浮遊し、９６ウエ
ルマイクロプレートに１００μl ずつ分注した。３〜４
日ごとに培地５０μl を追加し、細胞の増殖を見た。Ｈ
ＡＴ選択により、ハイブリドーマのみ増殖することを確
認した。
ム）を加え赤血球を溶血した後Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏ
ｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ
（ＩＭＤＭ）で細胞を３回洗い、マウス骨髄腫細胞ＰＡ
ＩはＩＭＤＭで３回洗った。両細胞数を計測し、脾細胞
とＰＡＩ細胞の割合を５対１にして遠心した。上清を捨
て、細胞沈渣を充分解きほぐした後ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）４，０００を培地で希釈した４５％液を
０．５ml滴下して融合を行った。３７℃、３０秒間静置
した後、ＩＭＤＭ１mlを１分間かけて静かに添加した。
続いて１０mlを５分間かけて加え、最終４０mlにした遠
心管１，０００rpm ８分間遠心した。沈渣を１０％Ｆｅ
ｓ添加ＩＭＤＭで浮遊し再度遠心して上清を捨てた。ヒ
ポキサンチン１０-4Ｍ、アミノプテリン４×１０-7Ｍ及
びチミジン１．６×１０-5Ｍを加えた（ＨＡＴ−）１０
％ＦＣＳ添加ＩＭＤＭを用い沈渣を再浮遊し、９６ウエ
ルマイクロプレートに１００μl ずつ分注した。３〜４
日ごとに培地５０μl を追加し、細胞の増殖を見た。Ｈ
ＡＴ選択により、ハイブリドーマのみ増殖することを確
認した。
【００３４】（４）抗体産生ハイブリドーマの検索 ハイブリドーマが増殖したウエルの培養液を採取し酵素
免疫法により、ＰＣＩに対する抗体産生ハイブリドーマ
を調べた。まず、９６ウエルマイクロプレート（イムノ
プレートＩ、ヌンク社製）にＰＣＩを０．１μg ／１０
０μl ／ウエル分注し、２５℃で１８時間静置し吸着さ
せる。次いで検体である培養液を１００μl ／ウエル注
入し、２５℃で２時間反応させる。０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）
で３回洗浄後、ワサビパーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウ
スＩｇＧ（カペル社製）を１００μl ／ウエル加え、２
時間後ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄する。これに、
０．００１％過酸化水素、０．４mg／mlオルトフェニレ
ンジアミン（シグマ社製）の０．１Ｍクエン酸−水酸化
ナトリウム緩衝液（pH４．０）を加え、波長４９２nmの
吸光度を測定した。検体中、ＰＣＩに対する抗体が存在
したウエルのみに発色が観察されるので、発色したウエ
ルの細胞を採取した。
免疫法により、ＰＣＩに対する抗体産生ハイブリドーマ
を調べた。まず、９６ウエルマイクロプレート（イムノ
プレートＩ、ヌンク社製）にＰＣＩを０．１μg ／１０
０μl ／ウエル分注し、２５℃で１８時間静置し吸着さ
せる。次いで検体である培養液を１００μl ／ウエル注
入し、２５℃で２時間反応させる。０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）
で３回洗浄後、ワサビパーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウ
スＩｇＧ（カペル社製）を１００μl ／ウエル加え、２
時間後ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄する。これに、
０．００１％過酸化水素、０．４mg／mlオルトフェニレ
ンジアミン（シグマ社製）の０．１Ｍクエン酸−水酸化
ナトリウム緩衝液（pH４．０）を加え、波長４９２nmの
吸光度を測定した。検体中、ＰＣＩに対する抗体が存在
したウエルのみに発色が観察されるので、発色したウエ
ルの細胞を採取した。
【００３５】（５）ＰＣＩに対するモノクローナル抗体
産生細胞のクローニング マウスの腹腔にＩＭＤＭを注射して採取した腹腔細胞を
フィーダー細胞として使用した。１０％ＦＣＳ添加ＩＭ
ＤＭに浮遊した腹腔細胞（１×１０5個／ml）を９６ウ
エルマイクロプレートに１００μl ずつ分注した。翌
日、抗体産生ハイブリドーマを５個／mlに調製し、各ウ
エルに１００μl ずつ分注した。３日ごとに培地を交換
し適当な量まで細胞が増殖したウエルから順に培養上清
を採取し、上記と同一の方法により、抗体産生を確認し
た。陽性のウエルは再度クローニングし、抗ＰＣＩモノ
クローナル抗体産生ハイブリドーマを得た。これらのハ
イブリドーマは、６種類得られ、前記表１の如くそれぞ
れ産生する抗ＰＣＩモノクローナル抗体の種類により、
ＰＣＩ−Ｈ３９、ＰＣＩ−Ｈ４６、ＰＣＩ−Ｈ１６７、
ＰＣＩ−Ｈ１６９、ＰＣＩ−Ｈ１７６、ＰＣＩ−Ｈ１８
０と命名した。
産生細胞のクローニング マウスの腹腔にＩＭＤＭを注射して採取した腹腔細胞を
フィーダー細胞として使用した。１０％ＦＣＳ添加ＩＭ
ＤＭに浮遊した腹腔細胞（１×１０5個／ml）を９６ウ
エルマイクロプレートに１００μl ずつ分注した。翌
日、抗体産生ハイブリドーマを５個／mlに調製し、各ウ
エルに１００μl ずつ分注した。３日ごとに培地を交換
し適当な量まで細胞が増殖したウエルから順に培養上清
を採取し、上記と同一の方法により、抗体産生を確認し
た。陽性のウエルは再度クローニングし、抗ＰＣＩモノ
クローナル抗体産生ハイブリドーマを得た。これらのハ
イブリドーマは、６種類得られ、前記表１の如くそれぞ
れ産生する抗ＰＣＩモノクローナル抗体の種類により、
ＰＣＩ−Ｈ３９、ＰＣＩ−Ｈ４６、ＰＣＩ−Ｈ１６７、
ＰＣＩ−Ｈ１６９、ＰＣＩ−Ｈ１７６、ＰＣＩ−Ｈ１８
０と命名した。
【００３６】（６）抗ＰＣＩモノクローナル抗体の調製 ７週令以上のＢＡＬＢ／Ｃ系マウスにプリスタン（アル
ドリッチ社製）０．５mlを腹腔内投与し、約１週間後、
上記で得たハイブリドーマ１×１０6個／マウス腹腔内
接種した。約１０日後、マウス腹腔より腹水を採取し
た。これを３，０００rpm 、１０分間遠心分離し、上清
を分取しその５mlに硫酸アンモニウムを終濃度が５０％
飽和濃度になるように加え、４℃で一夜放置する。次い
で、３，０００rpm 、１５分間遠心分離し、沈渣を０．
１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８）に溶かし同緩衝液に対
して透析した。これを同緩衝液で平衡化したＰｒｏｔｅ
ｉｎＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂ（ファルマシ
ア社製）カラムクロマトグラフィーに付した。モノクロ
ーナル抗体の溶出は、０．１Ｍグリシン−０．１５Ｍ塩
化ナトリウム緩衝液（pH２．７）で行い、抗ＰＣＩモノ
クローナル抗体を得た。ＰＣＩ−Ｈ３９を用いた場合
は、ＰＣＩ−Ａ３９ １４．２mg、ＰＣＩ−Ｈ４６を用
いた場合は、ＰＣＩ−Ａ４６ ２０．２mg、ＰＣＩ−Ｈ
１６７を用いた場合は、ＰＣＩ−Ａ１６７ ２２．９m
g、ＰＣＩ−Ｈ１６９を用いた場合は、ＰＣＩ−Ａ１６
９２５．０mg、ＰＣＩ−Ｈ１７６を用いた場合は、ＰＣ
Ｉ−Ａ１７６ ２５．０mg、ＰＣＩ−Ｈ１８０を用いた
場合は、ＰＣＩ−Ａ１８０ ８．６mgをそれぞれ得た。
これらの抗ＰＣＩモノクローナル抗体は、前記表１の性
質を示した。
ドリッチ社製）０．５mlを腹腔内投与し、約１週間後、
上記で得たハイブリドーマ１×１０6個／マウス腹腔内
接種した。約１０日後、マウス腹腔より腹水を採取し
た。これを３，０００rpm 、１０分間遠心分離し、上清
を分取しその５mlに硫酸アンモニウムを終濃度が５０％
飽和濃度になるように加え、４℃で一夜放置する。次い
で、３，０００rpm 、１５分間遠心分離し、沈渣を０．
１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８）に溶かし同緩衝液に対
して透析した。これを同緩衝液で平衡化したＰｒｏｔｅ
ｉｎＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂ（ファルマシ
ア社製）カラムクロマトグラフィーに付した。モノクロ
ーナル抗体の溶出は、０．１Ｍグリシン−０．１５Ｍ塩
化ナトリウム緩衝液（pH２．７）で行い、抗ＰＣＩモノ
クローナル抗体を得た。ＰＣＩ−Ｈ３９を用いた場合
は、ＰＣＩ−Ａ３９ １４．２mg、ＰＣＩ−Ｈ４６を用
いた場合は、ＰＣＩ−Ａ４６ ２０．２mg、ＰＣＩ−Ｈ
１６７を用いた場合は、ＰＣＩ−Ａ１６７ ２２．９m
g、ＰＣＩ−Ｈ１６９を用いた場合は、ＰＣＩ−Ａ１６
９２５．０mg、ＰＣＩ−Ｈ１７６を用いた場合は、ＰＣ
Ｉ−Ａ１７６ ２５．０mg、ＰＣＩ−Ｈ１８０を用いた
場合は、ＰＣＩ−Ａ１８０ ８．６mgをそれぞれ得た。
これらの抗ＰＣＩモノクローナル抗体は、前記表１の性
質を示した。
【００３７】参考例１ 免疫吸着クロマトグラフィーによるＰＣＩの精製： （１）抗ＰＣＩモノクローナル抗体の担体への結合 ブロムシアン活性化セファロース４Ｂ（０．４ｇ）を、
１mM塩酸、０．１Ｍ重炭酸ナトリウム−０．５Ｍ塩化ナ
トリウム（pH８．３）緩衝液で順次洗浄し、ブロムシア
ン活性化セファロース４Ｂのカップリング緩衝液（１．
５ml）溶液を調製した。これに、精製モノクローナル抗
体ＰＣＩ−Ａ４６ ２mgのカップリング緩衝液（１ml）
溶液を加え、室温で２時間振盪しグラスフィルターで脱
水した。更に、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８．
０）１０mlを加え、室温で２時間振盪し、残った活性部
位をブロックした。得られた抗体結合セファロース４Ｂ
を、０．１Ｍトリス−塩酸−０．５Ｍ塩化ナトリウム緩
衝液（pH８．３）、０．１Ｍ酢酸−０．５Ｍ塩化ナトリ
ウム緩衝液（pH４．０）で交互に３回洗浄し、０．１Ｍ
トリス−塩酸緩衝液（pH７．４）で平衡化し、抗体カラ
ム４６を得た。
１mM塩酸、０．１Ｍ重炭酸ナトリウム−０．５Ｍ塩化ナ
トリウム（pH８．３）緩衝液で順次洗浄し、ブロムシア
ン活性化セファロース４Ｂのカップリング緩衝液（１．
５ml）溶液を調製した。これに、精製モノクローナル抗
体ＰＣＩ−Ａ４６ ２mgのカップリング緩衝液（１ml）
溶液を加え、室温で２時間振盪しグラスフィルターで脱
水した。更に、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８．
０）１０mlを加え、室温で２時間振盪し、残った活性部
位をブロックした。得られた抗体結合セファロース４Ｂ
を、０．１Ｍトリス−塩酸−０．５Ｍ塩化ナトリウム緩
衝液（pH８．３）、０．１Ｍ酢酸−０．５Ｍ塩化ナトリ
ウム緩衝液（pH４．０）で交互に３回洗浄し、０．１Ｍ
トリス−塩酸緩衝液（pH７．４）で平衡化し、抗体カラ
ム４６を得た。
【００３８】（２）抗体カラムによるＰＣＩの精製 上記で作製した抗体カラム４６に、実施例１−（ｉ）−
（ii）で得た粗ＰＣＩ溶液をかけ、平衡化に用いた緩衝
液で充分洗浄した。ＰＣＩの溶出は、０．１Ｍ酢酸−
０．５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（pH５．０）を用いる方
法あるいは、０．１Ｍトリス−塩酸−０．１Ｍ塩化カル
シウム（pH７．４）を用いる方法で行うことができる。
ＰＣＩは、素通り画分には認められず、溶出画分から７
０％以上の回収率で精製することができた。なお、精製
係数などの結果は表２に示した。ＰＣＩの測定は、参考
例２の方法で行った。
（ii）で得た粗ＰＣＩ溶液をかけ、平衡化に用いた緩衝
液で充分洗浄した。ＰＣＩの溶出は、０．１Ｍ酢酸−
０．５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（pH５．０）を用いる方
法あるいは、０．１Ｍトリス−塩酸−０．１Ｍ塩化カル
シウム（pH７．４）を用いる方法で行うことができる。
ＰＣＩは、素通り画分には認められず、溶出画分から７
０％以上の回収率で精製することができた。なお、精製
係数などの結果は表２に示した。ＰＣＩの測定は、参考
例２の方法で行った。
【００３９】
【表２】
【００４０】参考例２ 抗ＰＣＩモノクローナル抗体を用いるＰＣＩの測定：
Ｓ．Ｙｏｓｈｉｔａｋｅらの方法〔Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．９２，１４１３−１４２４，１９８２〕に準じてホ
ースラディッシュ（西洋わさび）ペルオキシダーゼ（以
下ＨＲＰと略す）を、抗ＰＣＩモノクローナル抗体に結
合させた。このＨＲＰ標識抗ＰＣＩモノクローナル抗体
を用いて、以下の如くＥＬＩＳＡ法によりＰＣＩの測定
を行った。９６ウエル平底マイクロプレートの各ウエル
に０．０５Ｍ炭酸ナトリウム（pH９．６）に溶解したモ
ノクローナル抗体を１００μl ずつ添加し、２５℃で２
時間コーティングした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄後、
試料の０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２５mM ＥＤＴ
Ａ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（pH７．４）緩衝液溶液
１００μl を加えた。２５℃で一晩反応させた後、ＰＢ
Ｓ−Ｔｗｅｅｎで洗浄し、ＨＲＰ標識モノクローナル抗
体のＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ希釈溶液を１００μl 加え、２
５℃で２時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄
後、１００μl の基質溶液（オルトフェニレンジアミン
０．４mg／ml及び０．０１％過酸化水素の０．１Ｍクエ
ン酸リン酸緩衝液、pH５．０）を添加し、２５℃で３０
分間反応させた。４．５Ｍ硫酸５０μl を加えて反応を
停止させた後、４９２nmにおける吸光度を測定した。そ
の結果、表３に示す如く、コーティング用モノクローナ
ル抗体としてＰＣＩ−Ａ４６を用い、標識用モノクロー
ナル抗体としてＰＣＩ−Ａ３９、ＰＣＩ−Ａ１６９、Ｐ
ＣＩ−Ａ１７６、ＰＣＩ−Ａ１８０を用いた場合、及び
コーティング用モノクローナル抗体としてＰＣＩ−Ａ１
７６を用い、標識用モノクローナル抗体としてＰＣＩ−
Ａ４６、ＰＣＩ−Ａ１８０を用いた場合には、５〜１０
０ng／mlの範囲のＰＣＩを検出できる。
Ｓ．Ｙｏｓｈｉｔａｋｅらの方法〔Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．９２，１４１３−１４２４，１９８２〕に準じてホ
ースラディッシュ（西洋わさび）ペルオキシダーゼ（以
下ＨＲＰと略す）を、抗ＰＣＩモノクローナル抗体に結
合させた。このＨＲＰ標識抗ＰＣＩモノクローナル抗体
を用いて、以下の如くＥＬＩＳＡ法によりＰＣＩの測定
を行った。９６ウエル平底マイクロプレートの各ウエル
に０．０５Ｍ炭酸ナトリウム（pH９．６）に溶解したモ
ノクローナル抗体を１００μl ずつ添加し、２５℃で２
時間コーティングした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄後、
試料の０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２５mM ＥＤＴ
Ａ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（pH７．４）緩衝液溶液
１００μl を加えた。２５℃で一晩反応させた後、ＰＢ
Ｓ−Ｔｗｅｅｎで洗浄し、ＨＲＰ標識モノクローナル抗
体のＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ希釈溶液を１００μl 加え、２
５℃で２時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄
後、１００μl の基質溶液（オルトフェニレンジアミン
０．４mg／ml及び０．０１％過酸化水素の０．１Ｍクエ
ン酸リン酸緩衝液、pH５．０）を添加し、２５℃で３０
分間反応させた。４．５Ｍ硫酸５０μl を加えて反応を
停止させた後、４９２nmにおける吸光度を測定した。そ
の結果、表３に示す如く、コーティング用モノクローナ
ル抗体としてＰＣＩ−Ａ４６を用い、標識用モノクロー
ナル抗体としてＰＣＩ−Ａ３９、ＰＣＩ−Ａ１６９、Ｐ
ＣＩ−Ａ１７６、ＰＣＩ−Ａ１８０を用いた場合、及び
コーティング用モノクローナル抗体としてＰＣＩ−Ａ１
７６を用い、標識用モノクローナル抗体としてＰＣＩ−
Ａ４６、ＰＣＩ−Ａ１８０を用いた場合には、５〜１０
０ng／mlの範囲のＰＣＩを検出できる。
【００４１】
【表３】
【００４２】また、コーティング用モノクローナル抗体
としてＰＣＩ−Ａ４６及びＰＣＩ−Ａ１７６を用い、標
識用モノクローナル抗体としてＰＣＩ−Ａ１８０を用い
た場合の検量線は、図１に示す如く極めて感度が高く、
しかも良好な直線性を示した。また、コーティング用モ
ノクローナル抗体としてＰＣＩ−Ａ４６を用い、標識用
モノクローナル抗体としてＰＣＩ−Ａ３９、ＰＣＩ−Ａ
１６９及びＰＣＩ−Ａ１７６を用いた場合の検量線は図
２に示す如く、良好な直線性を示した。
としてＰＣＩ−Ａ４６及びＰＣＩ−Ａ１７６を用い、標
識用モノクローナル抗体としてＰＣＩ−Ａ１８０を用い
た場合の検量線は、図１に示す如く極めて感度が高く、
しかも良好な直線性を示した。また、コーティング用モ
ノクローナル抗体としてＰＣＩ−Ａ４６を用い、標識用
モノクローナル抗体としてＰＣＩ−Ａ３９、ＰＣＩ−Ａ
１６９及びＰＣＩ−Ａ１７６を用いた場合の検量線は図
２に示す如く、良好な直線性を示した。
【図１】参考例２のＰＣＩ測定法におけるＰＣＩ濃度と
吸光度（４９２nm）との関係を示す図面である。
吸光度（４９２nm）との関係を示す図面である。
【図２】参考例２のＰＣＩ測定法におけるＰＣＩ濃度と
吸光度（４９２nm）との関係を示す図面である。
吸光度（４９２nm）との関係を示す図面である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 33/577 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (1)
- 【請求項１】 下記の性質； （１）分子量（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法，還元状態） ３４，０００±２，０００ （２）等電点（アンフォライトを用いる等電点カラム電
気泳動法） ４．７±０．１ （３）安定性 イ）５０℃、３０分加熱処理で失活 ロ）pH４〜１０で安定 ハ）血漿中３７℃、３０分で安定 （４）作用 イ）カルシウム再加凝固時間を延長 ロ）プロトロンビン時間を延長 ハ）活性化部分トロンボプラスチン時間を延長 （５）アミノ酸分析 アミノ酸分析で、アスパラギン酸、スレオニン、セリ
ン、グルタミン酸、プロリン、グリシン、アラニン、１
／２シスチン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロ
イシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、リ
ジン及びアルギニンの存在が認められる。 を有するヒト胎盤由来の抗血液凝固活性物質に対して特
異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7173070A JP2613188B2 (ja) | 1995-07-10 | 1995-07-10 | 抗ｐｃｉモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7173070A JP2613188B2 (ja) | 1995-07-10 | 1995-07-10 | 抗ｐｃｉモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61269588A Division JPH08840B2 (ja) | 1986-11-14 | 1986-11-14 | 抗ｐｃｉモノクローナル抗体、これを用いた抗ｐｃｉの精製法及び免疫学的測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08187082A JPH08187082A (ja) | 1996-07-23 |
| JP2613188B2 true JP2613188B2 (ja) | 1997-05-21 |
Family
ID=15953654
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7173070A Expired - Fee Related JP2613188B2 (ja) | 1995-07-10 | 1995-07-10 | 抗ｐｃｉモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2613188B2 (ja) |
-
1995
- 1995-07-10 JP JP7173070A patent/JP2613188B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH08187082A (ja) | 1996-07-23 |
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