JPS62210984A - 犬のc−反応性蛋白に対するモノクロ−ナル抗体産生ハイブリド−マとその抗体を用いた犬c−反応性蛋白の分離精製法 - Google Patents

犬のc−反応性蛋白に対するモノクロ−ナル抗体産生ハイブリド−マとその抗体を用いた犬c−反応性蛋白の分離精製法

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JPS62210984A
JPS62210984A JP61054113A JP5411386A JPS62210984A JP S62210984 A JPS62210984 A JP S62210984A JP 61054113 A JP61054113 A JP 61054113A JP 5411386 A JP5411386 A JP 5411386A JP S62210984 A JPS62210984 A JP S62210984A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
canine
reactive protein
crp
antibody
mouse
Prior art date
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Pending
Application number
JP61054113A
Other languages
English (en)
Inventor
Shigetaka Shibata
柴田 重孝
Shizuo Yamamoto
静雄 山本
Tetsuya Sakano
阪野 哲也
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Federation of Agricultural Cooperative Associations
Original Assignee
National Federation of Agricultural Cooperative Associations
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Publication date
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  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はモノクローナル抗犬C−反応性蛋白抗体を産す
るハイブリドーマと、犬の血清等から犬のC−反応性蛋
白を分離精製する方法に関する。
C−反応性蛋白(C−Reactive Protei
n 。
以下CRPと略記)は人では急性炎症時や組織破壊時の
病態把循の指標として必須の検査項目の一つとされてい
る、 獣医学ではCRPについてその存在すら知られの でおらず存−生理学的意義についての報告もみられない
発明者等は初めて犬の血清よりCRPを分離し、その物
理化学的性状を明らかにし得た。
犬のCRPは人のCRPと分子量、等電点、熱に対する
強度等四らかに差のある新発見の作用蛋白質であること
を知った。同時に犬CRPも又大の炎症や組織破壊に伴
って増加し、回復に伴って減少し臨床面で極めて有力な
病態把握の指標となる蛋白質であることを報告済みであ
る。
発明の目的 犬のCRPと反応する特異的な抗体を産生ずるハイブリ
ドーマを作出することと、その抗体を用いて抗原である
CRPを高純度かつ高収率で分離精製することを目的と
した。
発明の構成1 1、 モノクローナル抗犬CRP抗体産生ハイブリドー
マの作出 犬CRPあるいは犬のCRPを含有する分画とフロイン
ト完全アジュバントを混合して得られる混合物でマウス
を免疫し、マウスより摘出した肝臓から採取した肝臓リ
ンパ球とマウス骨髄腫細胞(ミエローマ細胞)とを公知
の方法で融合させて抗犬CRP抗体産生バイブリドiマ
を得る。
実施例 犬CRPあるいは犬のCRPを含有する分画と、フロイ
ント完全アジュバントを当量混合して得られる当量混合
物を6〜8週令のマウスの腹腔に0.2Wll宛接種、
3週及び4週後に同様に接種、最後の3日間は連続して
接種し最後の免疫後3〜7日目白目出した肝臓からリン
パ球を採取する。
IJIILH,リンパ球とマウス骨髄腫細胞5P210
−Ay/14 (以下ミエローマ細胞)とを7対1の割
合に混合し、融合促進剤として分子量4.000のガス
クロマトグラフィー用ポリエチレングリコール(メルク
社製)をおよそ1分間作用させた。
この細胞浮遊液を1.00Or、p、mで5分間遠心し
てポリエチレングリコールを含む上清を除き、10%牛
脂児血清を含むHA T培地(ヒポキサンチン、アミノ
ブチリン、チミヂン)を加え細胞数が4×1067m1
になるよう再浮遊させ、之を96°穴培養用プレートに
まき、5%炭酸ガスを含んだ37℃の温度に設定した条
件下で培養を行った。
ハイブリドーマのコロニーが大きくなったら細胞を分散
させ細胞数が十分量になるまで培養を続ける。
細胞数が十分な増殖をしめした段階で培養上清中のハイ
ブリドーマのモノクローナル抗体の産生をエライ晶(E
L I SA )でチェックした。抗体産生を示した穴
のハイブリドーマにつき限界希釈法によりクローニング
を行った。
ハイブリドーマのコロニー形成率・・・・・・92%抗
体産生を示したハイブリドーマを96穴プレート上で増
殖させ、十分に増殖したものを24穴のプレート上に移
し、10%牛脂児血清を含むHT培地(ヒポキサンチン
、チミヂン)中で培養を継続しハイブリドーマが1〜3
×10/mlに増殖した段階で限界希釈法によるクロー
ニングを行った。
限界希釈法には、発育促進のためのフィーダー細胞とし
てマウスの胸腺細胞を1x 10 /ml加え浮遊させ
たHT培地(ヒポキサンチン+チミジン+10%牛脂児
血清を含むギブコRPMI 1640培地)で希釈を行
いハイブリドーマが計算1各大当り1ケになるように分
注してハイブリドーマの単一コロニーを得た。
この操作を3回行いモノクローナル化された特異抗体産
生ハイブリドーマを得た。
上述のようにして得られたハイブリドーマは公知の方法
に従ってHT培地中で培養し得られた抗体産生−ハイブ
リドーマを事前にブリスタンを投与したマウスの腹腔内
に接種し、1〜2週後に腹水を採取した。
これらの腹水を採取するか、或は培地中で大量に培養し
てその上清液を回収し、硫安で塩析し得られた沈澱蛋白
をブロティメ(ファローPf″B又は陰イオン交換体を
用いて精製することによりモノクローナル抗犬CRP抗
体を得ることができた。
これらの結果から発明者等の得たハイブリドーマは発明
者等が犬において初めて分離しその作用を報告した特異
な蛋白質犬CRPに対する抗体を産生ずる新生酸物であ
ることが知られる。
本発明では上述のようにして形成したハイブリドーマが
産生ずるモノクローナル抗犬CRP抗体を、アフィニテ
ィークロマトグラフィー用担体のような不溶性担体、例
えばCNB−アクチベイテラドセファローズ4B(ファ
ルマシアファインケミカルズ)と公知の方法により結合
させ固定し、アフィニティーカラムとして犬血清からの
CRPの分離、精製に用いた。
モノクローナル抗犬CRP抗体をアフィニティーゲルの
ような担体に固定し得たものは0.1%アジ化ナトリウ
ムを含むpH8,0の食塩加リン酸緩衝液(PBS)中
に分散させておけば4%’Cの温度下で6〜12ケ月程
度保存することが可能となる。
該アフィニティーカラムに25℃以下の温度、好ましく
は4℃以下で試料を通液してカラムに対する非吸着分画
を溶出させた後pH8,0の食塩加リン酸緩衝液で0、
D、値が0.002以下になるまで洗浄し、0.05 
M 、 pH4,8以下のグリシン塩酸緩衝液で溶出し
て、抗体に吸着している犬CRPを解離させる。得られ
たCRP分画は直ちにアルカリ剤を加えて中性に戻す。
好ましくは中和に用いる適量のアルカリ剤を加えた試験
管内に解離した溶出液を採取する。本発明に従ってモノ
クローナル抗犬CRP抗体を固定したアフィニティーカ
ラムを用いて犬血清から犬CRPを分離精製すると従来
の方法のように各種クロマトグラフィーを行う必要がな
く、−−i湖=山は、アフィニティーカラムに1回通す
のみで犬血清から犬CRPを容易に分離し得る。
得られた犬CRPは薄層ディスク電気泳動法で分画し銀
染色を行った結果単一なバンドが見られ、他成分の混入
が認められず純度の高いものであることを知った。
その回収率は95%以上であった。
この分離精製した犬CRPをフロイント完全アジュバン
トと共に家兎に6〜7回免疫して得た抗血清は犬CRP
と反応する特異抗血清であった。
よって本発明によって渇られた犬CRPの純度はほぼ1
00%と判断した。
発明の効果 本発明の方法は、生物学的親和力という極めて特異性の
高い相互作用を利用した犬CRPの分離精製法で従来の
物理、化学的方法とは本質的に異なったものである。末
法によって初めて高純度の犬CRPを効率よく提供が可
能となった。
発明者等は先に犬において今迄知られていなかった特異
蛋白質として所謂穴CRPを初めて分離、その物理化学
的性状を明らかにし、この犬CRPが炎症時疾患の病態
把握の指標となることを報告した。(特許出願中) 更に本発明によって高純度の犬CRPを単離し、その抗
体の入手を容易ならしめたことは犬の疾病の診断、予後
判定に際して貢献するところが極めて大きいものと思わ
れる。
以上

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)犬C−反応性蛋白で免疫したマウスの膵臓リンパ
    球とマウスの骨髄腫細胞とを融合させて成るモノクロー
    ナル抗犬C反応性蛋白抗体産生ハイブリドーマの製法。
  2. (2)モノクローナル抗犬C−反応性蛋白抗体を不溶性
    の担体に吸着させて成生したアフイニテイークロマトグ
    ラフイー用カラムを用いて犬血清、腹水ならびに胸水か
    らC−反応性蛋白を分離、精製する方法。
  3. (3)不溶性の担体がアフイニテイーゲルである特許請
    求の範囲第2項記載の方法。
  4. (4)アフイニテイーカラムに吸着した犬C−反応性蛋
    白の溶出をpH4.3以下、好ましくはpH4.3〜2
    .3で行い、ついで得られた犬C−反応性蛋白分画のp
    Hを直ちに中性に戻す特許請求の範囲第2項記載の方法
JP61054113A 1986-03-12 1986-03-12 犬のc−反応性蛋白に対するモノクロ−ナル抗体産生ハイブリド−マとその抗体を用いた犬c−反応性蛋白の分離精製法 Pending JPS62210984A (ja)

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