JPS62210984A - 犬のｃ−反応性蛋白に対するモノクロ−ナル抗体産生ハイブリド−マとその抗体を用いた犬ｃ−反応性蛋白の分離精製法 - Google Patents
犬のｃ−反応性蛋白に対するモノクロ−ナル抗体産生ハイブリド−マとその抗体を用いた犬ｃ−反応性蛋白の分離精製法Info
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- JPS62210984A JPS62210984A JP61054113A JP5411386A JPS62210984A JP S62210984 A JPS62210984 A JP S62210984A JP 61054113 A JP61054113 A JP 61054113A JP 5411386 A JP5411386 A JP 5411386A JP S62210984 A JPS62210984 A JP S62210984A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はモノクローナル抗犬Ｃ−反応性蛋白抗体を産す
るハイブリドーマと、犬の血清等から犬のＣ−反応性蛋
白を分離精製する方法に関する。
るハイブリドーマと、犬の血清等から犬のＣ−反応性蛋
白を分離精製する方法に関する。
Ｃ−反応性蛋白（Ｃ−Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ 。
ｎ 。
以下ＣＲＰと略記）は人では急性炎症時や組織破壊時の
病態把循の指標として必須の検査項目の一つとされてい
る、 獣医学ではＣＲＰについてその存在すら知られの でおらず存−生理学的意義についての報告もみられない
。
病態把循の指標として必須の検査項目の一つとされてい
る、 獣医学ではＣＲＰについてその存在すら知られの でおらず存−生理学的意義についての報告もみられない
。
発明者等は初めて犬の血清よりＣＲＰを分離し、その物
理化学的性状を明らかにし得た。
理化学的性状を明らかにし得た。
犬のＣＲＰは人のＣＲＰと分子量、等電点、熱に対する
強度等四らかに差のある新発見の作用蛋白質であること
を知った。同時に犬ＣＲＰも又大の炎症や組織破壊に伴
って増加し、回復に伴って減少し臨床面で極めて有力な
病態把握の指標となる蛋白質であることを報告済みであ
る。
強度等四らかに差のある新発見の作用蛋白質であること
を知った。同時に犬ＣＲＰも又大の炎症や組織破壊に伴
って増加し、回復に伴って減少し臨床面で極めて有力な
病態把握の指標となる蛋白質であることを報告済みであ
る。
発明の目的
犬のＣＲＰと反応する特異的な抗体を産生ずるハイブリ
ドーマを作出することと、その抗体を用いて抗原である
ＣＲＰを高純度かつ高収率で分離精製することを目的と
した。
ドーマを作出することと、その抗体を用いて抗原である
ＣＲＰを高純度かつ高収率で分離精製することを目的と
した。
発明の構成１
１、 モノクローナル抗犬ＣＲＰ抗体産生ハイブリドー
マの作出 犬ＣＲＰあるいは犬のＣＲＰを含有する分画とフロイン
ト完全アジュバントを混合して得られる混合物でマウス
を免疫し、マウスより摘出した肝臓から採取した肝臓リ
ンパ球とマウス骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とを公知
の方法で融合させて抗犬ＣＲＰ抗体産生バイブリドｉマ
を得る。
マの作出 犬ＣＲＰあるいは犬のＣＲＰを含有する分画とフロイン
ト完全アジュバントを混合して得られる混合物でマウス
を免疫し、マウスより摘出した肝臓から採取した肝臓リ
ンパ球とマウス骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とを公知
の方法で融合させて抗犬ＣＲＰ抗体産生バイブリドｉマ
を得る。
実施例
犬ＣＲＰあるいは犬のＣＲＰを含有する分画と、フロイ
ント完全アジュバントを当量混合して得られる当量混合
物を６〜８週令のマウスの腹腔に０．２Ｗｌｌ宛接種、
３週及び４週後に同様に接種、最後の３日間は連続して
接種し最後の免疫後３〜７日目白目出した肝臓からリン
パ球を採取する。
ント完全アジュバントを当量混合して得られる当量混合
物を６〜８週令のマウスの腹腔に０．２Ｗｌｌ宛接種、
３週及び４週後に同様に接種、最後の３日間は連続して
接種し最後の免疫後３〜７日目白目出した肝臓からリン
パ球を採取する。
ＩＪＩＩＬＨ，リンパ球とマウス骨髄腫細胞５Ｐ２１０
−Ａｙ／１４ （以下ミエローマ細胞）とを７対１の割
合に混合し、融合促進剤として分子量４．０００のガス
クロマトグラフィー用ポリエチレングリコール（メルク
社製）をおよそ１分間作用させた。
−Ａｙ／１４ （以下ミエローマ細胞）とを７対１の割
合に混合し、融合促進剤として分子量４．０００のガス
クロマトグラフィー用ポリエチレングリコール（メルク
社製）をおよそ１分間作用させた。
この細胞浮遊液を１．００Ｏｒ、ｐ、ｍで５分間遠心し
てポリエチレングリコールを含む上清を除き、１０％牛
脂児血清を含むＨＡ Ｔ培地（ヒポキサンチン、アミノ
ブチリン、チミヂン）を加え細胞数が４×１０６７ｍ１
になるよう再浮遊させ、之を９６°穴培養用プレートに
まき、５％炭酸ガスを含んだ３７℃の温度に設定した条
件下で培養を行った。
てポリエチレングリコールを含む上清を除き、１０％牛
脂児血清を含むＨＡ Ｔ培地（ヒポキサンチン、アミノ
ブチリン、チミヂン）を加え細胞数が４×１０６７ｍ１
になるよう再浮遊させ、之を９６°穴培養用プレートに
まき、５％炭酸ガスを含んだ３７℃の温度に設定した条
件下で培養を行った。
ハイブリドーマのコロニーが大きくなったら細胞を分散
させ細胞数が十分量になるまで培養を続ける。
させ細胞数が十分量になるまで培養を続ける。
細胞数が十分な増殖をしめした段階で培養上清中のハイ
ブリドーマのモノクローナル抗体の産生をエライ晶（Ｅ
Ｌ Ｉ ＳＡ ）でチェックした。抗体産生を示した穴
のハイブリドーマにつき限界希釈法によりクローニング
を行った。
ブリドーマのモノクローナル抗体の産生をエライ晶（Ｅ
Ｌ Ｉ ＳＡ ）でチェックした。抗体産生を示した穴
のハイブリドーマにつき限界希釈法によりクローニング
を行った。
ハイブリドーマのコロニー形成率・・・・・・９２％抗
体産生を示したハイブリドーマを９６穴プレート上で増
殖させ、十分に増殖したものを２４穴のプレート上に移
し、１０％牛脂児血清を含むＨＴ培地（ヒポキサンチン
、チミヂン）中で培養を継続しハイブリドーマが１〜３
×１０／ｍｌに増殖した段階で限界希釈法によるクロー
ニングを行った。
体産生を示したハイブリドーマを９６穴プレート上で増
殖させ、十分に増殖したものを２４穴のプレート上に移
し、１０％牛脂児血清を含むＨＴ培地（ヒポキサンチン
、チミヂン）中で培養を継続しハイブリドーマが１〜３
×１０／ｍｌに増殖した段階で限界希釈法によるクロー
ニングを行った。
限界希釈法には、発育促進のためのフィーダー細胞とし
てマウスの胸腺細胞を１ｘ １０ ／ｍｌ加え浮遊させ
たＨＴ培地（ヒポキサンチン＋チミジン＋１０％牛脂児
血清を含むギブコＲＰＭＩ １６４０培地）で希釈を行
いハイブリドーマが計算１各大当り１ケになるように分
注してハイブリドーマの単一コロニーを得た。
てマウスの胸腺細胞を１ｘ １０ ／ｍｌ加え浮遊させ
たＨＴ培地（ヒポキサンチン＋チミジン＋１０％牛脂児
血清を含むギブコＲＰＭＩ １６４０培地）で希釈を行
いハイブリドーマが計算１各大当り１ケになるように分
注してハイブリドーマの単一コロニーを得た。
この操作を３回行いモノクローナル化された特異抗体産
生ハイブリドーマを得た。
生ハイブリドーマを得た。
上述のようにして得られたハイブリドーマは公知の方法
に従ってＨＴ培地中で培養し得られた抗体産生−ハイブ
リドーマを事前にブリスタンを投与したマウスの腹腔内
に接種し、１〜２週後に腹水を採取した。
に従ってＨＴ培地中で培養し得られた抗体産生−ハイブ
リドーマを事前にブリスタンを投与したマウスの腹腔内
に接種し、１〜２週後に腹水を採取した。
これらの腹水を採取するか、或は培地中で大量に培養し
てその上清液を回収し、硫安で塩析し得られた沈澱蛋白
をブロティメ（ファローＰｆ″Ｂ又は陰イオン交換体を
用いて精製することによりモノクローナル抗犬ＣＲＰ抗
体を得ることができた。
てその上清液を回収し、硫安で塩析し得られた沈澱蛋白
をブロティメ（ファローＰｆ″Ｂ又は陰イオン交換体を
用いて精製することによりモノクローナル抗犬ＣＲＰ抗
体を得ることができた。
これらの結果から発明者等の得たハイブリドーマは発明
者等が犬において初めて分離しその作用を報告した特異
な蛋白質犬ＣＲＰに対する抗体を産生ずる新生酸物であ
ることが知られる。
者等が犬において初めて分離しその作用を報告した特異
な蛋白質犬ＣＲＰに対する抗体を産生ずる新生酸物であ
ることが知られる。
本発明では上述のようにして形成したハイブリドーマが
産生ずるモノクローナル抗犬ＣＲＰ抗体を、アフィニテ
ィークロマトグラフィー用担体のような不溶性担体、例
えばＣＮＢ−アクチベイテラドセファローズ４Ｂ（ファ
ルマシアファインケミカルズ）と公知の方法により結合
させ固定し、アフィニティーカラムとして犬血清からの
ＣＲＰの分離、精製に用いた。
産生ずるモノクローナル抗犬ＣＲＰ抗体を、アフィニテ
ィークロマトグラフィー用担体のような不溶性担体、例
えばＣＮＢ−アクチベイテラドセファローズ４Ｂ（ファ
ルマシアファインケミカルズ）と公知の方法により結合
させ固定し、アフィニティーカラムとして犬血清からの
ＣＲＰの分離、精製に用いた。
モノクローナル抗犬ＣＲＰ抗体をアフィニティーゲルの
ような担体に固定し得たものは０．１％アジ化ナトリウ
ムを含むｐＨ８，０の食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中
に分散させておけば４％’Ｃの温度下で６〜１２ケ月程
度保存することが可能となる。
ような担体に固定し得たものは０．１％アジ化ナトリウ
ムを含むｐＨ８，０の食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中
に分散させておけば４％’Ｃの温度下で６〜１２ケ月程
度保存することが可能となる。
該アフィニティーカラムに２５℃以下の温度、好ましく
は４℃以下で試料を通液してカラムに対する非吸着分画
を溶出させた後ｐＨ８，０の食塩加リン酸緩衝液で０、
Ｄ、値が０．００２以下になるまで洗浄し、０．０５
Ｍ 、 ｐＨ４，８以下のグリシン塩酸緩衝液で溶出し
て、抗体に吸着している犬ＣＲＰを解離させる。得られ
たＣＲＰ分画は直ちにアルカリ剤を加えて中性に戻す。
は４℃以下で試料を通液してカラムに対する非吸着分画
を溶出させた後ｐＨ８，０の食塩加リン酸緩衝液で０、
Ｄ、値が０．００２以下になるまで洗浄し、０．０５
Ｍ 、 ｐＨ４，８以下のグリシン塩酸緩衝液で溶出し
て、抗体に吸着している犬ＣＲＰを解離させる。得られ
たＣＲＰ分画は直ちにアルカリ剤を加えて中性に戻す。
好ましくは中和に用いる適量のアルカリ剤を加えた試験
管内に解離した溶出液を採取する。本発明に従ってモノ
クローナル抗犬ＣＲＰ抗体を固定したアフィニティーカ
ラムを用いて犬血清から犬ＣＲＰを分離精製すると従来
の方法のように各種クロマトグラフィーを行う必要がな
く、−−ｉ湖＝山は、アフィニティーカラムに１回通す
のみで犬血清から犬ＣＲＰを容易に分離し得る。
管内に解離した溶出液を採取する。本発明に従ってモノ
クローナル抗犬ＣＲＰ抗体を固定したアフィニティーカ
ラムを用いて犬血清から犬ＣＲＰを分離精製すると従来
の方法のように各種クロマトグラフィーを行う必要がな
く、−−ｉ湖＝山は、アフィニティーカラムに１回通す
のみで犬血清から犬ＣＲＰを容易に分離し得る。
得られた犬ＣＲＰは薄層ディスク電気泳動法で分画し銀
染色を行った結果単一なバンドが見られ、他成分の混入
が認められず純度の高いものであることを知った。
染色を行った結果単一なバンドが見られ、他成分の混入
が認められず純度の高いものであることを知った。
その回収率は９５％以上であった。
この分離精製した犬ＣＲＰをフロイント完全アジュバン
トと共に家兎に６〜７回免疫して得た抗血清は犬ＣＲＰ
と反応する特異抗血清であった。
トと共に家兎に６〜７回免疫して得た抗血清は犬ＣＲＰ
と反応する特異抗血清であった。
よって本発明によって渇られた犬ＣＲＰの純度はほぼ１
００％と判断した。
００％と判断した。
発明の効果
本発明の方法は、生物学的親和力という極めて特異性の
高い相互作用を利用した犬ＣＲＰの分離精製法で従来の
物理、化学的方法とは本質的に異なったものである。末
法によって初めて高純度の犬ＣＲＰを効率よく提供が可
能となった。
高い相互作用を利用した犬ＣＲＰの分離精製法で従来の
物理、化学的方法とは本質的に異なったものである。末
法によって初めて高純度の犬ＣＲＰを効率よく提供が可
能となった。
発明者等は先に犬において今迄知られていなかった特異
蛋白質として所謂穴ＣＲＰを初めて分離、その物理化学
的性状を明らかにし、この犬ＣＲＰが炎症時疾患の病態
把握の指標となることを報告した。（特許出願中） 更に本発明によって高純度の犬ＣＲＰを単離し、その抗
体の入手を容易ならしめたことは犬の疾病の診断、予後
判定に際して貢献するところが極めて大きいものと思わ
れる。
蛋白質として所謂穴ＣＲＰを初めて分離、その物理化学
的性状を明らかにし、この犬ＣＲＰが炎症時疾患の病態
把握の指標となることを報告した。（特許出願中） 更に本発明によって高純度の犬ＣＲＰを単離し、その抗
体の入手を容易ならしめたことは犬の疾病の診断、予後
判定に際して貢献するところが極めて大きいものと思わ
れる。
以上
Claims (4)
- （１）犬Ｃ−反応性蛋白で免疫したマウスの膵臓リンパ
球とマウスの骨髄腫細胞とを融合させて成るモノクロー
ナル抗犬Ｃ反応性蛋白抗体産生ハイブリドーマの製法。 - （２）モノクローナル抗犬Ｃ−反応性蛋白抗体を不溶性
の担体に吸着させて成生したアフイニテイークロマトグ
ラフイー用カラムを用いて犬血清、腹水ならびに胸水か
らＣ−反応性蛋白を分離、精製する方法。 - （３）不溶性の担体がアフイニテイーゲルである特許請
求の範囲第２項記載の方法。 - （４）アフイニテイーカラムに吸着した犬Ｃ−反応性蛋
白の溶出をｐＨ４．３以下、好ましくはｐＨ４．３〜２
．３で行い、ついで得られた犬Ｃ−反応性蛋白分画のｐ
Ｈを直ちに中性に戻す特許請求の範囲第２項記載の方法
。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61054113A JPS62210984A (ja) | 1986-03-12 | 1986-03-12 | 犬のｃ−反応性蛋白に対するモノクロ−ナル抗体産生ハイブリド−マとその抗体を用いた犬ｃ−反応性蛋白の分離精製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61054113A JPS62210984A (ja) | 1986-03-12 | 1986-03-12 | 犬のｃ−反応性蛋白に対するモノクロ−ナル抗体産生ハイブリド−マとその抗体を用いた犬ｃ−反応性蛋白の分離精製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62210984A true JPS62210984A (ja) | 1987-09-17 |
Family
ID=12961536
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61054113A Pending JPS62210984A (ja) | 1986-03-12 | 1986-03-12 | 犬のｃ−反応性蛋白に対するモノクロ−ナル抗体産生ハイブリド−マとその抗体を用いた犬ｃ−反応性蛋白の分離精製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62210984A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990012884A1 (fr) * | 1989-04-25 | 1990-11-01 | Iatron Laboratories, Inc. | Anticorps monoclonal inhibiteur de proteines c-reactives |
| US5500345A (en) * | 1989-04-25 | 1996-03-19 | Iatron Laboratories, Inc. | Hybridomas producing monoclonal antibodies specific for C-reactive protein and methods for detection of C-reactive protein |
| EP2141180A1 (en) | 2008-06-30 | 2010-01-06 | Fujifilm Corporation | Antibody recognizing canine CRP and human CRP |
| EP2336158A1 (en) | 2009-12-21 | 2011-06-22 | Fujifilm Corporation | Dry analytical element for measurement of canine CRP |
-
1986
- 1986-03-12 JP JP61054113A patent/JPS62210984A/ja active Pending
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CLIN CHIM.ACTA=1970 * |
| IMMUNOLOGY=1984 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JP2010006774A (ja) * | 2008-06-30 | 2010-01-14 | Fujifilm Corp | 犬ｃｒｐ及び人ｃｒｐを認識する抗体 |
| EP2336158A1 (en) | 2009-12-21 | 2011-06-22 | Fujifilm Corporation | Dry analytical element for measurement of canine CRP |
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