JPS6125482A - モノクロ−ナル抗ウシラクトフエリン抗体産生ハイブリド−マ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上皇租■公！ 本発明は、モノクローナル抗ウシラクトフェリン抗体を
産生ずるハイブリドーマに関する。

ラクトフェリンは乳汁などの外分泌液中に存在する鉄結
合性蛋白質であって、乳児の授乳において栄養的に著し
く有益であるばかりでなく、その鉄結合能の特性のため
腸管における鉄要求性の高い病原性細菌に対して強い静
菌作用を呈するという生理的効果を有するものである。

すなわち、ラクトフェリンは、乳汁に存在する免疫グロ
ブリンやりゾチームなどと共に感染防禦物質として栄養
学的のみならず、薬理学的にも重要な乳蛋白質といえる
。

従米肢血 上述したようなラクトフェリンの特性に鑑み、従来より
乳からラクトフェリンを分離、精製するための方法が種
々提案されている。しかしながら、ラクトフェリンは非
常に反応性に富んだ分子構造を有する蛋白質であり、か
つ他の乳蛋白質とも相互作用を示すため′、従来の方法
では純度の高いうクトフエリンを簡易にかつ有効に分離
精製して採取することは困難であった。

例えば、従来、乳から脂肪を分離した税脂乳よりｐＨ４
，６でカゼインを等電沈澱させることにより除去し、つ
いで得られる乳清画分を硫酸アンモニウムで塩析した画
分を純水に対して透析した後、イオン交換樹脂に数回通
して分離、精製する方法（Ｇｏｒｄｏｎ　ｅｔ　ａｌ、
：　ｒＢｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏ−ｐｈｙｓ、＾ｃｔａ＋
６０＋４１０〜４１），１９６２Ｊ及びＭｅｒｔｏｎ　
Ｌ、Ｇｌｏｖｅ　ｅｔ　ａｌ、：ｒＢｉｏｃｈｉｍ、Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、　１００．１５４〜１６２．
１９６５ＪまたはＪｏｈａｎｓｓｏｎ、Ｂ、Ｇ、ｅｔ　
ａｌ、：　ｒＡｃｔａ　Ｃｈｅｍ、５ｃａｎｄ。

２３．６８３，１９６９　Ｊ　）や上記方法においてイ
オン交換樹脂の代りにシリカ粒子を用いる方法（特開昭
５８−２８２３３号）及び上述のようにイオン交換樹脂
を通した後に、更に銅アフィニティークロマトグラフィ
ー処理を行なう方法（河方則裕、吉野芳夫等ｒ生化学会
講演予稿集、第１０５３頁、１９８３Ｊ　）が行なわれ
ているが、これらの方法は、いずれも操作が煩雑で、処
理に要する時間も長いため実用性に乏しいといえる。

更に、ラクトフェリンは乳中に存在する他の蛋白質と相
互作用を有するという特性のため、イオン交換樹脂を用
いる上掲の方法では乳中の免疫グロブリン等の他の蛋白
質の混入が避けられず、したがって、純度の高いラクト
フェリンを採取することが実際上困難であり、加うるに
、塩析及びイオン交換による処理を繰返して行なうため
に、ラクトフェリンの回収率の著しい低下が避けられな
いのみならず、ラクトフェリンを分離精製する過程で得
られる残留分に含まれる、ラクトフェリン以外の乳蛋白
質及びその他の乳成分を回収して再利用することが実際
上不可能であるという欠点がみられる。

溌１）２Ｊｌ直 本発明は、ラクトフェリンに関する従来技術の現状に鑑
みてなされたものであって、牛乳からウシラクトフェリ
ンを高純度でかつ高収率で有利に分離、精製するのに用
い得るモノクローナル抗ウシラクトフェリン抗体を産生
するハイブリドーマを提供することを目的とする。以下
本発明の詳細な説明する。

血ユ豊盪底 本発明の構成上の特徴は、ウシラクトフェリンで免疫し
たマウスの脾臓リンパ球と、マウスの骨髄腫細胞とを融
合させて得られるモノクローナル抗ウシラクトフェリン
抗体産生ハイブリドーマにある。

従来、免疫されたマウスの脾臓リンパ球とマウスの骨髄
腫細胞を融合させることによりモノクローナルな抗体産
生のハイブリドーマを得る手法は、Ｇ、にδｈ］ｅｒ、
　Ｃ，ＭＨｓｔｅｉｎ等により発表（Ｎａｔｕｒｅ、２
５６゜４９５〜４９７．１９７５）されて以来、細胞融
合によるハイブリドーマの形成および得られたハイブリ
ドーマ産生の抗体についての科学的研究及びその利用に
関する報告が多くなされている。

しかしながら、このようなハイブリドーマを形成するた
めの一般的手法を特定なモノクローナル抗体産生の新規
なハイブリドーマの形成に適用する場合、操作工種々の
困難な問題がみられる。すなわち、ハイブリドーマの形
成に当って抗原として用いる蛋白質の相違により、その
後の免疫、融合の操作上特別な工夫を要し、かつ、所望
のハイブリドーマを単離するためのスクリーニング技術
に影響を与えるからである。

因に、本発明者らはさきにヒトラクトフェリンに対する
高純度なモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを形成
させる発明をしたが（特願昭５９−２２４１２）、同一
の名前を持つラクトフェリンであっても種によってその
一次構造は異なる。従って、ヒトラクトフェリンに対す
るモノクローナル抗体はウシラクトフェリンとは反応し
得ない。このように類似の抗原蛋白質であってもそれに
対するモツクローナル抗体産生ハイブリドーマを取得す
るためにはそれなりの工夫をこらす必要がある。

本発明に係るモノクローナル抗ウシラクトフェリン抗体
産生ハイブリドーマは、ウシラクトフェリンで免疫した
マウスから摘出した脾臓より採取した脾臓リンパ球とマ
ウスの骨髄腫細胞を公知の手法で融合させることにより
形成し得る。次に上記ハイブリドーマの形成法について
説明する。

ヒトラクトフェリンはシグマ社から純度９８％のものが
市販されているが、ウシラクトフェリンは市販されてい
ない。そこで、まずウシ初乳より等電点沈澱によりカゼ
インを除き、残ったホエー画分から公知の方法（例えば
Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ、Ｂ、Ｇ、ｅｔ　ａｔ。

：　Ａｃｔａ　Ｃｈｅｍ、５ｃａｎｄ、２３＋６８３．
１９６９）に従って純度的６０％のウシラクトフェリン
を得た。

ついで、ウシラクトフェリンの溶液を調製しく一般に食
塩を含むリン酸緩（ｈ液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）　ｐＨ７，２を
用いる）、この溶液とフロイント・アジュハン）　（Ｆ
ｒｅｕｎｄ’ｓ　ａｄｊｕｖａｎｔ）を等量混合して得
られるエマルジョンを、マウス（一般に６〜８週令）の
腹腔内に２週問おきに３回免疫を行なう。この際用いる
ウシラクトフェリンは純度の高いものを用いなければな
らない。

そのためには、ウシラクトフェリン画分に含まれる主た
る不純物であるウシ免疫グロブリンに対する抗血清を用
いて免疫グロブリンを吸収してウシラクトフェリンの純
度を高めることが望ましい。

ウシラクトフェリンの純度が低いと目的とするハイブリ
ドーマを得にくい。すなわち、ウシラクトフェリンとウ
シ免疫グロブリンではウシ免疫グロブリンの方がずっと
免疫され易く、ウシラクトフェリンの抗体価が上らない
ためである。

本発明に使用するマウスの種類は特に限定されないが、
一般にはＢＡＬＢ／ｃ系のマウスを用いるとよい。

従来、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの形成に
用いられる脾臓リシパ球は、特定の抗原による最終免疫
後３〜４日目に摘出した脾臓から採取するのが一般的で
あるが、本発明において対象とするウシラクトフェリン
の場合には、上記最終免疫後３〜４日目ではマウスにお
ける抗体価の上昇が最高値に達せず、また脾臓リンパ球
中の抗体産生細胞の活性化が不充分であり、したがって
、目的とするモノクローナル抗ウシラクトフェリン抗体
産生ハイブリドーマの形成率が低くなる。

本発明者は、ウシラクトフェリンで最終免疫後６〜７日
目のマウスから摘出した脾臓から採取した脾臓リンパ球
を用いると上記ハイブリドーマの形成率が非常に高くな
ることを見出した。

上述のようにしてマウスの脾臓から採取した脾臓リンパ
球（以下肺細胞と称する）はマウス骨髄腫細胞（以下ミ
エローマ細胞と称する）と融合させる。

ここで用いるミエローマ細胞は特に限定されないが、Ｂ
　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ系マウスの牌細胞と融合させる場
合には、ＩｇＧのに鎮を分泌しないｓｐ２１０−Ａｇ１
４を用いるのが好ましい。融合方法は公知の手法に準じ
て行ない得るが、ミエローマ細胞として上記Ｓ　Ｐ　２
　／　０−Ａｇ１４を用いる場合には、融合促進剤（融
合誘導剤）の添加、混合及び希釈の各操作から成る融合
時間を５〜１５分、好ましくは９〜１）分の範囲内にす
ることが肝要である。

この場合、融合時間が５分より短いと融合が不完全とな
り、一方１５分を越えると融合促進剤として用いたポリ
エチレングリコールの被毒により細胞が死滅する。因に
、上記融合時間を９〜１）分の範囲にするとほぼ１００
％に近いコロニー形成率が得られる。また、ウジラクト
フェリンで免疫したＢＡＬＢ／ｃ系マウスの牌細胞と５
Ｐ２１０−Ａｇ１４を融合する場合には、融合促進剤と
してメルク社製ガスクロマトグラフィー用の分子量４０
００のポリエチレングリコールを濃度５０％で用いると
特に高いコロニー形成率（融合率）が得られる。

融合終了後、融合細胞を従来法にしたがって、ＨＴ培地
（ヒボキサンチン・チミジン・ｌＯ％ウシ胎児血清を含
むダルベツコ変法ＭＥＭ培地）に分散させ、ついで９６
穴マイクロタイタープレート上に撒布し、３７℃の温度
で５％炭酸ガス雰囲気下で培養し、その翌日よりＨＡＴ
培地（ヒボキサンチン・アミノプテリン・チミジン・１
０％ウシ胎児血清を含むダルベツコ変法ＭＥＭ培地）中
でハイブリドーマの選択を行なう。

ついでハイブリドーマのコロニーが充分に大きくなった
ところでソリッドフェイズ法（Ｓｏｌｉｄｐｈａｓｅ　
ｍｅｔｈｏｄ）に従ってスクリーニングを行ない、陽性
反応を示したハイブリドーマについて限界希釈法を用い
てクローニングを行なう。

なお、ソリッドフェイズ法は、可溶性の抗原を９６穴ソ
フトマイクロウエルに吸着させた後、ウシ血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）で上記ウェル中の非吸着部分をブロックし
、上記の培養液上清を各ウェルに入れて抗原と反応させ
、反応後各ウェルを充分洗い、ついで二次抗体としてビ
オチニル化させたマウス抗体に対する抗体を添加し、そ
の後アビジン及び螢光色素で標識したビオチンを反応さ
せて、目的とする抗体を螢光で検出して行なった。

ここで用いる可溶性の抗原は、なるべく高い純度のウシ
ラクトフェリンでなければならない。すなわち、ウシラ
クトフェリンの純度が低いと不純物抗原に対す°るハイ
ブリドーマに−も陽性を示し目的としているウシラクト
フェリンに対するモノクローナル抗体産生ハイブリドー
マを見つけ出すことが困難となるためである。

また、限界希釈法は、マウスの胸腺細胞１０”個とハイ
ブリドーマ５０個を１０Ｉｌｌｊ！のＨＴ培地に分散し
たものを、９６穴÷イクロタイタープレート上にハイブ
リドーマが各ウェル当り１個以下になるように散布して
ハイブリドーマの単一コロニーを得るように行なった。

なお、ハイブリドーマは細胞密度が低いと増殖できない
ので、マウスの胸腺細胞をフィーダー細胞（ｆｅｅｄｅ
ｒ　ｃｅｌｌ）として添加した。

上述のようなりローニングを３回以上繰返し行なってモ
ノクローン化されたハイブリドーマを得る。

次に、このようにして得られたモノクローナル抗ウシラ
クトフェリン抗体産生ハイブリドーマは、公知の手法に
従って、マウス腹腔内に投与し、その腹水を回収するか
、或は培地中で培養してその上清液を回収し、硫安沈澱
、陰イオン交換樹脂を用いて精製することにより、モノ
クローナル抗ウシラクトフェリン抗体を産生じ得る。

因に、本発明に係るハイブリドーマ産生の上記モノクロ
ーナル抗ウシラクトフェリン抗体を用いて牛乳からウシ
ラクトフェリンを分離、精製するには、該抗体を不溶性
の担体に固定化したアフィニテイカラムを用いて行なう
。

以下に実施例を示して本発明を更に具体的に説明する。

実施例 ウシラクトフェリンは従来方法（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ、
Ｂ、Ｇ。

ｅｔ　ａｌ、：　Ａｃｔａ　Ｃｈｅｍ、５ｃａｎｄ、２
３，６８３．１９６９）に従い、ウシ初乳よりイオン交
換樹脂を用いて分離精製した。尚、ウシラクトフェリン
の純度は６０％であった。

このウシラクトフェリン画分にウシ免疫グロブリン抗血
清を添加し、主たる不純物であるウシ免疫グロブリンを
吸収してウシラクトフェリンの純度を約９０％に上げた
。

このウシラクトフェリンを、食塩０．１５Ｍを含むリン
酸緩衝液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）　ｐＨ７，２に０．３％濃度に
なるように熔解し、この溶液にフロイント・アジュバン
ト（ディフコ社製）を等量混合してエマルジョンを作り
、得られたエマルジョンを６〜８週令のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ
　／　ｃ系腹腔内に投与し、免疫した。

この免疫を２週問おきに３回行ない、最終免疫後７日目
にマウスより脾臓を摘出し、これから肺細胞を採取した
。この肺細胞をＤＭＥＭ培地（ダルベツコ変法ＭＥＭ培
地）に分散し、マウス骨髄腫細胞Ｓ　Ｐ　２／　０−Ａ
ｇ　１４と２：１の割合で混合した。この混合液に５０
％ポリエチレングリコール（メルク社製、ガスクロマト
グラフィー用、分子量４０００）溶液を融合促進剤とし
て添加し、１０分間で融合を終了した。このようにして
得られた融合細胞を、遠心分離してポリエチレングリコ
ールを除いた後、ＨＴ培地中にｌＸ１０７個／ｎｕ以下
の細胞密度となるように分散し、ついで９６穴マイクロ
タイタープレートにまき、３７℃の温度で５％炭酸ガス
雰囲気下に培養を開始した。培養開始の翌日（第１８目
）よりＨＡＴ培地で半量交換を行ないつつ、１７７日目
ソリッドフェイズ法でスクリーニングを行なった。ハイ
ブリドーマのコロニー形成率は１００％、ウシラクトフ
ェリン陽性率は８．３％であった。

次に、陽性反応を示したハイブリドーマを２４穴マイク
ロタイタープレートに移し、細胞密度がｌＸＩＯ３個／
ｍｌｌに増殖した時点でクローニングを行なった。その
１に２週間ＨＴ培地中で培養し、単一コロニーを形成し
ているウェルを選んで二次スクリーニングを行なった。

このようなりローニングとスクリーニング操作を計３回
行ない、抗ウジラクトフェリン抗体を産生ずるハイブリ
ドーマのモノクローンを得た。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ウシラクトフエリンで免疫したマウスの脾臓リン
   パ球と、マウスの骨髄腫細胞とを融合させて成るモノク
   ローナル抗ウシラクトフエリン抗体産生ハイブリドーマ
   。
2. （２）脾臓リンパ球は、最終免疫してから６〜７日目に
   摘出したマウス脾臓から採取したものである特許請求の
   範囲第（１）項記載のハイブリドーマ。
3. （３）マウスの骨髄腫細胞がＳＰ２／０−Ａｇ１４であ
   る特許請求の範囲第（１）項記載のハイブリドーマ。