DE3524585A1 - Zur erzeugung eines monoklonalen antikoerpers gegen bovines lactoferrin faehiges hybridoma - Google Patents
Zur erzeugung eines monoklonalen antikoerpers gegen bovines lactoferrin faehiges hybridomaInfo
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Description
Anmelder: Snow Brand Milk Products Co., Ltd. 1-1, Naebo-cho 6-chome, Higashi-ku,
Sapporo-shi, Hokkaido, Japan
Zur Erzeugung eines monoklonalen Antikörpers gegen
bovines Lactoferrin fähiges Hybridoma
Die Erfindung betrifft ein Hybridoma, das fähig ist, einen monoklonalen Antikörper gegen bovines Lactoferrin
zu erzeugen, und das vorteilhaft für die Isolation von Lactoferrin aus Milch in einem hochreinen Zustand
und mit hoher Ausbeute eingesetzt werden kann.
Lactoferrin ist ein eisenbindendes Protein, das in nach außen sekretierten Fluiden wie Milch und dergleichen
gefunden wird. Es ist nicht nur bei der Ernährung von
Kindern vom Ernährungsstandpunkt aus in hohem Maße heilsam/ sondern es besitzt auch die physiologische
Wirkung, daß es eine bakteriostatisehe Wirkung auf
pathogene Bakterien ausübt, die in dem Intestinum auftreten,
und weist einen hohen Grad an Eisenbedarf wegen seiner charakteristischen eisenbindenden Fähigkeit
auf. Das heißt also, daß Lactoferrin als ein wichtiges Milchprotein angesehen werden kann, das nicht nur
als ein Nahrungsmittel dient, sondern auch eine pharmakologische
Signifikans als ein Anti-Infektionsmittel besitzt, in gleicher Weise wie in der Milch vorhandene
Immunglobuline und Lysozym.
Im Hinblick auf die vorstehend beschriebenen charakteristischen Eigenschaften von Lactoferrin wurden bereits
eine Anzahl von Verfahren zur Abtrennung von Lactoferrin von Milch und seine Reinigung vorgeschlagen. Da jedoch
Lactoferrin ein Protein mit einer hoch-reaktionsfähigen Molekularstruktur ist und auch zur Wechselwirkung
mit anderen Milchproteinen neigt, war es bisher schwierig, eine hoch-reine Form von Lactoferrin leicht
und mit gutem Wirkungsgrad nach herkömmlichen Verfahren zu isolieren.
So umfaßt beispielsweise ein herkömmliches Verfahren
zum Abtrennen und Reinigen von Lactoferrin, daß von Magermilch, von der Fett abgetrennt worden ist, durch
isoelektrische Ausfällung bei pH 4,6 Kasein abgetrennt wird, die entstehende Molkefraktion mit Ammoniumsulfat
ausgesalzt wird, die entstehende Fraktion gegen entionisiertes Wasser dialysiert wird und dann das Dialysat
mehrere Male durch ein Ionenaustauschharz geschickt
wird (Gordon et al.: Biochim. Biophys. Acta , 60, 410-411,
1 yίj2; Morton L. Gloves et al.: Biochim. Biophys. Acta,
100, 154-162, 1965; Johansson, B.G. et al.: Acta Chem. Scand., 23, 683, 1969). Weiterhin schließen Abwandlungen
des vorstehend beschriebenen Verfahrens das Verfahren ein, bei dem Silica-Teilchen anstelle des Ionenaustauschharzes
verwendet werden (Japanische Patent-Offenlegungsschrift No. 28233/1983) und das Verfahren, bei
dem, nachdem die Dialysatlösung durch ein Ionenaustauschharz geleitet worden ist, das entstehende Produkt weiterhin
der Kupfer-Affinitätschromatographie unterworfen wird (Norihiro Kawakata, Yoshio Yoshino, et al., Abstracts
of Lectures at the 1983 Annual Meeting of the Japan Biochemical Society, Seite 1053). Diese Verfahren
besitzen jedoch alle keine praktische Brauchbarkeit, da sie mühsame Verfahrensschritte und eine ungewöhnlich
lange Behandlungszeit erfordern.
Weiterhin kann bei den vorstehend beschriebenen Verfahren, bei denen ein Ionenaustauschharz verwendet wird,
die Verunreinigung des Produktes mit Immunglobulinen und anderen in der Milch vorhandenen Proteinen nicht
vermieden werden, da Lactoferrin die Eigenschaft besitzt, mit anderen in der Milch vorhandenen Proteinen
in Wechselwirkung zu treten. Demzufolge ist es schwierig, in der Praxis eine hoch-reine Form von Lactoferrin
zu isolieren. Darüber hinaus besitzen diese Verfahren auch die Nachteile, daß die wiederholte Behandlung
durch Aussalzen und Ionenaustausch nicht nur eine merkliche Verringerung in der Rückgewinnung von Lactoferrin
bewirken, sondern es auch praktisch unmöglich machen, andere Milchproteine (als Lactoferrin) und andere
Milchbestandteile, die in den Rückständen, die wäh-
BAD ORIGINAL
—4 .
rend der Separierung und Reinigung von Lactoferrin erhalten werden, vorhanden sind, zurückzugewinnen und
wiederzuverwenden.
Als ein Ergebnis der Untersuchungen, die zur Lösung der vorstehend beschriebenen, bei den bekannten Verfahren
zur Isolierung einer hoch-reinen Form von Lactoferrin aus Milch auftretenden Probleme durchgeführt
wurden, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung gefunden, daß sich ein monoklonaler Antikörper gegen
bovines Lactoferrin mit Lactoferrin spezifisch kombinieren kann und daß solch ein monoklonaler Antikörper
gegen bovines Lactoferrin durch eine Hybridzelle, ein Hybridoma, erzeugt wird, die durch Verschmelzen von
Milzlymphozyten von einer mit bovinem Lactoferrin immunisierten Maus mit Mäuse-Myelomzellen gebildet werden
kann.
Dementsprechend ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung,
ein Hybridoma zu schaffen, das fähig ist, einen monoklonalen Antikörper gegen bovines Lactoferrin zu
erzeugen, der mit Vorteil für die Isolation von bovinem Lactoferrin aus Milch in einem hoch-reinen Zustand
und mit hoher Ausbeute verwendet werden kann.
Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird gelöst durch ein Hybridoma, das fähig ist, einen monoklonalen
Antikörper gegen bovines Lactoferrin zu erzeugen, und sich spezifisch mit bovinem Lactoferrin kombinieren
kann, wobei dieses Hybridoma durch Verschmelzen von
Milzlymphozyten von einer mit bovinem Lactoferrin immunisierten Maus mit Mäuse-Myelomzellen erhalten wird,
und außerdem durch ein Verfahren zur Bildung des Hybridoma, d.h. dieser Hybridzelle.
Es folgt nun eine Beschreibung der Erfindung.
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein zur Erzeugung eines monoklonalen Antikörpers gegen
bovines Lactoferrin fähiges Hybridoma, das durch Verschmelzen von Milzlymphozyten von einer mit bovinem
Lactoferrin immunisierten Maus mit Mäuse-Myelomzellen erhalten wird, und ein Verfahren zur Bildung des Hybridoma.
Das Verfahren zur Bildung von Hybridomas, die monoklonale
Antikörper erzeugen, durch Verschmelzen von MiIz-Lymphozyten
von einer immunisierten Maus mit Mäuse-Myelomzellen wurde zuerst von G.Köhler und C.Milstein veröffentlicht
(Nature, 256, 495-497, 1975). Seit dieser Zeit sind viele Berichte über die Bildung von Hybridomas
durch Zellfusion erschienen und auch wissenschaftliche Forschungen über Antikörper, die durch diese Hybridomas
erzeugt werden, und ihre Anwendung durchgeführt worden.
Beim Anwenden dieses allgemeinen Verfahrens zur Bildung von Hybridomas auf die Erzeugung eines neuen Hybridoma,
das zur Erzeugung eines besonderen monoklonalen Antikörpers fähig ist, treten jedoch vom Standpunkt des Betriebsverfahrens
verschiedene Schwierigkeiten auf. Spezieller gesagt, können in Abhängigkeit von dem Typ
des als Antigen verwendeten Proteins bei der Bildung
eines Hybridoma spezielle Maßnahmen in späteren Verfahren für Immunisierung und Zellfusion erforderlich sein,
und es können Einflüsse auf die Auswahltechnik zum Isolieren
des gewünschten Hybridoma ausgeübt werden.
Das zur Erzeugung eines monoklonalen Antikörpers gegen
bovines Lactoferrin fähige Hybridoma gemäß der vorliegenden Erfindung kann gebildet werden, indem Milzlymphozyten
von der Milz aufgesammelt werden, die von einer mit Lactoferrin immunisierten Maus herausgeschnitten
worden ist, und diese Milzlymphozyten mit Mäuse-Myelomzellen auf die herkömmliche Weise verschmolzen werden.
Das Verfahren zur Bildung des vorstehend beschriebenen Hybridoma wird nachfolgend beschrieben.
Bildung eines Hybridoma, das zur Erzeugung eines monoklonalen Antikörpers gegen bovines Lactoferrin fähig ist.
Eine Human-Lactoferrin-Zubereitung mit einer Reinheit
von 98% wird von Sigma Co., verkauft, aber bovines Lactoferrin ist nicht kommerziell erhältlich. Deshalb
wird Kasein von bovinem Colostrum durch isoelektrische Ausfällung entfernt, und die entstehende Molke- oder
Milchserumfraktion wird nach einem herkömmlichen Verfahren behandelt (z.B. Johansson, B.G. et al.: Acta
Chem.Scand., 23, 683, 1969), um eine bovine Lactoferrinfraktion mit einer Reinheit von etwa 60% zu erhalten.
Dann wird eine Lösung von bovinem Lactoferrin hergestellt (üblicherweise unter Verwendung einer Phosphatpuffersalzlösung
(PBS), pH 7,2, die 0,15 M Natriumchlorid enthält) und mit einer gleichen Menge Freundschem Adjuvans gemischt, um eine Emulsion zu bil-
ORlOlNAl.
den. Durch Injizieren dieser Emulsion in die Bauchhöhle
wird eine Maus (die üblicherweise 6 bis 8 Wochen alt ist) dreimal mit Intervallen von zwei Wochen immunisiert.
Für diesen Zweck muß eine hoch-reine Form von bovinem Lactoferrin verwendet werden.
Zu diesem Zweck ist es wünschenswert, die Reinheit von bovinem Lactoferrin zu erhöhen, indem ein Antiserum
gegen bovine Immunglobuline verwendet wird, um Immunglobuline aufzunehmen, die die Hauptverunreinigungen
sind, die in der bovinen Lactoferrinfraktion vorhanden sind.
Wenn die Reinheit von bovinem Lactoferrin niedrig ist, ist es schwierig, das gewünschte Hybridoma zu erhalten.
Der Grund hierfür ist, daß eine Maus leichter mit bovinen Immunglobulinen als mit bovinem Lactoferrin immunisiert
wird, und deshalb wird der Titer des Antikörpers gegen bovines Lactoferrin nicht vollständig angehoben
.
Es gibt keine besondere Beschränkung für den Typ Mäuse, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Es ist jedoch üblicherweise wünschenswert, eine Maus vom BALB/c-Stamm zu verwenden.
Gemäß dem Stand der Technik werden üblicherweise MiIzlymphozyten
für die Verwendung bei der Herstellung eines zur Erzeugung eines monoklonalen Antikörpers fähigen
Hybridoma von einer Mäusemilz aufgesammelt, die 3 oder 4 Tage nach der Endimmunisierung mit einem spezifischen
Antigen herausgeschnitten worden ist. Im Falle von bovinem Lactoferrin , auf das die vorliegende Erfindung
-8——·
gerichtet ist, erreicht der Titer des Antikörpers/ der in der Maus gemessen worden ist, nicht ein Maximum 3
oder 4 Tage nach der Endimmunisierung, und die antikörpererzeugenden Zellen unter den Milzlymphozyten
sind zu dieser Zeit nicht ausreichend aktiviert. Demzufolge ist die Rate der Bildung eines gewünschten
Hybridoma, das zur Erzeugung eines monoklonalen Antikörpers gegen bovines Lactoferrin fähig ist, unzufriedenstellend
niedrig.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gefunden, daß die Rate der Bildung des besagten Hybridoma stark
erhöht werden kann, indem Milzlymphozyten verwendet werden, die von einer Milz aufgesammelt werden, die
aus einer Maus 6 oder 7 Tage nach der Endimmunisierung mit Lactoferrin herausgeschnitten wird.
Die Milzlymphozyten ( hier im folgenden als Milzzellen bezeichnet), die von der Mäusemilz auf die vorstehend
angegebene Weise aufgesammelt worden sind, werden dann mit Mäuse-Myelomzellen (hier im folgenden als Myelomzellen
bezeichnet) verschmolzen.
Es besteht keine besondere Beschränkung für den Typ der Myelomzellen, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet
werden. Wenn es jedoch gewünscht wird, sie mit Milzzellen, die von einer Maus vom BALB/c-Stamm erhalten
worden sind, zu verschmelzen, ist es vorzuziehen, SP2/O-Ag14-Zellen zu verwenden, die nicht die K-Kette
von IgG sekretieren. Die Verschmelzung kann nach irgendeinem herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden.
Wenn jedoch SP2/O-Ag14-Zellen als Myelomzellen verwendet
werden, ist es wesentlich, daß die Verschmelzungs-
zeit, einschließlich der Zugabe eines Verschmelzungsbeschleunigers (Verschmelzungseinleiters), des Mischens
und der Verdünnung, im Bereich von 5 bis 15 Minuten und vorzugsweise 9 bis 11 Minuten liegen sollte.
Wenn die Verschmelzungszeit kürzer als 5 Minuten ist,
wird die Verschmelzung unvollständig sein, während dann, wenn sie langer als 15 Minuten ist, die Zellen durch
Vergiftung durch Polyäthylenglycol, das als Verschmelzungsbeschleuniger (Fusionspromotor) verwendet wird,
absterben werden. In diesem Zusammenhang ist zu bemerken, daß dann, wenn die Verschmelzungszeit im Bereich
von 9 bis 11 Minuten liegt, die Rate der Koloniebildung 100% annähern wird. Wenn Milzzellen von einer
Maus vom BALB/c-Stamm, die mit bovinem Lactoferrin immunisiert ist, mit SP2/O-Ag14-Zellen verschmolzen
werden, kann die Rate der Koloniebildung (die Verschmelzungsrate) stark erhöht werden, indem Polyäthylenglycol
von gaschromatischer Qualität (Molekulargewicht 4000; Merck & Co., Inc.) als ein Verschmelzungsbeschleuniger mit einer Konzentration von 50% verwendet
wird.
Nach Abschluß der Verschmelzung können die verschmolzenen Zellen auf die herkömmliche Weise behandelt werden.
Typischerweise werden die geschmolzenen Zellen in HT-Medium (Dulbecco-modifiziertes MEM-Medium, das Hypoxanthin,
Thymidin und 10% fötales Kalbserum enthält) dispergiert, über eine 96-Löcher-Mikrotiterplatte gesprüht
und bei einer Temperatur von 37°C unter einer Atmosphäre von 5% Kohlendioxid kultiviert. Von dem
folgenden Tag an wird Auswahl von Hybridomas in HAT-Medium (Dulbecco-modifiziertes MEM-Medium, das Hypo-
xanthin, Aminopterin, Thymidin und 10% fötales Kalbserum
enthält) durchgeführt.
Sobald die Kolonien bis zu einer ausreichenden Größe angewachsen sind, werden die Hybridomas nach dem feste
- Phase-Verfahren klassiert. Dann werden die Hybridomas,
die eine positive Reaktion zeigen, nach dem begrenzten Verdünnungsverfahren (limiting dilution method)
geklont.
In einer Ausführungsform wird das Feste-Phase-Verfahren
durchgeführt, indem bewirkt wird, daß ein lösliches Antigen an einer sanft arbeitenden oder weichen 96-Löcher-Mikrobohrungseinheit
(96-hole soft microwell) adsorbiert wird, die Bohrungen mit bovinem Serumalbumin
(BSA) behandelt werden, um die Abschnitte zu blockieren, an denen das Antigen nicht adsorbiert ist, und
die überstehende Flüssigkeit des vorgenannten Kulturmediums in die Bohrungen gegeben wird, um Reaktion mit
dem Antigen zu bewirken. Nach Beendigung der Reaktion werden die Bohrungen gründlich gewaschen, und Antikörper
gegen biotinylierte Mäuse-Antikörper (blotinylated mouse antibodies) werden als zweite Antikörper dort
hinzugegeben. Danach werden die Bohrungen mit Avidin und Fluoreszein-markiertem Biotin behandelt, um die
gewünschten Antikörper durch die Erzeugung von Fluoreszenz zu erfassen und nachzuweisen.
Das lösliche Antigen, das für diesen Zweck verwendet wird, muß bovines Lactoferrin sein, das eine Reinheit
besitzt, die so groß wie möglich ist. Der Grund dafür ist, daß dann, wenn die Reinheit des bovinen Lactoferrins
gering ist, die Hybridomas auch für Verunrei-
nigungsantigene eine positive Reaktion zeigen, und dies macht es schwierig, ein gewünschtes Hybridoma herauszufinden,
das einen monoklonalen Antikörper gegen bovines Lactoferrin erzeugt.
In einer Ausführungsform wird das begrenzte Verdünnungsverfahren
folgendermaßen durchgeführt: Eine Dispersion
von 10 Mäuse-Thymuszellen und 50 Hybridomazellen in
ml HT-Medium wird über eine 96-Löcher-Mikrotiterplatte
so gesprüht, daß eine oder weniger Hybridomazellen in jeder Bohrung vorhanden sein wird, und auf diese Weise
werden einzelne Kolonien von dem Hybridoma gebildet. Die Mäuse-Thymuszellen werden als Beschickungszellen
oder Feeder-Zellen hinzugegeben, weil Hybridomazellen bei niedrigen Zelldichten nicht wachsen können.
Das vorstehend beschriebene Klonierungsverfahren wird drei oder mehr Male wiederholt, um ein mohogeklontes
Hybridoma zu erhalten.
Dann kann das entstehende Hybridoma, das zur Erzeugung eines monoklonalen Antikörpers gegen bovines Lactoferrin
fähig ist, auf die übliche Weise weitergezüchtet werden.
Spezieller wird das Hybridoma in die Bauchhöhle von Mäusen injiziert und deren aszitisches Fluid rückgewonnen.
Alternativ dazu wird das Hybridoma in einem geeigneten Medium kultiviert und dessen überstehende
Flüssigkeit rückgewonnen. Das rückgewonnene asζitisehe
Fluid oder die überstehende Flüssigkeit wird dann durch Ausfällen mit Ammoniumsulfat und Ionenaustauschchromatographie
gereinigt, um den monoklonalen Antikörper gegen bovines Lactoferrin zu gewinnen.
/15 ·
In einer Ausführungsform kann der monoklonale Antikörper
gegen bovines Lactoferrin folgendermaßen hergestellt werden: Zellen von dem vorgenannten Hybridoma
werden in einer Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS) dispergiert
und in die Bauchhöhle von Mäusen vom BALB/c~ Stamm injiziert, denen vorher Pristan(2,6,10,14-Tetramethylpentadecan)
verabreicht worden war. Nach 7 bis 10 Tagen wird ihr aszitisches Fluid aufgesammelt, durch
Zentrifugieren geklärt oder gereinigt, mit PBS so verdünnt, daß eine Proteinkonzentration von der Größenordnung
von 10 bis 12 mg/ml entsteht, und dann mit 45% Sättigungs-Ammoniumsulfat ausgesalzt. Eine Lösung
von der entstehenden Ausfällungsfraktion wird dialysiert
und dann durch lonenaustauschchromatographie gereinigt.
Dann können die so erhaltenen monoklonalen Antikörper gegen bovines Lactoferrin bei der Abtrennung und Reinigung
von bovinem Lactoferrin verwendet werden. Dies kann durchgeführt werden, indem eine Affinitäts-chromatographische
Säule von dem Antikörper nach dem im folgenden beschriebenen Verfahren hergestellt wird und
eine Lösung von bovinem Roh-Lactoferrin, die von Milch abgetrennt worden ist, durch die Affinitäts-chromatographische
Säule hindurchgeschickt wird.
Der monoklonale Antikörper gegen bovines Lactoferrin, der auf die vorstehend beschriebene Weise hergestellt
worden ist, wird mit einer gleichen Menge eines unlöslichen Trägers für die Verwendung bei Affinitäts-Chromatographie
(z.B. Affigel~10; Bio-Rad Co.) gemischt,
■Μ
und diese Mischung wird bei niedriger Temperatur gerührt,
um den Antikörper an dem Träger zu binden und zu fixieren. Nach dem Waschen werden diejenigen funktioneilen
Gruppen auf dem Träger, an denen der besagte Antikörper nicht anhaftet oder nicht gebunden ist, inaktiviert,
und der Träger wird dann gewaschen. Das entstehende Affinitätsgel wird in eine Säule mit geeigneter
Größe gepackt, um eine Affinitäts-chromatographische Säule zu bilden. Bovines Roh-Lactoferrin, das von
Milch erhalten worden ist, wird in einer Phoaphatpuffer-Salzlösung
(PBS) gelöst, und die entstehende Lösung wird durch die vorstehend beschriebene Säule geleitet.
Dann wird das Affinitätsgel innerhalb der Säule mit PBS gewaschen, um die nicht adsorbierte Fraktion zu
entfernen, woraufhin gründliches Waschen mit PBS, die 0,5M Natriumchlorid enthält, und dann 0,15M Natriumchloridlösung
folgt. Danach wird das adsorbierte bovine Lactoferrin mit einer Acetatpufferlösung, pH 2,7,
die 0,15M Natriumchlorid enthält, eluiert. Die Eluatfraktion, die bovines Lactoferrin enthält, wird auf
pH 7 eingestellt, gegen entionisiertes Wasser dialysiert und dann gefriergetrocknet, um bovines Lactoferrin
mit einer Reinheit von 98% oder höher zu erhalten.
Die vorliegende Erfindung wird weiterhin durch das folgende Beispiel näher erläutert.
Unter Verwendung eines Ionenaustauschharzes wurde eine bovine Lactoferrinfraktion von bovinem Colostrum oder
boviner Vormilch nach dem herkömmlichen Verfahren abgetrennt (Johansson, B.G. et al.: Acta Chem.Scand., 23,
-/IJ-
683, 1969). Diese bovine Lactoferrinfraktion besaß eine Reinheit von 60%.
Zu der vorstehenden bovinen Lactoferrinfraktion wurde ein Antiserum gegen bovine Immunglobuline hinzugegeben.
Auf diese Weise wurden bovine Immunglobuline, die die
Hauptverunreinigungen bildeten, aufgenommen, um die Reinheit des bovinen Lactoferrins auf etwa 90% zu erhöhen
.
Das so erhaltene bovine Lactoferrin wurde in einer Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS), pH 7,2, die 0,15M
Natriumchlorid enthielt, so gelöst, daß sich eine Konzentration von 0,3% ergab. Diese Lösung wurde mit
einer gleichen Menge Freundschem vollständigem Adjuvans (Freund1s complete adjuvant; Difco) gemischt,
um eine Emulsion zu bilden. Eine Maus vom BALB/c-Stamm , die 6 bis 8 Wochen alt war, wurde durch Injizieren der
Emulsion in ihre Bauchhöhle immunisiert. Diese Immunisierung wurde dreimal in Intervallen von 2 Wochen
wiederholt. Sieben Tage nach der Endimmunisierung wurde die Milz von der Maus herausgeschnitten und Milzzellen
wurden davon entnommen. Diese Milzzellen wurden in DMEM-Medium (Dulbecco-modifiziertes-Minimum-essentie1-les-Medium)
dispergiert und mit SP2/O-Ag14 Mäuse-Myelomzellen
in einem Verhältnis von 2:1 gemischt. Zu dieser Mischung wurde eine 50%ige Lösung von Polyäthylenglycol
(gaschromatographische Qualität, Molekulargewicht 4000; Merck & Co., Inc.) als Verschmelzungsbeschleuniger oder
Fusionspromotor hinzugegeben. Auf diese Weise wurde die Verschmelzung der Zellen in 10 Minuten fertiggestellt.
Die entstandenen verschmolzenen Zellen wurden durch Zentrifugieren von Polyäthylenglycol abgetrennt, in
HT-Medium so dispergiert, daß sich eine Zelldichte von 1 χ 10 Zellen/ml oder weniger ergab, über 96 Löcher-Mikrotiterplatten
gesprüht und bei 37°C unter einer Atmosphäre von 5% Kohlendioxid kultiviert. Von dem Tage
nach dem Beginn der Kultur (d.h. dem ersten Tag) wurde die Hälfte des Mediums kontinuierlich mit HAT-Medium
ausgetauscht. An dem 17. Tag wurden Hybridomas nach dem Feste-Phase-Verfahren klassiert. Als Ergebnis
hatten 100% der Hybridomas eine Kolonie gebildet und 8,3% der Hybridomas zeigten eine positive Reaktion
für bovines Lactoferrin.
Dann wurden die Hybridomas, die eine positive Reaktion zeigten, zu 24-Löcher-Mikrotiterplatten übergeführt
und geklont, sobald sie zu einer Zelldichte von 1 χ 10 Zellen/ml gewachsen waren. Danach wurden sie in HT-Medium
zwei Wochen lang kultiviert, und die Hybridomas, die eine einzige Kolonie in der Bohrung bildeten, wurden
einem zweiten Klonen unterworfen.
Dieses Klonierungs- und Klassierungsverfahren wurde dreimal wiederholt. Auf diese Weise wurden Monoklone
von einem Hybridoma erhalten, das fähig war, einen Antikörper gegen bovines Lactoferrin zu erzeugen.
Ein Vorrat, d.h. eine Probe, von dem entstandenen Hybridoma, das fähig ist, einen monoklonalen Antikörper
gegen bovines Lactoferrin zu erzeugen, wird in der American Type Culture Collection, 12 301 Parklawn Drive,
Rockville, Maryland 20852-1776 unter der Hinterlegungsnummer (Deposition No.) ATCC HB 8852 aufbewahrt.
Claims (1)
- PatentansprücheZur Erzeugung eines monoklonalen Antikörpers gegen bovines Lactoferrin fähiges Hybridoma, das sich spezifisch mit bovinem Lactoferrin
kombinieren kann, dadurch gekennzeichnet , daß es durch Verschmelzen von Milzlymphozyten von einer mit
bovinem Lactoferrin immunisierten Maus mit
Mäuse-Myelomzellen erhalten worden ist.Hybridoma nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß die Milzlymphozyten von einer Mäusemilz entnommen
worden sind, die 6 oder 7 Tage nach der End-immunisierung herausgeschnitten worden ist.3. Hybridoma nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet , daß die Mäuse-Myelomzellen SP2/O-Ag14-Zellen sind.4. Verfahren zum Bilden eines Hybridomas, das fähig ist, einen monoklonalen Antikörper gegen bovines Lactoferrin zu erzeugen, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lösung von bovinem Lactoferrin, das von der Molke- oder Milchserumfraktion von Milch abgetrennt worden ist, hergestellt wird;: eine Maus mit einer Emulsion, die durch Mischen gleicher Mengen der Lactoferrinlösungy und Freundschem vollständigem Adjuvans ge-L bildet wird, immunisiert wird; Milzlymphozy-* ten von der Milz der Maus entnommen werden;die Milzlymphozyten mit Mäuse-MyelomzeIlen verschmolzen werden und die entstehenden verschmolzenen Zellen kultiviert werden; die gebildeten Hybridomas in HAT-Medium selektiert werden; die selektierten Hybridomas nach dem Feste-Phase-Verfahren gesiebt oder klassiert werden, um ein Hybridoma zu erhalten, das eine positive Reaktion zeigt; und das Hybridoma einem Klonierungsverfahren unterworfen wird/ um einen Monoklon des Hybridomas zu erhalten.5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung aus bovinem Lactoferrin durch Abtrennenvon bovinem Lactoferrin von der Molkefraktion von Rindervormilch oder bovinem Colostrum hergestellt wird, ein Antiserum gegen bovine Immunglobuline zu dem bovinen Lactoferrin hinzugegeben wird, um die bovinen Immunglobuline und andere darin vorhandene Verunreinigungen aufzunehmen und zu entfernen, und das entstehende gereinigte bovine Lactoferrin in einer Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS) gelöst wird.6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , daß Milzlymphozyten, die von einer Mäusemilz entnommen sind, die 6 oder 7 Tage nach der Endimmunisierung mit bovinem Lactoferrin herausgeschnitten wird, als die genannten Milzlymphozyten verwendet werden, SP2/O-Ag14-Zellen ^ als die besagten Mäuse-Myelomzellen verwendet werden und diese Zellen über eine Zeitdauer von 5 bis 15 Minuten und vorzugsweise 9 bis 11 Minuten miteinander verschmolzen werden.
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