DE3544400A1 - Verfahren zum abtrennen von bovinem lactoferrin von kuhmilch und reinigen desselben - Google Patents
Verfahren zum abtrennen von bovinem lactoferrin von kuhmilch und reinigen desselbenInfo
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Description
Beanspruchte Priorität: 19.Dezember 1984, Japan,
Patentanmeldung No. 266401/1984
Anmelder: SNOW BRAND MILK PRODUCTS CO., LTD. 1-1, Naebo-cho 6-chome, Higashi-ku,
Sapporo-shi, Hokkaido, Japan
Verfahren zum Abtrennen von bovinem Lactoferrin von Kuhmilch und Reinigen desselben.
Die Erfindung betrifft ein Abtrennungs- und Reinigungsverfahren zur Gewinnung von bovinem Lactoferrin aus
Kuhmilch in einem hochreinen Zustand und mit hoher Ausbeute .
Lactoferrin ist ein eisenbindendes Protein, das in nach außen abgegebenen Flüssigkeiten wie Milch gefunden wird.
Es besitzt nicht nur seine hohen Vorzüge für die Ernährung von Kindern vom Ernährungsstandpunkt aus, sondern
hat auch die physiologische Wirkung, daß es eine bakte-
'354UOO
riostatische Wirkung auf pathogene Bakterien, die in
den Därmen auftreten und· einen hohen Eisenbedarf haben, wegen seiner charakteristischen Eisenbindungsfähigkeit
ausübt. Mit anderen Worten, man kann sagen, daß Lactoferrin·
ein wichtiges Milchprotein ist, das nicht nur als Nährstoff dient, sondern auch eine pharmakologische
Signifikanz als ein Antiinfektionsmittel besitzt, ähnlich wie Immunoglobuline und Lysozym, die in der Milch
vorhanden sind.
Im Hinblick auf die vorstehend beschriebenen charakteri stischen Eigenschaften von Lactoferrin wurden bereits
eine Reihe von Verfahren zum Abtrennen von Lactoferrin aus Milch und seine Reinigung vorgeschlagen. Da Lactoferrin
jedoch ein Protein ist, das eine hochreaktionsfähige Molekularstruktur aufweist, und auch zur Wechselwirkung
mit anderen Milchproteinen neigt, war es bisher schwierig, eine hochreine Form von Lactoferrin
leicht und mit gutem Wirkungsgrad nach den herkömmlichen Verfahren zu isolieren.
Ein herkömmliches Verfahren zum Abtrennen und Reinigen von· Lactoferrin umfaßt beispielsweise das Vorsehen von
Magermilch, von der Fett getrennt worden ist, das Entfernen von Kasein von dieser Magermilch durch isoelektrische
Ausfällung bei einem pH von 4,6, Aussalzen der entstehenden Molkefraktion mit Ammoniumsulfat, Dialysieren
der entstehenden Fraktion gegen entionisiertes Wasser und nachfolgendes Hindurchleiten des Retentats
einige Male durch ein Ionenaustauschharz (Gordon, Ziegler, Bash et al.: Biochim. Biophys. Acta, 60, 410-411,
1962; Merton L. Glove et al.: Biochim. Biophys. Acta, 100, 154-162, 1965; Johansson, B.G. et al.: Acta
Chem. Scand., 23, 683, 1969). Weiterhin umfassen
. S-
Abwandlungen des vorstehenden Verfahrens ein Verfahren, bei dem Siliziumdioxid-(Silika)Teilchen anstelle des
Ionenaustauschharzes verwendet werden (japanische Patentoffenlegungsschrift No. 28233/1983), und ein Verfahren,
bei dem nach dem Hindurchleiten des Retentats
durch ein Ionenaustauschharz das entstehende Produkt weiter der Kupfer-Affinitätschromatographie unterworfen
wird (Norihiro Kawakata, Yoshio Yoshino et al., Abstracts of Lectures at the 1983 Annual Meeting of
the Japan Biochemical Society, S. 1053). Diesen Verfahren fehlt jedoch allen eine praktische Brauchbarkeit,
weil sie komplizierte Maßnahmen und eine viel zu lange Behandlungszeit erfordern.
Da Lactoferrin die Eigenschaft besitzt, mit anderen in der Milch vorhandenen Proteinen in Wechselwirkung zu
treten, kann darüber hinaus bei den vorstehend angegebenen Verfahren, bei denen ein Ionenaustauschharz verwendet
wird, nicht die Verunreinigung des Produktes mit
Immunoglobulinen und anderen in der Milch vorhandenen
Proteinen vermieden werden. Demzufolge ist es in der Praxis schwierig, eine hochreine Form von Lactoferrin
zu erhalten. Außerdem sind diese Verfahren auch nachteilig insofern, als die wiederholte Behandlung durch
Aussalzen und Ionenaustausch nicht nur eine merkliche Verringerung in der Gewinnung von Lactoferrin bewirken,
sondern es auch praktisch unmöglich machen, andere Milchproteine als Lactoferrin und andere Milchbestandteile,
die in den Rückständen vorhanden sind, die im Verlauf der Abtrennung und der Reinigung von Lactoferrin
erhalten werden, zurückzugewinnen und wieder zu verwenden.
BAD ORIGINAL
Im Hinblick auf die vorstehenden Probleme, die bei den bekannten Verfahren zum Isolieren einer hochreinen Form
von Lactoferrin aus Kuhmilch auftraten, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung Untersuchungen mit
dem Ziel durchgeführt, ein Abtrennungs- und Reinigungsverfahren zu schaffen, das mit Vorteil für die Isolierung
von bovinem Lactoferrin aus Kuhmilch in einem hochreinen Zustand und mit hoher Ausbeute verwendet werden
kann. Als Ergebnis haben die Erfinder gefunden, daß bovines Lactoferrin mit einer affinitätschromatographischen
Säule spezifisch kombiniert und daran adsorbiert werden kann, wobei an dieser Säule ein monoklonaler
Antikörper gegen bovines Lactoferrin fixiert worden ist, und es ist ihnen gelungen, eine in hohem Maße reine
Form von bovinem Lactoferrin mit hoher Ausbeute zu erhalten, indem bovines Lactoferrin von Kuhmilch mit
Hilfe einer derartigen affinitätschromatographischen Säule abgetrennt und gereinigt wird.
Es ist deshalb Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Abtrennungs- und Reinigungsverfahren zum Erhalten einer
in hohem Maße reinen Form von bovinem Lactoferrin von Kuhmilch in hoher Ausbeute zu schaffen.
Weitere Aufgaben und Gegenstände der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nun folgenden Beschreibung.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird gelöst durch ein Verfahren zum Abtrennen einer hochreinen
Form von bovinem Lactoferrin von Kuhmilch und Reinigen derselben, bei dem eine affinitatschromatographisehe
Säule hergestellt wird, indem ein monoklonaler Anti-
35U400
körper gegen bovines Lactoferrin an einem unlöslichen
Träger fixiert wird; Kuhmilch oder eine Lösung von bovinem Lactoferrin, die von Kuhmilch abgeleitet worden
ist, durch die affinitatschromatographisehe Säule gelei
tet wird und dann das an der affinitätschromatographischen
Säule adsorbierte bovine Lactoferrin eluiert wird.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß eine affinxtätschromatographische
Säule, die einen unlöslichen Träger mit einem daran fixierten monoklonalen Antikörper gegen bovines Lactoferrin
umfaßt, verwendet wird, um bovines Lactoferrin von Kuhmilch abzutrennen und zu reinigen.
Auf diese Weise ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Abtrennen und Reinigen von
Lactoferrin unter Ausnutzung der biologischen Affinität (d.h. einer hochspezifischen Wechselwirkung zwischen
biologischen Komponenten), und es unterscheidet sich somit wesentlich von herkömmlichen Abtrennungsverfahren,
bei denen physikalische oder chemische Affinität ausgenutzt wird.
Ein monoklonaler Antikörper gegen bovines Lactoferrin
für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung kann folgendermaßen erhalten werden: Ein Hybridoma, das
einen monoklonalen Antikörper gegen bovines Lactoferrin erzeugen kann, wird durch Verschmelzen von Milzlymphozyten
(hier im folgenden als Milzzellen bezeichnet) von einer mit bovinem Lactoferrin immunisierten Maus
mit Mäusemyelomzellen (hier im folgenden als Myelomzellen bezeichnet) gebildet. Dann wird das Hybridoma
nach irgendeinem gut bekannten Verfahren in die Bauch-
höhle von Mäusen injiziert und ihre aszitische Flüssigkeit wird gewonnen. Alternativ dazu wird das Hybridoma
in einem geeigneten Medium kultiviert und seine überstehende Flüssigkeit wird gewonnen. Die gewonnene aszitische
Flüssigkeit oder die überstehende Flüssigkeit wird dann durch Ausfällen mit Ammoniumsulfat und Behandlung
mit einem Anionenaustauschharz gereinigt, um den gewünschten Antikörper zu erhalten.
Zuerst wird ein konkretes Beispiel für das Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen
bovines Lactoferrin nachstehend erläutert.
Wie bereits gesagt wurde, kann ein monoklonaler Antikörper
gegen bovines Lactoferrin hergestellt werden, indem ein Hybridoma, das durch Verschmelzen von Milzzellen
von einer mit bovinem Lactoferrin immunisierten Maus mit Myelomzellen erhalten worden ist, gezüchtet
wird. Solch ein Hybridoma kann beispielsweise nach dem folgenden Verfahren gebildet werden.(Dieses Verfahren
zum Bilden solch eines Hybridomas wird in einer Anmeldung für ein unabhängiges Patent der gleichen
Erfinder beschrieben und beansprucht.)
Bildung eines Hybridomas, mit dem ein monoklonaler Antikörper gegen bovines Lactoferrin hergestellt werden
kann.
Bovines Lactoferrin wird von der Molkefraktion von Milch nach einem gut bekannten Verfahren (z.B.
Johansson, B.G. et al.: Acta Chem. Scand., 23, 683, 1969) isoliert und dann wird eine Lösung von ihm hergestellt
(üblicherweise unter Verwendung einer Phosphat-
Puffersalzlösung (PBS von englisch: phosphate buffer saline
solution), pH 7,2, die O,15M Natriumchlorid enthält) . Diese Lösung wird mit einer gleichen Menge
Freund1schem vollständigem Adjuvans gemischt, um eine
Emulsion zu bilden. Durch Injizieren dieser Emulsion in die Bauchhöhle wird eine Maus (üblicherweise mit
einem Alter von 6 bis 8 Wochen) dreimal in Intervallen von zwei Wochen immunisiert. Das bovine Lactoferrin,
das für diesen Zweck verwendet wird, kann kleine Mengen Verunreinigungen enthalten. Um jedoch das gewünschte
Hybridoma zu erhalten, wird es natürlich bevorzugt, eine hochreine Form von bovinem Lactoferrin zu verwenden.
Es bestehen keine besonderen Beschränkungen für den Typ der Maus, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet
wird. Es ist jedoch üblicherweise wünschenswert, eine BALB/C-Stamm-Maus zu verwenden.
Von der auf die vorstehend beschriebene Weise immunisierten Maus wird die Milz vorzugsweise 6 oder 7 Tage
nach der letzten Immunisierung mit bovinem Lactoferrin herausgeschnitten. Der Grund ist, weil die Bildungsrate von gewünschten Hybridomas erhöht wird, wenn Milzzellen
verwendet werden, die von der so ausgeschnittenen Milz gewonnen worden sind.
Es besteht keine besondere Beschränkung für den Typ von Myelomzellen, die mit den Milzzellen verschmolzen
werden sollen, die auf die oben beschriebene Weise erhalten worden sind. Wenn es jedoch gewünscht wird, sie
mit Milzzellen zu verschmelzen, die von einer BALB/c-Stamm-Maus
erhalten worden sind, ist es zu bevorzugen,
r) Englisch: Freund1s complete adjuvant
SP2/O-Ag14-Zellen zu verwenden, die nicht die K-Kette
von IgG sekretieren. Die Verschmelzung kann durch irgendein an sich bekanntes Verfahren durchgeführt werden.
Wenn jedoch SP2/O-Ag14-Zellen als Myelomzellen verwendet
werden, ist es wesentlich, daß die Verschmelzungszeit,
einschließlich der Zugabe eines Verschmelzungsbeschleunigers (Verschmelzungseinleiters), des Mischens
und der Verdünnung, in dem Bereich von 5 bis 15 Minuten, und vorzugsweise 9 bis 11 Minuten, liegen sollte. In
diesem Zusammenhang sei bemerkt, daß dann, wenn die Verschmelzungszeit im Bereich von 9 bis 11 Minuten
liegt, die Rate der Koloniebildung fast 100% annähern wird. Wenn Milzzellen von einer BALB/c-Stamm Maus, die
mit bovinem Lactoferrin immunisiert ist, mit SP2/O-Ag14-Zellen
verschmolzen werden, kann die Rate der Koloniebildung (die Rate der Verschmelzung) stark erhöht werden,
indem Polyäthylenglycol mit gaschromatographischer
Qualität (Molekulargewicht 4000; Merck & Co., Inc.) als ein Verschmelzungsbeschleuniger mit einer Konzentration
von 50% verwendet wird.
Nach Beendigung der Verschmelzung können die verschmolzenen Zellen auf die herkömmliche Weise behandelt werden.
Spezieller gesagt, die verschmolzenen Zellen werden in einem HT-Medium (Dulbecco-modifiziertes MEM-Medium,
das Hypoxanthin, Thymidin und 10% fötales Kalbserum enthält) dispergiert, über eine 96-Loch Mikrotiterplatte
gesprüht und bei einer Temperatur von 37°C unter einer Atmosphäre von 5% Kohlendioxid gezüchtet.
Von dem folgenden Tag an wird Selektion von Hybridomas in einem HAT-Medium (Dulbecco-modifiziertes MEM-Medium,
das Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin und 10% fötales Kalbserum enthält) durchgeführt.
— S) —
Sobald die Kolonien bis zu einer ausreichenden Größe angewachsen sind, werden die Hybridomas nach dem Festphasenverfahren
klassiert. Dann werden die Hybridomas, die eine positive Reaktion zeigen, nach dem Grenzverdünnungsverfahren
(englisch: limiting dilution method) geklont.
In einer Ausführungsform wird das Festphasenverfahren
(solid phase method) durchgeführt, indem ein lösliches Antigen an einer weichen 96-Loch Mikrobohrungseinrichtung
adsorbieren gelassen wird, die Bohrungen mit bovinem Serumalbumin (BSA) behandelt werden, um die
Abschnitte, an denen das Antigen nicht adsorbiert ist, abzublocken, und die überstehenden Flüssigkeiten aus
den vorstehend beschriebenen Kulturmedien in die Bohrungen gegeben werden, um Reaktion mit dem Antigen zu
bewirken. Nach Fertigstellung der Reaktion werden die Bohrungen völlig durchgewaschen, und es werden Antikörper
gegen biotinylierte Mäuse-Antikörper als sekundäre Antikörper dort hinzugegeben. Danach werden die
Bohrungen mit Avidin und mit Fluoreszein-markiertem Biotin behandelt, um die gewünschten Antikörper durch
die Erzeugung von Fluoreszenz nachzuweisen.
In einer anderen Ausführungsform wird das Grenzverdünnungsverfahren
folgendermaßen durchgeführt: Eine
Dispersion von 10 Mäuse-ThymuszeIlen und 50 Hybridomazellen
in 10 ml eines HT-Mediums wird über eine 96-Loch Mikrotiterplatte so gesprüht, daß eine Hybridomazelle
oder weniger in jeder Bohrung vorhanden ist, und auf diese Weise werden Einzelkolonien des Hybridomas gebildet.
Die Mäuse-Thymuszellen werden als Speisezellen
oder Feeder-Zellen hinzugegeben, weil Hybridomazellen in niedrigen Zelldichten nicht wachsen können.
354AA00
- yo -
Das vorstehend beschriebene Klonungsverfahren wird drei
oder mehr Male wiederholt, um ein monogeklontes Hybridoma zu erhalten.
Herstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen bovines
Lactoferrin.
Das auf die vorstehende Weise gebildete Hybridoma wird in die Bauchhöhle von Mäusen injiziert, und deren aszitisches
Fluid wird gewonnen. Alternativ dazu wird das Hybridoma in einem geeigneten Medium kultiviert und
seine überstehende Flüssigkeit gewonnen. Das gewonnene aszitische Fluid oder die überstehende Flüssigkeit
wird dann durch Ausfällen mit Ammoniumsulfat und Ionenaustauschchromatographie gereinigt, um einen monoklonalen
Antikörper gegen bovines Lactoferrin zu erhalten.
In einer Ausführungsform kann der monoklonale Antikörper
gegen bovines Lactoferrin folgendermaßen hergestellt werden: Zellen des vorgenannten Hybridomas werden
in einem PBS dispergiert und in die Bauchhöhle von BALB/c-Stamm Mäusen injiziert, denen vorher Pristan
(2,6,10,14-Tetramethylpentadecan) verabreicht worden
war. Nach 7 bis 10 Tagen wird deren aszitisches Fluid aufgesammelt, durch Zentrifugieren geklärt, mit PBS
so verdünnt, daß sich eine Proteinkonzentration von der Größenordnung von 10 bis 12 mg/ml einstellt, und
dann mit 45% gesättigtem Ammoniumsulfat ausgesalzt. Eine Lösung der entstehenden Ausfällungsfraktion wird
dialysiert und dann durch Ionenaustauschchromatographie gereinigt.
BAD OR
• β-
Dann kann der monoklonale Antikörper gegen bovines Lactoferrin,
der auf diese Weise erhalten worden ist, bei der Abtrennung und Reinigung von bovinem Lactoferrin
verwendet werden. Dies kann durchgeführt werden, indem eine affinitätschromatographische Säule von dem Antikörper
nach dem nachfolgend beschriebenen Verfahren hergestellt wird und eine Lösung von bovinem Roh-Lactoferrin,
das von Kuhmilch erhalten worden ist, durch die affini-'
tätschromatographische Säule hindurchgeleitet wird.
Der monoklonale Antikörper gegen bovines Lactoferrin, der auf die vorstehende Weise hergestellt worden ist,
wird mit einer gleichen Menge eines unlöslichen Trägers wie eines Trägers für die Verwendung bei Affinitätschromatographie (z.B. Affigel-10; Bio-Rad Co.) gemischt,
und diese Mischung wird bei niedriger Temperatur gerührt, um den Antikörper an dem Träger zu binden
und zu fixieren. Nach dem Waschen werden diejenigen funktionellen Gruppen auf dem Träger, an denen der vorgenannte
Antikörper nicht anhaftet, inaktiviert, und der Träger wird dann gewaschen.Das entstehende Affinitätsgel wird in eine Säule mit geeigneter Größe gepackt,
um eine äffinitätsehromatographische Säule zu bilden.
In diesem Zusammenhang sei bemerkt, daß ein Träger (wie ein Affinitätsgel), an dem ein monoklonaler Antikörper
gegen bovines Lactoferrin fixiert ist, bei einer Temperatur von 4°C etwa 3 Monate oder länger aufgehoben
werden kann unter der Voraussetzung, daß er in einem PBS, das 0,02% Natriumazid enthält, dispergiert gehalten
wird.
ORIGINAL
- γι -
Abtrennung und Reinigung von bovinem Lactoferrin.
Um bovines Lactoferrin von Kuhmilch abzutrennen und zu reinigen, indem eine affinitätschromatographische Säule
verwendet wird, die durch Fixieren eines monoklonalen Antikörpers gegen bovines Lactoferrin an einem unlöslichen
Träger auf die oben beschriebene Weise hergestellt worden ist, wird eine geeignete Menge einer bovines
Lactoferrin enthaltenden Probe (wie z.B. Kuhmilch) durch die affinitätschromatographische Säule bei einer Temperatur
von 50 C oder tiefer, vorzugsweise bei Raumtemperatur, geleitet. Nachdem die nicht an der Säule adsorbierte
Fraktion ausfließen gelassen worden ist, wird die Säule mit einem PBS, das 0,5M Natriumchlorid enthält,
und dann mit einer 0,15M Natriumchloridlösung gewaschen. Danach wird das an der Säule adsorbierte
bovine Lactoferrin eluiert, indem eine Acetatlösung mit einem pH von 4,7 oder weniger, vorzugsweise einem
pH von 4,3 bis 2,7, die 0,15M Natriumchlorid enthält,
durch sie hindurchgeleitet wird. Der pH der entstehenden bovinen Lactoferrinfraktion wird sofort auf Neutralität
zurückgebracht durch die Zugabe von Alkali.
Die rohe Milch, die für die Abtrennung von bovinem Lactoferrin verwendet wird, kann irgendeine der verschiedenen
Typen von Kuhmilch sein, einschließlich Kolostrum, Übergangsmilch, normale Milch und späte Milch. Es werden
jedoch Kolostrum und späte Milch vom Standpunkt der Gewinnungsrate bevorzugt. Darüber hinaus kann bovines
Lactoferrin auch von pasteurisierter Milch, Molke, pasteurisierter Molke und von Milchpulvern wie z.B.
Molkeproteinkonzentrat (WPC von englisch: whey protein concentrate) gewonnen werden.
Wenn bovines Lactoferrin nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Verwendung einer affinitätschromatographi
sehen Säule, an der ein monoklonaler Antikörper
gegen bovines Lactoferrin fixiert ist, von Kuhmilch abgetrennt und gereinigt wird, ist es möglich,
all die Vorbehandlungen zu eliminieren, die bei den herkömmlichen Verfahren erforderlich sind, einschließlich
der Abtrennung von Kasein mit einer Säure, dem Aussalzen mit Ammoniumsulfat, der Dialyse und Gefriertrocknung.
Darüber hinaus muß bei den herkömmlichen Verfahren die rohe Milch, die den vorstehend beschriebenen
Vorbehandlungen unterworfen werden muß, mehrere Male durch ein Ionenaustauschharz geleitet werden.
Bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann jedoch bovines Lactoferrin leicht von anderen Milchkomponenten
abgetrennt werden, indem Kuhmilch nur einmal durch eine affinitätschromatographische Säule geleitet
wird.
Weiterhin ist eine affinitätschromatographische Säule,
an der ein monoklonaler Antikörper gegen bovines Lactoferrin fixiert ist, brauchbar für die Abtrennung von
bovinem Lactoferrin allein und besitzt keine Affinität zu Lactoferrinen, die von Milch von Säugetieren anderer
Arten abgeleitet sind, z.B. zu humanem Lactoferrin. Mit anderen Worten, die spezifische Wirkung von solchen
affinitätschromatographischen Säulen ist so hoch, daß eine affinitätschromatographische Säule, an der
ein monoklonaler Antikörper gegen humanes Lactoferrin fixiert ist, nur für die Abtrennung von humanem Lactoferrin
allein wirksam ist, und eine affinitätschromatographische Säule, an der ein monoklonaler Antikörper
gegen bovines Lactoferrin fixiert ist, nur für die
354U00
Abtrennung von bovinem Lactoferrin allein wirksam ist.
Weiterhin liefern die herkömmlichen Verfahren Lactoferrin mit einer Reinheit von höchstens 66% oder ähnlich, und
seine Rückgewinnung liegt in der Größenordnung von 60%. Nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann jedoch
eine in hohem Maße reine Form von bovinem Lactoferrin mit einer Reinheit von 98% oder höher durch einen
einzigen Durchgang durch eine Säule erhalten werden, wobei eine hohe Rückgewinnungsrate von nicht weniger
als 80%, sogar 90%, erzielt wird.
Die Reinheit und Rückgewinnung von bovinem Lactoferrin, wie sie hier angegeben werden, sind nach den folgenden
Verfahren bewertet worden.
SDS-Elektrophorese der rückgewonnenen bovinen Lactoferrinfraktion
lieferte ein einziges perfektes Band. Es kann jedoch nicht aus dieser elektrophoretischen Analyse
geschlossen werden, daß die Reinheit von Lactoferrin 100% ist, weil Lactoperoxidase mit im wesentlichen
dem gleichen Molekulargewicht (etwa 80000) wie Lactoferrin in der Kuhmilch vorhanden ist. Unabhängig
davon zeigte ein immunologischer Doppeldiffusionstest
zwischen Anti-Lactoperoxidaseserum und der bovinen Lactoferrinfraktion, daß keine Präzipitin-Linie gebildet
wurde. Somit kann abgeschätzt werden, daß der Gehalt an Lactoperoxidase, die in der bovinen Lactoferrinfraktion
vorhanden sein kann, nicht mehr als 0,01% beträgt. Dies ist der Fall, weil die bovine
Lactoferrinfraktion 0,01% oder mehr Lactoperoxidase enthalten muß, um eine derartige Präzipitin-Linie zu
bilden.
Demzufolge ist auf der Basis der durch die obige SDS-Elektrophorese,
den immunologischen Doppeldiffusionstest und die Messung der Proteinkonzentration der bovinen
Lactoferrinfraktion erhaltenen Ergebnisse die Reinheit des bovinen Lactoferrins, das durch das Verfahren
der vorliegenden Erfindung erhalten worden ist, auf 98% oder höher eingeschätzt worden.
Was die Rückgewinnung anbelangt, so zeigte ein immunologischer Doppeldiffusionstest zwischen anti-bovinem-Lactoferrinserum
und der nicht adsorbierten Fraktion, daß keine Präzipitin-Linie gebildet wurde. Deshalb
kann der Gehalt an restlichem bovinem Lactoferrin in der nicht adsorbierten Fraktion so abgeschätzt werden,
daß er nicht mehr als 0,01% beträgt. Dies ist der Fall, weil die nicht adsorbierte Fraktion 0,01% oder mehr
bovines Lactoferrin enthalten muß, um solch eine Präzipitin-Linie zu bilden.
Entsprechend kann auf der Basis der durch den vorstehend angegebenen immunologischen Doppeldiffusionstest und
Proteinkonzentrationsmessung erhaltenen Ergebnisse die Rückgewinnung von bovinem Lactoferrin bei dem Verfahren
der vorliegenden Erfindung so beurteilt werden, daß sie wenigstens 80% oder größer ist, selbst 90% oder
größer.
Das Lactoferrin, das durch das Verfahren der vorliegenden
Erfindung abgetrennt und gereinigt worden ist, besitzt die folgenden Vorteile.
Wie vorstehend bereits angegeben, hat Lactoferrin die physiologische Wirkung, daß es eine starke wachstumhem-
-ahmende Wirkung auf Eisen erfordernde pathogene Bakterien
wegen seiner eigenen Eisenbindungsfähigkeit ausübt. Um deshalb seine physiologische Wirkung auszunutzen, darf
das gewonnene Lactoferrin nicht mit Eisen gesättigt sein, sondern muß seine Eisenbindungsfähigkeit beibehalten.
Das Lactoferrin, das durch herkömmliche Verfahren gewonnen wurde, konnte jedoch manchmal ein an Eisen
gebundenes Lactoferrin sein, das eine rosa Farbe annahm (vergleiche japanische Patentoffenlegungsschrift
No. 28233/1983). In solch einem Falle kann die vorstehend angegebene physiologische Wirkung nicht vorausgesetzt
werden, wenn das Lactoferrin nicht mit einem Eisen-Chelierungsmittel (wie z.B. EDTA) behandelt worden
ist, um das Eisen abzutrennen.
Im Gegensatz dazu behält das Lactoferrin, das durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung abgetrennt und
gereinigt wird, seine ihm innewohnende Eisenbindungsfähigkeit vollständig. Zu bemerken ist, daß die Eisenbindungsfähigkeit
von bovinen Lactoferrinproben, die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten
worden waren, nach dem Verfahren von Suzuki, Nonaka et al. ("Eiyo-to-Shokuryo", Vol. 31, No. 4, 395-403, 1978)
bestimmt worden war. Als Ergebnis wurde gefunden, daß die Eisenbindungsfähigkeit der Proben von 2,4 bis 3,7
mg pro Gramm Lactoferrin reichten, was bestätigte, daß das bovine Lactoferrin, das durch das Verfahren der
vorliegenden Erfindung erhalten wird, seine ihm innewohnende Eisenbindungsfähigkeit vollständig beibehält.
Deshalb kann das bovine Lactoferrin, das durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wird, als
ein Vorbeugungsmittel zum Schutz von Kindern gegen In-
354A400
fektion, die durch Eisen erfordernde pathogene Bakterien
verursacht wird/ und als ein Heilmittel für verschiedene Symptome, die von solchen pathogenen Bakterien herrühren,
verwendet werden, und darüber hinaus kann es auch zu Milchpulver für Kindernahrung hinzugegeben werden, um
dessen Proteinzusammensetzung an diejenige von Muttermilch anzunähern und die vorgenannte Anti-Infektionswirkung des Milchpulvers zu erhöhen.
Außerdem ist es bekannt, daß humanes und bovines Lactoferrin
als Wachstumsfaktor für spezifische Typen von
Zellen wirken kann (Biochim. Biophys. Acta, 763, 377, 1983). Während die das Wachstum beschleunigende Wirkung
von menschlichem Lactoferrin nur für humane B und T Lymphozyten bekannt ist, besitzt bovines Lactoferrin
eine Wachstum beschleunigende Wirkung nicht nur auf solche Zellen sondern auch auf Mäuselymphozyten. Aus
diesem Grund ermöglicht bovines Lactoferrin, eine wirksame Zellkultur für solche Zellen durch seine Zugabe
zu dem Kulturmedium herzustellen.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nun folgenden
Beispiele weiter erläutert. Diese Beispiele sollen jedoch den Umfang der Erfindung nicht einschränken.
Bildung eines Hybridomas, das einen monoklonalen Antikörper gegen bovines Lactoferrin erzeugen kann.
Bovines Lactoferrin (60% rein), das durch das herkömmliche Ionenaustauschverfahren erhalten worden war, wurde
in einer Phosphat-Puffer-physiologische Kochsalzlösung
(PBS), pH 7,2, die 0,15M Natriumchlorid enthielt, so ge-
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- 1
ψ -
löst, daß sich eine Konzentration von 0,3% ergab. Diese Lösung wurde mit einer gleichen Menge Freund1 schein vollständigem
Adjuvans (Freund1s complete adjuvant; Difco)
gemischt, um eine Emulsion zu bilden.
Eine BALB/c-Stamm Maus, die 6 bis 8 Wochen alt war, wurde
immunisiert, indem die Emulsion in ihre Bauchhöhle injiziert wurde. Diese Immunisierung wurde dreimal mit Intervallen
von 2 Wochen wiederholt. Sechs Tage nach der letzten Immunisierung wurde die Milz aus der Maus herausgeschnitten
und Milzzellen wurden daraus entnommen. Diese Milzzellen wurden in ein DMEM (Dulbecco-modifiziertes
minimum essential Medium) dispergiert und mit SP2/O-Ag14
Mäuse-MyelomzeIlen in einem Verhältnis von 2:1 gemischt.
Zu dieser Mischung wurde eine 50%ige Lösung von PoIyäthylenglycol (gaschromatographischer Reinheitsgrad
Molekulargewicht 4000; Merck & Co., Inc.) als ein Verschmelzungsbeschleuniger hinzugegeben. Auf diese Weise
wurde die Verschmelzung der Zellen in 10 Minuten durchgeführt. Die entstandenen verschmolzenen Zellen wurden
von dem Polyäthylenglycol durch Zentrifugieren abgetrennt, in einem HT-Medium so dispergiert, daß sich eine
Zelldichte von 1 χ 10 Zellen/ml oder weniger ergab, über 96-Loch Mikrotiterplatten versprüht und bei 37°C
unter einer Atmosphäre von 5% Kohlendioxid gezüchtet. Von dem Tag nach dem Beginn der Kultivierung (der als
der erste Tag bezeichnet wird) an wurde die Hälfte des Mediums kontinuierlich mit einem HAT-Medium ausgetauscht.
An dem 17.Tag wurden Hybridomas nach dem Festphasenverfahren
klassiert. Als Ergebnis bildeten 99% der Hybridomas eine Kolonie, während 8,3% der Hybridomas
eine positive Reaktion gegen bovines Lactoferrin zeigten.
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354U00
Dann wurden die Hybridomas, die eine positive Reaktion zeigten, auf 24-Loch Mikrotiterplatten übergeführt,
die in einer Kultur in einem HT-Medium gehalten wurden, und geklont, sobald sie zu einer Zelldichte von 1 χ 10
ZeIlen/ml angewachsen waren. Danach wurden sie in einem
HT-Medium 2 Wochen lang gezüchtet, und die Hybridomas, die eine einzige Kolonie in der Bohrung bildeten, wurden
dem zweiten Klonen unterworfen.
Dieses Klonungs- und Klassierungsverfahren wurde dreimal wiederholt. Auf diese Weise wurden Monoklone von einem
Hybridoma erhalten, das in der Lage war, einen Antikörper gegen bovines Lactoferrin zu erzeugen.
Ein Stamm des entstandenen Hybridomas, das einen monoklonalen Antikörper gegen bovines Lactoferrin erzeugen
kann, wird in der American Type Culture Collection, 12 301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852-1776
unter der Hinterlegungsnummer ATCC HB 8852 aufbewahrt.
Herstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen bovines Lactoferrin
Zellen von dem vorgenannten Hybridoma, das in der Lage ist, einen monoklonalen Antikörper gegen bovines Lactoferrin
zu erzeugen, wurden in PBS so dispergiert, daß eine Dosis von 10 Zellen/0,5 ml für jede Maus entstand,
und in die Bauchhöhle von 18 BALB/c-Stamm Mäusen injiziert, denen vorher Pristan (2,6,10,14-Tetramethylpentadecan)
verabreicht worden war.
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Sieben bis zehn Tage nach der vorgenannten Injektion wurden 86 ml aszitische Flüssigkeit aufgesammelt, durch
Zentrifugieren geklärt, mit PBS so verdünnt, daß sich eine Proteinkonzentration von 10 bis 12 mg/ml einstellte,
und dann mit 45% gesättigtem Ammoniumsulfat ausgesalzt. Die entstandene Ausfällungsfraktion wurde in
einer 0,02M tris-Pufferlösung, pH 7,9, die 0,04M Natriumchlorid
enthielt, gelöst, und diese Lösung wurde über Nacht bei niedriger Temperatur gegen die gleiche
Pufferlösung dialysiert. Unter Verwendung einer Säule (2 cm im Durchmesser und 80 cm in der Länge), die mit
200 ml DEAE Zellulose (DE-52; Whatman Co.) bepackt war, wurde das Retentat der Ionenaustauschchromatographie
unterworfen, bei der ein Ionenstärkegradient mit 0,02M tris-Pufferlösungen, pH 7,9, die 0,04M bis 0,15M Natriumchlorid
enthielten, eingestellt wurde. Auf diese Weise wurde eine Fraktion rückgewonnen, die bei einer Natriumchloridkonzentration
von 0,04m eluiert worden war. Diese Fraktion wurde weiter mit 50% gesättigtem Ammoniumsulfat
ausgefällt, und der Niederschlag, der sich so gebildet hatte, wurde in entionisiertem Wasser gelöst.
Diese Lösung wurde dialysiert und dann gefriergetrocknet, um 364 mg eines monoklonalen Antikörpers gegen bovines
Lactoferrin zu erhalten.
Ein Enzym-verkettetes-Immunsorbens-Test (enzyme-linked
immunosorbent assay; ELISA method) zeigte, daß die Antikörper vom IgG-Typ waren.
10 bis 30 mg/ml, vorzugsweise 20 mg/ml oder mehr, des gereinigten monoklonalen Antikörpers gegen bovines Lacto-
ferrin, das auf die vorstehend beschriebene Weise erhalten worden war, wurden mit einer gleichen Menge eines
Trägers für die Verwendung bei Affinitätschromatographie (Affigel-10) gemischt, und diese Mischung wurde über
Nacht bei niedriger Temperatur gerührt, um den Antikörper an dem/zubinden. Nachdem der Träger mehrere Male
mit einer 0,1M Natriumbicarbonat-Pufferlösung, pH 8,0, die 0,15m Natriumchlorid enthielt, gewaschen worden war,
wurde er mit einer gleichen Menge O,1M Äthanolamin, das
auf pH 8,0 mit Chlorwasserstoffsäure eingestellt worden
war, gemischt, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur über eine Stunde leicht gerührt, um diejenigen
funktionellen Gruppen auf dem Träger zu inaktivieren, an denen der monoklonale Antikörper gegen bovines Lactoferrin
nicht adsorbiert war. Danach wurde der Träger vollständig mit einer PBS, die 0,15M Natriumchlorid
enthielt, gewaschen und dann in eine Säule mit einer geeigneten Größe gepackt, um eine affinitätschromatographische
Säule zu bilden.
Trennung und Reinigung von bovinem Lactoferrin
2 ml des auf die vorstehend beschriebene Weise gebildeten Affinitätsgels, an dem ein monoklonaler Antikörper
gegen bovines Lactoferrin fixiert war, wurden in eine Säule mit einem inneren Durchmesser von 13 mm gepackt.
Der monoklonale Antikörper gegen bovines Lactoferrin wurde in einer Menge von 4,7 mg pro Milliliter des
Affinitätsgels fixiert. Nachdem das Affinitätsgel innerhalb
der vorgenannten Säule vollständig mit PBS gewaschen worden war, wurde eine Lösung von 5,5 mg
rohem bovinem Lactoferrin (60% rein) in 1 ml PBS durch die Säule mit einer Rate von 2,5 ml/min hindurchgeleitet.
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Dann wurde das Affinitätsgel innerhalb der Säule mit
PBS gewaschen, um die nicht adsorbierte Fraktion zu entfernen. Als Ergebnis wurde eine Spitze oder ein
"Peak" entsprechend den Verunreinigungen, die in der Probenlösung vorhanden waren, erkannt, und der Proteingehalt
dieser Fraktion war 1,7 mg. Nachdem das vorgenannte Affinitätsgel weiter vollständig mit einer PBS,
die 0,5M Natriumchlorid enthielt, und dann mit einer 0,15M Natriumchloridlösung gewaschen worden war, wurde
das adsorbierte bovine Lactoferrin mit einer Acetat-Pufferlösung,
pH 2,7, die 0,15M Natriumchlorid enthielt, eluiert. Die Reihenfolge der Maßnahmen wurde bei Raumtemperatur
durchgeführt. Die entstandene Eluat-Fraktion wurde auf pH 7 eingestellt, dialysiert gegen entionisiertes
Wasser und dann gefriergetrocknet, um 3,4 mg bovines Lactoferrin zu erhalten. Das so erhaltene bovine
Lactoferrin besaß eine Reinheit von 98% oder höher und eine Eisenbindungsfähigkeit von 3,7 mg/g. Seine
Rückgewinnung betrug 92%. Wie somit durch dieses Beispiel gezeigt wurde, ermöglicht die Verwendung der affinitätschromatographischen
Säule bei der vorliegenden Erfindung, daß bovines Lactoferrin in hoher Ausbeute rückgewonnen wird, ohne daß irgendeine Verringerung in
der Reinheit oder in der Eisenbindungsfähigkeit verursacht
wird.
Das Affinitätsgel innerhalb der Säule, die in Beispiel 1
verwendet worden war, wurde vollständig zuerst mit einer PBS, die 0,5M Natriumchlorid enthielt, und dann mit PBS,
die 0,15M Natriumchlorid enthielt, gewaschen. (Auf diese
Weise wurde die gleiche Säule in diesem und in den fol-
-regenden Beispielen wiederholt verwendet.) Danach wurden
19 ml entrahmtes Kolostrum von der Kuh durch die Säule auf die gleiche Weise, wie es in Beispiel 1 beschrieben
ist, hindurchgeleitet.
Hierbei wurde jedoch das Eluieren mit einer O,001M Acetat-Pufferlösung,
pH 4,3, die 0,15M Natriumchlorid enthielt,
durchgeführt. Als Ergebnis wurden eine Fraktion, die an dem Affinitätsgel adsorbiert war, und eine nicht
adsorbierte Fraktion erhalten. Die adsorbierte Fraktion wurde auf die gleiche Weise aufgearbeitet, wie es in
Beispiel 1 beschrieben ist, um 4,0 mg bovines Lactoferrin zu gewinnen. Das rückgewonnene bovine Lactoferrin
besaß eine Reinheit von 98% oder höher und seine Eisenbindungsfähigkeit betrug 2,7 mg/g.
Nachdem die gebrauchte Säule auf die gleiche Weise, wie es in Beispiel 2 beschrieben worden war, vollständig
gewaschen worden war, wurden 25 ml rohe entrahmte Kuhmilch
durch die Säule auf die gleiche Weise, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, geleitet.
Als Ergebnis wurden eine Fraktion, die an dem Affinitätsgel adsorbiert war, und eine nicht adsorbierte
Fraktion erhalten. Die adsorbierte Fraktion wurde auf die gleiche Weise, wie es in Beispiel 1 beschrieben
ist, aufgearbeitet, um 3,0 mg bovines Lactoferrin zu
gewinnen. Das rückgewonnene bovine Lactoferrin besaß eine Reinheit von 9 8% oder höher und seine Eisenbindungsfähigkeit
betrug 2,5 mg/g.
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Nachdem die gebrauchte Säule auf die gleiche Weise, wie es in Beispiel 2 beschrieben worden war, vollständig gewaschen
worden war, wurden 25 ml pasteurisierte entrahmte Kuhmilch auf die gleiche Weise, wie es in Beispiel
1 beschrieben worden war, durch die Säule hindurch geleitet.
Als Ergebnis wurden eine Fraktion, die an dem Affinitätsgel adsorbiert war, und eine nicht adsorbierte Fraktion
erhalten. Die adsorbierte Fraktion wurde auf die gleiche Weise, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist,
aufgearbeitet, um 1,6 mg bovines Lactoferrin zu gewinnen.
Das rückgewonnene bovine Lactoferrin besaß eine Reinheit von 98% oder höher und seine Eisenbindungsfähigkeit
betrug 2,4 mg/g.
Nachdem die gebrauchte Säule auf die gleiche Weise, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist, vollständig gewaschen
worden war, wurden 100 ml Käsemolke auf die gleiche Weise, wie es in Beispiel 1 beschrieben worden war, durch
die Säule hindurchgeleitet.
Als Ergebnis wurden eine Fraktion, die an dem Affinitätsgel adsorbiert war, und eine nicht adsorbierte Fraktion
erhalten. Die adsorbierte Fraktion wurde auf die gleiche Weise, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist,
aufgearbeitet, um 2,4 mg bovines Lactoferrin zu gewinnen. Das rückgewonnene bovine Lactoferrin besaß eine
Reinheit von 98% oder höher und seine Eisenbindungs-
BAD ORIGINAL
- 3« fähigkeit betrug 2,8 mg/g.
Nachdem die gebrauchte Säule auf die gleiche Weise, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist, vollständig gewaschen
worden war, wurden 100 ml pasteurisierte Käsemolke auf die gleiche Weise, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist,
durch die Säule hindurchgeleitet.
Als Ergebnis wurden eine Fraktion, die an dem Affinitäts gel adsorbiert war, und eine nicht adsorbierte Fraktion
erhalten. Die adsorbierte Fraktion wurde auf die gleiche Weise, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, aufgearbeitet,
um 2,2 mg bovines Lactoferrin zu gewinnen. Das rückgewonnene bovine Lactoferrin besaß eine Reinheit von
98% oder höher und seine Eisenbindungsfähigkeit betrug 3,2 mg/g.
Nachdem die gebrauchte Säule auf die gleiche Weise, wie
es in Beispiel 2 beschrieben ist, vollständig gewaschen worden war, wurden 100 ml einer 1% WPC wässrigen Lösung
auf die gleiche Weise, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, durch die Säule hindurchgelextet.
Als Ergebnis wurden eine Fraktion, die an dem Affinitätsgel adsorbiert war, und eine nicht adsorbierte
Fraktion erhalten. Die adsorbierte Fraktion wurde auf die gleiche Weise, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist,
aufgearbeitet, um 0,2 mg bovines Lactoferrin zu gewinnen. Das so rückgewonnene bovine Lactoferrin besaß eine
Reinheit von 98% oder höher und seine Eisenbindungsfähigkeit betrug 3,0 mg/g.
BAD ORIGINAL
Claims (4)
1. Verfahren zum Abtrennen einer hoch-reinen Form
von bovinem Lactoferrin von Kuhmilch und Reinigen desselben,
dadurch gekennzeichnet, daß eine affinitätschromatographische Säule
hergestellt wird, indem ein monoklonaler Antikörper gegen bovines Lactoferrin an einem unlöslichen
Träger fixiert wird, die Kuhmilch oder eine Lösung von bovinem Lactoferrin, die von Kuhmilch abgeleitet worden ist, durch die
affinitatschromatographxsche Säule hindurchgeleitet wird und dann das an der affinitatschromatogr
aphischen Säule adsorbierte bovine Lactoferrin eluiert wird.
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2. Verfahren nach Anspruch 1 ,
dadurch gekennzeichnet, daß der monoklonale Antikörper gegen bovines Lactoferrin durch ein Hybridoma erzeugt wird,
dadurch gekennzeichnet, daß der monoklonale Antikörper gegen bovines Lactoferrin durch ein Hybridoma erzeugt wird,
' das durch Verschmelzen von Milzlymphozyten von einer mit bovinem Lactoferrin immunisierten
Maus mit Mäuse-Myelomzellen erhalten worden ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 ,
dadurch gekennzeichnet, daß die affinitätschromatographische Säule durch Fixieren eines monoklonalen Antikörpers gegen bovines Lactoferrin an einem Träger, der aus einem Affinitätsgel besteht, hergestellt wird.
dadurch gekennzeichnet, daß die affinitätschromatographische Säule durch Fixieren eines monoklonalen Antikörpers gegen bovines Lactoferrin an einem Träger, der aus einem Affinitätsgel besteht, hergestellt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 ,
dadurch gekennzeichnet, daß das bovine Lactoferrin, das an der affinitätschromatographisehen Säule adsorbiert ist, bei einem pH von 4,7 oder weniger und vorzugsweise bei einem pH von 4,3 bis 2,7 eluiert wird und der pH der eluierten bovinen Lactoferrin-Fraktion sofort wieder auf Neutralität eingestellt wird.
dadurch gekennzeichnet, daß das bovine Lactoferrin, das an der affinitätschromatographisehen Säule adsorbiert ist, bei einem pH von 4,7 oder weniger und vorzugsweise bei einem pH von 4,3 bis 2,7 eluiert wird und der pH der eluierten bovinen Lactoferrin-Fraktion sofort wieder auf Neutralität eingestellt wird.
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