CH632091A5

CH632091A5 - Process for the preparation of an antiserum directed against placenta-specific glycoprotein

Info

Publication number: CH632091A5
Application number: CH800281A
Authority: CH
Inventors: Hans Dr Bohn
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1976-04-17
Filing date: 1981-12-15
Publication date: 1982-09-15
Also published as: ATA266377A; NO771316L; BE853711A; AT362057B; ES462699A1; AU2431977A; DE2616984B2; SE7704359L; ES457714A1; IL51883A0; DK168577A; IE44824L; CA1101847A; NO146747C; IE44824B1; FI771186A; NZ183878A; DE2616984A1; GB1555197A; IT1075832B

Abstract

Placenta-specific protein PP5 is used for the preparation of an antiserum directed against PP5. In this process, the animals are immunised with PP5 and the antiserum is obtained from the blood of the immunised animals.

Description

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PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung eines gegen das plazentaspezifische Protein PPs gerichteten Antiserums, dadurch gekennzeichnet, dass man eine PPs enthaltende Proteinlösung bei einem pH-Wert zwischen 4 und 9 mit einem an einen unlösli- 5 chen Träger gebundenen Antikörper gegen das PPs in Berührung bringt, den Träger, der das PPs gebunden enthält, von der flüssigen Phase abtrennt, zur Ablösung des PPs mit einem wäss-rigen Medium vom pH-Wert 2 bis 4 oder mit einer Lösung eines Proteinbindungen dissoziierenden Stoffes bei einem io pH-Wert von 4 bis 9 behandelt, mit dem erhaltenen PPs Tiere immunisiert und aus dem Blut der immunisierten Tiere das Antiserum gewinnt. PATENT CLAIM Process for the preparation of an antiserum directed against the placenta-specific protein PPs, characterized in that a protein solution containing PPs at a pH value between 4 and 9 is brought into contact with an antibody against the PPs bound to an insoluble carrier Carrier containing the PPs bound, separated from the liquid phase, treated with an aqueous medium with a pH of 2 to 4 or with a solution of a protein-binding dissociating substance at a pH of 4 to 9 to detach the PPs , immunized animals with the PPs obtained and the antiserum is obtained from the blood of the immunized animals.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines gegen das in der menschlichen Plazenta vorkommende, von 20 H. Bohn 1972 im wässrigen Plazentenextrakt gefundene und als PPs bezeichnete Plazentaprotein gerichteten Antiserums. The invention relates to a method for producing an antiserum which is directed against the placental protein which occurs in the human placenta and was found by 20 H. Bohn in 1972 in the aqueous placenta extract and is referred to as PPs.

Wie von H. Bohn in Archiv für Gynäkologie, Bd. 212, Seite 165 bis 175,1972, beschrieben, kann mit Hilfe von Antiseren, die durch Immunisierung von Plazentenfraktionen gewonnen wor- 25 den waren, im Extrakt von Plazenta eine Reihe löslicher Antigene immunologisch nachgewiesen werden. Für das mit PPs bezeichnete Protein konnte gezeigt werden, dass es offensichtlich plazentaspezifisch ist, denn die Nachweisversuche dieses Proteins mit immunologischen Standardtechniken in einer 30 Reihe von embryonalen und adulten menschlichen Organen oder auch im Humanplasma sowie Erythrozytenlysaten führten zu keiner positiven Reaktion. As described by H. Bohn in Archiv für Gynäkologie, vol. 212, pages 165 to 175, 1972, with the help of antisera, which were obtained by immunizing placenta fractions, a number of soluble antigens in the extract of placenta can be immunologically be detected. For the protein labeled PPs it could be shown that it is obviously placenta-specific, because the attempts to detect this protein with standard immunological techniques in a range of embryonic and adult human organs or in human plasma as well as erythrocyte lysates did not lead to a positive reaction.

In der elektrophoretischen Wanderung in Agar zeigt sich PPs als ßi-Globulin. In einem Polyacrylamidgel wandert es im 35 Vergleich zu Albumin = 100 mit einer relativen Beweglichkeit von 75. Aufgrund seines Verhaltens bei der Gelfiltration auf quervernetztem Dextran wurde ein Molekulargewicht für PPs von etwa 50 000 abgeleitet. Das PPs ist selbst im Plazentenextrakt in relativ niedriger Konzentration vorhanden, so dass 40 seine Reindarstellung trotz aufwendiger Verfahren der.bioche-misch präparativen Techniken bisher nicht möglich war, insbesondere weil diese Verfahren nicht hinreichend selektiv sind. In the electrophoretic migration in agar, PPs shows up as ßi-globulin. In a polyacrylamide gel it migrates in comparison to albumin = 100 with a relative mobility of 75. Because of its behavior in gel filtration on cross-linked dextran, a molecular weight for PPs of around 50,000 was derived. The PPs is even present in the placenta extract in a relatively low concentration, so that it has not yet been possible to present it in pure form despite complex biochemical preparative techniques, particularly because these processes are not sufficiently selective.

Es wurde nun überraschend gefunden, dass PPs durch Immunadsorption soweit angereichert werden kann, dass in 45 einer anschliessenden Reinigung nach konventionellen Fraktio-nierungsmethoden oder auch in einem weiteren Immunadsorp-tionsverfahren, in welchem die restlichen Serumproteine und Plazentenproteine entfernt werden können, das reine PPs erhalten werden kann. 50 It has now surprisingly been found that PPs can be enriched by immunoadsorption to the extent that pure PPs are obtained in a subsequent purification according to conventional fractionation methods or in another immunoadsorption process in which the remaining serum proteins and placenta proteins can be removed can be. 50

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Herstellung eines gegen das plazentaspezifische Protein gerichteten Antiserums durch Anreicherung des Proteins PPs aus dessen Lösungen, vorzugsweise aus dem wässrigen Extrakt von Plazenten und Immunisieren von Tieren mit dem gewönne- 55 nen Protein. The invention accordingly relates to a method for producing an antiserum directed against the placental-specific protein by enriching the protein PP from its solutions, preferably from the aqueous extract of placentas, and immunizing animals with the obtained protein.

Serologisch mit PPs verwandte Antikörper sind zur adsorp-tiven Gewinnung sowohl von PPs als auch von damit antigen-verwandten Proteinen einsetzbar. Antibodies serologically related to PPs can be used for the adsorptive extraction of both PPs and antigen-related proteins.

Die Anreicherung erfolgt durch in Berührung bringen einer 60 PPs enthaltenden Proteinlösung, vorzugsweise den wässrigen Extrakt von Plazenten - im besonderen menschlichen Plazenten -, bei einem pH-Wert zwischen 4 und 9 mit einem an einen unlöslichen Träger gebundenen Antikörper gegen das PPs durch Abtrennung des Trägers, der das PPs gebunden enthält, 65 von der flüssigen Phase und durch Behandlung zur Ablösung des PPs mit einem wässrigen Medium vom pH-Wert 2 bis 4 oder mit einer Lösung eines Proteinbindungen dissoziierenden Enrichment takes place by contacting a protein solution containing 60 PPs, preferably the aqueous extract of placentas - especially human placentas - at a pH between 4 and 9 with an antibody against the PPs bound to an insoluble carrier by separating the carrier containing the PPs bound, 65 of the liquid phase and by treatment to dissolve the PPs with an aqueous medium of pH 2-4 or dissociating with a solution of a protein binding

Stoffes bei einem pH-Wert von 4 bis 9, vorzugsweise etwa pH 7. Substance at a pH of 4 to 9, preferably about pH 7.

Als Ausgangsmaterial dient bevorzugt die menschliche Plazenta, aus der man etwa 10 bis 20 mg PPs pro Plazenta durchschnittlicher Grösse (etwa 500 bis 600 g) extrahieren kann. Zur Herstellung des wässrigen Extraktes werden zerkleinerte Pla-tenten mit Wasser oder einer geeigneten Salzlösung behandelt und die flüssige Phase gewonnen. The human placenta is preferably used as the starting material, from which approximately 10 to 20 mg of PPs per placenta of average size (approximately 500 to 600 g) can be extracted. To produce the aqueous extract, crushed plateaus are treated with water or a suitable salt solution and the liquid phase is obtained.

Geeignete Salze für die Salzlösung sind möglichst inerte Salze, wie sie als Bestandteile von Lösungen für die Extraktion von Geweben bekannt sind. Verwendet werden dazu Neutralsalze und Puffersubstanzen, insbesondere Kochsalz oder Tris-hydroxymethylaminomethan, ferner Alkalisalze der Phosphoroder Citronensäure. Zweckmässig liegen die Salzkonzentratio-nèn bei 0,1 bis 5%. Suitable salts for the salt solution are salts which are as inert as possible, as are known as components of solutions for the extraction of tissues. Neutral salts and buffer substances, in particular table salt or tris-hydroxymethylaminomethane, and also alkali metal salts of phosphoric or citric acid are used for this. The salt concentration is expediently 0.1 to 5%.

Bei dem obigen Anreicherungsverfahren kann das PPs aus üblicherweise verwendeten Plazentenextrakten, in denen es in einer Konzentration von etwa 1 bis 2 mg pro 100 ml vorliegt bis zu einer Konzentration von etwa 100 bis 1000 mg/100 ml angereichert werden. Die spezifische Anreicherung liegt bei etwa 2500 bis 5000. In the above enrichment process, the PPs can be enriched from commonly used placenta extracts in which it is present in a concentration of about 1 to 2 mg per 100 ml to a concentration of about 100 to 1000 mg / 100 ml. The specific enrichment is around 2500 to 5000.

Der für die Anreicherung des PPs benötigte Antikörper, der in bekannter Weise an einen festen Träger gebunden werden kann, wird durch Immunisierung von Tieren mit PPs erhalten. Solange das Reinprotein nicht zur Verfügung steht, wird der für die Immunisierung von Wirbeltieren, insbesondere Kaninchen, mit einer durch Fällungsverfahren in Bezug auf PPs angereicherten Plazentenfraktion hergestellt: beispielsweise nach der von H. Bohn 1972 beschriebenen Methode. The antibody required for the enrichment of the PPs, which can be bound to a solid support in a known manner, is obtained by immunizing animals with PPs. As long as the pure protein is not available, the one for the immunization of vertebrates, especially rabbits, is produced with a placenta fraction enriched by means of precipitation with respect to PPs: for example according to the method described by H. Bohn 1972.

Bei der Immunisierung mit derartigen Rohfraktionen werden Antiseren mit multispezifischen Antikörpern erhalten. Die nicht spezifisch gegen PPs gerichteten Antikörper werden mit geeigneten Antigenen aus Blutserum und Plazentenfraktionen behandelt, wonach mit Hilfe der resultierenden Antigen-Anti-körperreaktion die unspezifischen Antikörper entfernt werden können. When immunized with such crude fractions, antisera with multispecific antibodies are obtained. The antibodies not specifically directed against PPs are treated with suitable antigens from blood serum and placenta fractions, after which the unspecific antibodies can be removed with the aid of the resulting antigen-antibody reaction.

Die Gewinnung der Immunglobulinfraktion, in der sich PPs-Antikörper befinden, erfolgt in bekannter Weise. Das danach erhaltene Anti-PPs wird entsprechend bekannten Verfahren an geeignete Träger gebunden. Solche Verfahren sind beispielsweise beschrieben in Ann. Rev. Biochem.40,1971, Seite 259, Naturwissenschaften 58 (1971), Seite 389 oder Nature 314 (1967), Seite 1302. Besonders geeignete Träger sind hochpoly-mere Kohlenhydrate, wie Cellulose oder Agar, synthetische Harze, wie Polyacrylamid oder Co-Polymere aus Äthylen/ Maleinsäure-Anhydrid; auch Glaspartikel können als Träger verwendet werden. The immunoglobulin fraction in which PPs antibodies are located is obtained in a known manner. The anti-PPs obtained thereafter are bound to suitable carriers in accordance with known methods. Such methods are described, for example, in Ann. Rev. Biochem. 40, 1971, page 259, Naturwissenschaften 58 (1971), page 389 or Nature 314 (1967), page 1302. Particularly suitable carriers are highly polymeric carbohydrates, such as cellulose or agar, synthetic resins, such as polyacrylamide or Co - ethylene / maleic anhydride polymers; glass particles can also be used as carriers.

Besonders bevorzugt als Trägermaterial ist eine gereinigte Agarose in Form von kleinen Kügelchen mit einem Durchmesser von 20-200 (im an die nach der oben zuletzt genannten Methode die Antikörper gegen PPs kovalent gebunden werden können. A particularly preferred carrier material is a purified agarose in the form of small beads with a diameter of 20-200 (to which the antibodies against PPs can be covalently bound by the method mentioned last).

Für die Isolierung des PPs aus Lösungen, im besonderen aus Plazentaextrakten, die ausserdem andere Proteine und Kohlehydrate enthalten, wird die PPs-Lösung mit dem den Antikörper tragenden Adsorbens in Berührung gebracht, wobei der pH-Wert auf >4 eingestellt wird. Um eine Denaturierung der Proteine zu vermeiden, wird der pH-Wert nicht höher als 9 eingestellt. Die Salzkonzentration der Lösung ist nich kritisch. Jedoch sollten Bedingungen vermieden werden, die geeignet sind, die Bindung von Antigenen an Antikörper zu lösen. Vorteilhaft enthält die wässrige Lösung neutrale Salze und/oder Puffersubstanzen, wie sie allgemein in biochemischen Reaktionen verwendet werden, insbesondere Natriumchlorid, Phosphatpuffer, Tris-Hydroxymethylaminomethan oder andere bekannte Puffersubstanzen, wie sie beispielsweise in Hand-boock of Biochemistry, published by the Chemical Rubber Co., Cleveland, Ohio, USA, 2nd Edition S.J238, beschrieben sind. Die To isolate the PP from solutions, in particular from placenta extracts, which also contain other proteins and carbohydrates, the PPs solution is brought into contact with the adsorbent carrying the antibody, the pH being adjusted to> 4. In order to avoid denaturation of the proteins, the pH is not set higher than 9. The salt concentration of the solution is not critical. However, conditions should be avoided which are suitable for breaking the binding of antigens to antibodies. The aqueous solution advantageously contains neutral salts and / or buffer substances, as are generally used in biochemical reactions, in particular sodium chloride, phosphate buffer, tris-hydroxymethylaminomethane or other known buffer substances, as are described, for example, in Hand-boock of Biochemistry, published by the Chemical Rubber Co ., Cleveland, Ohio, USA, 2nd Edition S.J238. The

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Konzentration dieser Substanzen liegt zweckmässig im Bereich zwischen 0,01 und 2 Mol/1. Das Verhältnis Proteinlösung: Adsorbens ist zweckmässig im Bereich 1:1 bis 10:1, vorzugsweise 2:1. Das Adsorbens sollte mit der Proteinlösung 0,1 bis 5 Stunden in Berührung bleiben, damit genügend Zeit zur Verfügung steht, die Antigen-Antikörper-Bindung zu knüpfen. The concentration of these substances is expediently in the range between 0.01 and 2 mol / 1. The ratio of protein solution: adsorbent is expedient in the range from 1: 1 to 10: 1, preferably 2: 1. The adsorbent should remain in contact with the protein solution for 0.1 to 5 hours, so that there is sufficient time to form the antigen-antibody bond.

Die Adsorption und die Elution des PPs kann sowohl im sogenannten Batch-Verfahren als auch in einer Chromatogra-phie-Säule durchgeführt werden. Hierzu wird das Adsorbens von der Lösung abgetrennt, im Batch-Verfahren durch Zentri-fugierung oder Filtration mehrfach mit einer neutralen Salzlösung gewaschen, um überschüssige Salze und unspezifisch adsorbierte Verunreinigungen zu eliminieren. In dem Säulenverfahren wird die Lösung durch gründliches Spülen mit Pufferlösung aus der Säule entfernt. The adsorption and elution of the PP can be carried out both in the so-called batch process and in a chromatographic column. For this purpose, the adsorbent is separated from the solution, washed several times with a neutral salt solution in a batch process by centrifugation or filtration in order to eliminate excess salts and non-specifically adsorbed impurities. In the column process, the solution is removed from the column by rinsing thoroughly with buffer solution.

Die Elution des PPs vom Antikörper-haltigen Träger kann auf bekannte Weise durch Massnahmen erfolgen, die die Auflösung von Antigen-Antikörper-Bindungen bewirken. So erfolgt die Elution durch Behandlung des Trägers mit einem wässrigen Medium vom pH-Wert zwischen 2 und 4. Die entsprechende Lösung sollte im allgemeinen Salze und geeignete Puffersubstanzen in geeigneter Konzentration, vorzugsweise 0,2 bis 8 Mol/1 enthalten. The PP can be eluted from the antibody-containing carrier in a known manner by measures which bring about the dissolution of antigen-antibody bonds. The elution is carried out by treating the support with an aqueous medium with a pH between 2 and 4. The corresponding solution should generally contain salts and suitable buffer substances in a suitable concentration, preferably 0.2 to 8 mol / l.

Im Batch-Verfahren empfiehlt es sich, die Dispersion des Adsorbens in dieser Lösung 0,1 -2 Stunden lang zu belassen, wobei das PPs vom Immunadsorbens desorbiert wird. Im Säulenverfahren lässt man die Elutionslösung durch die Säule hin-durchfliessen. Nach Abtrennung des Adsorbens wird der pH-Wert der das PPs enthaltenden Lösung im allgemeinen auf etwa neutral (pH 6 bis 8) gestellt. Die angereicherte PPs-Lösung kann gewünschtenfalls einer weiteren Reinigung unterworfen werden. In the batch process, it is advisable to leave the dispersion of the adsorbent in this solution for 0.1-2 hours, the PPs being desorbed from the immunoadsorbent. In the column process, the elution solution is allowed to flow through the column. After the adsorbent has been separated off, the pH of the solution containing the PPs is generally set to about neutral (pH 6 to 8). If desired, the enriched PPs solution can be subjected to further purification.

Die Elution des PPs vom Antikörper-haltigen Träger erfolgt auch mit Hilfe von Proteinbindungen dissoziierenden Stoffen, beispielsweise Harnstoff- oder Guanidinlösungen oder Lösungen von sogenannten chaotropen Salzen wie NaNCh, NaBr, NaClOi, CF3COONa, NaSCN oder CChCOONa erfolgen. Die Konzentration dieser Salze im Elutionsmedium beträgt zweckmässig 2 bis 8 Mol/1. Zur Entfernung der chaotropen Salze aus der Lösung nach der Desorption des PPs und zur Abtrennung des Adsorbens kann die Lösung gegen eine Neutralsalzlösung oder Pufferlösung der Konzentration 0,1 bis 1 Mol/I dialysiert werden. The PP is also eluted from the antibody-containing carrier with the aid of substances which dissociate protein bonds, for example urea or guanidine solutions or solutions of so-called chaotropic salts such as NaNCh, NaBr, NaClOi, CF3COONa, NaSCN or CChCOONa. The concentration of these salts in the elution medium is expediently 2 to 8 mol / 1. To remove the chaotropic salts from the solution after the desorption of the PP and to separate the adsorbent, the solution can be dialyzed against a neutral salt solution or buffer solution with a concentration of 0.1 to 1 mol / l.

Das nach dieser Anreicherung erhaltene PPs besitzt einen Reinheitsgrad von 50 bis 80%. Durch weitere Reinigungsverfahren kann es auf über 99% angereichert werden. The PPs obtained after this enrichment have a degree of purity of 50 to 80%. It can be enriched to over 99% by further cleaning processes.

Falls eine Weiterreinigung des durch Immunadsorption angereicherten PPs gewünscht wird, kann diese mit gängigen Fraktionierungsverfahren vorgenommen werden. Bevorzugt werden dabei Fraktionierungsverfahren mit Hilfe eines Molekularsiebs mit dem Ziel, die PPs-Anteile in den Fraktionierungs-bereichen von Molekülen mit einem Molekulargewicht von etwa 50 000 anzureichern. Ein weiteres gängiges anwendbares Verfahren ist die Ionenaustausch-Chromatographie. Dabei werden die Ladungseigenschaften des PPs verwertet, das sich ' bekanntlich wie ein ßi-Globulin verhält. Eine weitere Möglichkeit zur Reindarstellung des PPs ist in Immunadsorptionsver-fahren gegeben, bei denen nicht die Antikörper gegen PPs sondern gegen die zu entfernenden Verunreinigungen als trägergebundene Adsorbentien Verwendung finden. Das PPs befindet sich nach Anwendung dieses Verfahrens in den nicht gebundenen Anteilen. If further purification of the PPs enriched by immunoadsorption is desired, this can be carried out using conventional fractionation processes. Fractionation processes using a molecular sieve are preferred, with the aim of enriching the PPs fractions in the fractionation regions of molecules with a molecular weight of approximately 50,000. Another common method that can be used is ion exchange chromatography. The charge properties of the PP are used, which is known to behave like a β-globulin. A further possibility for the pure presentation of the PP is given in immunoadsorption methods, in which the antibodies against PPs but not against the impurities to be removed are used as carrier-bound adsorbents. After using this procedure, the PPs is in the unbound portions.

Der Fortschritt der Reinigungsverfahren ist in jedem Falle am einfachsten mit Hilfe entsprechender Antiseren überprüfbar. Bei den jeweiligen Fraktionierungsverfahren werden diejenigen Fraktionen gewonnen, die mit dem spezifisch gegen PPs reagierenden Antiseren eine immunologische Reaktion, insbesondere eine Immunpräzipitation, zeigen. The easiest way to check the progress of the cleaning process is to use appropriate antisera. In the respective fractionation processes, those fractions are obtained which show an immunological reaction, in particular an immunoprecipitation, with the antisera reacting specifically against PPs.

Das derart angereicherte Protein PPs ist besonders geeignet, spezifisch dagegen gerichtete Antiseren herzustellen. Es wird deshalb zur Herstellung eines Anti-PPs-Serums verwendet. Dabei werden Tiere nach bekannten Methoden mit PPs s immunisiert und aus dem Blut der Tiere das Antiserum gewonnen. Mit Hilfe dieser neuen Antiseren lässt sich PPs durch immunologische Methoden, wie beispielsweise dem Hämagglu-tinationshemmungstest, der Komplimentbindungsreaktion, dem Radioimmunoassay, der Latexagglutination und ähnlichen io empfindlichen Methoden, in Körperflüssigkeiten nachweisen. The protein PPs enriched in this way is particularly suitable for specifically producing antisera directed against it. It is therefore used to make an anti-PPs serum. Animals are immunized with PPs s according to known methods and the antiserum is obtained from the blood of the animals. With the help of these new antisera, PPs can be detected in body fluids by means of immunological methods, such as the hemagglutination inhibition test, the compliment binding reaction, the radioimmunoassay, latex agglutination and similar io sensitive methods.

So lässt sich zeigen, dass PPs während der Schwangerschaft in geringen Konzentrationen im Blut der Schwangeren erscheint. Ferner ist PPs in der Tumordiagnostik von Bedeutung. Es kann im Blut und Tumorgewebe von Kranken mit trois phoblastischen Tumoren nachgewiesen werden. In der Regel bestehen die entsprechenden diagnostischen Mittel im wesentlichen aus Anti-PPs und bei bestimmten Verfahren, beispielsweise in radioimmunologischen Testsystemen, wird PPs selbst als Standardsubstanz mitgeführt. In diagnostischen Mitteln 20 zum Nachweis von gegen PPs gerichteten Antikörpern ist PPs der wesentliche Bestandteil des Reagens. It can be shown that PPs appear in the pregnant woman's blood in low concentrations during pregnancy. PPs are also important in tumor diagnostics. It can be detected in the blood and tumor tissue of patients with trois phoblastic tumors. As a rule, the corresponding diagnostic means consist essentially of anti-PPs and in certain methods, for example in radioimmunological test systems, PPs themselves are carried as the standard substance. In diagnostic means 20 for the detection of antibodies directed against PPs, PPs is the essential component of the reagent.

Das nachfolgende Beispiel erläutert das Verfahren. The following example explains the procedure.

1. Herstellung des Immunadsorbens 1. Preparation of the immunoadsorbent

25 150 ml eines Anti-PPs-Serums vom Kaninchen werden gegen 0,02 M Phosphatpuffer (pH 7,0) dialysiert und zur Abtrennung der Immunglobuline an DEAE-Zellulose chroma-tographiert. Die Immunglobulinfraktion (1,3 g Protein) wird dann mit 258 g besonders gereinigter Agarose in Kugelform 30 (Sepharose ®4B der Pharmacia Uppsala, Schweden), die mit 16,1 g Bromcyan aktiviert worden war, umgesetzt und so ko valent an diesen Träger gebunden. 25 150 ml of a rabbit anti-PPs serum are dialyzed against 0.02 M phosphate buffer (pH 7.0) and chromatographed on DEAE cellulose to separate the immunoglobulins. The immunoglobulin fraction (1.3 g protein) is then reacted with 258 g of specially purified agarose in spherical shape 30 (Sepharose®4B from Pharmacia Uppsala, Sweden), which had been activated with 16.1 g of cyanogen bromide, and so ko valent to this carrier bound.

Das Verfahren ist beschrieben von Axen R., Porath J., Embach S., Nature 214,1302(1967). The method is described by Axen R., Porath J., Embach S., Nature 214, 1302 (1967).

35 Mit Hilfe eines auf diese Weise hergestellten Immunadsorbens kann das Plazentaprotein PPs aus dessen Lösungen, insbesondere aus PPs-angereicherten Plazentaextraktfraktionen isoliert werden. 35 With the help of an immunoadsorbent produced in this way, the placental protein PPs can be isolated from its solutions, in particular from PPs-enriched placental extract fractions.

2. Anreicherung des PPs aus Plazentaextrakt 2.1 Anreicherung der PPs Eiweissfraktion 2. Enrichment of the PPs from placental extract 2.1 Enrichment of the PPs protein fraction

150 kg tiefgefrorene Plazenten werden zerkleinert und mit 150 Liter einer 0,5%igen wässrigen Natriumchlorid-Lösung extrahiert. Der Extrakt wird mit 2 normalen Natriumhydroxid 45 auf pH 8 eingestellt und mit 50 Liter einer 3%igen wässrigen Lösung von Diaminoäthoxyacridinlactat(Rivanol ®) versetzt. Nach einer Wartezeit von 1 Stunde wird der Überstand, der das PPs zusammen mit Gammaglobulin enthält, abgehebert, mit 5% festem Natriumchlorid (11 kg) zur Abscheidung des so noch in Lösung verbliebenen Rivanols versetzt, filtriert und mit 26,5%, bezogen auf das Gewicht der Flüssigkeit, festem Ammonsulfat versetzt und gut durchgerührt. Nach 1 Stunde wird der Niederschlag abfiltriert. 150 kg of frozen placenta are crushed and extracted with 150 liters of a 0.5% aqueous sodium chloride solution. The extract is adjusted to pH 8 with 2 normal sodium hydroxide 45 and 50 liters of a 3% aqueous solution of diaminoethoxyacridine lactate (Rivanol®) are added. After a waiting time of 1 hour, the supernatant, which contains the PPs together with gamma globulin, is siphoned off, mixed with 5% solid sodium chloride (11 kg) to separate off the rivanol still remaining in solution, filtered and 26.5%, based on the weight of the liquid, added solid ammonium sulfate and stirred well. After 1 hour the precipitate is filtered off.

500 g des auf dem Filter gesammelten Niederschlags wer-55 den in 500 ml destilliertem Wasser gelöst und gegen eine 0,01 molare Tris-(oxymethyl)-aminomethan (im folgenden mit «Tris» abgekürzt)-Salzsäure-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0, die 0,05% Natriumazid enthält, dialysiert. Die dialysierte Lösung wird zentrifugiert und der Überstand wird mit der gleichen Puf-60 ferlösung auf 2000 ml aufgefüllt, mit 0,1 normaler Natriumhydroxidlösung auf pH 8,0 eingestellt und mit 250 g feuchter DEAE-Cellulose eine Stunde verrührt. 500 g of the precipitate collected on the filter are dissolved in 500 ml of distilled water and against a 0.01 molar tris (oxymethyl) aminomethane (hereinafter abbreviated to “Tris”) hydrochloric acid buffer solution with a pH of 7 , 0, containing 0.05% sodium azide, dialyzed. The dialyzed solution is centrifuged and the supernatant is made up to 2000 ml with the same buffer 60 solution, adjusted to pH 8.0 with 0.1 normal sodium hydroxide solution and stirred with 250 g moist DEAE cellulose for one hour.

Sodann wird die DEAE-Cellulose durch Filtrieren von der Lösung abgetrennt, zweimal mit je einem Liter 0,01 molarem 65 Tris-Salzsäure-Puffer vom pH-Wert 8,0 gewaschen und danach dreimal mit je 500 ml 0,02molarem Tris-Salzsäure-Puffer, pH 6,5, der 0,85% Natriumchlorid und 0,05% Natriumazid enthält, eluiert. The DEAE cellulose is then separated from the solution by filtration, washed twice with one liter of 0.01 molar 65 Tris hydrochloric acid buffer with a pH of 8.0 and then three times with 500 ml of 0.02 molar Tris hydrochloric acid. Buffer, pH 6.5, containing 0.85% sodium chloride and 0.05% sodium azide, eluted.

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Den vereinigten Eluaten wird 30% Ammonsulfat, bezogen auf das Flüssigkeitsgewicht, zugesetzt und das ganze verrührt. Der Niederschlag, der das PPs enthält, wird mit 100 ml destilliertem Wasser gelöst und gegen einen 0,1 molaren Tris-Salz-säure-Puffer pH 8,0, der 1,0 Mol NaCl pro Liter und 0,1% Natriumazid enthält, dialysiert. Man erhält 200 ml einer Lösung mit etwa 6% Eiweiss und etwa 30 mg PPs. Aus dieser Fraktion kann PPs durch Immunadsorption isoliert werden. 30% ammonium sulfate, based on the liquid weight, is added to the combined eluates and the whole is stirred. The precipitate containing the PPs is dissolved with 100 ml of distilled water and against a 0.1 molar tris-hydrochloric acid buffer pH 8.0, which contains 1.0 mol NaCl per liter and 0.1% sodium azide, dialyzed. 200 ml of a solution with about 6% protein and about 30 mg PPs are obtained. PPs can be isolated from this fraction by immunoadsorption.

Das unter 2.1 vorgestellte Anreicherungsverfahren ist nicht erfindungswesentlich. Die Immunadsorption kann auch mit Plazentenextrakt direkt durchgeführt werden. The enrichment process presented under 2.1 is not essential to the invention. Immunoadsorption can also be carried out directly with placenta extract.

2.2 Immunadsorption des PPs 2.2 Immunoadsorption of the PP

Das Immunadsorbens wird in 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), der 1,0 Mol/I NaCl und 0,1% NaN3 enthält (nachstehend Pufferlösung I) suspendiert, dann in eine Chromatographiesäule gefüllt (3 x 20cm) und mit Pufferlösung I nachgespült. Dann lässt man langsam 100 ml einer PPs-haltigen Lösung durch die Säule wandern, wobei PPs immunadsorptiv gebunden wird. Man wäscht die Säule gründlich mit Puffer I nach und eluiert dann das adsorbierte Protein mit 0,5 M Glycin-HCl-Puf-fer (pH 2,5). Die PPs-haltigen Eluate werden mit 1 n NaOH auf pH 7,0 eingestellt und im Ultrafilter auf etwa 10 ml eingeengt. Ausbeute pro Adsorption ~2 mg PPs. The immunoadsorbent is suspended in 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 1.0 mol / l NaCl and 0.1% NaN3 (hereinafter buffer solution I), then poured into a chromatography column (3 x 20cm) and rinsed with buffer solution I. Then 100 ml of a PPs-containing solution is slowly allowed to pass through the column, PPs being bound by immunoadsorption. The column is washed thoroughly with buffer I and the adsorbed protein is then eluted with 0.5 M glycine-HCl buffer (pH 2.5). The PPs-containing eluates are adjusted to pH 7.0 with 1N NaOH and concentrated to about 10 ml in an ultrafilter. Yield per adsorption ~ 2 mg PPs.

Das Adsorbens in der Säule wird unmittelbar nach der Elution von PPs wieder mit Pufferlösung I neutralisiert und gründlich gewaschen; es kann erneut zu immunadsorptiven Bindung von PPs eingesetzt werden. The adsorbent in the column is neutralized again with buffer solution I immediately after the elution of PPs and washed thoroughly; it can be used again for immunoadsorptive binding of PPs.

Das durch Immunadsorption gewonnene Protein ist häufig durch unspezifisch gebundene Serumproteine (hauptsächlich IgG und daneben etwas IgA) verunreinigt. Die Abtrennung dieser Begleitproteine gelingt, z. B. durch Gelfiltration, Molekular-5 siebfraktionierung z. B. bevorzugt mit Hilfe von quervernetz-tem Dextran wie Sephadex ®G - 100; die Serumproteine können aber auch durch Immunadsorption, d. h. mit Hilfe von trägergebundenen Antikörpern gegen Serumproteine, entfernt werden. The protein obtained by immunoadsorption is often contaminated by non-specifically bound serum proteins (mainly IgG and some IgA besides). These accompanying proteins can be separated, e.g. B. by gel filtration, molecular sieve 5 fractionation z. B. preferably with the help of cross-linked dextran such as Sephadex ®G - 100; but the serum proteins can also by immunoadsorption, i. H. with the help of carrier-bound antibodies against serum proteins.

10 Das im Rahmen der Erfindung verwendete Anti-PPs-Serum wurde wie folgt erhalten: 10 The anti-PPs serum used in the invention was obtained as follows:

Es wurden Kaninchen mit dem gereinigten PPs unter Verwendung von Aluminiumhydroxid als Adjuvans über einen Zeitraum von 6 Wochen immunisiert. Rabbits were immunized with the purified PPs using aluminum hydroxide as an adjuvant over a period of 6 weeks.

15 Das PPs wird in physiologischer Kochsalzlösung gelöst (Konzentration 0,06 mg/3 ml) und unter Zusatz von Aluminiumhydroxid zu einer Suspension verrührt. Die Kaninchen erhalten an 5 aufeinander folgenden Tagen je 0,06 mg Protein in 3 ml Suspension/Tier i.v. injiziert. 15 The PPs is dissolved in physiological saline (concentration 0.06 mg / 3 ml) and mixed with the addition of aluminum hydroxide to a suspension. The rabbits received 0.06 mg protein in 3 ml suspension / animal i.v. on 5 consecutive days. injected.

20 Anschliessend lässt man die Tiere 9 Tage ruhen. Dann immunisiert man wieder an 5 aufeinander folgenden Tagen mit der oben angegebenen gleichen Menge Antigen, lässt die Tiere wieder 9 Tage ruhen und injiziert schliesslich nochmals an 5 aufeinander folgenden Tagen j e 0,06 mg des Antigens. Nach 25 einer erneuten Wartezeit von 7 bis 9 Tagen werden die Tiere entblutet. Nach dem Gerinnen des Blutes wird das Serum vom Blutkuchen abgeschleudert und gewonnen. 20 The animals are then left to rest for 9 days. Then again immunize on 5 consecutive days with the same amount of antigen given above, let the animals rest again for 9 days and finally inject again 0.06 mg of the antigen on 5 consecutive days. After another waiting period of 7 to 9 days, the animals are bled to death. After the blood has clotted, the serum is thrown off the blood cake and collected.