CH630643A5

CH630643A5 - Process for concentrating a placenta-specific glycoprotein.

Info

Publication number: CH630643A5
Application number: CH465377A
Authority: CH
Inventors: Hans Dr Bohn
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1976-04-17
Filing date: 1977-04-14
Publication date: 1982-06-30
Also published as: ATA266377A; NO771316L; BE853711A; AT362057B; ES462699A1; AU2431977A; DE2616984B2; SE7704359L; ES457714A1; CH632091A5; IL51883A0; DK168577A; IE44824L; CA1101847A; NO146747C; IE44824B1; FI771186A; NZ183878A; DE2616984A1; GB1555197A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Anreicherung eines in der menschlichen Plazenta vorkommenden von H. Bohn 1972 im wässrigen Plazentenextrakt gefundenen als PP5 bezeichneten Plazentaproteins sowie dessen Verwendung zum Nachweis von PP5 und von gegen PP5 gerichteten Antikörpern. The invention relates to a method for the enrichment of a placenta protein found in the human placenta by H. Bohn in 1972 in the aqueous placenta extract, designated as PP5, and its use for the detection of PP5 and antibodies directed against PP5.

Wie von H. Bohn in Archiv für Gynäkologie, Bd 212, Seite 165 bis 175, 1972, beschrieben, kann mit Hilfe von Antiseren, die durch Immunisierung von Plazentenfraktionen gewonnen worden waren, im Extrakt von Plazenta eine Reihe löslicher Antigene immunologisch nachgewiesen werden. Für das mit PPS bezeichnete Protein konnte gezeigt werden, dass es offensichtlich plazentaspezifisch ist, denn die Nach weis versuche dieses Proteins mit immunologischen Standardtechniken in einer Reihe von embryonalen und adulten menschlichen Organen oder auch im Humanplasma sowie Erythrozytenlysaten führten zu keiner positiven Reaktion. As described by H. Bohn in Archives for Gynecology, Vol. 212, pages 165 to 175, 1972, a number of soluble antigens can be immunologically detected in the extract of placenta with the aid of antisera which have been obtained by immunizing placenta fractions. For the protein labeled PPS it could be shown that it is obviously placenta-specific, because the detection of this protein with standard immunological techniques in a number of embryonic and adult human organs or in human plasma and erythrocyte lysates did not lead to a positive reaction.

In der elektrophoretischen Wanderung in Agar zeigt sich PP5 als ßj-Globulin. In einem Polyacrylamidgel wandert es im Vergleich zu Albumin = 100 mit einer relativen Beweglichkeit von 75. Aufgrund seines Verhaltens bei der Gelfiltration auf quervernetztem Dextran wurde ein Molekulargewicht für PP5 von etwa 50 000 abgeleitet. Das PP5 ist selbst im Plazentenextrakt in relativ niedriger Konzentration vorhanden, so dass seine Reindarstellung trotz aufwendiger Verfahren der biochemisch präparativen Techniken bisher nicht möglich war, insbesondere weil diese Verfahren nicht hinreichend selektiv sind. In the electrophoretic migration in agar, PP5 shows up as ßj-globulin. In a polyacrylamide gel it migrates compared to albumin = 100 with a relative mobility of 75. Because of its behavior in gel filtration on cross-linked dextran, a molecular weight for PP5 of about 50,000 was derived. The PP5 is present in the placenta extract in a relatively low concentration, so that it has not been possible to display it in pure form, despite the complex procedures of biochemical preparative techniques, especially because these procedures are not sufficiently selective.

Es wurde nun überraschend gefunden, dass PP5 durch Immunadsorption soweit angereichert werden kann, dass in einer anschliessenden Reinigung nach konventionellen Frak-tionierungsmethoden oder auch in einem weiteren Immun-adsorptionsverfahren, in welchem die restlichen Serumproteine und Plazentenproteine entfernt werden können, das reine PP5 erhalten werden kann. It has now surprisingly been found that PP5 can be enriched by immunoadsorption to the extent that pure PP5 is obtained in a subsequent purification according to conventional fractionation methods or in a further immunosorption process in which the remaining serum proteins and placenta proteins can be removed can.

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Anreicherung des Proteins PP5 aus dessen Lösungen, vorzugsweise aus dem wässrigen Extrakt von Plazenten. The invention accordingly relates to a process for the enrichment of the protein PP5 from its solutions, preferably from the aqueous extract of placentas.

Serologisch mit PP5 verwandte Antikörper sind zur ad-sorptiven Gewinnung sowohl von PP5 als auch von damit antigenverwandten Proteinen einsetzbar. Antibodies serologically related to PP5 can be used for the adsorptive extraction of both PP5 and antigen-related proteins.

Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man eine PP5 enthaltende Proteinlösung, vorzugsweise den wässrigen Extrakt von Plazenten — im besonderen menschlichen Plazenten —, bei einem pH-Wert zwischen 4 und 9 mit einem an einen unlöslichen Träger gebundenen Antikörper gegen das PP5 in Berührung bringt, den Träger, der das PP5 gebunden enthält, von der flüssigen Phase abtrennt und zur Ablösung des PP5 mit einem wässrigen Medium vom pH-Wert 2-4 oder mit einer Lösung eines Proteinbindungen dissoziierenden The method is characterized in that a protein solution containing PP5, preferably the aqueous extract of placentas - in particular human placentas - is brought into contact at a pH value between 4 and 9 with an antibody against the PP5 bound to an insoluble carrier, the carrier containing the PP5 bound, separated from the liquid phase and dissociating to dissolve the PP5 with an aqueous medium of pH 2-4 or with a solution of a protein bond

Stoffes bei einem pH-Wert von 4-9, vorzugsweise etwa pH 7, behandelt. Fabric treated at a pH of 4-9, preferably about pH 7.

Als Ausgangsmaterial dient bevorzugt die menschliche Plazenta, aus der man etwa 10-20 mg PP5 pro Plazenta durchschnittlicher Grösse (ca. 500-600 g) extrahieren kann. Zur Herstellung des wässrigen Extraktes werden zerkleinerte Plazenten mit Wasser oder einer geeigneten Salzlösung behandelt und die flüssige Phase gewonnen. The human placenta is preferably used as the starting material, from which approximately 10-20 mg PP5 per placenta of average size (approximately 500-600 g) can be extracted. To produce the aqueous extract, crushed placenta are treated with water or a suitable salt solution and the liquid phase is obtained.

Geeignete Salze für die Salzlösung sind möglichst inerte Salze, wie sie als Bestandteile von Lösungen für die Extraktion von Geweben bekannt sind. Verwendet werden dazu Neutralsalze und Puffersubstanzen, insbesondere Kochsalz oder Tris-hydroxymethylaminomethan, ferner Alkalisalze der Phosphor- oder Citronensäure. Zweckmässig liegen die Salzkonzentrationen bei 0,1 bis 5%. Suitable salts for the salt solution are salts which are as inert as possible, as are known as components of solutions for the extraction of tissues. For this purpose, neutral salts and buffer substances, in particular table salt or tris-hydroxymethylaminomethane, and also alkali salts of phosphoric or citric acid are used. The salt concentrations are expediently from 0.1 to 5%.

Bei dem erfindungsgemässen Verfahren kann das PP5 aus üblicherweise verwendeten Plazentenextrakten, in denen es in einer Konzentration von etwa 1-2 mg pro 100 ml vorliegt bis zu einer Konzentration von etwa 100-1 000 mg/ 100 ml angereichert werden. Die spezifische Anreicherung liegt bei etwa 2 500-5 000. In the method according to the invention, the PP5 can be enriched from commonly used placenta extracts in which it is present in a concentration of approximately 1-2 mg per 100 ml up to a concentration of approximately 100-1000 mg / 100 ml. The specific enrichment is around 2,500-5,000.

Der für die Anreicherung des PP5 benötigte Antikörper, der in bekannter Weise an einen festen Träger gebunden werden kann, wird durch Immunisierung von Tieren mit PP5 erhalten. Solange das Reinprotein nicht zur Verfügung steht, wird der für die Immunisierung von Wirbeltieren, insbesondere Kaninchen, mit einer durch Fällungsverfahren in bezug auf PP5 angereicherten Plazentenfraktion hergestellt: beispielsweise nach der von H. Bohn 1972 beschriebenen Methode. The antibody required for the enrichment of the PP5, which can be bound to a solid support in a known manner, is obtained by immunizing animals with PP5. As long as the pure protein is not available, the one for the immunization of vertebrates, especially rabbits, is produced with a placenta fraction enriched by PP5 precipitation processes: for example according to the method described by H. Bohn 1972.

Bei der Immunisierung mit derartigen Rohrfraktionen werden Antiseren mit multispezifischen Antikörpern erhalten. Die nicht spezifisch gegen PPS gerichteten Antikörper werden mit geeigneten Antigenen aus Blutserum und Plazentenfraktionen behandelt, wonach mit Hilfe der resultierenden Anti-gen-Antikörperreaktion die unspezifischen Antikörper entfernt werden könen. When immunized with such tube fractions, antisera with multispecific antibodies are obtained. The antibodies not specifically directed against PPS are treated with suitable antigens from blood serum and placenta fractions, after which the non-specific antibodies can be removed with the aid of the resulting anti-gene antibody reaction.

Die Gewinnung der Immunoglobulinfraktion, in der sich PPä-Antikörper befinden, erfolgt in bekannter Weise. Das danach erhaltene Anti-PP5 wird entsprechend bekannten Verfahren an geeignete Träger gebunden. Solche Verfahren sind beispielsweise beschrieben in Ann. Rev. Biochem. 40, 1971, Seite 259, Naturwissenschaften 58 (1971), Seite 389 oder Nature 314 (1967), Seite 1302. Besonders geeignete Träger sind hochpolymere Kohlenhydrate, wie Cellulose oder Agar, synthetische Harze, wie Polyacrylamid oder Co-Polymere aus Äthylen/Maleinsäure-Anhydrid; auch Glaspartikel können als Träger verwendet werden. The immunoglobulin fraction in which PPa antibodies are located is obtained in a known manner. The anti-PP5 obtained after this is bound to suitable carriers according to known methods. Such methods are described, for example, in Ann. Rev. Biochem. 40, 1971, page 259, Naturwissenschaften 58 (1971), page 389 or Nature 314 (1967), page 1302. Particularly suitable carriers are highly polymeric carbohydrates, such as cellulose or agar, synthetic resins, such as polyacrylamide or copolymers of ethylene / maleic acid -Anhydride; glass particles can also be used as carriers.

Besonders bevorzugt als Trägermaterial ist eine gereinigte Agarose in Form von kleinen Kügelchen mit einem Durchmesser von 20-200 p,m an die nach der oben zuletzt genannten Methode die Antikörper gegen PP5 kovalent gebunden werden können. A particularly preferred carrier material is a purified agarose in the form of small beads with a diameter of 20-200 μm, to which the antibodies against PP5 can be covalently bound according to the last-mentioned method.

Für die Isolierung des PP5 aus Lösungen, im Besonderen aus Plazentaextrakten, die ausserdem andere Proteine und Kohlehydrate enthalten, wird die PP5-Lösung mit dem den Antikörper tragenden Adsorbens in Berührung gebracht, wobei der pH-Wert auf > 4 eingestellt wird. Um eine Denaturierung der Proteine zu vermeiden, wird der pH-Wert nicht höher als 9 eingestellt. Die Salzkonzentration der Lösung ist nicht kritisch. Jedoch sollten Bedingungen vermieden werden, die geeignet sind, die Bindung von Antigenen an Antikörper zu lösen. Vorteilhaft enthält die wässrige Lösung neutrale Salze und/oder Puffersubstanzen, wie sie allg. in biochemischen Reaktionen verwendet werden, insbesondere Natriumchlorid, Phosphatpuffer, Tris-Hydroxymethylamino-methan oder andere bekannte Puffersubstanzen, wie sie beispielsweise in Handbook of Biochemistry, Published by The To isolate the PP5 from solutions, in particular from placenta extracts, which also contain other proteins and carbohydrates, the PP5 solution is brought into contact with the adsorbent carrying the antibody, the pH being adjusted to> 4. In order to avoid denaturation of the proteins, the pH is not set higher than 9. The salt concentration of the solution is not critical. However, conditions should be avoided which are suitable for breaking the binding of antigens to antibodies. The aqueous solution advantageously contains neutral salts and / or buffer substances, as are generally used in biochemical reactions, in particular sodium chloride, phosphate buffer, tris-hydroxymethylamino-methane or other known buffer substances, as are described, for example, in the Handbook of Biochemistry, Published by The

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Chemical Rubber Co., Cleveland, Ohio, USA, 2nd Edition S.J238, beschrieben sind. Die Konzentration dieser Substanzen liegt zweckmässig im Bereich zwischen 0,01 und 2 Mol/1. Das Verhältnis Proteinlösung:Adsorbens ist zweckmässig im Bereich 1:1 -10:1, vorzugsweise 2:1. Das Adsorbens sollte mit der Proteinlösung 0,1 bis 5 Stunden in Berührung bleiben, damit genügend Zeit zur Verfügung steht, die Antigen-Antikörper-Bindung zu knüpfen. Chemical Rubber Co., Cleveland, Ohio, USA, 2nd Edition S.J238. The concentration of these substances is expediently in the range between 0.01 and 2 mol / 1. The ratio of protein solution: adsorbent is expedient in the range 1: 1 -10: 1, preferably 2: 1. The adsorbent should remain in contact with the protein solution for 0.1 to 5 hours, so that there is sufficient time to form the antigen-antibody bond.

Die Adsorption und die Elution des PP5 kann sowohl im sogenannten batch-Verfahren als auch in einer Chromatographie-Säule durchgeführt werden. Hierzu wird das Adsorbens von der Lösung abgetrennt, im batch-Verfahren durch Zentrifugierung oder Filtration mehrfach mit einer neutralen Salzlösung gewaschen, um überschüssige Salze und unspezifisch adsorbierte Verunreinigungen zu eliminieren. In dem Säulenverfahren wird die Lösung durch gründliches Spülen mit Pufferlösung aus der Säule entfernt. The adsorption and elution of the PP5 can be carried out both in the so-called batch process and in a chromatography column. For this purpose, the adsorbent is separated from the solution, washed several times with a neutral salt solution in a batch process by centrifugation or filtration in order to eliminate excess salts and non-specifically adsorbed impurities. In the column process, the solution is removed from the column by rinsing thoroughly with buffer solution.

Die Elution des PP5 vom Antikörper-haltigen Träger kann auf bekannte Weise durch Massnahmen erfolgen, die die Auflösung von Antigen-Antikörper-Bindungen bewirken. So erfolgt die Elution durch Behandlung des Trägers mit einem wässrigen Medium vom pH-Wert 2 und 4. Die entsprechende Lösung sollte im allgemeinen Salze und geeignete Puffersubstanzen in geeigneter Konzentration, vorzugsweise 0,2-8 Mol/1 enthalten. The PP5 can be eluted from the antibody-containing carrier in a known manner by measures which bring about the dissolution of antigen-antibody bonds. The elution is carried out by treating the support with an aqueous medium with a pH of 2 and 4. The corresponding solution should generally contain salts and suitable buffer substances in a suitable concentration, preferably 0.2-8 mol / l.

Im batch-Verfahren empfiehlt es sich, die Dispersion des Adsorbens in dieser Lösung 0,1-2 Stunden lang zu belassen, wobei das PP5 vom Immunadsorbens desorbiert wird. Im Säulenverfahren lässt man die Elutionslösung durch die Säule hindurchfliessen. Nach Abtrennung des Adsorbens wird der pH-Wert der das PP5 enthaltenden Lösung im allgemeinen auf etwa neutral (pH 6-8) gestellt. Die angereicherte PP5-Lö-sung kann gewünschtenfalls einer weiteren Reinigung unterworfen werden. In the batch process, it is advisable to leave the dispersion of the adsorbent in this solution for 0.1-2 hours, the PP5 being desorbed from the immunoadsorbent. In the column process, the elution solution is allowed to flow through the column. After the adsorbent has been separated off, the pH of the solution containing the PP5 is generally set to approximately neutral (pH 6-8). The enriched PP5 solution can, if desired, be subjected to further cleaning.

Die Elution des PP5 vom Antikörper-haltigen Träger erfolgt auch mit Hilfe von Proteinbindungen dissoziierenden Stoffen, beispielsweise Harnstoff- oder Guanidinlösungen oder Lösungen von sogenannten chaotropen Salzen wie NaN03 NaBr, NaC104, CF3COONa, NaSCN oder CC13-COONa. Die Konzentration dieser Salze im Elutionsme-dium beträgt zweckmässig 2 bis 8 Mol/1. Zur Entfernung der chaotropen Salze aus der Lösung nach der Desorption des PP5 und zur Abtrennung des Adsorbens kann die Lösung gegen eine Neutralsalzlösung oder Pufferlösung der Konzentration 0,1 bis 1 Mol/1 dialysiert werden. The PP5 is also eluted from the antibody-containing carrier with the aid of substances which dissociate protein bonds, for example urea or guanidine solutions or solutions of so-called chaotropic salts such as NaN03 NaBr, NaC104, CF3COONa, NaSCN or CC13-COONa. The concentration of these salts in the elution medium is expediently 2 to 8 mol / 1. To remove the chaotropic salts from the solution after the desorption of the PP5 and to separate the adsorbent, the solution can be dialyzed against a neutral salt solution or buffer solution with a concentration of 0.1 to 1 mol / 1.

Das nach diesem Verfahren erhaltene PP5 besitzt einen Reinheitsgrad von 50 bis 80%. Durch weitere Reinigungsverfahren kann es auf über 99 % angereichert werden. The PP5 obtained by this process has a purity of 50 to 80%. It can be enriched to over 99% by further cleaning processes.

Falls eine Weiterreinigung des durch Immunadsorption angereicherten PP5 gewünscht wird, kann diese mit gängigen Fraktionierungsverfahren vorgenommen werden. Bevorzugt werden dabei Fraktionierungsverfahren mit Hilfe eines Molekularsiebs mit dem Ziel, die PP5-Anteile in den Fraktionie-rungsbereichen von Molekülen mit einem Molekulargewicht von etwa 50 000 anzureichern. Ein weiteres gängiges anwendbares Verfahren ist die Ionenaustausch-Chromatographie. Dabei werden die Ladungseigenschaften des PP6 verwertet, das sich bekanntlich wie ein ß^Globulin verhält Eine weitere Möglichkeit zur Rein-Darstellung des PP5 ist in Im-munadsorptionsverfahren gegeben, bei denen nicht die Antikörper gegen PP5 sondern gegen die zu entfernenden Verunreinigungen als trägergebundene Adsorbentien Verwendung finden. Das PP5 befindet sich nach Anwendung dieses Verfahrens in den nicht gebundenen Anteilen. If further purification of the PP5 enriched by immunoadsorption is desired, this can be carried out using conventional fractionation processes. Fractionation processes with the aid of a molecular sieve are preferred, with the aim of enriching the PP5 fractions in the fractionation regions of molecules with a molecular weight of approximately 50,000. Another common method that can be used is ion exchange chromatography. The charge properties of the PP6 are exploited, which is known to behave like a ß ^ globulin. Another possibility for the pure representation of the PP5 is in immunoadsorption processes, in which the antibodies against PP5 but not against the contaminants to be removed are used as carrier-bound adsorbents Find. The PP5 is in the unbound portions after using this procedure.

Der Fortschritt der Reinigungsverfahren ist in jedem Falle am einfachsten mit Hilfe entsprechender Antiseren überprüfbar. Bei den jeweiligen Fraktionierungsverfahren werden diejenigen Fraktionen vewonnen, die mit den spezifisch gegen The easiest way to check the progress of the cleaning process is to use appropriate antisera. In the respective fractionation processes, those fractions are won that match those specifically against

PP5 reagierenden Antiseren eine immunologische Reaktion, insbesondere eine Immunpräzipitation, zeigen. PP5-reacting antisera show an immunological reaction, in particular immunoprecipitation.

Das nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhältliche PP5 ist besonders geeignet, spezifisch dagegen gerichtete Antiseren herzustellen. Mit dem erfindungsgemäss erhältlichen PP5 kann deshalb ein Anti-PPr>-Serum hergestellt werden. Dabei werden Tiere nach bekannten Methoden mit PP5 immunisiert und aus dem Blut der Tiere das Antiserum gewonnen. Mit Hilfe dieser neuen Antiseren lässt sich PP5 durch immunologische Methoden, wie beispielsweise dem Häm-agglutinationshemmungstest, der Komplimentbindungsreaktion, dem Radioimmunoassay, der Latexagglutination u. ähnlichen empfindlichen Methoden, in Körperflüssigkeiten nachweisen. The PP5 obtainable by the process according to the invention is particularly suitable for specifically producing antisera directed against it. An anti-PPr> serum can therefore be produced with the PP5 obtainable according to the invention. Animals are immunized with PP5 using known methods and the antiserum is obtained from the blood of the animals. With the help of these new antisera, PP5 can be obtained by immunological methods such as the heme agglutination inhibition test, the compliment binding reaction, the radioimmunoassay, the latex agglutination and the like. similar sensitive methods, in body fluids.

So last sich zeigen, dass PP5 während der Schwangerschaft in geringen Konzentrationen im Blut der Schwangeren erscheint. Ferner ist PP5 in der Tumordiagnostik von Bedeutung. Es kann im Blut und Tumorgewebe von Kranken mit trophoblastischen Tumoren nachgewiesen werden. In der Regel bestehen die entsprechenden diagnostischen Mittel im wesentlichen aus Anti-PP5, und bei bestimmten Verfahren, beispielsweise in radioimmunologischen Testsystemen, wird PP5 selbst als Standardsubstanz mitgeführt. In diagnostischen Mitteln zum Nachweis von gegen PP5 gerichteten Antikörpern ist PP5 der wesentliche Bestandteil des Reagens. It can be shown that PP5 appears in the pregnant woman's blood in low concentrations during pregnancy. PP5 is also important in tumor diagnosis. It can be detected in the blood and tumor tissue of patients with trophoblastic tumors. As a rule, the corresponding diagnostic agents essentially consist of anti-PP5, and in certain methods, for example in radioimmunological test systems, PP5 itself is carried as the standard substance. In diagnostic agents for the detection of antibodies directed against PP5, PP5 is the essential component of the reagent.

Das nachfolgende Beispiel erläutert das Verfahren. The following example explains the procedure.

1. Herstellung des Immunadsorbens 1. Preparation of the immunoadsorbent

150 ml eines Anti-PP5-Serums vom Kaninchen werden gegen 0,02M Phosphatpuffer (pH 7,0) dialysiert und zur Abtrennung der Immunglobuline an DEAE-Zellulose chromato-graphiert. Die Immunglobulinfraktion (1,3 g Protein) wird dann mit 258 g besonders gereinigter Agarose in Kugelform (Sepharose ® 4B der Pharmacia Uppsala, Schweden), die mit 16,1 g Bromcyan aktiviert worden war, umgesetzt und so kovalent an diesen Träger gebunden. 150 ml of a rabbit anti-PP5 serum are dialyzed against 0.02M phosphate buffer (pH 7.0) and chromatographed on DEAE cellulose to separate the immunoglobulins. The immunoglobulin fraction (1.3 g protein) is then reacted with 258 g of specially purified spherical agarose (Sepharose® 4B from Pharmacia Uppsala, Sweden), which had been activated with 16.1 g of cyanogen bromide, and thus covalently bound to this support.

Das Verfahren ist beschrieben von Axen R., Porath J., Embach S.. Nature 214, 1302, (1967). The method is described by Axen R., Porath J., Embach S. .. Nature 214, 1302, (1967).

Mit Hilfe eines auf diese Weise hergestellten Immunadsorbens kann das Plazentaprotein PP5 aus dessen Lösungen, insbesondere aus PP5-angereicherten Plazentaextraktfraktionen isoliert werden. With the help of an immunoadsorbent produced in this way, the placental protein PP5 can be isolated from its solutions, in particular from PP5-enriched placental extract fractions.

2. Anreicherung des PP5 aus Plazentaextrakt 2. Enrichment of PP5 from placental extract

2.1. Anreicherung der PP5 Eiweissfraktion 2.1. Enrichment of the PP5 protein fraction

150 kg tiefgefrorene Plazenten werden zerkleinert und mit 150 Liter einer 0,5%igen wässrigen Natriumchlorid-Lösung extrahiert. Der Extrakt wird mit 2 normalem Natriumhydroxid auf pH 8 eingestellt und mit 50 Liter einer 3 %igen wässrigen Lösung von Diaminoäthoxyacridinlactat (Rivanol®) versetzt. Nach einer Wartezeit von 1 Stunde wird der Überstand, der das PPS zusammen mit Gammaglobulin enthält, abgehebert, mit 5% festem Natriumchlorid (11 kg) zur Ab-scheidung des noch in Lösung verbliebenen Rivanols versetzt, filtriert und mit 26,5%, bezogen auf das Gewicht der Flüssigkeit, festem Ammonsulfat versetzt und gut durchgerührt. Nach 1 Stunde wird der Niederschlag abfiltriert. 150 kg of frozen placenta are crushed and extracted with 150 liters of a 0.5% aqueous sodium chloride solution. The extract is adjusted to pH 8 with 2 normal sodium hydroxide and 50 liters of a 3% aqueous solution of diaminoethoxyacridine lactate (Rivanol®) are added. After a waiting time of 1 hour, the supernatant, which contains the PPS together with gamma globulin, is siphoned off, mixed with 5% solid sodium chloride (11 kg) to separate off the rivanol which is still in solution, filtered and obtained with 26.5% to the weight of the liquid, solid ammonium sulfate and stirred well. After 1 hour the precipitate is filtered off.

500 g des auf dem Filter gesammelten Niederschlags werden in 500 ml destilliertem Wasser gelöst und gegen eine 0,01 molare Tris-(oxymethyl)-aminomethan (im folgenden mit «Tris» abgekürzt)-Salzsäure-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0, die 0,05 % Natriumazid enthält, dialysiert. Die dialysierte Lösung wird zentrifugiert und der Überstand wird mit der gleichen Pufferlösung auf 2000 ml aufgefüllt, mit 0,1 normaler Natriumhydroxidlösung auf pH 8,0 eingestellt und mit 250 g feuchter DEAE-Cellulose eine Stunde verrührt. 500 g of the precipitate collected on the filter are dissolved in 500 ml of distilled water and against a 0.01 molar tris (oxymethyl) aminomethane (hereinafter abbreviated to "Tris") hydrochloric acid buffer solution with a pH of 7.0. containing 0.05% sodium azide, dialyzed. The dialyzed solution is centrifuged and the supernatant is made up to 2000 ml with the same buffer solution, adjusted to pH 8.0 with 0.1 normal sodium hydroxide solution and stirred with 250 g of moist DEAE cellulose for one hour.

Sodann wird die DEAE-Cellulose durch Filtrieren von der Lösung abgetrennt, zweimal mit je einem Liter 0,01 mo5 The DEAE cellulose is then separated from the solution by filtration, twice with one liter of 0.01 mo5 each

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larem Tris-Salzsäure-Puffer vom pH-Wert 8,0 gewaschen und danach dreimal mit je 500 ml 0,02 molarem Tris-Salzsäure-Puffer, pH 6,5, der 0,85% Natriumchlorid und 0,05% Natriumazid enthält, eluiert. washed larem Tris-hydrochloric acid buffer of pH 8.0 and then three times with 500 ml of 0.02 molar Tris-hydrochloric acid buffer, pH 6.5, which contains 0.85% sodium chloride and 0.05% sodium azide, eluted.

Den vereinigten Eluaten wird 30% Ammonsulfat, bezogen auf das Flüssigkeitsgewicht, zugesetzt und das ganze verrührt. Der Niederschlag, der das PP5 enthält, wird mit 100 ml destilliertem Wasser gelöst und gegen einen 0,1 molaren Tris-Salzsäure-Puffer pH 8,0, der 1,0 Mol NaCl pro Liter und 0,1 % Natriumazid enthält, dialysiert. Man erhält 200 ml einer Lösung mit ca. 6% Eiweiss und etwa 30 mg PP5. Aus dieser Fraktion kann PP5 durch Immunadsorption isoliert werden. 30% ammonium sulfate, based on the liquid weight, is added to the combined eluates and the whole is stirred. The precipitate, which contains the PP5, is dissolved with 100 ml of distilled water and dialyzed against a 0.1 molar tris-hydrochloric acid buffer pH 8.0, which contains 1.0 mol NaCl per liter and 0.1% sodium azide. 200 ml of a solution with about 6% protein and about 30 mg PP5 are obtained. PP5 can be isolated from this fraction by immunoadsorption.

Das unter 2.1 vorgestellte Anreicherungsverfahren ist nicht erfindungswesentlich. Die Immunadsorption kann auch mit Plazentenextrakt direkt durchgeführt werden. The enrichment process presented under 2.1 is not essential to the invention. Immunoadsorption can also be carried out directly with placenta extract.

2.2. Immunadsorption des PP5 2.2. Immunoadsorption of the PP5

Das Immunadsorbens wird in 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), der 1,0 Mol/1 NaCl und 0,1% NaN3 enthält (nachstehend Pufferlösung I) suspendiert, dann in eine Chromatographiesäule gefüllt (3 X 20 cm) und mit Pufferlösung I nachgespült. Dann lässt man langsam 100 ml einer PP5-haltigen Lösung durch die Säule wandern, wobei PP5 immunadsorp-tiv gebunden wird. Man wäscht die Säule gründlich mit Puffer I nach und eluiert dann das adsorbierte Protein mit 0,5 M Glycin-HCl-Puffer (pH 2,5). Die PP5-haltigen Eluate werden mit 1 n NaOH auf pH 7,0 eingestellt und im Ultrafilter auf ca. 10 ml eingeengt. Ausbeute pro Adsorption — 2 mg PP5. The immunoadsorbent is suspended in 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 1.0 mol / 1 NaCl and 0.1% NaN3 (hereinafter buffer solution I), then filled into a chromatography column (3 × 20 cm) and rinsed with buffer solution I. Then 100 ml of a solution containing PP5 is slowly allowed to pass through the column, PP5 being bound immunoadsorbently. The column is washed thoroughly with buffer I and the adsorbed protein is then eluted with 0.5 M glycine-HCl buffer (pH 2.5). The PP5-containing eluates are adjusted to pH 7.0 with 1N NaOH and concentrated to approx. 10 ml in an ultrafilter. Yield per adsorption - 2 mg PP5.

Das Adsorbens in der Säule wird unmittelbar nach der Elution von PP5 wieder mit Pufferlösung I neutralisiert und gründlich gewaschen; es kann dann erneut zur immunadsorp-tiven Bindung von PP5 eingesetzt werden. The adsorbent in the column is neutralized again immediately after the elution of PP5 with buffer solution I and washed thoroughly; it can then be used again for the immunoadsorbative binding of PP5.

Das durch Immunadsorption gewonnene Protein ist häufig durch unspezifisch gebundene Serumproteine (hauptsächlich 5 IgG und daneben etwas IgA) verunreinigt. Die Abtrennung dieser Begleitproteine gelingt, z.B. durch Gelfiltration, Mole-kularsiebfraktionierung z.B. bevorzugt mit Hilfe von quer-vernetztem Dextran wie Sephadex® G-100; die Serumproteine können aber auch durch Immunadsorption, d.h. mit Hilfe von io trägergebundenen Antikörpern gegen Serumproteine, entfernt werden. The protein obtained by immunoadsorption is often contaminated by nonspecifically bound serum proteins (mainly 5 IgG and some IgA besides). These accompanying proteins can be separated, e.g. by gel filtration, molecular sieve fractionation e.g. preferably with the help of cross-linked dextran such as Sephadex® G-100; however, the serum proteins can also be obtained by immunoadsorption, i.e. with the help of carrier-bound antibodies against serum proteins.

Das im Rahmen des im obigen Verfahren verwendeten Anti-PP5-Serums wurde wie folgt erhalten: The anti-PP5 serum used in the above procedure was obtained as follows:

i Es wurden Kaninchen mit dem gereinigten PP5 unter Verwendung von Aluminiumhydroxid als Adjuvans über einen Zeitraum von 6 Wochen immunisiert. i Rabbits were immunized with the purified PP5 using aluminum hydroxide as an adjuvant over a period of 6 weeks.

Das PPS wird in physiologischer Kochsalzlösung gelöst (Konzentration 0,06 mg/3 ml) und unter Zusatz von Alumi-20 niumhydroxid zu einer Suspension verrührt. Die Kaninchen, erhalten an 5 aufeinander folgenden Tagen je 0,06 mg Protein in 3 ml Suspension/Tier i.v. injiziert. The PPS is dissolved in physiological saline (concentration 0.06 mg / 3 ml) and stirred to a suspension with the addition of aluminum hydroxide. The rabbits received 0.06 mg protein in 3 ml suspension / animal i.v. on 5 consecutive days. injected.

Anschliessend lässt man die Tiere 9 Tage ruhen. Dann immunisiert man wieder an 5 aufeinander folgenden Tagen 25 mit der oben angegebenen gleichen Menge Antigen, lässt die Tiere wieder 9 Tage ruhen und injiziert schliesslich nochmals an 5 aufeinander folgenden Tagen je 0,06 mg des Antigens. Nach einer erneuten Wartezeit von 7 bis 9 Tagen werden die Tiere entblutet. Nach dem Gerinnen des Blutes wird das 30 Serum vom Blutkuchen abgeschleudert und gewonnen. The animals are then left to rest for 9 days. Then 25 are immunized again on 5 consecutive days with the same amount of antigen given above, the animals are left to rest for 9 days and finally injected again on 5 consecutive days each 0.06 mg of the antigen. After another waiting period of 7 to 9 days, the animals are bled to death. After the blood has clotted, the serum is thrown off the blood cake and collected.

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Claims

630643 2 PATENT CLAIMS

1. A process for the enrichment of the placenta-specific protein PPa, characterized in that a protein solution containing PP5 is brought into contact at a pH value between 4 and 9 with an antibody against the PP5 bound to an insoluble carrier, the carrier which bound the PPg contains, separated from the liquid phase and treated to remove the PP5 with an aqueous medium with a pH of 2 to 4 or with a solution of a protein-binding dissociating substance at a pH of 4 to 9.

2. Use of the placenta-specific protein PP5 obtained according to claim 1 in a diagnostic agent for the detection of the PP5 and of antibodies directed against PP5.