CH639394A5 - Verfahren zur herstellung von immunglobulinpraeparationen mit verminderter komplementaktivitaet. - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Immunglobulinpräparationen mit verminderter Komplementaktivität.

Die durch Fraktionierung von Serum, insbesondere von menschlichen Serum ausgehend, hergestellten Immunglobulinpräparationen haben aufgrund ihrer Antikörpereigenschaften eine wesentliche Bedeutung als Prophylaktika und Therapeutika zur Unterstützung körpereigener Abwehrreaktionen.

Immunglobulinpräparationen erwiesen sich bislang im wesentlichen nur für die intramuskuläre Anwendung geeignet: bei intravenösen Applikationen reagierten die Empfänger mehr oder weniger ausgeprägt mit anaphylaktoiden Erscheinungsformen. Eine intravenöse Applikation der Immunglobulinpräparationen ist jedoch sehr erwünscht, da diese im Organismus rascher zur Wirkung kommen.

Es wird angenommen, dass die anaphylaktoiden Nebenreaktionen auf der Bindung des Serumkomplementes durch das verabreichte Immunglobulin beruhen. Man hat darum bereits mehrfach versucht, die Immunglobuline derart zu verändern, dass ihre Antikörperaktivität erhalten bleibt, das Mass der Komplement-Bindung jedoch soweit verringert wird, dass die modifizierten Immunglobuline für eine intravenöse Applikation eingesetzt werden können. Es ist bekannt, Immunglobuline durch enzymatischen Abbau dahingehend zu verändern, dass die Bindungsstellen für das Komplement abgespalten werden, der Rest der Moleküle jedoch noch in der Lage bleibt, die Antigene zu binden. Ein solches Präparat wird mit gutem Erfolg intravenös appliziert.

In einigen Fällen wird das in seinem Molekül verkleinerte Immunglobulin wegen der vergleichsweise verkürzten Halbwertszeit im Organismus als weniger befriedigend angesehen als Immunglobulinpräparationen mit weitgehend unverändertem Molekulargewicht.

Auch die Umsetzung von Immunglobulinen mit alkylie-renden und acylierenden Mitteln ist zur Herstellung von intravenös appliziertbaren Immunglobulinen beschrieben.

Weiter sind Verfahren bekannt, wonach Immunglobuline durch Reduktion der intramolekularen Disulfid-Bindungen gespalten und die gebildeten Sulfhydrilgruppen anschliessend alkyliert werden.

Man hat auch schon versucht, in dem Immunglobulin-Molekül die Disulfid-Bindungen sulfitolytisch zu spalten, wozu relativ hohe Konzentrationen an Sulfit oder Tetra-thionat eingesetzt werden. Die Verwendung von Sulfit zusammen mit Cu-II Ionen führte zu schlecht beurteilten Produkten.

Die vorliegende Erfindung geht von dem Gedanken aus, dass der wesentliche Anteil von Unverträglichkeitsreaktionen bei der Verabreichung von handelsüblichen Gammaglobulinen auf intravenösem Wege nicht durch das Gamma-globulin-Molekül selbst sondern durch von dem nativen Zustand der Immunglobuline abweichende Strukturen hervorgerufen wird.

Gegenstand der Erfindung ist demnach das im Patentanspruch 1 angegebene Verfahren zur Herstellung von Immunglobulinpräparationen, wonach durch sulfitolytische Massnahmen komplementbindende Strukturen in dem Masse verändert oder entfernt werden, dass sie Komplement nicht oder nur wenig zu binden vermögen.

Die Immunglobulinpräparationen werden erhalten durch ein Verfahren, das dadurch gekennzeichentist, dass eine Immunglobulin- Fraktion mit einer niedrigen Konzentration eines sulfitolytischen Agens und/oder einer für die Reduktion der Komplementbindung ausreichenden Menge eines in Wasser schwer löslichen Phosphats behandelt wird.

Die Immunglobulin-Fraktion ist nach bekannten Verfahren der Fraktionierung von Blutplasma erhältlich.

Eine geringe Konzentration eines sulfitolytischen Agens stellt im Sinne der Erfindung bevorzugt eine Konzentration >0 aber <5 • 10"2 M/1, vorzugsweise 2-4-10~3 M/1 dar.

Als sulfitolytisches Agens wird in der Regel Sulfit verwendet. Erfindungsgemäss wird jedoch ein Disulfit wie Natrium-Disulfit bevorzugt und vorteilhaft in einer Konzentration von 1.3 bis 3.6-10-3 M/1 eingesetzt. Gemeinsam mit Sulfit können oxidierende Stoffe wie Dithionit und Schwermetallionen wie Cu2+-Ionen verwendet werden. Sie können erfindungsgemäss bevorzugt im Bereich von >0 aber <5 • 10-3 M/1 eingesetzt werden; in der Regel 1/10 der auf die Mola-rität bezogenen Menge des sulfitolytischen Agens.

Die Temperatur, bei der die sulfitolytische Substanz zu der Immunglobulinlösung hinzugegeben wird, ist nicht kritisch, soweit nicht bedeutend höhere Temperaturen als 50°C vorliegen. Vorzugsweise wird das Verfahren bei einer Temperatur zwischen +5°C und 25°C durchgeführt. Trotz dieser generellen Aussage ist festzustellen, dass die Temperaturen

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insofern einen Einfluss auf das Verfahren ausüben, als bei höheren Temperaturen geringere Konzentrationen des Reduktionsmittels benötigt werden.

Auch die Reaktionszeit steht im umgekehrten Verhältnis zur Konzentration der sulfitolytischen Agentien. Die Sulfito-lyse der Immunglobulinfraktion wird in der Regel während 5-90 Stunden durchgeführt.

Die Reaktion wird durch Trennung der sulfitolytischen Agentien und der Immunglobuline beendet. Zweckmässig werden hierfür die Immunglobuline ausgefällt. Eine andere Möglichkeit besteht z.B. in der Entfernung der sulfitolytischen Agentien durch Dialyse.

Es hat sich als zweckmässig erwiesen, die Behandlung von nach dem Stand der Technik erhältlichen Immunglobulinpräparationen nicht erst in einem letzten Reaktionsschritt vorzunehmen. Es ist vielmehr günstiger, letzte Reinigungsschritte, wie sie bei der Immunglobulinpräparation allgemein üblich sind, dem erfindungsgemässen Verfahren anzu-schliessen.

Das Ausgangsmaterial für das erfindungsgemässe Verfahren ist ein nach dem Stand der Technik erhältliches Immunglobulin. Diese Substanz wird in der Literatur verschiedentlich auch mit Gammaglobulin, IgG und Immunglobulin G bezeichnet. Sie besteht überwiegend aus der sogenannten 7 S-Fraktion mit einem Molekulargewicht von etwa 160 000. Es können sowohl die aus Mischseren erhätlichen Immunglobuline, aber auch die von besonders immunisierten Spendern erfindungsgemäss eingesetzt werden. Dies sind die sogenannten Hyperimmunglobuline mit überdurchschnittlich hohen spezifisch gegen bestimmte Antigene gerichteten Antikörpergehalten. Beispielsweise soll hier genannt werden Mumpsimmunglobulin. Die für das erfindungsgemässe Verfahren geeigneten Ausgangsmaterialien sind durch gängige Verfahren aus Blutplasma zu gewinnen, wie z.B. durch die fraktionierte Salzfällung des Plasmas oder durch Fällung mit organischen Lösungsmitteln, insbesondere durch Äthanol, mit den verschiedenen Verfahrensvarianten, die auf die grundlegenden Arbeiten von Cohn et al., J. Am. Chem. Soc. 68, (1946), Seite 449 ff zurückgehen.

Bevorzugt geeignet als Ausgangsmaterial ist eine y-globu-linhaltige Fraktion, die nach Cohn als Fraktion II und III oder nach Nitschmann Fraktion A genannt ist. Derartige Fraktionen enthalten neben y-Globulin noch a- und ß-Glo-bulin sowie kleiner Mengen Albumin. Der y-Globulinanteil liegt bei etwa 40-80 Gew.-%, bezogen auf die Menge des Gesamtproteins.

Es hat sich als zweckmässig erwiesen, eine im Rahmen des Alkoholfraktionierungsverfahrens anfallende, noch nicht gereinigte Gammaglobulinfraktion, in der Regel die bei der Albuminfraktionierung anfallende Paste, in Wasser oder in einer wenig konzentrierten, vorzugsweise einer etwa 0,3-0,9%igen Neutralsalzlösung wie Kochsalz aufzulösen. Nach der Auflösung soll das Protein zweckmässig in einer Konzentration von 0,5 bis 15%, vorzugsweise zwischen 1 und 5% (g/V) vorliegen. Zu dieser Lösung wird in der Regel bei einem pH-Wert zwischen 4 und 8, vorzugsweise bei pH 5.0 bis 6.0 das sulfitolytische Mittel (z.B. das Na2S20s oder Na2SCb) und gewünschtenfalls ein Schwermetall-Salz (z.B. CuSCh) zugesetzt und dabei eine Temperatur zwischen 5 und 50°C eingehalten.

Der pH-Wert des Reaktionsgemisches kann während der Reaktion von seinem Ausgangswert abweichen, ohne dass dies nachteilige Folgen hat. Nach der Umsetzung mit den sulfitolytischen Agentien kann die Weiterreinigung des Immunglobulins auf üblichem Wege unmittelbar fortgeführt werden.

Vor allem hat sich die Einbeziehung einer Adsorption an ein in Wasser schwer lösliches Phosphat in die Verfahrens-

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schritte der Weiterreinigung bewährt, da derart behandelte Endprodukte der Immunglobulinreinigung eine verringerte Komplementbindung aufweisen. So kann z.B. in der Lösung in situ Aluminiumphosphat aus AlCb und Na3PC>4 hergestellt werden. Daran können neben Verunreinigungen auch komplementbindende Aggregate des Immunglobulins an das Aluminiumphosphat gebunden werden. Auch Calciumphos-phat ist zur Entfernung von Verunreinigungen und komplementbindenden Substanzen einsetzbar.

In der Regel 5-90 Stunden nach Zusatz der sulfitolytischen Agentien können die Immunglobuline beispielsweise mit Äthanol in an sich bekannter Weise ausgefällt werden. Eine Reinigung ist auch über Ionenaustauscher durchführbar. Wenn Kationenaustauscher bei einem schwach sauren pH-Wert eingesetzt werden, werden die Immunglobuline besonders rein erhalten. Restliche Cu-Gehalte können durch Metall-Chelat-bildende Verbindungen, auch in Form von Ionenaustauschern, entfernt werden.

Die danach erhältlichen Immunglobulinpräparationen sind aufgrund der vorgenommenen partiellen Sulfitolyse hinsichtlich der Komplementbindungskapazität schwächer komplementbindend als das Ausgangsmaterial. Dieser Effekt kann gewünschtenfalls durch die Adsorption von komplementbindender Aktivität weiter abgeschwächt werden.

Unabhängig von gleichzeitig erwünschten Reinigungserfolgen werden besonders gute Ergebnisse hinsichtlich der verringerten Komplementbindung erreicht, wenn Immun-globulinfraktionen mit einem in Wasser schwer löslichen Phosphat behandelt werden. Bevorzugt wird hierfür Aluminiumphosphat oder Calciumphosphat eingesetzt.

Hierfür sind Mengen von 0,005 bis 0,15 M/1 besonders günstig. Die Adsorbentien werden zweckmässig durch Zugabe eines wasserlöslichen Kations und eines wasserlöslichen Phosphates von denen bekannt ist, dass sie schwer lösliche Phosphate miteinander zu bilden vermögen, in der Immunglobulinlösung selbst hergestellt. Zweckmässig wird hierfür der pH-Wert zwischen 4 und 8,5 gehalten, wobei man für die Adsorption von Komplement-bindender Aktivität mit Hilfe von AIPO4 pH-Werte zwischen 4 und 6 bevorzugt, für Erdalkaliphosphate, wie Calciumphosphat, pH-Werte zwischen 5,8 und 8,5. Gängige wasserlösliche Kationen, welche mit Phosphationen schwer lösliche Niederschläge zu bilden vermögen, sind Aluminium, bevorzugt als AlCb oder (A1)2(SC>4)3, ferner unter den wasserlöslichen Erdalkalisalzen insbesondere wasserlösliche Calciumsalze, wie Calciumacetat. Für die Bildung des Adsorptionsmittels in der Immunglobulinlösung wird zweckmässig mit einem geringen Über-schuss der kationischen Komponente gearbeitet.

Wird nun die Sulfitolyse mit einem Adsorptionsschritt im Sinne der vorstehenden Ausführungen kombiniert, kann die Komplementbindung der Immunglobulinpräparationen auf besonders niedrige Werte, häufig nahe 0, gebracht werden. Jeder Schritt ist jedoch für sich geeignet, die Komplementbindung der Immunglobulinpräparationen herabzusetzen.

Da das Ziel des Verfahrens darin besteht, die Komplementbindung zu verringern, werden die Verfahrensschritte möglichst so aufeinander abgestimmt, dass die durch das erfindungsgemässe Verfahren erhältlichen Produkte dieser Forderung entsprechen.

Es entspricht dem Erfindungsgedanken, wenn das Verfahren unter Bedingungen durchgeführt wird, die der Fachmann als in dieser Hinsicht besonders geeignet erkennt. Das heisst, dass eine Kombination von hohen Konzentrationen der sulfitolytischen Agentien im Verhältnis zu niedriger Proteinkonzentration, einer niedrigen Temperatur und einer kurzen Reaktionszeit im beschriebenen Rahmen zuzuordnen sind und umgekehrt.

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Die Bestimmung der antikomplementären Wirkung erfolgt in einem Hämolyse-Test mit sensibilisierten Hammelerythro-zyten und Meerschweinchenserum (Komplement). Dabei werden die Erythrozyten und das Komplement mit der Immunglobulinpräparation zur Reaktion gebracht. Nach entsprechender Inkubationszeit lässt sich erkennen, dass die Immunglobulinpräparation auch bei hohen Konzentrationen die Hämolyse, welche quantitativ auf photometrischem Wege bestimmbar ist, praktisch nicht beeinträchtigt. Weiterhin lässt sich in einem in vivo-test am Kaninchen nachweisen, dass nach intravenöser Applikation der erfin-dungsgemässen Immunglobulinpräparation keine Inaktivie-rung des Komplementfaktors Cl feststellbar ist.

In einer Reihe von erfindungsgemäss hergestellten Präparationen liegt die Komplementbindung insgesamt unter 10% bezogen auf einen 100%-Standard. Dieser Wert wird auch nach einer Lagerung der Präparation von etwa zwei Jahren nur unwesentlich nach oben hin verändert. Die Aggregat-Anteile der Immunglobulinpräparationen liegen ebenfalls unter 10%. In einer 5%igen Proteinlösung sind bei Verwendung von CuSCU grössenordnungsmässig < 1 ng/ml Kupfer-II-Ionen nachweisbar.

Die an Antikomplementaktivität verringerte neue Gamma-globulinpräparation enthält im wesentlichen unverändertes 7 S-Immunglobulin im Vergleich zu den modifizierten Präparationen nach dem Stand der Technik mit z.T. niedrigeren Sedimentationswerten. Die Antikörperaktivität des Moleküls bleibt erhalten.

Die erfindungsgemäss hergestellten Immunglobulinpräparationen sind in erster Linie für die intravenöse Applikation gedacht. Intravenös applizierbare Arzneimittel enthalten die erfindungsgemäss hergestellten Immunglobulinpräparationen in einer geeigneten galenischen Zubereitung. Die schwach sulfitolytisch behandelten und anschliessend wie beschrieben gereinigten Immunglobuline können nach üblicher Sterilfiltration zum Verbrauch in einer beliebigen Menge abgefüllt werden. Wenn vorgesehen ist, die Präparation als 5 bis 16%ige Proteinlösung anzuwenden, ist eine entsprechende Einstellung der gereinigten und sterilfiltrierten Lösung ohne weiteres möglich. Eine 0,3-0,9% Neutralsalz enthaltende Lösung, der gewünschtenfalls noch physiologisch verträgliche Zuschläge, z.B. eine Alpha-Aminosäure wie Glycin, in 1,5-2,5% zugegeben werden, lässt sich gefriertrocknen, als gefriergetrocknetes Produkt aufbewahren und vor der Verwendung durch Zufügen der gewünschten Menge von destilliertem Wasser als Lösung rekonstituieren. Auch diese Lösung zeigt keine erhöhte Komplementbindung. Das rekonstituierte Mittel ist gleicherweise intravenös applizierbar.

Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen näher erläutert:

Beispiel 1

Die bei der Albuminfraktionierung nach Cohn mit Hilfe von Äthanol anfallende Gammaglobulinfraktion wird in einer 0,3%igen Kochsalzlösung gelöst, wobei für 1 kg der Gammaglobulinpaste 10 Liter Kochsalzlösung verwendet werden. Die Temperatur wird bei etwa 5°C gehalten. Man fügt zu der Lösung 0,07% (g/vol) Na2S20s in Form einer 10%igen Natriumdisulfitlösungund 0,007% (g/vol) CuSCU x 5 H2O in Form einer l%igen Kupfersulfatlösung zu. Nach erfolgter Zugabe werden pro Liter Lösung 200 ml einer 0,2 molaren AlCb- und 200 ml einer 0,2 molaren Na3PC>4-Lösung zugefügt. Die Zugabe erfolgt unter pH-Kontrolle, die einen pH-Wert von etwa 5 gewährleisten soll. Die Lösung wird über Nacht bei 5°C gerührt. Das Aluminiumphosphat-Adsorbens wird sodann durch Zentrifugation abgetrennt.

Die die Immunglobuline enthaltende Lösung wird durch Zugabe von 25% (vol/vol) Äthanol ausgefällt. Das Präzipitat wird durch Zentrifugation gewonnen. Es wird in einer ausreichenden Menge destilliertem Wasser gelöst, 0,2% Äthylen-diamintetraessigsäure zugegeben und der pH-Wert auf 7,0 eingestellt. Durch Zusatz von 25% Äthanol werden die Immunglobuline erneut präzipitiert, zentrifugiert, der Niederschlag wird in einer ausreichenden Menge 0,85%iger Kochsalzlösung aufgelöst. Zu dieser Lösung werden 2,5% (g/V) Glycin gegeben. Danach wird die Präparation lyophilisiert.

Die Endfertigung für das intravenös applizierbare Immunglobulin kann in folgender Weise vorgenommen werden: Das Lyophilisat wird in destilliertem Wasser aufgelöst, auf einen Proteingehalt von 5% gebracht, in Endbehälter abgefüllt und erneut lyophilisiert.

Beispiel 2

Die bei der Albuminfraktionierung nach Cohn mit Hilfe von Äthanol anfallende Gammaglobulinfraktion wird in einer 0,3%igen Kochsalzlösung gelöst, wobei für 1 kg Gammaglobulinpaste 10 Liter Kochsalzlösung verwendet werden. Die Temperatur wird bei etwa 5°C gehalten. Man fügt zu der Lösung 0,2% (g/vol) Na2S20s in Form einer 10%igen Natri-umdisulfitlösung und anschliessend 0,02% (g/vol) CuSCk x 5 H2O in Form einer l%igen Kupfersulfatlösung zu. Nach Beendigung der Zusätze werden pro Liter Lösung 120 ml einer 1 molaren Calcium-Acetatlösung und 120 ml einer 1/3 molaren sekundären Natriumphosphatlösung unter Rühren zugegeben. DerpH-Wert wird auf8±0,l mit 0,1 MNatron-lauge gehalten. Der Ansatz wird 20 Stunden bei 5°C gerührt. Nach dieser Zeit wird das gebildete Calciumphosphat durch Filtration abgetrennt und die filtrierte Immunglobulinlösung gewonnen.

Die weitere Aufarbeitung der Immunglobuline kann entsprechend Beispiel 1 durchgeführt werden.

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639394 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung von Immunglobulinpräpara-tionen mit verminderter Komplementaktivität, dadurch gekennzeichnet, dass eine Immunglobulinfraktion mit einer niedrigen Konzentration eines sulfitolytischen Agens und/ oder einem in Wasser schwer löslichen Phosphat behandelt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Immunglobulinfraktion mit >0 aber <5 • 10-2 M/1 eines sulfitolytischen Agens behandelt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass als sulfitolytisches Agens Dilsufit verwendet wird.

4. Verfähren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Sulfitolyse in Gegenwart von Schwermetallionen durchgeführt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Schwermetallionen in einer Konzentration von >0 aber <5 -10-3 M/1 eingesetzt werden.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Schwermetallionen Kupfer-II-Ionen verwendet werden.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Immunglobulinfraktion neben Immunglobulinen 20-60% andere Plasmaproteine enthält.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Immunglobulinfraktion bestehend aus 40-80° Immunglobulin und 20-60% anderen Plasmaproteinen in einer Konzentration von 1-5% Protein, 5-90 Stunden, mit 2-4-10-3 M/1 Na2S20s und 2-4-10"4 M/1 CuSO«, bei pH 5 bis 8 behandelt und danach, gegebenenfalls unter Anreicherung und Reinigung der Immunglobuline, die Proteine abtrennt.

9. Verfahren nach Anspruch 1 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Immunglobulinfraktion mit 0,005 bis 0,15 M/1 eines in der Immunglobulinlösung hergestellten, in Wasser schwer löslichen Phosphats behandelt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das in Wasser schwer lösliche Phosphat Aluminiumphosphat ist.

11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das in Wasser schwer lösliche Phosphat Calciumphos-phat ist.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine sulfitolytisch behandelte Immunglobulinfraktion mit einem in Wasser schwer löslichen Phosphat behandelt wird.

13. Immunglobulinpräparation, hergestellt nach dem Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 12.