DE2658334B2 - Verfahren zum Herstellen von Immunglobulinpraparationen mit verminderter Komplementbindung und ein diese enthaltendes Arzneimittel - Google Patents

Verfahren zum Herstellen von Immunglobulinpraparationen mit verminderter Komplementbindung und ein diese enthaltendes Arzneimittel

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Description

Die durch Fraktionierung von Serum, insbesondere vom menschlichen Serum ausgehend, hergestellten lmmunglobulinpräparationen haben auf Grund ihrer Antikörpereigenschaften eine wesentliche Bedeutung als Prophylaktika und Therapeutika zur Unterstützung körpereigener Abwehrreaktionen.
lmmunglobulinpräparationen erwiesen sich bislang im wesentlichen nur für die intramuskuläre Anwendung geeignet: bei intravenösen Applikationen reagierten die Empfänger mehr oder weniger ausgeprägt mit anaphylaktoiden Erscheinungsformen. Eine intravenöse Applikation der lmmunglobulinpräparationen ist jedoch sehr erwünscht, da diese im Organismus rascher zur Wirkung kommen.
Es wird angenommen, daß die anaphylaktoiden Nebenreaktionen auf der Bindung des Serumkomplementes durch das verabreichte Immunglobulin beruhen. Man hat darum bereits mehrfach versucht, die Immunglobulinc derart zu verändern, daß ihre Antikörperaktivität erhalten bleibt, das Maß der Komplement-Bindung jedoch soweit verringert wird, daß die modifizierten Immunglobuline für eine intravenöse Applikation eingesetzt werden können. Es ist bekannt, Immunglobuline durch enzymatischen Abbau dahingehend zu verändern, daß die Bindungsstellen für das Komplement abgespalten werden, der Rest der Moleküle jedoch noch in der Lage bleibt, die Antigene zu binden. Ein solches Präparat wird mit gutem Erfolg intravenös appliziert.
In einigen Fällen wird das in seinem Molekül verkleinerte Immunglobulin wegen der vergleichsweise \erkürzten Halbwertszeit im Organismus als weniger befriedigend angesehen als lmmunglobulinpräparationen mit weitgehend unverändertem Molekulargewicht.
Auch die Umsetzung von Immunglobulinen mit aikylierenden und acylierenden Mitteln ist zur Herstellung von intravenös applizierbarem Immunglobulinen beschrieben (Schweiz, med. Wochenschrift 106 Nr. 16, 1976, S. 540).
Weiter sind Verfahren bekannt, wonach Immunglobuline durch Reduktion der intramolekularen Disulfid-Bindungen gespalten und die gebildeten Sulfhydrilgruppen anschließend alkyliert werden.
Man hat auch schon versucht, in dem Immunglobu-Iin-Molekül die Disulfid-Bindungen sultitolytisch zu spalten, wozu relativ hohe Konzentrationen an Sulfit und Tetrathionat eingesetzt werden. DE-OS 25 08 132. Die Verwendung von Sulfit zusammen mit Cu-II Ionen führte zu schlecht beurteilten Produkten.
Die vorliegende Erfindung geht von dem Gedanken aus, daß der wesentliche Anteil von Unverträglichkeitsreaktionen bei der Verabreichung von handelsüblichen Gammaglobulinen auf intravenösem Wege nicht durch das Gammaglobulin-Molekül selbst sondern durch von dem nativen Zustand der Immunglobuline abweichende Strukturen hervorgerufen wird.
Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zum Herstellen von lmmunglobulinpräparationen, wonach durch sulfitolytische Maßnahmen die Bildung von komplementbindenden Strukturen verhindert bzw. bereits vorliegende Strukturen in dem Maße verändert oder adsorptiv entfernt werden, daß sie Komplement nicht oder nur wenig zu binden vermögen.
Die lmmunglobulinpräparationen werden erhalten, indem eine nach bekannten Verfahren der Fraktionierung von Blutplasma hergestellte Immunglobulin-Fraktion mit einer niedrigen Konzentration eines sulfitolytischen Agens und/oder einer für die Reduktion der Komplementbindung ausreichenden Menge eines in Wasser schwer löslichen Phosphats behandelt wird.
Eine geringe Konzentration eines sulfitolytischen Agens stellt im Sinne der Erfindung eine Konzentration > 0 aber <5 ■ 10-2 M/l, vorzugsweise 2-4 · 10~3 M/l dar.
Das beanspruchte Verfahren ist gekennzeichnet durch die Maßnahmen des Anspruchs 1.
Als sulfitolytisches Agens wird in der Regel Sulfit verwendet. Es wird jedoch ein Disulfit wie Natrium-Disulfit bevorzugt und vorteilhaft in einer Konzentration von 1.3 bis 3.6 ■ 10-3M/l eingesetzt. Gemeinsam mit Sulfit können oxidierende Stoffe wie Dithionit und .Schwermetallionen wie Cu2+-Ionen verwendet werden. Sie werden im Bereich von > 0 aber <5 · 10-3M/l eingesetzt; in der Regel 1/10 der auf die Molarität bezogenen Menge des sulfitolytischen Agens.
Die Temperatur, bei der die sulfitolytische Substanz zu der Immunglobulinlösung hinzugegeben wird, ist nicht kritisch, soweit nicht bedeutend höhere Temperaturen als 50l\ vorliegen. Bevorzugt wird das Verfahren bei einer Temperatur zwischen +50C und 250C durchgeführt. Trotz dieser generellen Aussage ist festzustellen, daß die Temperaturen insofern einen Einfluß auf das Verfahren ausüben, als bei höheren Temperaturen geringere Konzentrationen des Reduktionsmittels benötigt werden.
Auch die Reaktionszeit steht im umgekehrten Verhältnis zur Konzentration der sulfitolytischen Angetien. Die Sulfitolyse der Immunglcbulininfraktion wird in der Regel während 5-90 Stunden durchgeführt.
Die Reaktion wird durch Trennung der sulfitolytischen Agentien und der Immunglobuline beendet. Zweckmäßig werden hierfür die Immunglobuline
ausgefällt. Eine andere Möglichkeit besteht z. B. in der Entfernung der sulfitolytischen Agenden durch Dialyse.
Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, die Behandlung von nach dem Stand der Technik erhältlichen Immunglobulinpräparationen nicht erst in einem letzten Reaktionsschritt vorzunehmen. Es ist vielmehr günstiger, letzte Reinigungsschritte, wie sie bei der Immunglobulinpräparation allgemein üblich sind, dem erfindungsgemäßen Verfahren anzuschließen.
Das Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren ist ein nach dem Stand der Technik erhältlichen Immunglobulin. Diese Substanz wird in der Literatur verschiedentlich auch mit Gammaglobulin, IgG und Immunglobulin G bezeichnet Sie besteht überwiegend aus der sogenannten 7 S-Fraktion mit einem Molekulargewicht von etwa 160 000. Es können sowohl die aus Mischseren erhältlichen Immunglobuline, aber auch die von besonders immunisierten Spendern erfindungsgemäß eingesetzt werden. Dies sind die sogenannten Hyperimmunglobuline mit überdurchschnittlich hohen spezifisch gegen bestimmte Antigene gerichteten Antikörpergehalten. Beispielsweise soll hier genannt werden Mumpsimmunglobulin. Die für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneten Ausgangsmaterialien sind durch gängige Verfahren aus Blutplasma zu gewinnen, wie z. B. durch die fraktionierte Salzfällung des Plasmas oder durch Fällung mit organischen Lösungsmitteln, insbesondere durch Äthanol, mit den verschiedenen Verfahrensvarianten, die auf die grundlegenden Arbeiten von Cohn et ah, J. Am. Chem. Soc. (1946), Seite 449 ff zurückgehen.
Bevorzugt geeignet als Ausgangsmaterial ist eine y-globulinhaltige Fraktion, die nach Cohn als Fraktion II und III oder nach Nitschmann Fraktion A genannt ist. Derartige Fraktionen enthalten neben y-Globulin noch x- und /3-Globulin sowie kleiner Mengen Albumin. Der y-Globulinanteil liegt bei etwa 40 - 80 Gew.-%, bezogen auf die Mengen des Gesamtproteins.
Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, eine im Rahmen des Alkoholfraktionierungsverfahrens anfallende, noch nicht gereinigte Gammaglobulinfraktion, in der Regel die bei der Albuminfraktionierung anfallende Paste, in Wasser oder in einer wenig konzentrierten, vorzugsweise einer etwa 0,3 — 0,9%igen Neutralsalzlösung wie Kochsalz aufzulösen. Nach der Auflösung soll das Protein zweckmäßig in einer Konzentration von 0,5 bis 15%, vorzugsweise zwischen 1 und 5% (g/V) vorliegen. Zu dieser Lösung wird bei einem pH-Wert zwischen 4 und 8, vorzugsweise bei pH 5.0 bis 6.0 das sulfitolytische Mittel (z. B. das Na2S2Os oder Na2SÜ3) und gewünschtenfalls ein Schwermetall-Salz (z. B. CUSO4) zugesetzt und dabei eine Temperatur zwischen 5 und 50° C eingehalten.
Der pH-Wert des Reaktionsgemisches kann während der Reaktion von seinem Ausgangswert abweichen, ohne daß dies nachteilige Folgen hat. Nach der Umsetzung mit den sulfolytischen Angentien kann die Weiterreinigung des Immunglobulins auf üblichem Wege unmittelbar fortgefüh; t werden.
Vor allem hat sich die Einbeziehung einer Adsorption an ein in Wasser schwer lösliches Phosphat in die Verfahrensschritte der Weitet reinigung bewährt, da derart behandelte Endprodukte der Iminunglobulinreinigung eine verringerte Komplementbindung aufweisen.
So kann z. B. in der Lösung in situ Aluniiniumphosphat aus AICb und Na3PC>4 hergestellt werden. Daran können neben Verunreinigungen auch komplementbindende Aggregate des Immunglobulins an das Aluminiumphosphat gebunden werden. Auch Calciumphosphat ist zur Entfernung von Verunreinigungen und komplementbindenden Substanzen einsetzbar.
5-90 Stunden nach Zusatz der sulfitolytischen Agenden können die Immunglobuline beispielsweise mit Äthanol in an sich bekannter Weise ausgefällt werden. Eine Reinigung ist auch über Ionenaustauscher durchführbar. Wenn Kationenaustauscher bei einem schwach sauren pH-Wert eingesetzt werden, werden die Immunglobuline besonders rein erhalten. Restliche Cu-Gehalte können durch Metall-Chelat-bildende Verbindungen, auch in Form von Ionenaustauschern, entfernt werden.
Die danach erhältlichen Immunglobulinpräparationen sind auf Grund der vorgenommenen partiellen Sulfitolyse hinsichtlich der Komplementbindungskapazität schwächer komplementbindend als das Ausgangsmaterial. Dieser Effekt kann gewünschtenfalls durch die Adsorption von komplementbindender Aktivität weiter abgeschwächt werden.
Unabhängig von gleichzeitig erwünschten Reinigungserfoljjen werden besonders gute Ergebnisse hinsichtlich der verringerten Komplementbindung erreicht, wenn Immunglobulinfraktionen mit einem in Wasser schwer löslichen Phosphat behandelt werden.
Bevorzugt wird hierfür Aluminiumphosphat oder Calciumphosphat eingesetzt.
Hierfür sind Mengen von 0,005 bis 0,1 M/I günstig. Die
«ι Adsorbentien werden zweckmäßig durch Zugabe eines wasserlöslichen Kations und eines wasserlöslichen Phosphates von denen bekannt ist, daß sie schwer lösliche Phosphate miteinander zu bilden vermögen, in der Immunglobulinlösung selbst hergestellt. Zweckmäßig wird hierfür der pH-Wert zwischen 4 und 8,5 gehalten, wobei man für die Adsorption von komplementbindender Aktivität mit Hilfe von AlPO4 pH-Werte zwischen 4 und 6 bevorzugt, für Erdalkaliphosphate, wie Calciumpl.osphat, pH-Werte zwischen 5,8 und 8,5.
Gängige wasserlösliche Kationen, welche mit Phosphationen schwer lösliche Niederschläge zu bilden vermögen, sind Aluminium bevorzugt als AICI3 oder (AI)2(SO4)3, ferner unter den wasserlöslichen Erdalkalisalzen insbesondere wasserlösliche Caiciumsalze, wie Calciumacetat. Für die Bildung des Adsorptionsmittels in der Immunglobulinlösung wird zweckmäßig mit einem geringen Überschuß der kationischen Komponente gearbeitet.
Wird nun die Sulfitolyse mit einem Adsorptionsschritt im Sinne der vorstehenden Ausführungen kombiniert, kann die Komplementbindung der Immunglobulinpräparationen auf besonders niedrige Werte, häufig nahe 0, gebracht werden. Jeder Schritt ist jedoch für sich geeignet, die Komplementbindung der Immunglobulinpräparationen herabzusetzen.
Da das Ziel des Verfahrens darin besteht, die Komplementbindung zu verringern, werden die Verfahrensschritte möglichst so aufeinander abgestimmt, daß die durch das erfindungsgemäße Verfahren
bo erhältlichen Produkte dieser Forderung entsprechen.
Es entspricht dem Erfindungsgedanken, wenn das Verfahren unter Bedingungen durchgeführt wird, die der Fachmann als in dieser Hinsicht besonders geeignet erkennt. Das heißt, daß eine Kombination von hohen
br> Konzentrationen der sulfitolytischen Agentien im Verhältnis zu niedriger Proteinkonzentration, einer niedrigen Temperatur und einer kurzen Reaktionszeit im beschriebenen Rahmen zuzuordnen sind und
umgekehrt
Die Bestimmung der antikomplementären Wirkung erfolgt in einem Hämolyse-Test mit sensibilisierten Hammelerythrozyten und Meerschweinchenserum (Komplement). Dabei werden die Erythrozyten und das Komplement mit der Immuaglobulinpräparation zur Reaktion gebracht Nach entsprechender Inkubationszeit läßt sich erkennen, daß die Immunglobulinpräparation auch bei hohen Konzentrationen die Hämolyse, welche quantitativ auf photometrischem Wege bestimmbar ist, praktisch nicht beeinträchtigt Weiterhin läßt sich in einem in vivo-Test am Kaninchen nachweisen, daß nach intravenöser Applikation der erfindungsgernäßen immunglobulinpräparation keine Inaktiverung des Komplementfaktors Cl feststellbar ist.
In einer Reihe von erfindungsgemäß durchgeführten Präparationen liegt die Komplementbindung insgesamt unter 10% bezogen auf einen 100%-Standard. Dieser Wert wird auch nach einer Lagerung der Präparation von etwa zwei Jahren nur unwesentlich nach oben hin verändert Die Aggregat-Anteile der Immunglobulinpräparationen liegen ebenfalls unter 10%. In einer 5%igen Proteinlösung sind bei Verwendung von CUSO4 größenordnungsmäßig < 1 μg/ml Kupfer-II-Ionen nachweisbar.
Die an Antikomplementaktivität verringerte neue Gammaglobulinpräparation enthält im wesentlichen unverändertes 7 S-Immunglobulin im V :Tgleich zu den modifizierten Präparationen nach dem Stand der Technik mit z.T. niedrigeren Sedimentationswerten. Die Antikörperaktivität des Moleküls bleibt erhalten.
Die erfindungsgemäß herstellbaren Immunglobulinpräparationen sind in erster Linie für die intravenöse Applikation gedacht. Gegenstand der Erfindung ist deshalb auch ein intravenös applizierbares Arzneimittel, enthaltend die erfindungsgemäß hergestellten Immunglobulinpräparationen in einer geeigneten galenischen Zubereitung. Die schwach sulfitolytisch behandelten und anschließenden wie beschrieben gereinigten Immunglobuline können nach üblicher Sterilfiltration zum Verbrauch in einer beliebigen Menge abgefüllt werden. Wenn vorgesehen ist, die Präparation als 5 bis 16%ige Proteinlösung anzuwenden, ist eine entsprechende Einstellung der gereinigten und sterilfiltrierten Lösung ohne weiteres möglich. Eine 0,3-0,9% Neutralsalz enthaltende Lösung, der gewünschtenfalls noch physiologisch verträgliche Zuschläge, z. B. eine Alpha-Aminosäure wie Glycin in 1,5--2,5% zugegeben werden, läßt sich gefriertrocknen, als gefriergetrocknetes Produkt aufbewahren und vor der Verwendung durch Zufügen der gewünschten Menge von destilliertem Wasser als Lösung rekonstituieren. Auch diese Lösung zeigt keine erhöhte Komplementbindung. Das rekonstituierte Mittel ist gleicherwsise intravenös applizierbar.
Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen näher erläutert:
Beispiel 1
Die bei der Albuminfraktionierung nach Cohn irit Hilfe von Äthanol anfallende Gammaglobuiinfraktion wird in einer 0,3%igen Kochsalzlösung gelöst, wobei 1 kg der Gammaglobulinpaste 10 Liter Kochsalzlösung verwendet werden. Die Temperatur wird bei etwa 5° C gehalten. Man fügt zu der Lösung 0,07% (g/vol) Na2S2Os in Form einer IO%igen Natriumdisulfitlösung und 0,007% (g/vol) CuSO4 χ 5 H2O in Form einer l%igen Kupfersulfatlösung zu. Nach erfolgter Zugabe werden pro Liter Lösung 200 ml einer 0,2molaren AICI3- und 200 ml einer 0,2molaren Na3PO4-Lösung zugefügt Die Zugabe erfolgt unter pH-Kontrolle, die einen pH-Wert von etwa 5 gewährleisten soll. Die Lösung wird über Nacht bei 5° C gerührt. Das Aluminiumphosphat-Adsorbens wird sodann durch Zentrifugation abgetrennt
Die die Immunglobuline enthaltende Lösung wird
durch Zugabe von 25% (vol/vol) Äthanol ausgefällt Das Präzipitat wird durch Zentrifugation gewonnen. Es wird in einer ausreichenden Menge destilliertem Wasser gelöst, 0,2% Äthylendiamintetraessigsäure zugegeben und der pH-Wert auf 7,0 eingestellt. Durch Zusatz von
25% Äthanol werden die Immunglobuline erneut prä>ipitiert, zentrifugiert der Niederschlag wird in einer ausreichenden Menge 0,85%iger Kochsalzlösung aufgelöst. Zu dieser Lösung werden 2,5% (g/V) Glycin gegeben.
Danach wird die Präparation lyophilisiert
Die Endfertigung für das intravenöse applizierbare Immunglobulin kann in folgener Weise vorgenommen werden: Das Lyophilisat wird in destilliertem, Wasser aufgelöst, auf einen Proteingehalt von 5% gebracht, in Endbehälter abgefüllt und erneut lyophilisiert.
Beispiel 2
Die bei der Albuminfraktionierung nach Cohn mit Hilfe von Äthanol anfallende Gammaglobulinfraktion
•»ο wird in einer 0,3%igen Kochsalzlösung gelöst, wobei für 1 kg Gammaglobulinpaste 10 Liter Kochsalzlösung verwendet werden. Die Temperatur wird bei *«'a 5"C gehalten. Man fügt zu der Lösung 0,2% (g/vol) Na2J2Os in Form einer 10%igen Natriumdisulfitlösung und anschließend 0,02% (g/vol) CuSO4 χ 5 H2C in Form einer l%igen Kupfersulfatlösung zu. Nach Beendigung der Zusätze werden pro Liter Lösung !2OmI einer 1 molaren Calcium-Acetatlösung und 120 ml einer l/3molaren sekundären Natriumphosphatlösung unter
so Rühren zugegeben. Der pH-Wert wird auf 8 ±0,1 mit 0,1 M Natronlauge gehalten. Der Ansatz wird 20 Stunden bei 50C gerührt. Nach dieser Zeit wird oas gebildete Calciumphosphat durch Filtration abgetrennt und die filtrierte Immunglobulinlösung gewonnen.
Die weitere Aufarbeitung der Immunglobuline kann entsprechend Beispiel 1 durchgeführt werden.

Claims (4)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung von Immunglobulinpräparationen mit verminderter Komplementaktivität, dadurch gekennzeichnet, daß eine Immunglobulinfraktion mit >0 <5-10~2M/l eines sulfitolytischen Agens ggf. in Gegenwart von Schwermetallionen in einer Konzentration von >0 <5·10~3Μ/Ι und ggf. einem in Wasser schwer löslichen Phosphat versetzt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Immunglobulinfraktion bestehend aus 40 bis 80% Immunglobulin und 20 bis 60% anderen Plasmaproteinen in einer Konzentration von 1 bis 5% Protein, 5 bis 90 Stunden, mit 2 bis 4 · 10-3 m/i Na2S2O5 und 2 bis 4 · 10~4 M/l CuSO4, bei pH 5 bis 8 versetzt, und danach, gegebenenfalls unter Anreicherung und Reinigung der Immunglobuline die Proteine abtrennt
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Immunglobulinfraktion mit 0,005 bis 0,15 M/l eines in der Immunglobulinlösung hergestellten, in Wasser schwer löslichen Phosphates versetzt wird.
4. Intravenös applizierbares Arzneimittel enthaltend die nach den Ansprüchen 1—3 hergestellte Immunglobulinpräparation in einer dafür geeigneten galenischen Zubereitung.
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