DE2560155C2

DE2560155C2 - Humanimmunglobulin-Derivat

Info

Publication number: DE2560155C2
Application number: DE2560155A
Authority: DE
Inventors: Sachio Tokyo Ishimoto; Yasuhiko Masuho; Kimihiko Hino Tokyo Matsuzawa; Kazuo Kawasaki Kanagawa Satake; Katsuhiko Tomibe; Tsuneo Tokyo Watanabe
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1974-03-08
Filing date: 1975-02-25
Publication date: 1984-04-26
Also published as: NO144111B; NL7502745A; CH614426A5; FR2262996B1; IN138636B; DE2508132B2; DE2508132C3; DK141432B; AU7872975A; US4059571A; SE7502346L; SE403703B; NL167167B; DK141432C; FR2262996A1; NO144111C; CA1041997A; DE2508132A1; NO750768L; DD118655A5

Description

Die Erfindung betrifft ein Humanimmunglobulln-Derlvat, wie es im Anspruch 1 gekennzeichnet ist. Verfahren zur Herstellung dieses Humanimmunglobulin-Dcrivats. sowie eine parenteral applizierbare Lösung, die dieses enthüll, sind bereits Gegenstand des liauplpatents ^4(< DE-PS 25 08 123.

Aul dem Gebiet der Proteinchemie wurde in letzter Zeit die Beziehung zwischen der Struktur und den Funktionen des Immunglobulins, welche eine wichtige Rolle für die medizinisch äußerst signifikante Humorallmmunitilt spielt, näher untersucht.

Es wurde dabei festgestellt, daß das lmmunglobulin in fünf Typen unterteilbar ist, d. h. IgG, IgA, IgM, IgD und IgE. wovon IgG (das Humanimmunglobulin G) nicht weniger als 70 Gew.-% einnimmt.

Die Humanimmunglobuline, ausgenommen IgM, sind jeweils hauptsächlich aus vier Peptidketten aufgebaut und es sind mehrere Dlsulfidbindungen in den Interketten und den Intraketten vorhanden. Beispielswelse kann das IgG. das typischste der Immunglobulinde, falls es ^j5 mit Papain digeriert wird, in zwei Fragmente »Fab« mit Antigenbindungsaktlvität und einem Fragment »Fc« mit Komplement- und Gewebebindungsaktivität fraktioniert werden. Es wurde weiterhin festgestellt, daß das IgG aus zwei Polypeptidschwerketten (Η-Ketten) und zwei Poly- ^b0 peptidleichtketten/(L-Ketten) aufgebaut ist, welche durch Disulfidhindungcn und nichikovalcmc Bindungen unter Bildung eines Proteinmoleküls mit einem Molekulargewicht von etwa 160 000 stark verbunden sind, und daß das Molekül durchschnittlich etwa 4.5 Interkettcn- ^h> disulfldblndungen und etwa 12 Intrakeuendisulfidbindungcn enthüll [B. Frangione & C. Mllstein; J. Mol. Biol.. Band 33. Seite 893 (1968)].

Bezogen auf die vorstehenden empirisch festgestellten Sachverhalte wurden verschiedene Untersuchungen hinsichtlich lmmunglobulin für intravenöse Injektion ausgeführt. Die Verwendung des Immunglobulins setzte sich nach der Beendigung der Cohn-Fraktionierung [E. G. Cohn und Mitarbeiter; J. Amer. Chem. Soc, Band i58, Seite 459 (1946)] rasch durch.

Cohn und Mitarbeiter fraktionierten eine große Menge Humanplasma durch Äthanolausfällung. Die Fraktion II ist überwiegend IgG, welches kleinere Mengen an IgA und IgM enthält, und zeigt Antikörperaktivität gegen verschiedene Mikroorganismen, die Infektionskrankheiten verursachen. Deshalb ist die Verabfolgung der Frak tion II wirksam für die Prophylaxe und die Therapie von Virusinfektionskrankheiten, wie Masern, Viralhepatitis und dergleichen, sowie Infektlonskranhkeiten von gegenüber Anitbiotika beständigen Bakterien, wie Streptococcus aureus.

Die einzige bisher zur Verabfolgung des auf diese Weise fraktionierten und rezeptierten Humanimmunglo bulins angewandte Maßnahme war die intramuskuläre Injektion. Jedoch kann die intramuskuläre Injektion lediglich P-irtialosmosen der Injektionsfiüssigkeit in den Körper bewirken und kann nicht eine augenblickliche Wirkung zeigen. Weiterhin erlaubt die intramuskuläre Injektion nicht die Verabfolgung großer Mengen. Deshalb war das Auffinden eines Humanimmunglobulins, das für intravenöse Injektion geeignet ist, erwünscht.

Die intravenöse Injektion des bekannten Humanimmunglobulins verursacht heftige pyrogene und cardiovaskuläre Reaktionen, welche bei einem gammaglobulinämischen Patienten besonders auffällig sind. Diese ungünstigen Reaktionen der intravenösen Injektion werden durch Aggregate von Humanimmunglobulin, die in den Fraktionen des Humanimmunglobulins enthalten sind, verursacht. Das aggregiene Humanimmunglobulin verbindet sich mit Komplement und Gewebe in ähnlicher Weise wie beim Antigen-Antikörper-Komplex. so daß sich nachteilige Reaktionen ergeben, die durch den im Körper ausgebildeten anaphylaktischen Faktor verursacht werden. Die nachteiligen Reaktionen können dadurch verhindert werden, daß die von dem rezeptierten lmmunglobulin durch Ultrazentrifugierung mit 100 000 xg abgetrennte überstehende Flüssigkeit verwendet wird, jedoch findet unvermeidlich eine langsame Reaggregierung in dem auf diese Weise behandelten lmmunglobulin statt.

Im Hinblick auf eine sichere Intravenöse Injection von lmmunglobulin wurden zahlreiche Untersuchungen unternommen. In der Schweiz wurde versucht, das Humanimmunglobulin einer pH 4-Behandlung zur zeitweiligen Denaturierung seines »Fc-Anteiles zu unterwerfen, so daß dieses für die intravenöse Injektion geeignet wird [S. Barandun und Mitarbeiter; Vox Sang. Band 7, Seite 157 (1962)]. Jedoch ist die Behandlung unvollkommen und die nachteiligen Reaktionen werden gelegentlich noch beobachtet.

Pepsinbehandeltes lmmunglobulin wird technisch für intravenöse Injektionen geliefert [H Koblet, S. Barandun und H. Dlggelman; Vox Sang, Band 13. Seite 92 (1967)]. Da 60 bis 80% des behandelten Immunglobulins aus dem Fragment F (ab')_; aufgebaut sind, wird in vivo die lnjek-Uonsflüssigkeit rasch verschlechtert, was sich durch ihre Halbwertszeit von einigen Stunden anzeigt, die einige Zehntel derjenigen des unherundelten Immunglobulins ist [B. Jäger; Arch. Intern. Mcd.. Band 114. Seite 60 (1967)).

fiine weiterhin verbesserte Injektionsflüssigkeii kann

erhalten werden, wenn das Pepsin durch Plasmin als Behandlungsmittel ersetzt wird, jedoch hat das Verfahren den Nachteil, daß das Plasmin später nicht entfernt werden kann [L. Ä. Hanson & B. G. Johonson; Int. Arch. Allergy, Band 31, Seite 380 (1967)].

Jn letzter Zeit wurde vorgeschlagen, selektiv hauptsächlich die Interkettendisulfidbindungen des Humanimmunglobulins zu spalten und die gebildeten Schwefelatome (S-) zu S-alkylieren und die Immunglobulin-terivate mit verringerten unerwünschten Reaktionen für die intravenöse injektion zu verwenden.

Beispielsweise Ist als Versuch zur Spaltung der Interkettendisulfidbindungen des Humanimmunglobulins, um Polypeptidketten zu erhalten, das Verfahren von S T. Stevenson und Mitarbeiter [Bio. Chem., J., Band 118, Seite 703 (I960)] bekannt, welches in der reduzierenden Spaltung der Interkettendisulfidbindungen von Humanimmunglobulin In Dithiothreitol und der S-Alkylierung desselben in Jodacetamid besteht. Das Verfahren erfordert jedoch zweistufige Reaktionen und weiterhin besteht das Produkt aus S-aiky!ferten Polypeptiden, die eine potentielle Gefahr für eine neue Antigenizität darstellen.

Weiterhin ist es in keiner Weise einfach, den S-TeIl in Thiolgruppen zu überführen. Deshalb ist es auch schwierig, hiervon ein brauchbares Reagens abzuleiten. Indem dieses auf einem Träger, beispielsweise einem geeigneten Polymeren, unter Anwendung des aktiven Thiols getragen wird.

Das Franek-Verfahren [F. Franek, Coll. Czech. Chem. Commun.. Band 29, Seite 1401 (1964)] besteht In der Behandlung von Schweineimmunglobulin mit Natriumsulfit und KupferdD-ionen zur Bildung von S-sulfonierten Polypeptiden.

Wiederholungsversuche des vorstehenden Verfahrens von Franek und Mitarbeitern zeigten die dem Verfahren anhaftenden Mängel auf. nämlich:

(i) die erhaltenen denaturierten Polypeptide enthalten Kupfer oder KupferdD-ionen, wobei die Entfernung des Kupfers oder der KupferdD-ionen aus dem Produkt äußerst schwierig oder praktisch unmöglich ist; (Ii) die denaturierten Polypeptide zeigen eine rasche Abnahme der Antigenbindungsaktivitäl, wenn sie die gewünschte niedrige Antikomplementaktlvität haben,

(iii) die ursprüngliche Gestalt des lmmunglobulins wird verzerrt und geändert, wie durch optische Drehungsmessungen bestätigt und wie In den später angegebenen Vergleichen und Kontrollen gezeigt wird.

Die Tatsache, daß es praktisch unmöglich Ist, den kleinen Rest an Kupfer aus dem denaturierten Polypeptidprodukt nach dem Verfahren von Franek und Mitarbeitern zu entfernen, belegt, daß dieses Produkt thermisch instabil ist, zur Bildung von Aggregaten neigt und offensichtlich physiologisch unerwünscht ist, wenn es für intravenöse Injektion verv/endet werden soll [D. A. Derber; Arthritis and Rheumatism, Band 17, Seite 85 (1974)].

Aufgabe der Erfindung Ist daher die Schaffung eines Humanimmunglobulin-Derivats, das weder Kupfer noch KupferdD-ionen enthält, worin entweder die Interkettendisulfidbindungen, welche zwei Polypeptldschwerketten (Η-Ketten) und zwei Polypeptldleichtketten (L-Ketten) im Humanlummunglobulin verbinden, selektiv gespalten sind oder außer den angegebenen Interkettendisulfidbindungen ein geringer Teil der Intraketiendisulfidbindungen gespalten ist und die gespaltenen Schwefelatome (-S) S-sulfoniert (S-SO",) sind, und das eine verringerte Anti-

10

komplementaktivität hat und eine ausgezeichnete hohe Antikörperaktivität während längerer Zeiträume im menschlichen Körper beibehalten kann, nur wenige nachteilige Reaktionen zeigt und das das native Humanimmunglobulin in vivo rekonstruieren kann.

Insbesondere bezweckt die Erfindung die Bereitstellung eines neuen Humanimmunglobulin-Derivats, welches durch selektive Spaltung von praktisch lediglich der Interkettendisulfidbindungen, die die schweren Ketten (Η-Ketten) und die leichten Ketten (L-Ketten) des Humanimmunglobulins verbinden, und durch S-Sulfonierung der gebildeten Schwefelatome gebildet wird und eine gleichförmige Qualität besitzt.
Gemäß der Erfindung werden die vorstehenden Aufga-

ben gelöst und die Vorteile erreicht durch die Bereitstellung des neuen Humanimmunglobulin-Derivats, das von oxidierenden Metallionen wie KupferdD-ionen frei ist und das dadurch gekennzeichnet ist, daß darin durchschnittlich 3 bis 5 der Interkeitendisulfidbindungen des

nativen Humanimmunglobulins vorwiegend gespalten sind, und die so erzeugten Schwefelatome (S-) S-sulfoniert (-S-SO")) sind, und daß es

(1) einen Antidiphterie-Titer, der praktisch gleich mit demjenigen von nativem Humanimmunglobulin ist, hat,

(2) eine optische Drehung, die praktisch gleich derjenigen von nativem Humanimmunglobulin ist, hat und

(3) in vivo zu nativem Humanimmunglobulin zurückgebildet wird.

Samtliche beanspruchten Humanimmunglobulinderivate besitzen die vorstehend angegebenen Merkmale (1), (2) und (3).

Besonders bevorzugt wird ein Humanimmunglobulin- !·'> Derivat gemäß der Erfindung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß durchschnittlich 3 bis 4,5, Insbesondere 4,5 der Interkettendisulfidbindungen des nativen Humanimmunglobulins Im wesentlichen selektiv gespalten sind und daß die dabei gespaltenen Schwefelatome S-sulfo-⁴⁽¹ niert sind.

Unabhängig von den Stellen oder Plätzen der gespaltenen Disulfidbindungen ist das neue Humanimmunglobulin-Derivat gemäß der Erfindung dadurch charakterisiert, daß

(1) es durch Spaltung von durchschnittlich 3 bis 5 Interkettendisulfidbindungen und gegebenenfalls von Intrakettendlsulfidblndungen in geringem Ausmaß des nativen Humanimmunglobulins und S-Sulfonierung

-₍₁ (-S-SO",) der hierbei gespaltenen Schwefelatome gebildet wird, und daß

(2) das Humanimmunglobulin-Derivat mindestens 1,0 1. E./ml des Antldlphterie-Titers bei einer Konzentration von 10,0 Gew.-% aufweist.

" Das Humanimmunglobulin-Derivat gemäß der Erfindung liefert eine wasserlösliche Zusammensetzung, die zur Bildung von Injektionsflüssigkeiten brauchbar ist, wenn sie mit Löslichmachungsmitteln, die für Menschen ungefährlich sind, vermischt wird. Auch durch Auflö-

sung der wasserlöslichen Zusammensetzung in Wasser können wäßrige Zusammensetzungen für intravenöse Injektion erhalten werden.

Hin besonders bevorzugtes Humanimmunglobulin-Derivat gemäß der Erfindung ist ein solches, worin

durchschnittlich 4,5 Interkettendisulfidbindungen des natlven Humanimmunglobulins im wesentlichen selektiv gespalten sind und die auf diese Weise gebildeten Schwefelatome (praktisch 9 Atome durchschnittlich) S-sulfo-

nlert (S-SO ι) sind. Anhand von Untersuchungen werden diese bevorzugten Humanimmunglobulin-Derlvate gebildet, wenn Im wesentlichen allein die Η-Ketten und L-Ketten des nativen Humanlmmunglobulins verbindenden lnierkettendisulfidbindungen gespalten sind und die dabei gebildeten Schwefelatome S-sulf'onlert sind.

Das neue Humanimmunglobulln-Derlvat gemäß der Erfindung kann durch Umsetzung von nativem Humanimmunglobulin In Wasser mit

(A) einer zur Bildung des Tetrathionatlons fähigen Verbindung und

(B) einer zur Bildung von Sulfitionen fähigen Verbindung zur Spaltung von durchschnittlich 3 bis 5 Interkettendisulfidbindungen oder zusätzlich zu den praktisch gesamten Interkettendlsulfldblndungen von einer kleineren Menge der intrakettendisuifidbindungen des nativen Humanimmunglobullns, wobei die Anzahl der gespaltenen Disulfidbindungen maximal durchschnittlich 5 nicht übersteigt, und gleichzeitige S-Sulfonierung (-S-SO"]) der auf diese Weise gebildeten Schwefelatome hergestellt werden.

Nach dem vorstehend angegebenen Verfahren ist es möglich, in erster Linie die Interkettendisulfidbindungen des nativen Humanimmunglobulins vorwiegend zu spalten.

Deshalb können die Humanimmunglobulin-Derivate gemäß der Erfindung, worin durchschnittlich 3 bis 5 Disulfidbindungen des nativen Humanimmunglobulins gespalten und die gebildeten Schwefelatome S-sulfoniert sind, als Produkte betrachtet werden, worin praktisch die Interkettendisulfidbindungen allein des nativen Humanimmunglobulins gespalten sind und die erhaltenen Schwefelatome S-sulfoniert sind.

Das Verfahren wird im wesentlichen in Wasser ausgeführt, jedoch ist das Medium in keiner Weise auf Wasser begrenzt, sondern es können auch andere wäßrige Medien verwendet werden, sofern sie für die Reaktion zur Bildung des Humanimmunglobulins gemäß der Erfindung nicht schädlich sind.

Als Verbindung (A). welche zur Bildung des Tetrathionations in Wasser fähig ist, werden Tetrathionsäure, Alkalisalze hiervon, wie Natrlumtetrathionat, Kaliumtetrathi^nat und dergleichen, und wasserlösliche Salze hiervon, wie Ammoniumtetrathionat, bevorzugt, obwohl auch andere Verbindungen verwendet werden können, sofern sie das Tetrathionation in Wasser bilden können.

Typische Beispiele für Verbindungen (B), welche das Sulfition in Wasser liefern können, umfassen schweflige Säure, Natriumsulfit, Kaliumsulfit und Natriumsulfit, wobei jedoch auch andere Verbindungen verwendet werden können, sofern sie Sulfitionen in Wasser bilden können.

Die Verbindung (A), welche zur Bildung des Tetrathionations in Wasser fähig ist, wirkt als Oxidationsmittel. Hingegen dient die Verbindung (B), die das Sulfition in Wasser bildet, als Reduktionsmittel, sowie als S-Sulfonierungsmittel.

Die Mengen von Sulfitionen und Tetrathionationen sollen jeweils nicht weniger als die 2fache molare Menge der zu spaltenden Disulfidbindungen (-S-S-Bindungen) des als Ausgangsmaterial dienenden, nativen Humanimmunglobulin sein. Sie können bis hinauf zu jeweils der lOOfachen molaren Menge der zu spaltenden Bindungen oder sogar noch darüber liegen.

Es wird bevorzugt, daß die Verbindungen (A) und (B), insbesondere (B), in Wasser oder einer Pufferlösung vor ihrem Zusatz zu dem Reaktionssystem dieses Verfahrens eelöst werden.

Die bei diesem Verfahren stattfindende Reaktion kann so beschrieben werden, daß die Interkettendlsulfidbindungen des nativen Humanimmunglobulins durch das Sulfition gespalten werden, eines der Schwefelatome in eine S-Sulfonatgruppe (-S-SO^-!) und das andere zur Thiolgruppe (-SH) gespalten werden und jeweils zwei der dabei gebildeten Thiolgruppen durch das Tetrathionalion zur Bildung einer Disulfidbindung oxidiert werden oder daß die Thiolgruppe mit dem Tetrathionation zur Überführung in S-Thiosulfat (-S-S_;O~i) reagiert und erneut durch das Sulfitlon angegriffen wird. Dadurch wiederholt sich die Reaktion. Infolge dieser Reaktion werden die Interkettendisulfidbindungen des nativen Humanimmunglobulins gespalten und die dadurch getrennten Schwefelatome werden in die S-Sulfonatgruppe (-S-SO~j) in den schweren Ketten und den leichten Ketten umgewandelt.

Das Verfahren wird bei Temperaturen von nicht höher als 50° C, insbesondere bei IO bis 50° C, möglichst bei 15 bis 48° C, ausgeführt, wobei es auch möglich ist, das Verfahren bei niedrigeren Temperaturen durchzuführen.

Normalerweise besteht bei hohen, 50° C übersteigenden Temperaturen, insbesondere oberhalb 55° C, eine Neigung, daß das native Humanimmunglobulin denaturiert wird und eine Spaltung der Intrakettendisuifidbindungen eintritt. Deshalb sollten derartig hohe Temperaturen vermieden werden.

In diesem Verfahren soll die Anwesenheit von solchen proteinstörenden Mitteln, wie Harnstoff oder Guanidin, welche bei der S-Sulfitolyse von Insulin oder Rlbonuclease [J. L. Bailey und Mitarbeiter, L. Biol. Chem., Band 234, Seite 1733 (1959)] verwendet werden, besser vermieden werden. Falls verwendet, sollte jedoch das quantitative Verhältnis dieser störenden Mittel nicht mehr als 2,0 Mol je Mol des nativen Humanimmunglobulins betragen.

Die Reaktionszeit variiert in Abhängigkeit von solchen Faktoren, wie Menge der Reaktionsteilnehmer, Reaktionstemperatur und Anwesenheit eines Denaturierungsmittels, wie Harnstoff und dergleichen. Der bevorzugte pH-Wert der Reaktionsflüssigkeit liegt im Bereich von etwa 3,5 bis 10, insbesondere 6 bis 9. Bei einem pH-Wert niedriger als 3,5 zeigt sich eine Neigung zur Spaltung der Intrakettendisulfidbindung im Fc-Teil des nativen Humanimmunglobulins. Hingegen wird bei einem pH-Wert oberhalb 10 das globulinbildende Protein denaturiert, was zu solchen nachteiligen Ergebnissen, wie Hemmung der Antikomplementaktivitätsverringerung und Verringerung der Antigenbindungsaktivltät, führt. Es besteht keine kritische Reihenfolge für den Zusatz der Reaktionsteilnehmer zu dem Reaktionssystem.

Nach der Reaktion wird das Reaktionsgemisch einer anschließenden Dialyse gegen Wasser oder eine geeignete Pufferlösung, wie Salzlösung mit einem Gehalt von O,01m-Phosphatpuffer (pH 7,4) und 2,5% Glycin unterzogen, worauf die neuen Humanimmunglobulin-Derivate gemäß der Erfindung erhalten werden können.

Die neuen Humanimmunglobulin-Derivate gemäß der Erfindung können weiterhin in die L-Ketten und H-Ketten durch Säulenchromatographie unter Anwendung einer mit geeigneten Harzen, beispielsweise Sephadex G-75 gefüllten Säule und einem Lösungsmittel, wie Im-Propionsäure, getrennt werden.

Die Anzahl der S-Sulfonatgruppen (-S-SO~₃) In dem neuen Humanimmunglobulln-Derlvat gemäß der Erfindung kann beispielsweise bestimmt werden, indem das Herstellungsverfahren unter Anwendung von radioaktivem Natriumsulfit ausgeführt wird und die mit ³⁵S mar-

kierien S-Sulfonaie in dem erhaltenen Humanlmmunglobulin-Derivat mit einem Füsslgkeitssclntlllationszähler gezählt werden, wie in den späteren Beispielen ausgeführt ist.

Die eine Hälfte der auf diese Welse bestimmten durchschnittlichen Anzahl der markierten S-Sulfonatgruppen je Molekül des llumanimmunglobulln-Derivats entspricht der durchschnittlichen Anzahl der gespaltenen intermolekularen Dlsulfidbindungen in dem als Ausgangsmaterial verwendeten nativen Humanlmmunglobulin.

Andererseits können die Humanimmunglobuiln-Derlvate, die durchschnittlich etwa 9 S-Sulfonatgruppen je Molekül enthalten, d. h. die durch Spaltung von durchschnittlich 4,5 Disulfldblndungen des nativen Humanimnvüngiobülins und S-Sulfonierung der gebildeten Schwefelatome nach dem Verfahren gebildet wurden, in H-Ketten und L-Ketten fraktioniert werden, wobei beispielsweise Sephadex G-75 oder G-200 für die Säulenchromatographie, vorzugsweise In Gegenwart einer geringen Menge von Harnstoff oder Guanidin, beispielsweise mit Propionsäure als Lösungsmittel, wie vorstehend abgehandelt, verwendet werden.

Es kann somit jeder Satz von Bedingungen für die Durchführung des Verfahrens angewandt werden, sofern sie die Herstellung von Humanimmunglobuün-Derivaten erlauben, welche durchschnittlich praktisch 9 S-Sulfonatgruppen je Molekül enthalten, die weiterhin in H-Ketten und L-Ketten nach der anpegebenen Säulenchromatographie fraktioniert werden können. Wenn ein derartiger Satz von Bedingungen empirisch einmal bestimmt wurde, kann die Anzahl der gespaltenen Dlsulfldbindungen in dem nativen Humanimmunglobulin in geeigneter Weise durch Einstellung der Reaktionszeit unter dem gewählten Satz von Bedingungen geregell werden.

Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand von Arbeitsbeispielen weiter erläutert.

Die in den Beispielen eingesetzten Reagenzien waren die folgenden:

Humanimmunglobulin I:

15%ige Lösung von Humanimmunglobulin, das Im wesentlichen aus 98 Gew.-% nativem Humanimmunglobulin G und 2 Gew.-% nativem Humanimmunglobulin A besteht, für intramuskuläre Injektion In gepufferter Salzlösung (pH neutral) mit einem Gehalt von 2,5% Glycin (Produkt der Chems-Sero-Therapeutlc Research Institute).

y-Globulin-Human Fr, II (Produkt der Nutritional BIochemicals Corporation, USA), das mehr als 95 Gew.-% natives Humanimmunglobulin G enthält.

Natrlumtetrathionai:

Unmittelbar vor dem Gebrauch aus Natrlumthiosulfat (Na₇S₂O₃ · 5H₂O) und Jod (J₂) in wäßrigem Äthanol hergestellt.

Natriumsulfit (special grade. Produkt der Komune Kagaku Yakuhln Co).

Na₂SO₃ markiert mit ⁵⁵S* (Produkt der New England Nuclear (USA))

Tris-HCl:

Tris-(hydroxyrnethyl)-arninomethan (Produkt der Nakarai Kagaku Yakuhin Co) Chemikalie spezieller Qualität für biochemische Untersuchungen mit einem mit wäßriger 1 n-HCl verringerten pH-Wert.

Die Antikörperaktiv Itäts- und die Antlkomplementaktivitätswerte wurden in folgender Weise bestimmt:

Bestimmung des Antidiphtherie-Titers

Reaktion:

Senslbilislerte positive Haem-Agglutlnatlonsreaklion

(Fußnote 1) wurde angewandt
Bestimmungsverfahren:

Mikroplatten verfahren
Blutzellen:

Menschliche rote Blutzellen vom O-Typ (Fußnote 2), welche mit Formalin und mit BDB (Bls-diazobenzidin) behandelt waren (Fußnote 3) und mit dlphtheritlschem

Toxoid senslbilislert waren.
Kontrolle:

Standard-Antikörper für Diphtherie (NIH Japan)

Fußnote 1)

NIH-Japanverfahren: F. Murata, Nr. 21, Tokyo Veterinaian &

Animal Husbandry (1975)
Fußnoie 2)

W. T. Butler: J. Immunol, Band 90, Seite 663, 1963)
Fußnoie 3)

J. Dordon, B. Rose, A. H. Sehon: J. Exp. Med., Band 108,

Bestimmung des Antikörpers für Masern, Röteln und

Mumps (Fußnoten 4 bis 9)

Reaktion:

Mikroplattenverfahren mit Ausnahme von Masern, wofür das Reagenzglasverfahren angewandt wurde.

Antigen:

Antigene für die Haem-Agglutlnation (von Toshiba Chemicals hergestellt).

Kontrollserum:

Standard-Antiserum (der Toshiba Chemicals) mit Ausnahme für Masern, für die Standard-Antiserum (NIH Japan) verwendet wurde.

Fußnote 4)

Dulde por Hemagglutionations Inhibition-Test für Masern

nach dem Mikroilterverfahren: NIH Japan
Fußnote 5)

Sequenze zur Bestimmung des Humanlmmunglobullns G ist

die Antikörperaktivliäi gegenüber Masern (NIH Japan)
Fußnoie 6)

T. Toyarna, Clinical Examinations, Band 16 Nr. 29 (1972)
Fußnoie 7)

An Introduction to Virus Empirical Science, herausgegeben

von NIH Japan Alumni. Maruzen Bookslone (1973)
Fußnoie 8)

Empfohlene Vorschriften für Mikrobiologische Reagenzien,

US-Depl. of HEW, April 1965
Fußnoie 9)

Mumps-Hl-Reaktlonsverfahren: (NlII Japan).

Bestimmung der Antikomplementaktivltäi:
Das von Kabat & Mayer »Experimental lmmunochemlstry« Seite 225 (1961) beschriebene Verfahren wurde angewandt. Eine l%ige Immunglobullnlösung mit einem Genau von Meerschweinchcnscrurr·., 20 CV.a/ml. wurde auf 5 ml mit GVB~ gebracht, auf 37° C während Stunde erwärmt und das verbrauchte Antlkomplement wurde nach diesem Verfahren bestimmt. Die Antikomplementaktivitätswerte sind durch die Prozentsätze des Verbrauchs, bezogen auf 20 CH₅o/ml, angegeben.

Beispiel 1

Beziehung der Reaktionsbedingungen zur Anzahl der Spaltungen der Disulfidbindungen

Bedingung I

Zu 51 mg des vorstehend angegebenen Humanimmunglobulins II wurden 36 mg mit "S-markiertes Na₂SO₃* und 22 mg Na₂S₄O₆, sowie wäßrige 0,Im-TfIs-HCL (pH 8,2) zur Bildung einer Probe von 5,0 ml zugesetzt, welche auf 45° C erhitzt wurde, wobei die anschließende Reak-

tion bei dieser Temperatur ausgeführt wurde. Jeweils 0.5 mi des Reaktionsgemisches wurden unmittelbar nach Beginn und nach 30 Minuten, 1 Stunde, 2 Stunden, 4 Stunden, 7,4 Stunden und 24 Stunden der Reaktion als Probe genommen. Jede Probe wurde mit 10 ml einer 50%igen gesättigten Ammoniumsulfatlösung unter Eiskühlung vermischt, während 15 Minuten unter Eiskühlung stehengelassen und der erhaltene Niederschlag zentrifugal abgetrennt. Nach der Wäsche, wiederum mit 50^llniger gesättigter Ammoniumsulfatlösung, wurde der Niederschlag hinsichtlich Radioaktivität mit einem Flüssigkeltsscintillatlonszählgeräl gemessen und aus dem Ergebnis die Anzahl der darin enthaltenen -S-SOj-Gruppen berechnet.

Bedingung II

Die Umsetzung wurde unter Identischen Bedingungen wie der vorstehenden Bedingung I ausgeführt, jedoch wurde während der Reaktion keine Probe genommen. 4 Stunden, nachdem die Reaktion begonnen hatte, wurde eine wäßrige lOm-Harnstofflösung zu dem Reaktionssystem zugesetzt, so daß die Harnstoffkonzentration darin 4m betrug. Nach einer Umsetzung während 5 und 6 Stunden (bzw. 1 uder 2 Stunden Reaktion nach der Harnstoffzugabe) wurden jeweils 0.5 ml der Reaktionsflüssigkeit als Probe genommen und in gleicher Welse wie die unter Bedingung I genommenen Proben behandelt.

Bedingung 111

Reaktion und Probebehandlung unter der Bedingung 1 wurde wiederholt, wobei jedoch die Reaktionstemperaiur 0^c C betrug.

Bedingung IV

Reaktion und Probebehandlung gemäß Bedingung 1 wurden wiederholt, wobei jedoch die Reaktlonstemperatür 25° C betrug.

Bedingung V

Reaktion und Probebehandlung gemäß Bedingung I wurden wiederholt, wobei jedoch kein Na₂S₄O,, ■ 2H₂O verwendet wurde.

Die Ergebnisse der Umsetzungen unter den vorstehenden Bedingungen 1. II. III. IV und V sind in der folgenden Tabelle I zusammengefaßt.

Tabelle I

Beziehung der Reaktionsbedingungen zur Anzahl der gebildeten -S-SO.rGruppen

Reaktionsbedingung

Reaktionszeil (Stunden)

0 0,5 1 2

7.4 24

I	(45° C)	O	6,1	9,0	8,9	9.4
II	(45° C, Harnstoff-	_	_	-	_	_
	Zusatz nach 4 Std.)
III	( O⁰C)	O	0.5	1,6	2.5	2.9
IV	(25° C)	0,2	1,6	4,1	5.0	4.5
V	(frei von	0	0,5	0,8	1.1	0.8
	Na-.S₄O„ 2H₂O)

8.9 10.4

10.9 13.3

3.4
7.0

5.0
8.5
4,5

Die Anzahl der gespaltenen Dlsulfldbindungen entspricht einer Hälfte der Anzahl der -S-SOi-Gruppen.

Aus den in Tabelle I angegebenen Ergebnissen der Reaktion läßt sich das Folgende schließen. Wenn das Verfahren in Gegenwart von Tetrathionat und Natriumsulfit bei 45° C unter der Bedingung I durchgeführt wird, werden etwa 3 Disulfldblndungen im Verlauf von einer halben Stunde gespalten, wobei der Durchschnitt etwa 4,5 im Verlauf νυπ 1 bis 7 Stunden Reaktion und etwa 5,2 nach 24 Stunden Reaktion erreichte.

Wenn die Reaktion in Identischer Weise, abgesehen von der Temperatur, bei 25° C (Bedingung IV) durchgeführt wurde, wurde die Anzahl der gespaltenen Disulfidblndungen verringert, wobei die Anzahl der gespaltenen Bindungen einen durchschnittlichen Wert von etwa 4,3 nach einer so langen Reaktionszeit wie 24 Stunden erreichte. Wenn die Reaktionstemperatur 0° C betrug (Bedingung III). nahm die durchschnittliche Anzahl der gespaltenen Disulfidbindungen noch weiter ab. Jedoch in Abwesenheit von Natriumtetrathionat (Bedingung V) konnte die Spaltung der Disulfidbindungen nicht glatt fortschreiten. Wenn hingegen Harnstoff zu dem Reaktionssystem zugegeben wurde (Bedingung II), nahm die durchschnittliche Anzahl der gespaltenen Disulfidbindungen nach der Harnstoffzugabe rasch zu.

Beispiel 2

Vergleich der Verschlechterung der physikalischen Eigenschaften, wenn Na₂S₄O₀ oder Cu"" als Oxidationsmittel verwendet wurden.

Bedingung I

Zu 2,0 g des vorstehend angegebenen Humanimmungiobuiins Π wurden i,42 g Na₂SOi und Ο,βό g Na_:S,O„ ■ 2H₂O. 0,1 m-Tris-HCl (pH 8,2) zugesetzt, um ein Gemisch von 200 ml zu erhalten, welches dann bei einer Anfangstemperatur von 45° C umgesetzt wurde. Unmittelbar nach Beginn der Reaktion und bei 30 Minuten, 1 Stunde. 2 Stunden und 4 Stunden danach wurden jeweils 15 ml der Reaktionsflüssigkeit als Probe genommen. Unmittelbar anschließend an die fünfte Probenähme wurde eine lOrn-Hamstofflösung zu dem Rest der Reaktionsflüssigkeit zugegeben, um die Harnstoffkonzentration darin auf 4m zu bringen, und die Reaktion wurde fortgesetzt. Nach 5 und 6 Stunden der Reaktion (bzw. 1 und 2 Stunden nach der Harnstoffzugabe) wurden jeweils 22,5 ml der Reaktionsflüssigkeit als Probe genommen und hierzu 22,5 ml einer eisgekühlten gesättigten Ammoniumsulfatlösung zugegeben, worauf 30 Minuten unter Kühlung mit Eis stehengelassen wurde.

ZD OU l3D

Der erhaltene Niederschlag wurde zentrifugal abgetrennt, mit 50'Uger gesättigter Ammoniumsulfatlösung gewaschen und während 24 Stunden gegen gepufferte Salzlösung von pH 7,4 durch ein Visking-Rohr dialysieri. Nach der Dialyse wurden Proben in der jeweilig erforderlichen Menge für bestimmte Analysen genommen, welche mit gepufferter Salzlösung von pH 7,4, die 2.5'ί, Glycin enthielt, verdünnt und analysiert wurden

Bedingung H

Die Reaktion und die Behandlung gemäß Bedingung 1 ■wurden wiederholt, wobei jedoch Na₂S₄O,, ■ 2H₂O durch 50 mg CuSO₄ ■ 5H₂O ersetzt wurde, und die Reaktion wurde am Ende der 4. Stunde beendet.

Die dabei erhaltenen Lösungen der verschiedenen Humanimmunglobulin-Derivate wurden den folgenden Testen und Bestimmungen unterzogen.

(a) Beziehung von Reaktionszeit und Anzahl der -S-SO.-Gruppen:

Die Anzahl der -S-SOj-Gruppen in den mit Tetrathionat (Na₂S₄Ot 2H₂O) oxidierten Proben sind in der F i g. 1 durch »O« zusammen mil den entsprechenden Werten, die unter den Bedingungen I und II von Beispiel 1 erhalten wurden, aufgetragen. Die Werte der anderen mil Cu" oxidierten Proben, die in identischer Weise mil der Bedingung I von Beispiel 1 umgesetzt und behandelt wurden, wobei jedoch Na₂S₄O₆ · 2H₂O durch 50 mg CuSO₄ ■ 5H₂O ersetzt wurde, sind in Fig. 1 mit schwarzen Punkten »·« aufgetragen.

(b) Beziehung der Reaktionszeit zur Antlkomplementaktivität:

Die Antikomplemeniaktivitäten der durch Oxidation mit Na₂S₄O₆ ■ 2H₂O unter der Bedingung 1 von Beispiel 2 erhaltenen Proben, bestimmt nach dem bereits angegebenen Verfahren, sind in Fig. 2 aufgetragen. Auch die Antikomplementaktivltäten der mit Cu" unter der Bedingung II oxidierten Proben sind aus Fig. 2 ersichtlich. Es ergibt sich aus Fi g. 2. daß die Antikomplementaktivitäten sämtlicher Proben auf nicht höher als 30% nach einer Reaktion von 30 Minuten verringert waren.

(c) Beziehung der Reaktionszeit zum Antidiphiherie-Titcr:

Die gleichen vorstehend unter (b) angewandten Proben wurden 3mal hinsichtlich des Antidipht'nerie-Titers nach dem bereits angegebenen Verfahren untersucht. Die Abweichung und die Mittelwerte ergeben sich aus Fig. 3. Aus der graphischen Darstellung ist ersichtlich, daß die mit Cu" oxidierten Proben einen bereits nicht höher als 0,3 IE liegenden Titer nach einer Reaktion von 30 Minuten zeigen.

(d) Beziehung der Reaktionszeit zur optischen Drehung Die für die Antikompiementaküviiälsbesiinimungcn

nach (b) vorstehend verwendeten Proben (Proteinkonzentration 2,5%) wurden hinsichtlich der optischen Drehung untersucht, wobei die Ergebnisse in Fig. 4 gezeigt sind. Aus den gezeigten Werten ergibt es sich, daß die Anwesenheit von Kupfer(II)ionen im Reaktionssystem eine fortschreitende Denaturierung während der Reaktion verursacht, und daß die Anwesenheit von Harnstoff die Denaturierung begünstigt, wie sich durch die erhebliche Zunahme der optischen Drehung zeigt.

Die optische Drehung wurde dabei bei 25° C unter Anwendung einer 1-cm-Zelle bestimmt.

e) Beziehung der Reaktionszeit zur Trübung nach der Wärmebehandlung:

Die gleichen für die Antikomplementaktivitälsbestimmung gemäß (b) angewandten Proben wurden bei einer Konzentration von 2,5% In Luft während 4 Stunden bei 5O^C C wärmebehandelt, wobei die In Fig. 5 aufgeführten Ergebnisse (optische Dichte OD) erhalten wurden. Wie sich aus Fig. 5 ergibt, verursacht die Anwesenheit von bereits einer sehr geringen Menge an KupferUD-ionen eine Verschlechterung der Wärmestabilität und begünstigt die Neigung zur Aggregation.

(O Beziehung der Reaktionszeit zum Kupfergehall:

Die gleichen für die AntlkomplementakUvitätsbestimmung gemäß (b) angewandten Proben wurden auf ihren KupferdDionengehalt durch Atomabsorptionsanalyse untersucht, wobei die Ergebnisse in Fig. 6 aufgeführt sind. Aus den Werten zeigt es sich, daß, falls Kupfer (II)-ionen angewandt werden, selbst durch Wäsche und Dialyse der Probe der KupferdDionengehalt nicht entternl werden kann.

(g) Trennung der schweren Kelten von den leichten Ketten:

Die gleiche Probe, wie sie nach 2 Stunden Reaktion unter Bedingung 1 von Beispiel 2 erhalten wurde, wurde während 24 Stunden mit ln-Propionsäure mit einem Gehalt von 6m-Harnstoff dialysiert und einer Säulenchromatographie mit Sephadex G 200 (1,5 cm Durchmesser χ 80 cm), das mit der angegebenen wäßrigen Lösung ins Gleichgewicht gesetzt worden war, unterzogen, wobei die in Fig. 7 aufgeführten Ergebnisse erhalten wurden.

Die erste Spitze von links der Zeichnung bezeichnet nicht gelrennte H₂L₂-Ketten, die zweite Spitze bezeichnet Η-Ketten und die dritie Spitze bezeichnet L-Ketten. Die Ergebnisse belegen, daß die Probe in Η-Ketten und L-Ketten getrennt war.

Bei einer Zusammenfassung der in den Fig. 1 bis 7 aufgeführten Ergebnisse werden die nachsiehenden Folgerungen erhalten:

(1) Wie sich aus den Ergebnissen der Versuche unter Bedingung I in Beispiel 1 ergibt, beträgt, falls das Verfahren in Gegenwart von Tetrathlonat- und Sulfitionen durchgeführt wird, bei jeder Reaktionsdauer im Bereich von 1 bis 4 Stunden die durchschnittliche Anzahl der gespaltenen Disulfidbindungen etwa 4,5 und die dabei gebildeten Schwefelatome sind S-suifoniert (durchschnittliche Anzahl der S-Sulfonatgruppen etwa 9), so daß das S-sulfonierte Immunglobulin erhalten wird (Fig. 1), welches in Η-Ketten und L-Ketten beispielsweise mittels Säulenchromatographie mit Sephadex G 200 (Fig. 7) trennbar ist und eine praktisch identische optische Drehung zu derjenigen des nativen Humanimmunglobulins hat (Fig. 4).

Aufgrund der vorstehenden Ergebnisse kann für das neue Kuffianimmunglubuiin-Dcrivat mit Sicherheit

" angenommen werden, daß es praktisch durch Spaltung lediglich der Interkettendisulfidbindungen des nativen Humanimmunglobulins und S-Sulfonierung der gespaltenen Schwefelatome erhalten wurde, und zwar im Hinblick auf die Tatsache, daß die Anzahl der Interkettendisulfidbindungen des nativen Humanimmunglobulins durchschnittlich 4,5 beträgt.

Dieses Humanimmunglobulin-Derivat hat eine auf nicht höher als 10% verringerte Antikomplementaktivität, d. h. eine weit niedrigere als diejenige des nativen Humanimmunglobulins (F i g. 2), zeigt jedoch einen nicht merklich schlechteren Antidiphtherie-Titer gegenüber nativem Humanimmunglobulin, wie sich durch die nahezu äauivalente Antlgenbindungsaktivität zeigt. Wie

aus F i g. 3 ersichtlich, behält bei einer Konzentration von 10 Gew.-% das Humanimmunglebulin-Derlvat eine Antigenbindungsaktlvität von mindestens 1,0 IE/ml bei.

(2) Die durch Spalt".'ng von weniger oder mehr als durchschnittlich 4,5 der Disulfidbindungen des natlven Humanimmunglobulins, beispielsweise durchschnittlich nicht weniger als 3 oder bis hinauf zu 5, und S-Sulfonierung der Schwefelatome erhaltenen S-sulfonlerteri Immunglobulin-Derivate zeigen eine etwas niedrigere Verringerung ihrer Antikomplementaktlvitäten und eine schlechtere Antlgenbindungsaktivität im Vergleich zu den bevorzugten Immunglobulln-Derlvaten, die vorstehend unter (1) angegeben sind (Fig. 2 und 3), zeigen jedoch eine noch merklich verbesserte Antikomplementaktivität gegenüber derjenigen von natlvem Humanimmunglobulin.

(3) Wenn hingegen das Tetrathionation als Oxidationsmittel durch das KupferdDion ersetzt wird, enthalten die sich ergebenden Humanimmunglobulln-Derivate KupferdDionen, wenn auch nur In sehr geringen Konzentrationen, die jedoch mit Zunahme der Reaktionszeit erhöht werden (Fig. 6). Auch die Anzahl der gespaltenen Disulfidbindungen des natlven Humanimmunglobulins nehmen bei einer Verlängerung der Reaktionszelt zu (Fig. 1). und infolgedessen ist es schwierig, die gewünschten Humanimmunglobulin-Derlvate durch Spaltung von durchschnittlich praktisch 4,5 Disulfidbindungen des nativen Humanlmmunglobllns in stabiler Weise herzustellen.

Darüber hinaus zeigen die unter Anwendung von KupferdDionen erhaltenen Humanimmunglobulin-Derivale eine verringert!. Antikomplementaktlvität (Fig. 2), jedoch ist auch gleichzeitig Ihr Antldlphtherle-Titer beträchtlich gesenkt im Vergleich zu demjenigen des natlven Humanimmunglobulins. Somit ist auch ihre Antlgenbindungsaktivität äußerst verringert (Flg. 3). Die Humanimmunglobulin-Derlvate zeigen wiederum, falls die Reaktionszeit 1 Stunde überschreitet, unterschiedliche optische Drehungen gegenüber derjenigen des natlven Humanimmunglobulins, was belegt, daß Strukturänderungen Im Protein aufgetreten sind.

(4) Ähnliche Änderungen der optischen Drehungen sind gleichfalls bei Humanlmrnunglobulln-Derivaten feststellbar, welche nach dem vorliegenden Verfahren erhalten wurden, wobei jedoch Harnstoff im Reaktionsverlauf zugegeben wurde. Aus diesem Grund Ist auch die Abwesenheit von Harnstoff, Guanidin und dgl. Im Reaktionssystem erwünscht.

Beispiel 3
Selektive Spaltung der Interkettendlsulfldblndungen

2 ml einer wäßrigen Lösung mit einem Gehalt von 20 mg Humanlmmunglobulin 1, 80 mg ¹⁵S-Na₂SO₁* (8,22 χ 10"dpm/Mol) und 40 mg Na₂S₄O,, ■ 2H₂O wurden auf einen pH von 7,2 mit AcOH eingestellt und bei 39° C wahrend 2 Stunden umgesetzt. Anschließend wurde die Reaktionsflüssigkeit gegen 5 I Wasser während 24 Stunden dialyslert. Dann wurden Harnstoff und Propionsäure langsam zu dem System bis zu Endkonzentratlonen von 4m bzw. In zugefügt. Vor der Einbringung in die Chromaiogruphicsäule wurde als Probe 0,1 ml Lösung abgenommen, deren Werte auf der linken Seite tier Ordinate in Fig. 8 angegeben .sind. Der Rest des Systems wurde der Säulenchromalographle unter Anwendung von Sephadex G 200 (1,5m Durchmesser χ 100 cm), welche mil ln-Proplonsäure mit einem Gehalt von 4m-Harnstoff ins Gleichgewicht gesetzt worden war. unterworfen.

Die Radioaktivität der Proben wurde durch OD₂₈O jeder Fraktion und mit dem Flüsslgkeltssclntlllationszählgerät gemessen; die Ergebnisse sind In Fig. 8 enthalten.

Beispiel 4

Fraktionierung der schweren Ketten
und leichten Ketten

Zu einer wäßrigen Lösung mit einem Gehalt von iOOmg Human-y-Globulin-II wurden 0,4 g NaiSOj und 0,2 g Na₂S₄O₆ · 2H₂O zugesetzt und der pH-Wert des Systems wurde auf 9,0 mit In-HCl eingestellt, worauf während 48 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt wurde. Nach der Umsetzung wurde eir.e kleine Menge des im System gebildeten unlöslichen Materials zentrifugal entfernt. Die ReaktionsflOssigkeit wurde dann unter Anwendung eines Vlsking-Rchres gegen 2,5 1 Wasser bei 5° C während 15 Stunden dialyslert und weiterhin gegen 2,5 I einer wäßrigen Lösung von ln-Proplonsäure bei 5° C während 28 Stunden dialysiert.

Das Dialysat wurde der Säulenchromatographie unter Anwendung von Sephadex G 7:5 (3,5 cm Durchmesser χ 111cm), die mit 1 n·Propionsäure ins Gleichgewicht gesetzt war, ur srzogen, und dabei wurden die Polvpcptldketten fraktioniert. Wie aus der in Flg. 9 gezeigten graphischen Darstellung erslchtllich, waren drei Spitzen feststellbar, welche in der Reihenfolge des größeren Molekulargewichtes als unfraktlonlertes S-sulfoniertes Immunglobulin, S-sulfonlerte Η-Ketten und S-sulfonierte L-Ketten Identifiziert wurden. Die Identifizierung wurde durch Immunologische Maßnahmen, beispielsweise dem Ouchterlony-Vcrfahren und der Immuno-Elektrophorese, sowie durch chemische Analyse, wie Aminosäureanalyse. Hexosegehaltbestimmung und dgl. durchgeführt.

Aus den in den Fi g. 8 und 9 aufgeführten Werten lassen sich die nachstehenden Folgerungen ableiten:

(1) Da die erste Spitze als unfraktioniertes S-sulfoniertes Immunglobulin, die zweite Spitze als S-sulfonlertc H-Ketten und die dritte Spitze als S-sulfonierte L-Kelten aufgrund Immunologischer und chemischer Methoden entsprechend Fig. 9 von links nach rechts Identifizier! wurden. Ist es logisch zu folgern, daß in gleicher Weise die drei Spitzen In der Fig. 8 von links nach rechts zu dem unfraktlonicrten S-sulfonicxten Immunglobulin, S-sulfonierten Η-Kelten und S-sulfonlcrtrn L-Kettcn zuzuordnen sind. Die Unterschiede zwischen den Chromatographiemustern werden durch die Anwesenheit vor Harnstoff im ersteren Reaktionssystem verursacht.

(2) Gemäß Fi g. 8 wurde aus der Menge des Protein; In den die dritte Spitze bildenden L-Ketten die molare Konzentration berechnet und aus der molaren Konzentration und dem Radioakvivltätswert wurde festgestellt daß die die dritte Spitze bildenden L-Ketten 1,0 -S-SO, *· Gruppen enthielten. In der gleichen Welse wurden die Anzahl der -S-SO^-üruppen in den Η-Ketten der zwei ten Spitze zu 3.4. diejenigen im unfraktionlerten S-sulfo nlerten Immunglobulin zu 8,8 und diejenigen In den· Gemisch vor der Einbringung in die Chromatographiesäule zu 8,6 berechnet. Wie bereits erläutert. Ist eine Di sulfidbindung zur Verbindung der L-Kette und der 11 Kelte vorhanden, während durchschnittlich 2.5 Disulfidbindungen /wischen /we! ll-keiten vorhanden sind Infolgedessen enthalt das native Hiimanlmmunglobulir

^b5 durchschnittlich 4.5 Interkcttentlsulfidblndungcn.

(3) Nach dem Chromatographiemuster der Flg. 8 is' der (jriißic fei! des S-sulfonierten Immunglobulins. wcf chcs durchschnittlich 8.6 -S--SO."-Gruppen einhalt, ir

Η-Ketten und L-Ketten auftrennbar. Daraus ist ersichtlich, daß die Interkeitendlsulfidblndungen selektiv gespalten sind, während die Intrakettendisulfldbindungen praktisch unversehrt geblieben sind.

Beispiel 5 Ausführungsformen der Reaktionsbedingungen

133 ml Human-y-globulin 1 wurden in 1667 ml eines O,06m-Phosphatpuffers (pH 8,2) mit einem Gehalt von 2,5% Glycin gelöst. Zu der Lösung wurden 7,0 g Na₂SO₃, gelöst in 100 ml des gleichen Puffers, und 4,4 g Na₂S₄O₆ · 2H₂O, gelöst in 100 ml des gleichen Puffers, zugesetzt und bei 45° C während 3 Stunden umgesetzt. Die Reaktionsflüssigkeit wurde während 6 Stunden gegen 20 Liter Puffersalzlösung, gebildet aus Natriumsalz, unter Anwendung eines Dow Chemical-Bechers, Ultrafilter b/HFU-1, dialysiert. Die Außenflüssigkeit der Dialyse wurde alle 2 Stunden ausgetauscht. Das Dialysat wurde auf ein Volumen von 180 ml durch das gleiche Filter konzentriert und hierzu wurden 50 g Glycin zugesetzt.

Die Lösung wurde steril durch eine 0,25 μιη-Membran filtriert, in 10 ml-Ampullen zu jeweils 5,0 ml gegossen und lyophilisieri. Die Antikomplementaktivitäi CH_S0 der sterilen Lösung bei 50%lger Konzentration betrug 4,3%.

Anwendungsbeispiel 1

Vergleich der Antikörperaktivitäten gegenüber Antlgenen In Versuchen unter Anwendung von Na₂SiO₆ oder Cu" als Oxidationsmittel

Bedingung I

Zu 67 ml Human-y-globulln I wurden 7,1g Na₂SO₃ und 0,43 g Na₂S₄O₆-2H₂O sowie eine O.lm-Tris-HCl-Pufferlösursg mit einem Gehalt von 2,5% Glycin zu einem Gesamtvolumen von 3,0 1 zugesetzt. Nach 3 Stunden Umsetzung bei 45° C wurde die Reaktionsflüssigkeit unter Anwendung eines Dow Chemical-Bechers, Ultra-Filter b/HFU-1, dialysiert und das Dialysai auf ein Volumen von 200 ml konzentriert, durch einen Seitz-0,25 μίτι-Filter steril filtriert, unter Zusatz von 2,5 g Glycin lyophillsiert und mit Wasser auf eine 5,0%ige Lösung verdünnt. Die Antikörperaktivität der Probelösung ergibt slrh aus Tabelle II.

Bedingung II

Die Reaktion und die Behandlungen unter der Bedingung I wurden wiederholt, wobei jedoch Reaktionstemperatur und Reaktionszeit auf 25° C bzw. 24 Stunden geändert wurden.

Bedingung HI

Reaktion und Behandlung unter der Bedingung I wurde wiederholt, wobei jedoch Na₂S₄O₆ ■ 2H₂O durch 0,16 g CuSO₄ ■ 5H₂O ersetzt wurde.

Die unter den vorstehenden Bedingungen 1 bis III erhaltenen Lösungen der Humanimmunglobulin-Derivate wurden hinsichtlich Antikörperaktivitäten gegenüber verschiedenen Antigenen uniersucht, wobei die Ergebnisse in Tabelle II aufgebührt sind.

10

15

Tabelle II

Antikörperaktivitäten für verschiedene Antigene

Reaktionsbedingung

Antigen

Diphtherie (Einheiten/ml) Masern
(Einhcitcn/ml)

Röieln
(relativ)

Mumps
(relativ)

Intakt 0,8

I (Na₂S₄O₆, 45° C - 3 Std.) 0,8

II (Na₂S₄O,, 25° C- 24 Std.) -

III (Cu⁺\ 45° C- 3 Std.) <0,l

6,7 5,0 4,4 <2

171
170

Aus den Werten der vorstehenden Tabelle 11 lassen sich nachstehende Folgerungen ableiten:

(1) Wenn Tetrathionat verwendet wurde (Bedingung I), war der Diphlherle-Titer des S-sulionlerten Immunglobulins praktisch äqulvplent mit demjenigen des natlven Humanlmmunglobullns, während, wenn Kupfer-(Il)ionen verwendet wurden, (Bedingung III), die Immunglobullnderlvate praktisch keine Aktivität zeigten.

(2) Hinsichtlich des Titers für Masern behielt das S-sulfonierte Immunglobulin, welches mit Tetrathionat oxidiert worden war (Bedingung I und II), mehr als 60% desjenigen des natlven Humanimmunglobullns bei. während das mit Kupfer!II(ionen (Bedingung III) oxidierte einen Aktiviiätsabfall auf weniger als 30% zeigte.

Hieraus ist ersichtlich, daß hei Verwendung von Kupfer! IDionen die Verringerung der Antikörperaktivität größer isl als bei Verwendung von Tetrathionat.

50 Anwendungsbeispiel 2

Antikomplementtest in vivo des S-sulfonicrten Humanlmmunglobullns

In gleicher Welse wie bei Bedingung 1 von Anwendungsbeispiel 1 wurde S-sulfoniertes Humanimmunglobulln erhalten.

3 ml der 5ⁱygcn. gepufferten Salzlösung mit einem Gehalt von 2,5% Glycin, pH 7,4, 3 ml der gepufferten Salzlösung allein als Kontrolle und 1 ml eines 15%igen unbehandelten Humanlmmunglobulin I in gepufferter Salzlösung mit einem Gehalt von 2,5% Glycin, ebenfalls als Kontrolle, wurden intravenös an weibliche Meerschweinchen mit einem Körpergewicht von 200 bis 300 g verabreicht und die Serumkomplcmentwerte der Testkörh5 per mit den Seren von jeweils 1,0 ml bestimmt, die jeweils durch Cardlo-Punktur in regelmäßigen Abständen abgenommen wurden.

Die Ergebnisse sind in Fi g. 10 aufgeführt. Aus Fi g. 10

25

ist ersichtlich, daß ein abrupter Abfall des Serumkomplementwertes in den Tesikörpern nach der intravenösen injektion von intaktem Humanimmunglobulin beobachtet wurde, der bei der gleichen Verabreichung von S-sulfoniertem Humanimmunglobulin Null betrug. Auch wurde ein gelegentliches Zittern bei den Meerschweinchen nach der Injektion des ersteren beobachtet, das andererseits bei Meerschweinchen nicht auftrat, an die das S-sulfonlerte Humanimmunglobulin intravenös injiziert war. Aus diesem Sachverhalt läßt sich mit Sicherhell erwarten, daß die Humanimmunglobuün-Derivate gemäß der Erfindung auch in vivo frei von ungünstigen Reaktionen sind.

Anwendungsbeispiel 3

Beständigkeit von S-sulfonierten Kaninchen-immunglobulin und Rückbildung der Disulfidbindungen in vivo

(a) Herstellung von Kaninchen-Anti-BSA-DNP-Anükörper:

Rinderserumalbumin (BSA) wurde mit Dinitrofluorphcnol zur Bildung einer Verbindung umgesetzt, welche nachfolgend mit der Abkürzung BSA-DNP bezeichnet wird. BSA-DNP wurde an Kaninchen (Species New Zealand White, weiblich) an den Fußpolstern zusammen mit vollständigem Adjuvans nach Freund Injiziert und immunisiert. Am 30. Tag nach der Injektion wurden die Kaninchen aus der Corotidartcrie ausgeblutet. Das dabei erhaltene Aniiscrum wurde in an sich bekannter Weise nach dem Ausfallungsverfahren mit 45'v,iger gesättigter Ammonlumsulfatlösung behandelt und Kaninchen-Anti-BSA-DNI'-Immunglobulin wurde erhalten.

(b) Herstellung der Proben:

Bedingung 1

Das Anti-BSA-DNP-lmmunglohulin wurde bei 37'C während 24 Stunden zusammen mil I Gew.-'*, Pepsin bezogen auf Immunglobulin gemäß dem A. Nisonoll-Verrahrcn (Arch. Biochm. Biophys.. 89, Seite 230. I960) hydrolysiert. Das Hydrolysat wurde der Säulcnchromatographie mit Sephadex G 150 unterworfen und das F (ab')₂-Fragment wurde erhalten.

Bedingung 2

250 ml des Anti-BSA-DNP-lmmunglobulins, 180 mg Nn₂SO, und 79 mg Na₂S₄O,, · 2H₂O wurden in 25 ml O.lm-Tris-HCI mit einem Gehalt von 2,5% Glycin (pH 8,2) gelöst und bei 37° C während 4 Stunden umgesetz.t. Die Reaktionsflüssigkeit wurde während 24 Stunden gegen gepufferte Salzlösung (pH 7,4) dialysiert und ergab S-sulfoniertes Kaninchen-Immunglobulin.

Bedingung 3

Das vorstehend aufgeführte BSA-DNP-lmmunglobulin wurde als solches verwendet.

35

40

45

50

55 Tabelle 111
Verblichene Radioa

(c) Bestimmung des Umwandlungsausmaßes und der Haltbarkeit

Die in der vorstehenden Welse hergestellten Proben wurden jeweils zu Lösungen mit einer Konzentralion von 5".· verarbeitet.

Die Probelösungcn wurden intravenös an Kaninchen (Species New Zealand White ': Probe 1 an drei Kanin- ^Μ

dien. Pp.be 2 an drei Kaninchen und Probe 3 an zwei

Kaninchen) mit einer Dosierung von etwa 3 ml injiziert. Pie Versuchstiere wurden In bestimmten Zeitabstiinden 15 Minuten ausgeblutet und ihr Plasma wurde extrahiert. Die Anti-BSA-DNP-Aktivität im Plasma wurde durch passive Haem-Agglutinationsreaklion bestimmt (T. Matsuhashi, Chemistry & Biology, 9, 396, 1971), wobei BSA-DNP auf roten Blutzellen der Schafe unter Anwendung von Glutaraldehyd fixiert wurde und das Mikrotiterverfahren angewandt wurde, wobei die in F i g. 11 aufgeführten Ergebnisse erhalten wurden.

Wie sich klar aus Fig. 11 ergibt, ist das Umwandlungsausmaß in vivo äußerst kurz für das handelsübliche F(ab')₂, was eine kurze Dauer der pharmazeutischen Wirksamkeit anzeigt. Im Gegensatz hierzu zeigt das S-sulfonierte Immunglobulin praktisch die gleiche Halbwertszeit wie diejenige des nativen Humanimmunglobulins, woraus sich eine beständige pharmazeutische Wirksamkeit ergibt.

(d) Bestimmung der hämolytischen Aktivität der Antikörper

Das angegebene native Anti-BSA-DNP-Immunglobulin wurde intravenös an Kaninchen injiziert und deren Plasma IO Minuten nach der Injektion gesammelt, welches auf das lOOfachc Volumen verdünnt wurde und mit Meerschweinchenkomplement und roten Blutzellen der Schafe, aufweiche BSA-DNP durch Gerbsäure adsorbiert worden war, bei 37° C während 1 Stunde umgesetzt.

Der intakte Antikörper gemäß Bedingung 3 verursachte eine IOO%ige Hämolyse. während F(ab')₂ gemäß Bedingung 1 und die S-sulfonierte Probe gemäß Bedingung 2 keine hämolyiischc Aktivität zeigten.

Von dem aus den Kaninchen 24 Stunden nach der Injektion genommenen Plasma verursacht das Produkt unter Bedingung 2 bei dem gleichen Test, wie vorstehend angegeben, eine 100%ige Hämolyse.

Diese Erscheinung ist vermutlich auf die Rückwandlung des S-sulfonierten Immunglobulins In natives Humanimmunglobulin in vivo zurückzuführen, d. h. die Reduktion von -S-SO₁ in -SH und die Wiederbildung der Disulfidbindungen.

(e) Bestimmung der Verringerung der Markierungskonzcntration in vivo:

30 mg Kaninchen-Immunglobulin. 21 mg '⁵S-Na₂SOi und 13 mg Na₂S₁O₁, ■ 21I₂O wurden in 3 ml O.lm-Tris-HCI mit einem Gehalt von 2.5% Glyc'n (pH 8.2) gelöst und bei 45 C während 3 Stunden umgesetzt. Die Reaktionsflüssigkeit wurde während 24 Stunden gegen gepufferte Salzlösung (pH 7.4) dialysiert und auf diese Weise wurde das "S-markiene S-sulfoniertc Kaninchen-Immunglobulin hergestellt.

Die vorstehende, aul eine 5¹JgC Konzentration verdünnte Probe wurde intravenös an zwei Kaninchen (New Zealand White, ■) mit jeweils 1.5 ml injiziert und das Kaninchenplasma in bestimmten Zeitabständen in einer Menge von 0.5 ml je Kaninchen abgenommen. Die Radioaktivitäten des Plasmas wurden durch einen Flüsslgkeitsscintillationszähler gemessen, wobei die in Tabelle IH aufgeführten Ergebnisse erhalten wurden.

iil im Blut

BIiIlCnInMlInIc-ZCiI nach
der intravenösen Injektion

Rcstraduiakliutat im Bin!
Kaninchen Λ Kaninchen Ii

KlO

100

Fortsetzung

Blutentnahme-Zeit nach	Restradioaktivität im Blut	A Kaninchen B
der intravenösen Injektion	Kaninchen	64 %
3 Stunden	64 %	34 %
7 Stunden	34 %	8,0%
»4 Stunden	9,5%	1,0%
18 Stunden	2,2%	0 %
72 Stunden	0,7%

Aus den vorstehenden Werten ergibt es sich, daß die -S-SOj*-Gruppen in dem S-sulfonierten Immunglobulin im Blut gespalten werden.

Wie sich aus den vorstehenden Beispielen zeigt, ist es möglich, selektiv die Disulfidbindungen. welche die H-Ketten und die L-Ketten im nativen Immunglobulin verbinden, zu spalten und die dabei gebildeten Schwefelatome einer S-Sulfonierung zu unterziehen. Die Anzahl der Spaltung kann weiterhin auf einen durchschnittlichen Bereich von 3 bis 5, etwa 4,5, geregelt werden, was die durchschnittliche Anzahl der Interkeilendisulfidbindungen von natlvem Humanimmunglobulin ist, und die bei der Spaltung gebildeten Schwefelatome können S-sulfoniert werden.

Diese neuen Humanimmunglobulin-Derivate gemäß der Erfindung besitzen eine weit niedrigere Antikomplementaktivität als natives Humanimmunglobulin, wie sich aus den Beispielen ergibt, und verursachen infolgedessen weit weniger ungünstige Reaktionen der ar-aphylaktischen Faktoren. Deshalb sind die Derivate nicht nur intramuskulär injizierbar, sondern auch intravenös. Darüber hinaus zeigen die neuen Humanimmunglobulin-Derivate gemäß der Erfindung praktisch eine äquivalente Antigenbindungsaktivitäl wie natives Humanimmunglobulin und besitzen deshalb ausgezeichnete Bindungsaktivitäten gegenüber verschiedenen Antigenen.

Es ist bereits bekannt, Aggregate aus dem durch Fraktionierung hergestellten nativen Humanimmunglobulin durch Absorption oder Sedimentation mit Aktivkohle oder Polymersubstanzen zu entfernen. Jedoch verursacht das auf diese Weise behandelte Immunglobulin nicht selten ungünstige Reaktionen beim Empfänger der Injektion. Darüber hinaus wird eine Rtaggregation des auf diese Weise behandelten Immunglobulins während der Lagerung beobachtet. Das Produkt ist somit für eine sicher injizierbare Zusammensetung noch nicht zufriedenstellend (L. A. Hanson & B. G. Johanson; Int. Arch. Allergy, 31,380, 1967).

Es wurde bereits erwähnt und gezeigt, daß die Humanimmunglobulin-Derivate gemäß der Erfindung weit weniger ungünstige Reaktionen zeigen und in dieser Hinsicht ganz ausgezeichnet sind, wozu auf Fig. 2 verwiesen wird.

Die Humanimmunglobulin-Derivate gemäß der Erfinlä dung behalten auch die Antigenbindungaktivität während eines langen Zeitraumes bei, wie in Anwendungsbeispiel 3 belegt ist. Weiterhin werden die S-Sulfonatgruppen in den Derivaten in Disulfidbindungen in vivo zurückgewandelt, während die Sulfonatgruppen aus dem Körper ausgeschieden werden. Somit werden schließlich die Derivate in natives Humanimmungiobulin zurückverwandelt. Auch aus diesem Grund hat das S-sulfonierte Immunglobulin gemäß der Erfindung ganz augenscheinliche Vorteile gegenüber den bekannten S-alkylierten Immunglobulinen.

Wie bereits gezeigt, sind die neuen Humanimmunglobulin-Derivate gemäß der Erfindung als pharmazeutisch wirksame Bestandteile nicht nur für die intramuskuläre Injektion sondern auch für die intravenöse Injektion geeignet.

Die neuen Immunglobulin-Derivate gemäß der Erfindung ergeben wasserlösliche Zusammensetzungen für injizierbare Flüssigkeiten, wenn sie mit Löslichmachungsmiueln. wie Glycin. Natriumphosphat, Citrat, Natriumchlorid und dgl. in geeigneten Konzentrationen vermischt werden. Weiterhin können die Zusammensetzungen in Wasser bei Konzentrationen von beispielsweise 1 bis 20 Gew.-χ vorzugsweise 2 bis 10 Gew.-",,, gelöst werden, wobei sich intravenös injizierbare Präpa-"»o rate ergeben.

Das S-sulfonierte Immunglobulin-Derivat gemäß der Erfindung ist offensichtlich für die Therapie beim Menschen brauchbar.

Hierzu 7 Blatt Zeichnungen

Claims

10 15 Patentansprüche:

1. Humanimmunglobulinderivat, das von oxidierenden Meialllonen, wie KupferOD-ionen, frei 1st, dadurch gekennzeichnet, daß darin durchschnittlich 3 bis 5 der Interkettend'.sulfldbindungen des nativen Humanimmunglobulins vorwiegend gespalten sind, und die so erzeugten Schwefelatome (S-) S-sulfonien (-S-SO",) sind, und daß es

(Deinen Antidiphterie-Titer, der praktisch gleich mit demjenigen von nativem Humanimmunglobulin ist, hat,

(2) eine optische Drehung, die praktisch gleich derjenigen von nativem Humanimmunglobulin ist, hat und

(3) In vivo zu nativem Humanimmunglobulin zurückgebildet wird.

2. Humanimmunglobulinderivat nach Anspruch ), Jo dadurch gekennzeichnet, daß durchschnittlich 3 bis 4,5 Interkettendisulfldbindungen des nativen Humanimmunglobulins Im wesentlichen selektiv gespalten sind und die so erzeugten Schwefelatome S-sulfoniert sind.

3. Humanimmunglobulinderivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß durchschnittlich 4.5 lnterkcttendlsulfidblndungen des nativen Humanimmunglobulins im wesentlichen selektiv gespulten sind und die so erzeugten Schwefelatome S-sulfoniert sind, so