CH631625A5

CH631625A5 - Process for the production of a stable insulin preparation having a lasting action

Info

Publication number: CH631625A5
Application number: CH47076A
Authority: CH
Inventors: Bruno Andre Hansen; Finn Hede Andresen
Original assignee: Nordisk Insulinlab
Priority date: 1975-01-15
Filing date: 1976-01-15
Publication date: 1982-08-31
Also published as: DK8375A; BR7600206A; SE437219B; NL166464B; ZA7658B; NZ179733A; AT362492B; EG11988A; MY7900169A; DE2600971A1; FI66751C; BE837600A; LU74175A1; DE2600971C2; FI760058A; IL48845A0; PL99927B1; ATA21376A; CA1094549A; RO71576A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines stabilen Insulinpräparats mit Dauerwirkung und niedriger Antigenizität, insbesondere aus Ochsenpankreas, durch Umsetzung von sauren Gruppen des Insulins mit basischen Gruppen organischer Verbindungen. The invention relates to a method for producing a stable insulin preparation with long-term action and low antigenicity, in particular from ox pancreas, by reacting acidic groups of the insulin with basic groups of organic compounds.

Zur Behandlung von Diabetes Mellitus benutzt man normalerweise aus Schweine- oder Ochsenpankreas gewonnene Insulinpräparate. Der Gesamtverbrauch an Insulin setzt sich wie folgt zusammen: etwa 30% Schweineinsulin und etwa 70% Ochseninsulin. Man hat auch bereits vorgeschlagen, von anderen Tieren, beispielsweise Schafen, Insulin zu gewinnen, doch hat dies bisher keine grosse kommerzielle Bedeutung erlangt. Insulin preparations derived from pork or ox pancreas are normally used to treat diabetes mellitus. The total insulin consumption is made up as follows: about 30% pig insulin and about 70% ox insulin. It has also been proposed to obtain insulin from other animals, for example sheep, but this has not yet become of great commercial importance.

Die bisher erfolgte Insulintherapie ist mit verschiedenen Mängeln behaftet. Unter diesen Folgeerscheinungen sind zu nennen Allergie und Lipodystrophie. The insulin therapy that has taken place to date has various deficiencies. Among these sequelae are allergy and lipodystrophy.

Es ist schon lange bekannt, dass die übliche Insulinbehandlung bei den meisten Patienten zur Bildung von Insulin-Antikörpern führt, was in einzelnen Fällen einen erhöhten Insulinbedarf nach sich zieht, indem nicht bekannte Insulinmengen an die Antikörper gebunden werden können und dadurch für die Dauer dieser Bindung zur Regelung des Blutzuckers unwirksam sind. It has long been known that the usual insulin treatment leads to the formation of insulin antibodies in most patients, which in some cases results in an increased insulin requirement in that unknown amounts of insulin can be bound to the antibodies and thus for the duration of this binding to control blood sugar are ineffective.

Man hat seit längerem die Auffassung vertreten, dass die Antikörperbildung und damit der grosse Insulinbedarf primär durch verschiedene Verunreinigungen in normalem Handelsinsulin verursacht werden. It has long been believed that the formation of antibodies and thus the large insulin requirement are primarily caused by various impurities in normal commercial insulin.

Als Beispiele solcher Verunreinigungen sind zu nennen dimeres Insulin, Proinsulin, intermediäres Insulin (das Stadium zwischen Proinsulin und Insulin), Arginin-Insulin, Examples of such impurities include dimeric insulin, proinsulin, intermediate insulin (the stage between proinsulin and insulin), arginine insulin,

Äthylester-Insulin, Mono-Desamido-Insulin und Di-Des-amido-Insulin. Es ist bekannt, dass die erstgenannten drei Stoffe stark antigen sind und dass auch die an vierter Stelle und/oder die an fünfter Stelle genannte Verunreinigung eine 5 starke antigene Wirkung aufweisen, während die sechste und siebente Verbindung sowie das Insulinmolekül selbst nicht oder nur in geringem Ausmass antigen sind (vgl.: Schlicht-crull, Monocomponent Insulin and its Clinical Implications, 16. März 1973). Ethyl ester insulin, mono-desamido insulin and di-des amido insulin. It is known that the first three substances are strongly antigenic and that the fourth and / or fifth impurity also have a strong antigenic effect, while the sixth and seventh compounds and the insulin molecule itself are not or only slightly To a large extent are antigenic (see: Schlicht-crull, Monocomponent Insulin and its Clinical Implications, March 16, 1973).

io Es ist auch bekannt, die vorerwähnten Verunreinigungen durch Gelfiltration und/oder Ionenaustausch zu entfernen, wodurch man weitgehend gereinigtes Insulin erhält, das im wesentlichen nur eine Komponente enthält. In den letzten Jahren sind von einigen oder mehreren der vorerwähnten i5 Verunreinigungen befreite Insulinpräparate auf den Markt gebracht worden, die in vielen Fällen bei Diabetikern auch zu einer verminderten Antikörperbildung geführt haben. It is also known to remove the above-mentioned impurities by gel filtration and / or ion exchange, thereby obtaining largely purified insulin which essentially contains only one component. In recent years, some or more of the aforementioned i5 contaminants have been released onto the market, which in many cases have also led to reduced antibody formation in diabetics.

Es hat sich herausgestellt, dass schnellwirkende Präparate aus Schweineinsulin und Ochseninsulin in so reinem Zu-20 stand herstellbar sind, dass sie keine oder zumindest eine sehr geringfügige Antikörperbildung verursachen (vgl.: Schlichtcrull, Monocomponent Insulin and its Clinical Implications, 16. März 1973). Es hat sich des weiteren gezeigt, dass es möglich ist, Präparate mit Dauerwirkung und mit 25 wesentlich reduzierter Antigenizität herzustellen, wenn diese Präparate auf der Basis von weitgehend gereinigtem Schweineinsulin hergestellt werden (vgl. T. Deckert et al.: Diabet-ologia, Band 10, S. 703 bis 708,1974). Es steht jedoch ebenfalls fest, dass zwar reines Ochseninsulin herstellbar ist, wel-30 ches nach den heutigen Analysenmethoden als ebenso rein bezeichnet werden muss wie heute herstellbares hochgereinigtes Schweineinsulin, und dass dieses Ochseninsulin in schnellwirkenden Präparaten, wie bereits erwähnt, keine oder nur eine geringfügige Antikörperbildung verursacht, 35 dass anderseits aber auf dem Markt bisher noch keine niedrig antigenen Präparate mit Dauerwirkung auf der Basis von hochgereinigtem Ochseninsulin verfügbar sind. Dies ist ein erheblicher Mangel, da Präparate mit Dauerwirkung auf der Basis von Ochseninsulin international die gebräuchlichsten 40 sind. It has been found that fast-acting preparations from pig insulin and ox insulin can be produced in such a pure state that they cause no or at least very little antibody formation (see: Schlichtcrull, Monocomponent Insulin and its Clinical Implications, March 16, 1973) . It has also been shown that it is possible to produce preparations with long-term effectiveness and with significantly reduced antigenicity if these preparations are produced on the basis of largely purified porcine insulin (see T. Deckert et al .: Diabet-ologia, volume 10, pp. 703 to 708, 1974). However, it is also clear that although pure ox insulin can be produced, which according to today's analytical methods has to be called as pure as highly purified pig insulin that can be produced today, and that, as already mentioned, this ox insulin in quick-acting preparations has no or only a minor one Antibody formation 35, on the other hand, means that, on the other hand, no long-term low-antigenic preparations based on highly purified ox insulin are available on the market. This is a considerable deficiency, since preparations with a long-term effect based on ox insulin are the most common 40 internationally.

Die Bildung von Antikörpern gegen eine chemische Verbindung, beispielsweise Insulin, im lebenden Organismus ist auf Unterschiede in der Primärstruktur zurückführbar (vgl. Arquilla E.R. et al: Immunochemistry of Insulin, Handbook 45 of Physiology, Kap. 9, S. 160,1972). Die chemische Verbindung hat dadurch einen solchen sterischen Aufbau, dass sie auf den Organismus als fremd und unerwünscht wirkt (siehe Arquilla, E. R. et al: Immunology Conformation and Biolo-gical Activity of Insulin, Diabetes, Band 18, S. 194,1969), so oder sie hat eine solche Gesamtgrösse, dass ihre Wirkung für den Organismus fremd und unerwünscht ist (siehe Arquilla, E.R. et al: Immunochemistry of Insulin, Handbook of Physiology, Kap. 9, S. 160,1972). The formation of antibodies against a chemical compound, for example insulin, in the living organism can be traced back to differences in the primary structure (cf. Arquilla E.R. et al: Immunochemistry of Insulin, Handbook 45 of Physiology, chap. 9, p. 160, 1972). The chemical compound has such a steric structure that it acts on the organism as foreign and undesirable (see Arquilla, ER et al: Immunology Conformation and Biological Activity of Insulin, Diabetes, Volume 18, pp. 194, 1969), either way it has such a total size that its effect is foreign and undesirable for the organism (see Arquilla, ER et al: Immunochemistry of Insulin, Handbook of Physiology, Chap. 9, p. 160, 1972).

Eine Antikörperbildung wird auch dadurch hervorge-55 rufen, dass zusammen mit der chemischen Verbindung eine den Immunapparat aktivierende Komponente verabreicht wird. Mehrere Untersuchungen deuten daraufhin, dass der physikalische Zustand von Insulin bei der Bildung von Antikörpern eine wesentliche Rolle spielt [Kumar et al: Horn. 6o Metab. Res. 6 (1974), 175 bis 177, und P.A. Piers et al: Neth J. Med. 17 (1974) C. 234-238]. Antibody formation is also caused by the fact that a component activating the immune system is administered together with the chemical compound. Several studies indicate that the physical state of insulin plays an essential role in the formation of antibodies [Kumar et al: Horn. 6o Metab. Res. 6 (1974), 175-177, and P.A. Piers et al: Neth J. Med. 17 (1974) C. 234-238].

Der Umstand, dass die schnellwirkenden hochreinen In-sulinpräparate keine oder zumindest nur eine unwesentliche Bildung von Antikörpern verursachen, ist vermutlich darauf 65 zurückzuführen, dass die Insuline in diesen Fällen nicht nur sehr rein sind, sondern auch in monomerer Form vorliegen oder eventuell nur lose Aggregationen bilden, während man bei den bisher hergestellten, auf dem Markt verfügbaren The fact that the fast-acting, high-purity insulin preparations cause no or at least only insignificant formation of antibodies is probably due to the fact that the insulins are not only very pure in these cases, but are also in monomeric form or possibly only loose aggregations form while looking at the previously manufactured ones available on the market

3 3rd

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hochreinen Insulinpräparaten mit Dauerwirkung erreicht, dass das Insulin in aggregierter Form auftritt und die Bildung von Antikörpern bedingende Eigenschaften aufweist. Dieses Problem ist bei Ochseninsulin besonders ausgeprägt, was vermutlich darauf zurückzuführen ist, dass Ochseninsulin mehr zur Bildung von Aggregaten neigt als Schweineinsulin. high-purity insulin preparations with long-term effect achieved that the insulin occurs in an aggregated form and has the properties of antibodies. This problem is particularly pronounced with ox insulin, which is probably due to the fact that ox insulin tends to form aggregates more than pig insulin.

Ochseninsulin ohne Zusatzstoffe weist bekanntlich eine breitere isoelektrische Ausfällzone auf als Schweineinsulin. Es ist bekannt, dass diese breite isoelektriksche Fällungszone durch Zusatz gewisser Stoffe, beispielsweise von Phenol oder m-Cresol, auf den Breitenwert der Fällungszone für Schweineinsulin verengert werden kann (vgl. die dänische Patentschrift Nr. 116 527). Es ist anzunehmen, dass diese breitere isoelektrische Fällungszone des Ochseninsulins dem Umstand zuzuschreiben ist, dass Ochseninsulin bei pH-Werten in der Nähe des Neutralpunktes aggregiert. Ox insulin without additives is known to have a broader isoelectric dropout zone than pig insulin. It is known that this broad isoelectric precipitation zone can be narrowed to the width of the precipitation zone for porcine insulin by adding certain substances, for example phenol or m-cresol (cf. Danish Patent No. 116 527). It is believed that this broader isoelectric precipitation zone of ox insulin is due to the fact that ox insulin aggregates at pH near the neutral point.

Die DE-AS 1 017 323 betrifft ein Verfahren zur Herstellung von insulinhaltigen Präparaten mit verzögerter Wirkung, bei welchem man an Insulin in wässeriger Lösung ein tierisches, verestertes Albumin bindet. Es geht jedoch aus den Beispielen hervor, dass kristallines Ausgangsmaterial verwendet wird. Durch den Kristallisiervorgang wird das Insulin von gegebenenfalls vorliegenden Stabilisatoren getrennt, wodurch dann eine gewisse irreversible Agglomerierung stattfindet. So gut auch das Insulin im voraus gereinigt sein mag, durch diese Agglomerierung werden die Präparate mindestens ebenso stark antigen wie das Präparat 2, das in dem später folgenden Versuchsbericht beschrieben wird. DE-AS 1 017 323 relates to a process for the preparation of insulin-containing preparations with a delayed action, in which an animal-esterified albumin is bound to insulin in aqueous solution. However, it is evident from the examples that crystalline starting material is used. The crystallization process separates the insulin from any stabilizers that may be present, which then results in a certain irreversible agglomeration. As good as the insulin may have been cleaned beforehand, this agglomeration will make the preparations antigen at least as strong as preparation 2, which is described in the test report that follows later.

Die AT-PS Nr. 205 660 (vgl. GB-PS Nr. 762 871) betrifft ein Verfahren zur Herstellung von sauren Insulinlösungen mit verlängerter Wirksamkeit, die eine Komponente von Insulin mit einem synthetischen basischen Polypeptid, z.B. Polymeren und Copolymeren des Lysins und des Ornithins, enthalten. Hauptsächlich wird kristallines Insulin mit den oben erwähnten Nachteilen verwendet, und keine speziellen Massnahmen werden getroffen vor oder während der Reaktion des Polypeptids, um der Agglomerierung des Insulins entgegenzuwirken, weshalb das Präparat ohne Zweifel antigen ist. AT-PS No. 205 660 (cf. GB-PS No. 762 871) relates to a process for the preparation of acidic insulin solutions with prolonged activity which comprise a component of insulin with a synthetic basic polypeptide, e.g. Polymers and copolymers of lysine and ornithine. Mainly crystalline insulin is used with the disadvantages mentioned above and no special measures are taken before or during the reaction of the polypeptide to counteract the agglomeration of the insulin, which is why the preparation is undoubtedly antigenic.

Die Heterogenität verschiedener Insulinprodukte einschliesslich des im Handel erhältlichen kristallinen oder um-kristallierten Insulins wurde z.B. von J. Arthur Mirsky und Kazunori Kawamura [«Heterogeneity of Crystalline Insulin», Endocrinology 78 (1966), S. 1115 bis 1119] untersucht, welche Insulin aus vielen verschiedenen Tierarten sowie Menschen abtrennten und die einzelnen Insulinkomponenten durch Gelfiltration und Auftrennung durch Gelelektrophorese auf Polyacrylamid isolierten. The heterogeneity of various insulin products including the commercially available crystalline or recrystallized insulin has e.g. by J. Arthur Mirsky and Kazunori Kawamura ["Heterogeneity of Crystalline Insulin", Endocrinology 78 (1966), pp. 1115 to 1119] investigated which insulin separated from many different animal species and humans and the individual insulin components by gel filtration and separation by gel electrophoresis Polyacrylamide isolated.

Es wurden Versuche unternommen, niedrig antigene oder antigenfreie Insulinpräparate auf Basis solcher einkom-ponentiger Insulinprodukte herzustellen. So betrifft die GB-PS Nr. 1 285 023 ein injizierbares Insulinpräparat, welches frei von Proteinen der Bauchspeicheldrüse ist, mit einem Molekulargewicht über 6000 und im wesentlichen aus einer einzigen Komponente, wenn eine Lösung davon durch Gelelektrophorese auf Polyacrylamid untersucht wurde. Attempts have been made to produce low-antigenic or antigen-free insulin preparations based on such single-component insulin products. Thus, GB-PS No. 1 285 023 relates to an injectable insulin preparation which is free from proteins of the pancreas with a molecular weight above 6000 and essentially consists of a single component when a solution thereof has been examined by gel electrophoresis on polyacrylamide.

Obzwar die genannte Patentschrift vor mehreren Jahren veröffentlicht wurde und obzwar auch vor dieser Veröffentlichung einkomponentiges Insulin hergestellt werden konnte, haben bis jetzt Insulinpräparate auf Basis von einkomponen-tigem Ochseninsulin keine kommerzielle Bedeutung erlangt. Although the patent mentioned was published several years ago and although one-component insulin could also be produced prior to this publication, insulin preparations based on one-component ox insulin have so far not achieved any commercial importance.

Anderseits sind Präparate auf Basis von einkomponen-tigem Schweineinsulin auf dem Markt erhältlich; sie sind jedoch nicht antigenfrei. On the other hand, preparations based on one-component pig insulin are available on the market; however, they are not antigen-free.

Die Antigenizität von einkomponentigem Insulin wurde von R. E. Chance et al («The immunogenicity of insulin préparations», Acta Endocrinologica Supplementum 205, Kopenhagen 1976) untersucht. Das Ergebnis dieser Untersuchung war, dass Präparate auf Basis von einkomponentigem Ochseninsulin praktisch die gleiche Antigenizität besitzen wie Präparate, welche im Handel erhältliches umkristallisiertes Insulin enthalten. The antigenicity of one-component insulin was examined by R.E. Chance et al ("The immunogenicity of insulin preparations", Acta Endocrinologica Supplementum 205, Copenhagen 1976). The result of this investigation was that preparations based on one-component ox insulin have practically the same antigenicity as preparations which contain commercially available recrystallized insulin.

Präparate auf Basis von einkomponentigem Schweineinsulin hatten eine geringere Antigenizität als entsprechende im Handel erhältliche Präparate auf Basis von umkristallisiertem Schweineinsulin, jedoch noch immer eine beträchtliche Restantigenizität. Preparations based on one-component porcine insulin had a lower antigenicity than corresponding commercially available preparations based on recrystallized porcine insulin, but still had considerable residual antigenicity.

Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass es möglich ist, hochreines Insulin so zu stabilisieren, dass es weder bei seiner Herstellung noch in Präparaten mit Dauerwirkung während deren Aufbewahrung oder Benutzung Aggregate bildet, die eine Antikörperbildung verursachen. The invention is based on the knowledge that it is possible to stabilize high-purity insulin in such a way that it does not form aggregates which cause antibody formation, neither in its preparation nor in preparations with long-term action while it is stored or used.

Diese Stabilisierung wird durch die im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebene Massnahme erreicht. This stabilization is achieved by the measure specified in the characterizing part of claim 1.

Die Wirkung der proteindissoziierenden oder protein-depolymerisierenden Mittel besteht darin, dass eine Reaktion zwischen den sauren Resten des Insulinmoleküls und den basischen Resten des proteindissoziierenden oder pro-teindepolymerisierenden Mittels, wie z.B. Harnstoff, stattfindet. The effect of the protein-dissociating or protein-depolymerizing agents is that a reaction between the acidic residues of the insulin molecule and the basic residues of the protein-dissociating or protein-polymerizing agent, e.g. Urea, takes place.

Beim erfindungsgemässen Verfahren kann das hochgereinigte Insulin in stabilisierter monomerer oder lose aggregierter Form mit einer basischen Komponente, beispielsweise Arginin, Somatostatin, Protamin oder Globin, umgesetzt werden. In the method according to the invention, the highly purified insulin can be reacted in a stabilized monomeric or loosely aggregated form with a basic component, for example arginine, somatostatin, protamine or globin.

Diese Reaktion erfolgt zweckmässig in Gegenwart eines Stabilisators. This reaction is conveniently carried out in the presence of a stabilizer.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist mit Insulin von vielen verschiedenen Tierarten, beispielsweise Schweinen, Ochsen oder Schafen, durchführbar, jedoch bei Ochseninsulin von besonderer Bedeutung. The method according to the invention can be carried out with insulin from many different animal species, for example pigs, oxen or sheep, but is of particular importance in the case of ox insulin.

Als proteindissoziierendes oder proteindepolymerisieren-des Mittel wird Harnstoff bevorzugt. Urea is preferred as the protein dissociating or protein depolymerizing agent.

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass eine ein proteindissoziierendes oder proteindepolymerisierendes Mittel als Stabilisator enthaltende Insulinlösung einem Ionenaustausch unterworfen wird, indem man mit einem Elutionsmittel eluiert, welches einen die stabilisierte monomere oder lose aggregierte Form des Insulins aufrechterhaltenden Stabilisator enthält, und danach eine von Verunreinigungen befreites Insulin enthaltende Fraktion einer Lösung zusetzt, die ein basisches Polypeptid enthält. Der ausgefällte Polypeptidinsulinkomplex wird dann isoliert. Man vermeidet so mit grosser Sicherheit die Aggregatbildung, da das hochreine Insulin nicht zunächst als solches isoliert wird, was Gefahr einer Aggregatbildung mit sich führen würde. Diese Verfahrensweise ist überdies sehr einfach, weil dabei das Insulinpräparat mit Dauerwirkung in stabiler Form direkt ausgefällt wird. A preferred embodiment of the invention is characterized in that an insulin solution containing a protein dissociating or protein depolymerizing agent as a stabilizer is subjected to ion exchange by elution with an eluent containing a stabilizer that maintains the stabilized monomeric or loosely aggregated form of the insulin, and then one the contaminated insulin-containing fraction is added to a solution containing a basic polypeptide. The precipitated polypeptide-insulin complex is then isolated. In this way, aggregate formation is avoided with great certainty, since the high-purity insulin is not initially isolated as such, which would lead to the risk of aggregate formation. This procedure is also very simple because the insulin preparation with a long-term effect is directly precipitated in a stable form.

Versuchsbericht über immunologische Untersuchungen Experimental report on immunological tests

Um die andersartigen immunologischen Eigenschaften der in erfindungsgemässer Weise isolierten Protamin-In-sulin-Komplexe zu zeigen, wurden bei Hasen Vergleichsversuche durchgeführt, weil Hasen normalerweise für die Prüfung der antigenen Eigenschaften von Insulin und insulinähnlichen Verbindungen verwendet werden. In order to show the different immunological properties of the protamine-insulin complexes isolated in the manner according to the invention, comparative experiments were carried out in rabbits, because rabbits are normally used for testing the antigenic properties of insulin and insulin-like compounds.

Es wurden die folgenden Präparate verwendet: The following preparations were used:

1. Übliches NPH-Ochseninsulin, hergestellt in üblicher 1. Usual NPH ox insulin, made in usual

Weise aus umkristallisiertem Ochseninsulin, welches die obengenannten Verunreinigungen enthält. Way from recrystallized ox insulin, which contains the above-mentioned impurities.

2. Gereinigtes NPH-Ochseninsulin, hergestellt in üblicher 2. Purified NPH ox insulin, made in usual

Weise aus gereinigtem kristallinem Ochseninsulin, jedoch durch Säulenchromatographie von den genannten Ver- Way from purified crystalline ox insulin, but by column chromatography of the above-mentioned

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

631 625 631 625

unreinigungen befreit (Dieses Produkt erfüllt die in der cleanliness free (This product complies with the

GB-PS Nr. 1 085 023 angegebenen Reinheitskriterien). 3. Neues gereinigtes NPH-Ochseninsulin, hergestellt in er- GB-PS No. 1 085 023 specified purity criteria). 3. New purified NPH ox insulin, made in

findungsgemässer Weise wie in Beispiel 3 beschrieben. Den Hasen wurde subkutan jeden 10. Tag eine konstante Dosis von 20 I.E. des zu untersuchenden Insulinpräparates injiziert. Es war nicht möglich, nach der Injektion von üblichem NPH-Ochseninsulin ohne Adjuvantien eine wesentliche Antikörperbildung zu beobachten, und im Hinblick auf einen Vergleich war es daher erforderlich, einen Immunisierungsvorgang, wie er normalerweise bei der Herstellung von Antikörpern angewendet wird, anzupassen, indem die Insulinpräparate der ersten Injektion in einem vollständigen Adjuvans nach Freund und die Insulinpräparate der weiteren Injektionen in einem unvollständigen Adjuvans nach Freund emulgiert wurden. Die Injektionszeiten sind durch Pfeile in den Fig. 1 bis 3 gezeigt. inventive manner as described in Example 3. The rabbits were given a constant dose of 20 IU subcutaneously every 10th day. of the insulin preparation to be examined. It was not possible to observe substantial antibody formation after the injection of conventional NPH ox insulin without adjuvants, and for comparison purposes it was necessary to adapt an immunization procedure normally used in the production of antibodies by using the Insulin preparations of the first injection in a complete adjuvant according to Freund and the insulin preparations of the further injections in an incomplete adjuvant according to Freund were emulsified. The injection times are shown by arrows in FIGS. 1 to 3.

Die Bildung von Insulinantikörpern wurde in Intervallen von 20 Tagen nach der Methode von Ortved Andersen et al. untersucht [Acta Endoer. (Kbh.) 69,195 bis 208,1972]. Die erzielten Ergebnisse sind in den Fig. 1 bis 3 gezeigt, wo die Punkte die Insulinbindefahigkeit in jiU/ml angeben. Eine hohe Bindungsfähigkeit ist ein Hinweis auf einen hohen Gehalt an Antikörpern. Insulin antibody formation was assessed at 20 day intervals using the method of Ortved Andersen et al. examined [Acta Endoer. (Kbh.) 69.195 to 208.1972]. The results obtained are shown in FIGS. 1 to 3, where the dots indicate the insulin binding capacity in jiU / ml. A high binding capacity is an indication of a high level of antibodies.

Aus den Ergebnissen ist ersichtlicht, dass es möglich war, eine Bildung von Antikörpern gegen übliches NPH-Ochseninsulin und eine verminderte Bildung von Antikörpern gegen gereinigtes NPH-Ochseninsulin zu zeigen, wogegen es praktisch unmöglich war, irgendeine Bildung von Antikörpern gegen das neue NPH-Ochseninsulin, hergestellt gemäss dem erfindungsgemässen Verfahren, zu zeigen. Es wird darauf hingewiesen, dass die Präparate 2 und 3 nach der gleichen chromatographischen Reinigung erhalten wurden, wobei der einzige Unterschied darin liegt, dass das Präparat 2 durch Isolierung des Insulins und nachfolgende Reaktion mit Protamin in bekannter Weise und das Präparat 3 unter Durchführung der Reaktion mit dem Protamin in einem harnstoffhaltigen Eluat ohne vorherige Isolierung des Insulins erhalten wurde. From the results, it can be seen that it was possible to show the generation of antibodies against ordinary NPH-ox insulin and a reduced formation of antibodies against purified NPH-ox insulin, whereas it was practically impossible to show any formation of antibodies against the new NPH-ox insulin , produced according to the inventive method to show. It should be noted that preparations 2 and 3 were obtained after the same chromatographic purification, the only difference being that preparation 2 by isolation of the insulin and subsequent reaction with protamine in a known manner and preparation 3 by carrying out the reaction with the protamine in a urea-containing eluate without prior isolation of the insulin.

Eine zweite Versuchsreihe wurde unter Anwendung einer milderen Immunisierungsweise durchgeführt, wobei die anfängliche Stimulierung des immunologischen Ansprechsystems mit dem vollständigen Adjuvans nach Freund, welches Bakterien tötet, unterblieb, d.h. die injizierten Präparate wurden in jedem Fall in unvollständigem Adjuvans nach Freund emulgiert. Den Hasen wurde jeden 10. Tag eine konstante Dosis von 20 I.E. injiziert (s. die Pfeile in den Fig. 4 bis 6). A second series of experiments was carried out using a milder mode of immunization, the initial stimulation of the immunological response system with the complete adjuvant according to Freund, which kills bacteria, was omitted, i.e. the injected preparations were in each case emulsified in Freund's incomplete adjuvant. The rabbits were given a constant dose of 20 IU every 10th day. injected (see the arrows in Figs. 4 to 6).

Die Bildung von Insulinantikörpern wurde in Intervallen von 10 Tagen unter Verwendung eines neu entwickelten Verfahrens unter Anwendung von Niederschlägen mit Polyäthy-lenglykol von Insulin-Antiinsulin-Komplexen mit radioaktiv markiertem Insulin (125J-Insulin) geprüft. Insulin antibody formation was checked at 10 day intervals using a newly developed method using polyethylene glycol precipitates of insulin-antiinsulin complexes with radiolabelled insulin (125J-insulin).

Polyäthylenglykol-Verfahren zur Antikörperbestimmung Polyethylene glycol method for antibody determination

100)il Hasenserum, 100(xl125J-Insulin (etwa 2 jiU/ml), 100 nl Insulinlösung (250 p.U/ml) und 700 |xl Phosphatpuffer, 0,04molar mit einem pH-Wert von 7,4 mit 0,15molarer NaCl-Lösung und 0,5% menschlichem Albumin wurden 48 Stunden bei 4 °C inkubiert. 500 |il Polyäthylenglykol (Molekulargewicht 6000) wurden zugefügt, 360 g/Liter auf einem Rotationsmischer vermischt und die Probe 1 Stunde bei 20 °C stehen gelassen. 100) il rabbit serum, 100 (xl125J-insulin (about 2 jIU / ml), 100 nl insulin solution (250 pU / ml) and 700 | xl phosphate buffer, 0.04 molar with a pH of 7.4 with 0.15 molar NaCl Solution and 0.5% human albumin were incubated for 48 hours at 4 ° C. 500 μl of polyethylene glycol (molecular weight 6000) were added, 360 g / liter were mixed on a rotary mixer and the sample was left to stand at 20 ° C. for 1 hour.

Nach Zentrifugieren für 10 Minuten bei 3000 UpM wurde die überstehende Lösung abdekantiert und verworfen und die Menge an 125J im Niederschlag gezählt. After centrifuging for 10 minutes at 3000 rpm, the supernatant solution was decanted off and discarded and the amount of 125 I in the precipitate was counted.

Bei jedem Versuch wird als Standard eine Probe mit einem Überschuss an Meerschweinchen-Antiochseninsulin und eine andere Probe mit Hasenserum aus nicht-immuni-sierten Hasen eingeschlossen. Diese beiden Proben ergeben eine maximale und eine Null-Bindung. Die Ergebnisse werden als gemessene Bindung in % der maximalen Bindung s wie folgt errechnet: In each experiment, a sample with an excess of guinea pig anti-ox insulin and another sample with rabbit serum from non-immunized rabbits are included as standard. These two samples give maximum and zero binding. The results are calculated as measured binding in% of the maximum binding s as follows:

^Bindung ^ Binding

10 10th

T- T T- T

o m _m o m _m

M O M O

100 100

worin T die Auszählung für die Probe, T„ die Auszählung für die Nullbindung und TM die Auszählung für die maximale Bindung bedeutet. where T is the count for the sample, T is the count for zero binding and TM is the count for maximum binding.

15 Die erhaltenen Ergebnisse sind in den Fig. 4, 5 und 6 wiedergegeben. 15 The results obtained are shown in FIGS. 4, 5 and 6.

Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, dass es nicht möglich war, eine wesentliche Bindung von Antikörpern gegen das neue NPH-Ochseninsulin, hergestellt gemäss der Erfindung 20 (vgl. Fig. 6), zu zeigen, wogegen die anderen Insuline Ursache für eine erhebliche Antikörperbildung (Fig. 4 und 5) waren. Da die Testwerte auf einen Standard bezogen sind, liegen einige Werte unterhalb der Abszisse, was auf Messungsgenauigkeiten zurückzuführen ist. From the results it can be seen that it was not possible to show a substantial binding of antibodies against the new NPH ox insulin, produced according to the invention 20 (cf. FIG. 6), whereas the other insulins were the cause of a considerable antibody formation ( 4 and 5) were. Since the test values are based on a standard, some values are below the abscissa, which is due to measurement accuracy.

25 Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert. 25 The invention is illustrated by the following examples.

Beispiel 1 example 1

250 mg rekristallisiertes Ochseninsulin werden in 5,2 ml 30 stabiliserter Pufferlösung, welche 7-molar an Harnstoff und 0,02molar an Tris ist, mit einem pH-Wert von 8,1 gelöst. Die Lösung wird mit 5,2 ml 7-molarer Harnstofflösung vermischt. Der pH-Wert des Gemischs wird auf 8,1 eingestellt. Eine Kolonne mit einem Durchmesser von 5 cm wird mit ei-35 ner 2,1 cm hohen Schicht von DEAE Zellulose (Whatmann DE 52) gepackt und mit einer Pufferlösung oben genannter Zusammensetzung ins Gleichgewicht gebracht. Die Insulinlösung wird in die Kolonne eingegeben, und es wird mit einer Geschwindigkeit von 75 ml pro Stunde nach folgendem 40 Schema eluiert: 250 mg of recrystallized ox insulin are dissolved in 5.2 ml of 30 stabilized buffer solution, which is 7 molar in urea and 0.02 molar in Tris, with a pH of 8.1. The solution is mixed with 5.2 ml of 7 molar urea solution. The pH of the mixture is adjusted to 8.1. A column with a diameter of 5 cm is packed with a 2.1 cm high layer of DEAE cellulose (Whatmann DE 52) and brought into equilibrium with a buffer solution of the above composition. The insulin solution is introduced into the column and eluted at a rate of 75 ml per hour according to the following 40 scheme:

2,5 Stunden mit einem Puffer vorgenannter Zusammensetzung 2.5 hours with a buffer of the above composition

3 Stunden mit einem Puffer von oben angegebener Zusammensetzung und mit einem Zusatz von 0,0045 Mol 45 Natriumchlorid pro Liter 3 hours with a buffer of the above composition and with the addition of 0.0045 mol 45 sodium chloride per liter

12 Stunden mit einem Puffer wie oben angegeben mit einem Zusatz von 0,011 Mol Natriumchlorid pro Liter. 12 hours with a buffer as indicated above with the addition of 0.011 mol sodium chloride per liter.

Das Eluat wird in Fraktionen aufgeteilt. Die hochgereinigten Fraktionen werden gesammelt, und der Insulinge-50 halt wird bestimmt. In einer 7-molaren Harnstofflösung mit dem Volumen des Gemischs aus den hochgereinigten Fraktionen wird diejenige Protaminmenge gelöst, welche zur Erzielung des isophanen Verhältnisses zwischen dem hochreinen Insulin und dem Protamin erforderlich ist. 55 Die Insulinlösung wird der Protaminlösung langsam tropfenweise unter Umrühren zugegeben, wodurch, gegebenenfalls nach einer Verdünnung auf eine Harnstoffkonzentration von 1 Mol pro Liter, ein Protamin-Insulin-Komplex in amorphem Zustand ausgefällt wird. The eluate is divided into fractions. The highly purified fractions are collected and the insulin 50 stop is determined. In a 7-molar urea solution with the volume of the mixture from the highly purified fractions, that amount of protamine is dissolved which is necessary to achieve the isophane ratio between the high-purity insulin and the protamine. 55 The insulin solution is slowly added dropwise to the protamine solution with stirring, whereby a protamine-insulin complex is precipitated in an amorphous state, if necessary after dilution to a urea concentration of 1 mol per liter.

6o Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren isoliert und weist im wesentlichen nur ein Band auf, wenn 300 jig einer isoelektrischen Fokussierung in Polyacrylamidgel unter Verwendung von 2% Ampholin (pH 3 bis 10) in 6molarer entionisierter Harnstofflösung unterworfen werden. 6o The precipitate is isolated by centrifugation and essentially shows only a band when 300 jig are subjected to isoelectric focusing in polyacrylamide gel using 2% ampholine (pH 3 to 10) in 6 molar deionized urea solution.

65 65

Beispiel 2 Example 2

Das Verfahren gemäss Beispiel 1 wird wiederholt, wobei in die Protaminlösung eine 0,5% Zn-Ionen im Verhältnis zu The process according to Example 1 is repeated, with a 0.5% Zn ion in relation to the protamine solution

5 5

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der Insulinmenge entsprechenden Menge Zinkchlorid sowie 0,3% m-Cresol auf der Basis des Gemischvolumens eingeführt werden. Dadurch wird der Protamin-Insulin-Komplex in kristallinem Zustand ausgefällt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren isoliert und weist im wesentlichen nur ein Band auf, wenn 300 (ig einer isoelektrischen Fokus-sierung in Polyacrylamidgel unter Verwendung von 2% Am-pholin (pH 3 bis 10) in 6molarer entionisierter Harnstofflösung unterworfen werden. the amount of zinc chloride corresponding to the amount of insulin and 0.3% m-cresol on the basis of the mixture volume. As a result, the protamine-insulin complex is precipitated in a crystalline state. The precipitate is isolated by centrifugation and essentially shows only a band when 300 is subjected to isoelectric focusing in polyacrylamide gel using 2% ampholine (pH 3 to 10) in 6 molar deionized urea solution.

Beispiel 3 Example 3

Das Verfahren gemäss Beispiel 1 wird wiederholt, wobei als Ausgangsmaterial durch Gelfiltration auf Sephadex G-50® gereinigtes, rekristallisiertes Ochseninsulin verwendet wird. The procedure according to Example 1 is repeated, the recrystallized ox insulin purified by gel filtration on Sephadex G-50® being used as the starting material.

Das hergestellte Präparat ist ebenso rein wie das im Beispiel 1 beschriebene Erzeugnis. The preparation produced is as pure as the product described in Example 1.

Beispiel 4 Example 4

Die Verfahren gemäss Beispiel 1 und 2 werden wiederholt, wobei jedoch als Ausgangsmaterial ein durch Aussalzen eines bei der Insulinproduktion anfallenden wässrigen Rohextraktes durch Zusatz von Salz bis 3,5 Mol pro Liter bei einem pH von 8,5 hergestelltes Schweineinsulin verwendet wird. Der gebildete Salzkuchen wird in bekannter Weise vor dem Ionenaustausch entsalzt. The processes according to Examples 1 and 2 are repeated, except that a pig insulin produced by salting out an aqueous crude extract obtained in the production of insulin by adding salt to 3.5 mol per liter at a pH of 8.5 is used as the starting material. The salt cake formed is desalted in a known manner before the ion exchange.

Das so erhaltene Präparat ist ebenso rein wie das im Beispiel 1 beschriebene Produkt. The preparation thus obtained is as pure as the product described in Example 1.

Beispiel 5 Example 5

Das Verfahren gemäss Beispiel 4 wird wiederholt. Der gebildete Salzkuchen wird einer Gelfiltration auf Sephadex G-50® unterworfen. The procedure according to Example 4 is repeated. The salt cake formed is subjected to gel filtration on Sephadex G-50®.

Das Produkt ist ebenso rein wie das im Beispiel 1 beschriebene. The product is as pure as that described in Example 1.

Beispiel 6 Example 6

Die Verfahren gemäss den Beispielen 1 bis 3 werden wiederholt, wobei jedoch statt Ochseninsulin Schweineinsulin verwendet wird. The procedures according to Examples 1 to 3 are repeated, but using pig insulin instead of ox insulin.

Der gebildete Protamin-Schweineinsulin-Komplex ist ebenso rein wie der im Beispiel 1 hergestellte Komplex. The protamine-porcine insulin complex formed is as pure as the complex produced in Example 1.

Beispiel 7 Example 7

Das Verfahren gemäss Beispiel 1 wird wiederholt, wobei jedoch statt dem Protamin Poly-L-Arginin mit einem Polymerisationsgrad von 295 verwendet wird. The process according to Example 1 is repeated, but using poly-L-arginine with a degree of polymerization of 295 instead of the protamine.

Der ausgefällte Niederschlag wird wie im Beispiel 1 isoliert. The precipitate is isolated as in Example 1.

Beispiel 8 Example 8

Das Verfahren gemäss Beispiel 1 wird wiederholt. Dabei wird aber den hochreinen Insulinfraktionen eine 0,2%ige wässrige Lösung von Bis-(4-amino-2-methyl-chinolyl-6)-harnstoffhydrochlorid in einer 10 Gew.% der in den Fraktionen vorhandenen Insulinmenge entsprechenden Menge zugesetzt. Hierdurch wird, eventuell nach Verdünnung bis auf eine Harnstoffkonzentration von 1 Mol pro Liter mit 0,025-molarem Na-Phosphatpuffer (pH: 7,3) ein Insulinkomplex ausgefallt, der einige Zeit absteht und dann durch Zentrifugieren isoliert werden kann. Das hergestellte Präparat hat die gleiche Reinheit wie das im Beispiel 1 beschriebene Produkt. The procedure according to Example 1 is repeated. However, a 0.2% aqueous solution of bis- (4-amino-2-methyl-quinolyl-6) -urea hydrochloride is added to the high-purity insulin fractions in a quantity corresponding to 10% by weight of the amount of insulin present in the fractions. As a result, an insulin complex is precipitated, possibly after dilution to a urea concentration of 1 mol per liter with 0.025 molar Na phosphate buffer (pH: 7.3), which remains for some time and can then be isolated by centrifugation. The preparation produced has the same purity as the product described in Example 1.

Beispiel 9 Example 9

Das Verfahren gemäss Beispiel 8 wird wiederholt, wobei als Ausgangsmaterial durch Gelfiltration auf Sephadex G-50 gereinigtes, rekristallisiertes Ochseninsulin benutzt wird. Das hergestellte Präparat hat die gleiche Reinheit wie das im Beispiel 1 beschriebene Produkt. The procedure according to Example 8 is repeated, the recrystallized oxy insulin purified by gel filtration on Sephadex G-50 being used as the starting material. The preparation produced has the same purity as the product described in Example 1.

Beispiel 10 Example 10

5 Das Verfahren gemäss den Beispielen 8 und 9 wird wiederholt, wobei jedoch statt Ochseninsulin Schweineinsulin verwendet wird. 5 The procedure according to Examples 8 and 9 is repeated, but using pig insulin instead of ox insulin.

Der hierbei gewonnene Schweineinsulinkomplex hat die gleiche Reinheit wie der gemäss Beispiel 1 hergestellte Kom-10 plex. The pig insulin complex obtained in this way has the same purity as the Kom-10 plex prepared according to Example 1.

Beispiel 11 Example 11

DasVerfahren gemäss Beispiel 8 wird wiederholt. Als 15 Ausgangsmaterial dient ein durch Aussalzen eines bei der Insulinproduktion anfallenden wässrigen Rohextraktes durch Zusatz von Salz bis 3,5 Mol pro Liter bei einem pH von 8,5 hergestelltes Schweineinsulin. Der gebildete Salzkuchen wird in bekannter Weise vor dem lonenaustausch entsalzt. The procedure according to Example 8 is repeated. A pig insulin produced by salting out an aqueous crude extract obtained in the production of insulin by adding salt to 3.5 mol per liter at a pH of 8.5 serves as the starting material. The salt cake formed is desalted in a known manner before the ion exchange.

Beispiel 12 Example 12

Das Verfahren gemäss Beispiel 11 wird wiederholt, wobei der anfallende Salzkuchen einer Gelfiltration auf Sephadex G-50 unterworfen wird. The process according to Example 11 is repeated, the salt cake obtained being subjected to gel filtration on Sephadex G-50.

25 Das Produkt hat die gleiche Reinheit wie das im Beispiel 1 beschriebene. 25 The product has the same purity as that described in Example 1.

Beispiel 13 Example 13

30 Eine Säule mit den Abmessungen 2,6 x 80 cm wurde mit DEAE-Sephadex A-25 gefüllt, welches zuvor gequollen und in einer Pufferlösung aus 0,15 Mol Ammoniumhydroxyd in 7 Mol Dimethylformamid, die mit 5-normaler Salzsäure auf einen pH-Wert von 9,0 eingestellt war, ins Gleichgewicht ge-35 bracht war. 300 mg Ochseninsulin, gereinigt durch Gelfiltration auf Sephadex G-50, wurden in 40 ml des genannten Puffers gelöst und in die Säule eingebracht, worauf 2 Stunden lang mit dem genannten Puffer bei einer Geschwindigkeit von 200 ml/Stunde eluiert wurde. Die Elution wurde dann 40 fortgesetzt, und bei der gleichen Geschwindigkeit wurde ein linearer Gradient eingeführt, welcher aus 2700 ml der genannten Pufferlösung und 2700 ml eines Puffers aus 0,25 Mol Ammoniumhydroxyd in 7 Mol Dimethylformamid, eingestellt auf einen pH-Wert von 9,0 mit 5-normaler 45 Salzsäure, resultierte. 30 A column measuring 2.6 x 80 cm was filled with DEAE-Sephadex A-25, which had previously been swollen and in a buffer solution of 0.15 mol of ammonium hydroxide in 7 mol of dimethylformamide, which was adjusted to pH with 5-normal hydrochloric acid. Value of 9.0 was set, brought into equilibrium. 300 mg of ox insulin purified by gel filtration on Sephadex G-50 were dissolved in 40 ml of the above buffer and introduced into the column, followed by elution with the above buffer at a rate of 200 ml / hour for 2 hours. Elution was then continued for 40 and at the same rate a linear gradient was introduced which consisted of 2700 ml of said buffer solution and 2700 ml of a buffer of 0.25 mol of ammonium hydroxide in 7 mol of dimethylformamide, adjusted to a pH of 9. 0 with 5-normal 45 hydrochloric acid resulted.

Das Eluat wurde in Fraktionen aufgeteilt. Die hochge-reinigten Fraktionen wurden gesammelt, und ihr Insulingehalt wurde bestimmt. Der pH-Wert wurde mit 5-normaler Salzsäure auf 7,9 gebracht, und dann wurde m-Cresol zuge-50 setzt, bis die Lösung 0,2%ig daran war. Wenn der gesamte Zinkgehalt der Lösung auf 0,5 Gew.% des Insulingehaltes eingestellt war, wurde die Menge an Protaminsulfat, die zur Erzielung des isophanen Verhältnisses notwendig war, in Form einer 1 %igen Lösung zugesetzt, und die Mischung 55 wurde vorsichtig gerührt. Nach einer Ruhezeit von 15 Minuten bei 20 °C wurden 6 Volumina 1/75 Natriumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,3, welcher 0,2% m-Cresol enthielt, zugesetzt, und nach kurzem Rühren wurde die Mischung bei 20 °C 16 Stunden lang stehen gelassen. Dadurch 60 kristallisierte der amorph ausgeschiedene Protamin-Insulin-Komplex. The eluate was divided into fractions. The highly purified fractions were collected and their insulin content was determined. The pH was brought to 7.9 with 5N hydrochloric acid, and then m-cresol was added until the solution was 0.2%. When the total zinc content of the solution was adjusted to 0.5% by weight of the insulin content, the amount of protamine sulfate necessary to achieve the isophane ratio was added as a 1% solution and the mixture 55 was gently stirred. After a rest period of 15 minutes at 20 ° C, 6 volumes of 1/75 sodium phosphate buffer with a pH of 7.3, which contained 0.2% m-cresol, were added, and after brief stirring, the mixture was at 20 ° C Let stand for 16 hours. As a result, the amorphous excreted protamine-insulin complex crystallized.

Durch Ersatz der oben genannten Flüssigkeit durch ein bekanntes Trägermedium wurde der Niederschlag in ein injizierbares Insulinpräparat überführt. By replacing the above-mentioned liquid with a known carrier medium, the precipitate was converted into an injectable insulin preparation.

65 Wenn ein Niederschlag von 300 |ig isoelektrisch in Polyacrylamidgel unter Verwendung von 2% Ampholin (pH = 3 bis 10) in 6molarem entionisiertem Harnstoff fokussiert wurde, zeigte dieser Niederschlag im wesentlichen nur ein Band. 65 When a 300 µg precipitate is isoelectrically focused in polyacrylamide gel using 2% ampholine (pH = 3 to 10) in 6 molar deionized urea, this precipitate showed essentially only one band.

20 20th

631 625 631 625

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Beispiel 14 Example 14

Eine Säule mit einem Durchmesser von 2,6 cm und einer Höhe von 4,4 cm wurde mit QAE-Sephadex A-25 gepackt, welches zuvor gequollen und in einer Pufferlösung aus 0,1 Mol pro Liter Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan in 60 Vol.-% Äthanol, eingestellt auf einen pH-Wert von 7,35 mit 5normaler Salzsäure ins Gleichgewicht gebracht worden war. A column with a diameter of 2.6 cm and a height of 4.4 cm was packed with QAE-Sephadex A-25, which was previously swollen and in a buffer solution of 0.1 mol per liter of tris (hydroxymethyl) aminomethane in 60 vol .-% ethanol, adjusted to a pH of 7.35 with 5normal hydrochloric acid.

250 mg Ochseninsulin, welches zuvor durch Gelfiltration auf Sephadex G-50 gereinigt worden war, wurden in 10 ml 0,lmolarem Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan in 60%igem Äthanol, eingestellt auf einen pH-Wert von 5,8 mit Salzsäure, gelöst, und nach Filtrieren der Lösung wurde dieses in die Säule eingebracht. Die Säule wurde dann mit dem Gleichgewichtspuffer in einer Geschwindigkeit von 10 ml/ Stunde eluiert. 250 mg ox insulin, which had previously been purified by gel filtration on Sephadex G-50, were dissolved in 10 ml 0.1 molar tris (hydroxymethyl) aminomethane in 60% ethanol, adjusted to a pH of 5.8 with hydrochloric acid, dissolved, and after filtering the solution, it was introduced into the column. The column was then eluted with the equilibrium buffer at a rate of 10 ml / hour.

Das Eluat wurde in Fraktionen geteilt, und die hochgereinigten Fraktionen wurden gesammelt und auf den Insulingehalt geprüft. Dann wurde m-Cresol zugesetzt, bis die Lösung 0,2% davon enthielt, worauf der gesamte Zinkgehalt auf 0,5 Gew.% des Insulingehaltes eingestellt wurde. Danach wurde die Menge an Protaminsultat, welche zur Erreichung des isophanen Verhältnisses notwendig war, in Form einer l%igen wässrigen Lösung zugesetzt, und die Mischung wurde vorsichtig gerührt. Nach einer Ruhezeit von 15 Minuten bei 20 °C wurden 9 V olumina 1 jl 5-Natriumphosphat-puffer mit einem pH-Wert von 7,3, welcher 0,2% m-Cresol enthielt, zugefügt, und nach kurzem Rühren wurde die Mischung 16 Stunden lang bei 20 °C stehen gelassen. Dadurch kristallisierte der amorph ausgefallene Protamin-Insulin-Komplex. The eluate was divided into fractions and the highly purified fractions were collected and checked for the insulin content. Then m-cresol was added until the solution contained 0.2% thereof, whereupon the total zinc content was adjusted to 0.5% by weight of the insulin content. Thereafter, the amount of protamine result necessary to achieve the isophane ratio was added in the form of a 1% aqueous solution, and the mixture was gently stirred. After a rest period of 15 minutes at 20 ° C., 9 volumes of 1 μl of 5 sodium phosphate buffer with a pH of 7.3, which contained 0.2% m-cresol, were added, and after brief stirring, the mixture became Let stand at 20 ° C for 16 hours. As a result, the amorphous protamine-insulin complex crystallized.

Durch Ersatz der oben genannten Flüssigkeit durch ein bekanntes Trägermedium wurde der Niederschlag zu einem injizierbaren Insulinpräparat umgewandelt. By replacing the above-mentioned liquid with a known carrier medium, the precipitate was converted into an injectable insulin preparation.

Wenn ein Niederschlag aus 300 |ig isoelektrisch in Poly-acrylamidgel unter Verwendung von 2% Ampholin (pH = 3 bis 10) in 6-molarem entionisiertem Harnstoff fokussiert wurde, zeigte der Niederschlag im wesentlichen nur ein Band. When a 300 µg precipitate was isoelectrically focused in polyacrylamide gel using 2% ampholine (pH = 3 to 10) in 6 molar deionized urea, the precipitate showed essentially only one band.

Beispiel 15 Example 15

In einem auf 5 °C gekühlten Raum wurde eine Säule mit einem Durchmesser von 2,6 cm und einer Höhe von 11 cm mit QAE Sephadex A-25 gefüllt, welches zuvor gequollen und in einer Pufferlösung aus 0,5 Mol Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan in 8 Mol Acetamid, eingestellt auf einen pH-Wert von 8,0 mit Eisessig, ins Gleichgewicht gebracht war. In a room cooled to 5 ° C., a column with a diameter of 2.6 cm and a height of 11 cm was filled with QAE Sephadex A-25, which had previously been swollen and in a buffer solution of 0.5 mol of tris (hydroxymethyl) -aminomethane in 8 moles of acetamide, adjusted to a pH of 8.0 with glacial acetic acid, was brought into equilibrium.

300 mg Ochseninsulin, welches durch Gelfiltration auf Sephadex G-50 gereinigt worden war, wurden in 30 ml des genannten Puffers gelöst und in die Säule eingebracht, worauf 1 Stunde lang mit einer Geschwindigkeit von 80 ml/ Stunde eluiert wurde. Die Elution wurde dann fortgesetzt, und mit derselben Geschwindigkeit wurde ein linearer Gradient eingeführt, der durch 2000 ml des genannten Puffers und 2000 ml desselben Puffers, der ausserdem 0,15 Mol pro Liter Natriumchlorid enthielt, erzielt wurde. 300 mg of ox insulin, which had been purified by gel filtration on Sephadex G-50, were dissolved in 30 ml of said buffer and introduced into the column, followed by elution at a rate of 80 ml / hour for 1 hour. Elution was then continued and a linear gradient introduced at the same rate, obtained by 2000 ml of said buffer and 2000 ml of the same buffer, which also contained 0.15 mol per liter of sodium chloride.

Das Eluat wurde in Fraktionen geteilt. Die hochgereinig-ten Fraktionen wurden gesammelt und ihr Insulingehalt bestimmt. Nach Zumischen von m-Cresol, bis ein Gehalt von 0,2% erreicht war, wurde der gesamte Zinkgehalt der Lösung auf 0,5 Gew.% des Insulingehaltes mit einer 0,15molaren Zinkchloridlösung eingestellt, und danach wurde die zur Erreichung des isophanen Verhältnisses erforderliche Menge an Protaminsulfat in Form einer l%igen wässrigen Lösung zugesetzt. Die Mischung wurde vorsichtig gerührt, und nach einer Ruhezeit von 15 Minuten würden 7 Volumina 1/75-molarer Natriumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,3, welche 0,2% m-Cresol enthielt, zugesetzt, The eluate was divided into fractions. The highly purified fractions were collected and their insulin content determined. After mixing m-cresol until a content of 0.2% was reached, the total zinc content of the solution was adjusted to 0.5% by weight of the insulin content with a 0.15 molar zinc chloride solution, and then that to achieve the isophane ratio required amount of protamine sulfate added in the form of a 1% aqueous solution. The mixture was gently stirred, and after a rest period of 15 minutes, 7 volumes of 1/75 molar sodium phosphate buffer with a pH of 7.3 and containing 0.2% m-cresol were added.

worauf die Mischung weitere 16 Stunden bei 20 °C stehen gelassen wurde. Dadurch kristallisierte der amorph ausgeschiedene Protamin-Insulin-Komplex. whereupon the mixture was left to stand at 20 ° C. for a further 16 hours. As a result, the amorphous excreted protamine-insulin complex crystallized.

Durch Ersatz der oben genannten Flüssigkeit durch ein 5 bekanntes Trägermedium wurde der Niederschlag in ein injizierbares Insulinpräparat überführt. The precipitate was converted into an injectable insulin preparation by replacing the above-mentioned liquid with a known carrier medium.

Wenn ein Niederschlag von 300 ng isoelektrisch in Polyacrylamid unter Verwendung einer 2%igen Ampholinlösung (pH = 3 bis 10) in 6-molarem entionisiertem Harnstoff fo-lo kussiert wurde, zeigte der Niederschlag im wesentlichen nur ein Band. When a 300 ng precipitate was kissed iso-electrically in polyacrylamide using a 2% ampholine solution (pH = 3 to 10) in 6 molar deionized urea, the precipitate showed essentially only one band.

Beispiel 16 Example 16

In einem auf 5 °C gekühlten Raum wurde eine Säule mit i5 einem Durchmesser von 2,6 cm und einer Höhe von 12 cm mit QAE Sephadex A-25 gefüllt, welches zuvor in einem Puffer aus 0,05 Mol Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan in 7 Mol Acetonitril, eingestellt auf einen pH-Wert von 8,2 mit 5normaler Salzsäure, gequollen und ins Gleichgewicht ge-2o bracht worden war. In a room cooled to 5 ° C., a column i5 with a diameter of 2.6 cm and a height of 12 cm was filled with QAE Sephadex A-25, which was previously in a buffer of 0.05 mol of tris (hydroxymethyl) - aminomethane in 7 moles of acetonitrile, adjusted to a pH of 8.2 with 5 normal hydrochloric acid, had been swollen and brought into equilibrium.

300 mg Ochseninsulin, welches durch Gelfiltration auf Sephadex G-50 gereinigt worden war, wurden in 30 ml des genannten Puffers gelöst, wobei der pH-Wert mit 2normaler NaOH auf 9,3 und dann mit 2normaler Salzsäure auf 8,2 25 eingestellt wurde. Diese Insulinlösung wurde in die Säule eingebracht, worauf 1 Stunde lang mit dem genannten Puffer bei einer Geschwindigkeit von 75 ml/Stunde eluiert wurde. Die Elution wurde dann fortgesetzt, und mit derselben Geschwindigkeit wurde ein linearer Gradient eingeführt, der 30 aus 1800 ml des genannten Puffers und 1800 ml desselben Puffers, der ausserdem 0,15 Mol pro Liter Natriumchlorid enthielt, resultuierte. 300 mg of ox insulin, which had been purified by gel filtration on Sephadex G-50, were dissolved in 30 ml of the said buffer, the pH being adjusted to 9.3 with 2 normal NaOH and then to 8.2 25 with 2 normal hydrochloric acid. This insulin solution was introduced into the column, followed by elution with said buffer at a rate of 75 ml / hour for 1 hour. Elution was then continued and a linear gradient was introduced at the same rate, resulting in 30 from 1800 ml of said buffer and 1800 ml of the same buffer, which also contained 0.15 mol per liter of sodium chloride.

Das Eluat wurde in Fraktionen geteilt. Die hochgereinigten Fraktionen wurden gesammelt und der Insulingehalt be-35 stimmt. Nach Zumischen von m-Cresol bis zu einem Gehalt von 0,2% wurde der gesamte Zinkgehalt der Lösung mit 0,15molarer Zinkchloridlösung auf 0,5 Gew.% des Insulingehaltes eingestellt, und dann wurde die zur Erreichung des isophanen Verhältnisses notwendige Menge an Protaminsul-40 fat in Form einer 1 %igen wässrigen Lösung zugesetzt. Die Mischung wurde vorsichtig gerührt, und nach einer Ruhezeit von 15 Minuten wurden 6 Volumina 1/75 Natriumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,3, welcher 0,2% m-Cresol enthielt, zugegeben. Die Mischung wurde weitere 16 Stun-45 den lang bei 20 °C stehen gelassen, wodurch der amorph ausgefallene Protamin-Insulin-Komplex kristallisierte. The eluate was divided into fractions. The highly purified fractions were collected and the insulin content determined. After mixing m-cresol up to a content of 0.2%, the total zinc content of the solution was adjusted to 0.5% by weight of the insulin content with 0.15 molar zinc chloride solution, and then the amount of protaminsul necessary to achieve the isophane ratio was adjusted -40 fat added in the form of a 1% aqueous solution. The mixture was gently stirred and after a 15 minute rest period, 6 volumes of 1/75 sodium phosphate buffer pH 7.3 containing 0.2% m-cresol were added. The mixture was left for a further 16 hours at 20 ° C., as a result of which the amorphous protamine-insulin complex crystallized.

Durch Ersatz der genannten Flüssigkeit durch ein bekanntes Trägermedium wurde das Produkt in ein injizierbares Insulinpräparat überführt. The product was converted into an injectable insulin preparation by replacing the liquid mentioned with a known carrier medium.

so Wenn 300 (ig Niederschlag im Polyacrylamidgel unter Verwendung von 2% Ampholin (pH = 3 bis 10) in 6molarem entionisiertem Harnstoff isoelektrisch fokussiert wurden, zeigte der Niederschlag im wesentlichen nur ein Band. so When 300 (µg precipitate in polyacrylamide gel using 2% ampholine (pH = 3 to 10) in 6 molar deionized urea is isoelectrically focused, the precipitate showed essentially only one band.

55 55

Beispiel 17 Example 17

Beispiel 15 wurde wiederholt, wobei der Puffer jedoch in diesem Fall aus 0,05 Mol Tris-(hydroxymethyl)-aminome-than in 5 Mol wässrigem N-Methylacetamid bestand und 60 sein pH-Wert mit 5normaler Salzsäure auf 8,2 eingestellt war. Der Insulinlösung wurden zur Kristallisation nur 4 Volumina Phosphatpuffer zugemischt. Example 15 was repeated, but in this case the buffer consisted of 0.05 mol of tris (hydroxymethyl) aminomethane in 5 mol of aqueous N-methylacetamide and its pH was adjusted to 8.2 with 5 normal hydrochloric acid. Only 4 volumes of phosphate buffer were added to the insulin solution for crystallization.

Beispiel 18 Example 18

65 Die Vorgangsweise von Beispiel 16 wurde wiederholt, wobei die gesammelten hochgereinigten Insulinfraktionen in eine mit Sephadex G-25, welches in einem Medium aus 1/ 60molarem Dmatriummonohydrogenphosphat in lmolarem 65 The procedure of Example 16 was repeated, the collected highly purified insulin fractions in a with Sephadex G-25, which was in a medium of 1/60 molar sodium monohydrogen phosphate in molar

7 7

631 625 631 625

Acetamid mit einem pH-Wert von 7,65 gequollen war, gepackte Kolonne eingebracht wurden, so dass das eingebrachte Volumen 20% des Gesamtvolumens der Säule nicht überstieg. Die Säule wurde dann mit dem genannten Medium mit einer Geschwindigkeit von 20 ml/Stunde x cm2 eluiert und die Insulin enthaltenden Eluatfraktionen gesammelt. Nach Bestimmung des Insulingehaltes wurde der gesamte Zinkgehalt der Lösung auf 0,5 Gew.% des Insulingehalts mit 0,15molarem Zinkchlorid in 1 molarem Acetamid eingestellt, und dann wurde 1/4 Volumen 0,1 molarer Salzsäure, enthaltend 1,5% m-Cresol, zugesetzt. Danach wurde die zur Erreichung des isophanen Verhältnisses notwendige Menge an Protaminsulfat zugegeben. Nach Stehenlassen für 16 Stunden bei 20 °C wurde der ausgeschiedene Protamin-s Insulin-Komplex kristallisiert. Das so erhaltene Produkt war von derselben Reinheit, wie das in Beispiel 16 beschriebene Produkt. Acetamide had swollen to a pH of 7.65, packed columns were introduced so that the volume introduced did not exceed 20% of the total volume of the column. The column was then eluted with the medium mentioned at a rate of 20 ml / hour × cm 2 and the eluate fractions containing insulin were collected. After determining the insulin content, the total zinc content of the solution was adjusted to 0.5% by weight of the insulin content with 0.15 molar zinc chloride in 1 molar acetamide, and then 1/4 volume of 0.1 molar hydrochloric acid containing 1.5% mol. Cresol added. The amount of protamine sulfate required to achieve the isophane ratio was then added. After standing for 16 hours at 20 ° C., the protamine-insulin complex which had been eliminated was crystallized. The product so obtained was of the same purity as the product described in Example 16.

Durch Ersatz der genannten Flüssigkeit durch ein bekanntes Trägermedium kann der Niederschlag zur Herstellung in-lo jizierbarer Insulinpräparate verwendet werden. By replacing the above-mentioned liquid with a known carrier medium, the precipitate can be used to produce injectable insulin preparations.

s s

3 Blatt Zeichnungen 3 sheets of drawings

Claims

631 625 PATENT CLAIMS

1. A process for the preparation of a stable insulin preparation with long-term action and low antigenicity by reacting acidic groups of the insulin with basic groups of organic compounds, characterized in that the reaction is carried out in an aqueous buffer solution which contains a protein-dissociating or protein-polymerizing agent.

2. The method according to claim 1, characterized in that insulin from ox pancreas is used.

Process according to claim 1 or 2, characterized in that the organic compound containing basic groups contains a basic polypeptide, e.g. a protamine,

or is a cleavage product of a basic polypeptide.

4. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that urea is used as protein-dissociating or protein-depolymerizing agent.

5. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the aqueous buffer solution contains ureas, and that the reaction product is precipitated by dilution.

6. Application of the method according to claim 1 to an insulin-containing fraction obtained by chromatographic purification of the insulin using a buffered aqueous eluent containing the protein-dissociating or protein-polymerizing agent.

7. Application according to claim 6 of the method according to one of claims 2 to 5 to an insulin-containing fraction, which was obtained by chromatographic purification of the insulin using a buffered aqueous eluent containing the protein-dissociating or protein polymer-risking agent.