CH631625A5 - Process for the production of a stable insulin preparation having a lasting action - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines stabilen Insulinpräparats mit Dauerwirkung und niedriger Antigenizität, insbesondere aus Ochsenpankreas, durch Umsetzung von sauren Gruppen des Insulins mit basischen Gruppen organischer Verbindungen.

Zur Behandlung von Diabetes Mellitus benutzt man normalerweise aus Schweine- oder Ochsenpankreas gewonnene Insulinpräparate. Der Gesamtverbrauch an Insulin setzt sich wie folgt zusammen: etwa 30% Schweineinsulin und etwa 70% Ochseninsulin. Man hat auch bereits vorgeschlagen, von anderen Tieren, beispielsweise Schafen, Insulin zu gewinnen, doch hat dies bisher keine grosse kommerzielle Bedeutung erlangt.

Die bisher erfolgte Insulintherapie ist mit verschiedenen Mängeln behaftet. Unter diesen Folgeerscheinungen sind zu nennen Allergie und Lipodystrophie.

Es ist schon lange bekannt, dass die übliche Insulinbehandlung bei den meisten Patienten zur Bildung von Insulin-Antikörpern führt, was in einzelnen Fällen einen erhöhten Insulinbedarf nach sich zieht, indem nicht bekannte Insulinmengen an die Antikörper gebunden werden können und dadurch für die Dauer dieser Bindung zur Regelung des Blutzuckers unwirksam sind.

Man hat seit längerem die Auffassung vertreten, dass die Antikörperbildung und damit der grosse Insulinbedarf primär durch verschiedene Verunreinigungen in normalem Handelsinsulin verursacht werden.

Als Beispiele solcher Verunreinigungen sind zu nennen dimeres Insulin, Proinsulin, intermediäres Insulin (das Stadium zwischen Proinsulin und Insulin), Arginin-Insulin,

Äthylester-Insulin, Mono-Desamido-Insulin und Di-Des-amido-Insulin. Es ist bekannt, dass die erstgenannten drei Stoffe stark antigen sind und dass auch die an vierter Stelle und/oder die an fünfter Stelle genannte Verunreinigung eine 5 starke antigene Wirkung aufweisen, während die sechste und siebente Verbindung sowie das Insulinmolekül selbst nicht oder nur in geringem Ausmass antigen sind (vgl.: Schlicht-crull, Monocomponent Insulin and its Clinical Implications, 16. März 1973).

io Es ist auch bekannt, die vorerwähnten Verunreinigungen durch Gelfiltration und/oder Ionenaustausch zu entfernen, wodurch man weitgehend gereinigtes Insulin erhält, das im wesentlichen nur eine Komponente enthält. In den letzten Jahren sind von einigen oder mehreren der vorerwähnten i5 Verunreinigungen befreite Insulinpräparate auf den Markt gebracht worden, die in vielen Fällen bei Diabetikern auch zu einer verminderten Antikörperbildung geführt haben.

Es hat sich herausgestellt, dass schnellwirkende Präparate aus Schweineinsulin und Ochseninsulin in so reinem Zu-20 stand herstellbar sind, dass sie keine oder zumindest eine sehr geringfügige Antikörperbildung verursachen (vgl.: Schlichtcrull, Monocomponent Insulin and its Clinical Implications, 16. März 1973). Es hat sich des weiteren gezeigt, dass es möglich ist, Präparate mit Dauerwirkung und mit 25 wesentlich reduzierter Antigenizität herzustellen, wenn diese Präparate auf der Basis von weitgehend gereinigtem Schweineinsulin hergestellt werden (vgl. T. Deckert et al.: Diabet-ologia, Band 10, S. 703 bis 708,1974). Es steht jedoch ebenfalls fest, dass zwar reines Ochseninsulin herstellbar ist, wel-30 ches nach den heutigen Analysenmethoden als ebenso rein bezeichnet werden muss wie heute herstellbares hochgereinigtes Schweineinsulin, und dass dieses Ochseninsulin in schnellwirkenden Präparaten, wie bereits erwähnt, keine oder nur eine geringfügige Antikörperbildung verursacht, 35 dass anderseits aber auf dem Markt bisher noch keine niedrig antigenen Präparate mit Dauerwirkung auf der Basis von hochgereinigtem Ochseninsulin verfügbar sind. Dies ist ein erheblicher Mangel, da Präparate mit Dauerwirkung auf der Basis von Ochseninsulin international die gebräuchlichsten 40 sind.

Die Bildung von Antikörpern gegen eine chemische Verbindung, beispielsweise Insulin, im lebenden Organismus ist auf Unterschiede in der Primärstruktur zurückführbar (vgl. Arquilla E.R. et al: Immunochemistry of Insulin, Handbook 45 of Physiology, Kap. 9, S. 160,1972). Die chemische Verbindung hat dadurch einen solchen sterischen Aufbau, dass sie auf den Organismus als fremd und unerwünscht wirkt (siehe Arquilla, E. R. et al: Immunology Conformation and Biolo-gical Activity of Insulin, Diabetes, Band 18, S. 194,1969), so oder sie hat eine solche Gesamtgrösse, dass ihre Wirkung für den Organismus fremd und unerwünscht ist (siehe Arquilla, E.R. et al: Immunochemistry of Insulin, Handbook of Physiology, Kap. 9, S. 160,1972).

Eine Antikörperbildung wird auch dadurch hervorge-55 rufen, dass zusammen mit der chemischen Verbindung eine den Immunapparat aktivierende Komponente verabreicht wird. Mehrere Untersuchungen deuten daraufhin, dass der physikalische Zustand von Insulin bei der Bildung von Antikörpern eine wesentliche Rolle spielt [Kumar et al: Horn. 6o Metab. Res. 6 (1974), 175 bis 177, und P.A. Piers et al: Neth J. Med. 17 (1974) C. 234-238].

Der Umstand, dass die schnellwirkenden hochreinen In-sulinpräparate keine oder zumindest nur eine unwesentliche Bildung von Antikörpern verursachen, ist vermutlich darauf 65 zurückzuführen, dass die Insuline in diesen Fällen nicht nur sehr rein sind, sondern auch in monomerer Form vorliegen oder eventuell nur lose Aggregationen bilden, während man bei den bisher hergestellten, auf dem Markt verfügbaren

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hochreinen Insulinpräparaten mit Dauerwirkung erreicht, dass das Insulin in aggregierter Form auftritt und die Bildung von Antikörpern bedingende Eigenschaften aufweist. Dieses Problem ist bei Ochseninsulin besonders ausgeprägt, was vermutlich darauf zurückzuführen ist, dass Ochseninsulin mehr zur Bildung von Aggregaten neigt als Schweineinsulin.

Ochseninsulin ohne Zusatzstoffe weist bekanntlich eine breitere isoelektrische Ausfällzone auf als Schweineinsulin. Es ist bekannt, dass diese breite isoelektriksche Fällungszone durch Zusatz gewisser Stoffe, beispielsweise von Phenol oder m-Cresol, auf den Breitenwert der Fällungszone für Schweineinsulin verengert werden kann (vgl. die dänische Patentschrift Nr. 116 527). Es ist anzunehmen, dass diese breitere isoelektrische Fällungszone des Ochseninsulins dem Umstand zuzuschreiben ist, dass Ochseninsulin bei pH-Werten in der Nähe des Neutralpunktes aggregiert.

Die DE-AS 1 017 323 betrifft ein Verfahren zur Herstellung von insulinhaltigen Präparaten mit verzögerter Wirkung, bei welchem man an Insulin in wässeriger Lösung ein tierisches, verestertes Albumin bindet. Es geht jedoch aus den Beispielen hervor, dass kristallines Ausgangsmaterial verwendet wird. Durch den Kristallisiervorgang wird das Insulin von gegebenenfalls vorliegenden Stabilisatoren getrennt, wodurch dann eine gewisse irreversible Agglomerierung stattfindet. So gut auch das Insulin im voraus gereinigt sein mag, durch diese Agglomerierung werden die Präparate mindestens ebenso stark antigen wie das Präparat 2, das in dem später folgenden Versuchsbericht beschrieben wird.

Die AT-PS Nr. 205 660 (vgl. GB-PS Nr. 762 871) betrifft ein Verfahren zur Herstellung von sauren Insulinlösungen mit verlängerter Wirksamkeit, die eine Komponente von Insulin mit einem synthetischen basischen Polypeptid, z.B. Polymeren und Copolymeren des Lysins und des Ornithins, enthalten. Hauptsächlich wird kristallines Insulin mit den oben erwähnten Nachteilen verwendet, und keine speziellen Massnahmen werden getroffen vor oder während der Reaktion des Polypeptids, um der Agglomerierung des Insulins entgegenzuwirken, weshalb das Präparat ohne Zweifel antigen ist.

Die Heterogenität verschiedener Insulinprodukte einschliesslich des im Handel erhältlichen kristallinen oder um-kristallierten Insulins wurde z.B. von J. Arthur Mirsky und Kazunori Kawamura [«Heterogeneity of Crystalline Insulin», Endocrinology 78 (1966), S. 1115 bis 1119] untersucht, welche Insulin aus vielen verschiedenen Tierarten sowie Menschen abtrennten und die einzelnen Insulinkomponenten durch Gelfiltration und Auftrennung durch Gelelektrophorese auf Polyacrylamid isolierten.

Es wurden Versuche unternommen, niedrig antigene oder antigenfreie Insulinpräparate auf Basis solcher einkom-ponentiger Insulinprodukte herzustellen. So betrifft die GB-PS Nr. 1 285 023 ein injizierbares Insulinpräparat, welches frei von Proteinen der Bauchspeicheldrüse ist, mit einem Molekulargewicht über 6000 und im wesentlichen aus einer einzigen Komponente, wenn eine Lösung davon durch Gelelektrophorese auf Polyacrylamid untersucht wurde.

Obzwar die genannte Patentschrift vor mehreren Jahren veröffentlicht wurde und obzwar auch vor dieser Veröffentlichung einkomponentiges Insulin hergestellt werden konnte, haben bis jetzt Insulinpräparate auf Basis von einkomponen-tigem Ochseninsulin keine kommerzielle Bedeutung erlangt.

Anderseits sind Präparate auf Basis von einkomponen-tigem Schweineinsulin auf dem Markt erhältlich; sie sind jedoch nicht antigenfrei.

Die Antigenizität von einkomponentigem Insulin wurde von R. E. Chance et al («The immunogenicity of insulin préparations», Acta Endocrinologica Supplementum 205, Kopenhagen 1976) untersucht. Das Ergebnis dieser Untersuchung war, dass Präparate auf Basis von einkomponentigem Ochseninsulin praktisch die gleiche Antigenizität besitzen wie Präparate, welche im Handel erhältliches umkristallisiertes Insulin enthalten.

Präparate auf Basis von einkomponentigem Schweineinsulin hatten eine geringere Antigenizität als entsprechende im Handel erhältliche Präparate auf Basis von umkristallisiertem Schweineinsulin, jedoch noch immer eine beträchtliche Restantigenizität.

Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass es möglich ist, hochreines Insulin so zu stabilisieren, dass es weder bei seiner Herstellung noch in Präparaten mit Dauerwirkung während deren Aufbewahrung oder Benutzung Aggregate bildet, die eine Antikörperbildung verursachen.

Diese Stabilisierung wird durch die im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebene Massnahme erreicht.

Die Wirkung der proteindissoziierenden oder protein-depolymerisierenden Mittel besteht darin, dass eine Reaktion zwischen den sauren Resten des Insulinmoleküls und den basischen Resten des proteindissoziierenden oder pro-teindepolymerisierenden Mittels, wie z.B. Harnstoff, stattfindet.

Beim erfindungsgemässen Verfahren kann das hochgereinigte Insulin in stabilisierter monomerer oder lose aggregierter Form mit einer basischen Komponente, beispielsweise Arginin, Somatostatin, Protamin oder Globin, umgesetzt werden.

Diese Reaktion erfolgt zweckmässig in Gegenwart eines Stabilisators.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist mit Insulin von vielen verschiedenen Tierarten, beispielsweise Schweinen, Ochsen oder Schafen, durchführbar, jedoch bei Ochseninsulin von besonderer Bedeutung.

Als proteindissoziierendes oder proteindepolymerisieren-des Mittel wird Harnstoff bevorzugt.

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass eine ein proteindissoziierendes oder proteindepolymerisierendes Mittel als Stabilisator enthaltende Insulinlösung einem Ionenaustausch unterworfen wird, indem man mit einem Elutionsmittel eluiert, welches einen die stabilisierte monomere oder lose aggregierte Form des Insulins aufrechterhaltenden Stabilisator enthält, und danach eine von Verunreinigungen befreites Insulin enthaltende Fraktion einer Lösung zusetzt, die ein basisches Polypeptid enthält. Der ausgefällte Polypeptidinsulinkomplex wird dann isoliert. Man vermeidet so mit grosser Sicherheit die Aggregatbildung, da das hochreine Insulin nicht zunächst als solches isoliert wird, was Gefahr einer Aggregatbildung mit sich führen würde. Diese Verfahrensweise ist überdies sehr einfach, weil dabei das Insulinpräparat mit Dauerwirkung in stabiler Form direkt ausgefällt wird.

Versuchsbericht über immunologische Untersuchungen

Um die andersartigen immunologischen Eigenschaften der in erfindungsgemässer Weise isolierten Protamin-In-sulin-Komplexe zu zeigen, wurden bei Hasen Vergleichsversuche durchgeführt, weil Hasen normalerweise für die Prüfung der antigenen Eigenschaften von Insulin und insulinähnlichen Verbindungen verwendet werden.

Es wurden die folgenden Präparate verwendet:

1. Übliches NPH-Ochseninsulin, hergestellt in üblicher

Weise aus umkristallisiertem Ochseninsulin, welches die obengenannten Verunreinigungen enthält.

2. Gereinigtes NPH-Ochseninsulin, hergestellt in üblicher

Weise aus gereinigtem kristallinem Ochseninsulin, jedoch durch Säulenchromatographie von den genannten Ver-

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unreinigungen befreit (Dieses Produkt erfüllt die in der

GB-PS Nr. 1 085 023 angegebenen Reinheitskriterien). 3. Neues gereinigtes NPH-Ochseninsulin, hergestellt in er-

findungsgemässer Weise wie in Beispiel 3 beschrieben. Den Hasen wurde subkutan jeden 10. Tag eine konstante Dosis von 20 I.E. des zu untersuchenden Insulinpräparates injiziert. Es war nicht möglich, nach der Injektion von üblichem NPH-Ochseninsulin ohne Adjuvantien eine wesentliche Antikörperbildung zu beobachten, und im Hinblick auf einen Vergleich war es daher erforderlich, einen Immunisierungsvorgang, wie er normalerweise bei der Herstellung von Antikörpern angewendet wird, anzupassen, indem die Insulinpräparate der ersten Injektion in einem vollständigen Adjuvans nach Freund und die Insulinpräparate der weiteren Injektionen in einem unvollständigen Adjuvans nach Freund emulgiert wurden. Die Injektionszeiten sind durch Pfeile in den Fig. 1 bis 3 gezeigt.

Die Bildung von Insulinantikörpern wurde in Intervallen von 20 Tagen nach der Methode von Ortved Andersen et al. untersucht [Acta Endoer. (Kbh.) 69,195 bis 208,1972]. Die erzielten Ergebnisse sind in den Fig. 1 bis 3 gezeigt, wo die Punkte die Insulinbindefahigkeit in jiU/ml angeben. Eine hohe Bindungsfähigkeit ist ein Hinweis auf einen hohen Gehalt an Antikörpern.

Aus den Ergebnissen ist ersichtlicht, dass es möglich war, eine Bildung von Antikörpern gegen übliches NPH-Ochseninsulin und eine verminderte Bildung von Antikörpern gegen gereinigtes NPH-Ochseninsulin zu zeigen, wogegen es praktisch unmöglich war, irgendeine Bildung von Antikörpern gegen das neue NPH-Ochseninsulin, hergestellt gemäss dem erfindungsgemässen Verfahren, zu zeigen. Es wird darauf hingewiesen, dass die Präparate 2 und 3 nach der gleichen chromatographischen Reinigung erhalten wurden, wobei der einzige Unterschied darin liegt, dass das Präparat 2 durch Isolierung des Insulins und nachfolgende Reaktion mit Protamin in bekannter Weise und das Präparat 3 unter Durchführung der Reaktion mit dem Protamin in einem harnstoffhaltigen Eluat ohne vorherige Isolierung des Insulins erhalten wurde.

Eine zweite Versuchsreihe wurde unter Anwendung einer milderen Immunisierungsweise durchgeführt, wobei die anfängliche Stimulierung des immunologischen Ansprechsystems mit dem vollständigen Adjuvans nach Freund, welches Bakterien tötet, unterblieb, d.h. die injizierten Präparate wurden in jedem Fall in unvollständigem Adjuvans nach Freund emulgiert. Den Hasen wurde jeden 10. Tag eine konstante Dosis von 20 I.E. injiziert (s. die Pfeile in den Fig. 4 bis 6).

Die Bildung von Insulinantikörpern wurde in Intervallen von 10 Tagen unter Verwendung eines neu entwickelten Verfahrens unter Anwendung von Niederschlägen mit Polyäthy-lenglykol von Insulin-Antiinsulin-Komplexen mit radioaktiv markiertem Insulin (125J-Insulin) geprüft.

Polyäthylenglykol-Verfahren zur Antikörperbestimmung

100)il Hasenserum, 100(xl125J-Insulin (etwa 2 jiU/ml), 100 nl Insulinlösung (250 p.U/ml) und 700 |xl Phosphatpuffer, 0,04molar mit einem pH-Wert von 7,4 mit 0,15molarer NaCl-Lösung und 0,5% menschlichem Albumin wurden 48 Stunden bei 4 °C inkubiert. 500 |il Polyäthylenglykol (Molekulargewicht 6000) wurden zugefügt, 360 g/Liter auf einem Rotationsmischer vermischt und die Probe 1 Stunde bei 20 °C stehen gelassen.

Nach Zentrifugieren für 10 Minuten bei 3000 UpM wurde die überstehende Lösung abdekantiert und verworfen und die Menge an 125J im Niederschlag gezählt.

Bei jedem Versuch wird als Standard eine Probe mit einem Überschuss an Meerschweinchen-Antiochseninsulin und eine andere Probe mit Hasenserum aus nicht-immuni-sierten Hasen eingeschlossen. Diese beiden Proben ergeben eine maximale und eine Null-Bindung. Die Ergebnisse werden als gemessene Bindung in % der maximalen Bindung s wie folgt errechnet:

^Bindung

10

T- T

o m _m

M O

100

worin T die Auszählung für die Probe, T„ die Auszählung für die Nullbindung und TM die Auszählung für die maximale Bindung bedeutet.

15 Die erhaltenen Ergebnisse sind in den Fig. 4, 5 und 6 wiedergegeben.

Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, dass es nicht möglich war, eine wesentliche Bindung von Antikörpern gegen das neue NPH-Ochseninsulin, hergestellt gemäss der Erfindung 20 (vgl. Fig. 6), zu zeigen, wogegen die anderen Insuline Ursache für eine erhebliche Antikörperbildung (Fig. 4 und 5) waren. Da die Testwerte auf einen Standard bezogen sind, liegen einige Werte unterhalb der Abszisse, was auf Messungsgenauigkeiten zurückzuführen ist.

25 Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

250 mg rekristallisiertes Ochseninsulin werden in 5,2 ml 30 stabiliserter Pufferlösung, welche 7-molar an Harnstoff und 0,02molar an Tris ist, mit einem pH-Wert von 8,1 gelöst. Die Lösung wird mit 5,2 ml 7-molarer Harnstofflösung vermischt. Der pH-Wert des Gemischs wird auf 8,1 eingestellt. Eine Kolonne mit einem Durchmesser von 5 cm wird mit ei-35 ner 2,1 cm hohen Schicht von DEAE Zellulose (Whatmann DE 52) gepackt und mit einer Pufferlösung oben genannter Zusammensetzung ins Gleichgewicht gebracht. Die Insulinlösung wird in die Kolonne eingegeben, und es wird mit einer Geschwindigkeit von 75 ml pro Stunde nach folgendem 40 Schema eluiert:

2,5 Stunden mit einem Puffer vorgenannter Zusammensetzung

3 Stunden mit einem Puffer von oben angegebener Zusammensetzung und mit einem Zusatz von 0,0045 Mol 45 Natriumchlorid pro Liter

12 Stunden mit einem Puffer wie oben angegeben mit einem Zusatz von 0,011 Mol Natriumchlorid pro Liter.

Das Eluat wird in Fraktionen aufgeteilt. Die hochgereinigten Fraktionen werden gesammelt, und der Insulinge-50 halt wird bestimmt. In einer 7-molaren Harnstofflösung mit dem Volumen des Gemischs aus den hochgereinigten Fraktionen wird diejenige Protaminmenge gelöst, welche zur Erzielung des isophanen Verhältnisses zwischen dem hochreinen Insulin und dem Protamin erforderlich ist. 55 Die Insulinlösung wird der Protaminlösung langsam tropfenweise unter Umrühren zugegeben, wodurch, gegebenenfalls nach einer Verdünnung auf eine Harnstoffkonzentration von 1 Mol pro Liter, ein Protamin-Insulin-Komplex in amorphem Zustand ausgefällt wird.

6o Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren isoliert und weist im wesentlichen nur ein Band auf, wenn 300 jig einer isoelektrischen Fokussierung in Polyacrylamidgel unter Verwendung von 2% Ampholin (pH 3 bis 10) in 6molarer entionisierter Harnstofflösung unterworfen werden.

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Beispiel 2

Das Verfahren gemäss Beispiel 1 wird wiederholt, wobei in die Protaminlösung eine 0,5% Zn-Ionen im Verhältnis zu

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der Insulinmenge entsprechenden Menge Zinkchlorid sowie 0,3% m-Cresol auf der Basis des Gemischvolumens eingeführt werden. Dadurch wird der Protamin-Insulin-Komplex in kristallinem Zustand ausgefällt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren isoliert und weist im wesentlichen nur ein Band auf, wenn 300 (ig einer isoelektrischen Fokus-sierung in Polyacrylamidgel unter Verwendung von 2% Am-pholin (pH 3 bis 10) in 6molarer entionisierter Harnstofflösung unterworfen werden.

Beispiel 3

Das Verfahren gemäss Beispiel 1 wird wiederholt, wobei als Ausgangsmaterial durch Gelfiltration auf Sephadex G-50® gereinigtes, rekristallisiertes Ochseninsulin verwendet wird.

Das hergestellte Präparat ist ebenso rein wie das im Beispiel 1 beschriebene Erzeugnis.

Beispiel 4

Die Verfahren gemäss Beispiel 1 und 2 werden wiederholt, wobei jedoch als Ausgangsmaterial ein durch Aussalzen eines bei der Insulinproduktion anfallenden wässrigen Rohextraktes durch Zusatz von Salz bis 3,5 Mol pro Liter bei einem pH von 8,5 hergestelltes Schweineinsulin verwendet wird. Der gebildete Salzkuchen wird in bekannter Weise vor dem Ionenaustausch entsalzt.

Das so erhaltene Präparat ist ebenso rein wie das im Beispiel 1 beschriebene Produkt.

Beispiel 5

Das Verfahren gemäss Beispiel 4 wird wiederholt. Der gebildete Salzkuchen wird einer Gelfiltration auf Sephadex G-50® unterworfen.

Das Produkt ist ebenso rein wie das im Beispiel 1 beschriebene.

Beispiel 6

Die Verfahren gemäss den Beispielen 1 bis 3 werden wiederholt, wobei jedoch statt Ochseninsulin Schweineinsulin verwendet wird.

Der gebildete Protamin-Schweineinsulin-Komplex ist ebenso rein wie der im Beispiel 1 hergestellte Komplex.

Beispiel 7

Das Verfahren gemäss Beispiel 1 wird wiederholt, wobei jedoch statt dem Protamin Poly-L-Arginin mit einem Polymerisationsgrad von 295 verwendet wird.

Der ausgefällte Niederschlag wird wie im Beispiel 1 isoliert.

Beispiel 8

Das Verfahren gemäss Beispiel 1 wird wiederholt. Dabei wird aber den hochreinen Insulinfraktionen eine 0,2%ige wässrige Lösung von Bis-(4-amino-2-methyl-chinolyl-6)-harnstoffhydrochlorid in einer 10 Gew.% der in den Fraktionen vorhandenen Insulinmenge entsprechenden Menge zugesetzt. Hierdurch wird, eventuell nach Verdünnung bis auf eine Harnstoffkonzentration von 1 Mol pro Liter mit 0,025-molarem Na-Phosphatpuffer (pH: 7,3) ein Insulinkomplex ausgefallt, der einige Zeit absteht und dann durch Zentrifugieren isoliert werden kann. Das hergestellte Präparat hat die gleiche Reinheit wie das im Beispiel 1 beschriebene Produkt.

Beispiel 9

Das Verfahren gemäss Beispiel 8 wird wiederholt, wobei als Ausgangsmaterial durch Gelfiltration auf Sephadex G-50 gereinigtes, rekristallisiertes Ochseninsulin benutzt wird. Das hergestellte Präparat hat die gleiche Reinheit wie das im Beispiel 1 beschriebene Produkt.

Beispiel 10

5 Das Verfahren gemäss den Beispielen 8 und 9 wird wiederholt, wobei jedoch statt Ochseninsulin Schweineinsulin verwendet wird.

Der hierbei gewonnene Schweineinsulinkomplex hat die gleiche Reinheit wie der gemäss Beispiel 1 hergestellte Kom-10 plex.

Beispiel 11

DasVerfahren gemäss Beispiel 8 wird wiederholt. Als 15 Ausgangsmaterial dient ein durch Aussalzen eines bei der Insulinproduktion anfallenden wässrigen Rohextraktes durch Zusatz von Salz bis 3,5 Mol pro Liter bei einem pH von 8,5 hergestelltes Schweineinsulin. Der gebildete Salzkuchen wird in bekannter Weise vor dem lonenaustausch entsalzt.

Beispiel 12

Das Verfahren gemäss Beispiel 11 wird wiederholt, wobei der anfallende Salzkuchen einer Gelfiltration auf Sephadex G-50 unterworfen wird.

25 Das Produkt hat die gleiche Reinheit wie das im Beispiel 1 beschriebene.

Beispiel 13

30 Eine Säule mit den Abmessungen 2,6 x 80 cm wurde mit DEAE-Sephadex A-25 gefüllt, welches zuvor gequollen und in einer Pufferlösung aus 0,15 Mol Ammoniumhydroxyd in 7 Mol Dimethylformamid, die mit 5-normaler Salzsäure auf einen pH-Wert von 9,0 eingestellt war, ins Gleichgewicht ge-35 bracht war. 300 mg Ochseninsulin, gereinigt durch Gelfiltration auf Sephadex G-50, wurden in 40 ml des genannten Puffers gelöst und in die Säule eingebracht, worauf 2 Stunden lang mit dem genannten Puffer bei einer Geschwindigkeit von 200 ml/Stunde eluiert wurde. Die Elution wurde dann 40 fortgesetzt, und bei der gleichen Geschwindigkeit wurde ein linearer Gradient eingeführt, welcher aus 2700 ml der genannten Pufferlösung und 2700 ml eines Puffers aus 0,25 Mol Ammoniumhydroxyd in 7 Mol Dimethylformamid, eingestellt auf einen pH-Wert von 9,0 mit 5-normaler 45 Salzsäure, resultierte.

Das Eluat wurde in Fraktionen aufgeteilt. Die hochge-reinigten Fraktionen wurden gesammelt, und ihr Insulingehalt wurde bestimmt. Der pH-Wert wurde mit 5-normaler Salzsäure auf 7,9 gebracht, und dann wurde m-Cresol zuge-50 setzt, bis die Lösung 0,2%ig daran war. Wenn der gesamte Zinkgehalt der Lösung auf 0,5 Gew.% des Insulingehaltes eingestellt war, wurde die Menge an Protaminsulfat, die zur Erzielung des isophanen Verhältnisses notwendig war, in Form einer 1 %igen Lösung zugesetzt, und die Mischung 55 wurde vorsichtig gerührt. Nach einer Ruhezeit von 15 Minuten bei 20 °C wurden 6 Volumina 1/75 Natriumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,3, welcher 0,2% m-Cresol enthielt, zugesetzt, und nach kurzem Rühren wurde die Mischung bei 20 °C 16 Stunden lang stehen gelassen. Dadurch 60 kristallisierte der amorph ausgeschiedene Protamin-Insulin-Komplex.

Durch Ersatz der oben genannten Flüssigkeit durch ein bekanntes Trägermedium wurde der Niederschlag in ein injizierbares Insulinpräparat überführt.

65 Wenn ein Niederschlag von 300 |ig isoelektrisch in Polyacrylamidgel unter Verwendung von 2% Ampholin (pH = 3 bis 10) in 6molarem entionisiertem Harnstoff fokussiert wurde, zeigte dieser Niederschlag im wesentlichen nur ein Band.

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Beispiel 14

Eine Säule mit einem Durchmesser von 2,6 cm und einer Höhe von 4,4 cm wurde mit QAE-Sephadex A-25 gepackt, welches zuvor gequollen und in einer Pufferlösung aus 0,1 Mol pro Liter Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan in 60 Vol.-% Äthanol, eingestellt auf einen pH-Wert von 7,35 mit 5normaler Salzsäure ins Gleichgewicht gebracht worden war.

250 mg Ochseninsulin, welches zuvor durch Gelfiltration auf Sephadex G-50 gereinigt worden war, wurden in 10 ml 0,lmolarem Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan in 60%igem Äthanol, eingestellt auf einen pH-Wert von 5,8 mit Salzsäure, gelöst, und nach Filtrieren der Lösung wurde dieses in die Säule eingebracht. Die Säule wurde dann mit dem Gleichgewichtspuffer in einer Geschwindigkeit von 10 ml/ Stunde eluiert.

Das Eluat wurde in Fraktionen geteilt, und die hochgereinigten Fraktionen wurden gesammelt und auf den Insulingehalt geprüft. Dann wurde m-Cresol zugesetzt, bis die Lösung 0,2% davon enthielt, worauf der gesamte Zinkgehalt auf 0,5 Gew.% des Insulingehaltes eingestellt wurde. Danach wurde die Menge an Protaminsultat, welche zur Erreichung des isophanen Verhältnisses notwendig war, in Form einer l%igen wässrigen Lösung zugesetzt, und die Mischung wurde vorsichtig gerührt. Nach einer Ruhezeit von 15 Minuten bei 20 °C wurden 9 V olumina 1 jl 5-Natriumphosphat-puffer mit einem pH-Wert von 7,3, welcher 0,2% m-Cresol enthielt, zugefügt, und nach kurzem Rühren wurde die Mischung 16 Stunden lang bei 20 °C stehen gelassen. Dadurch kristallisierte der amorph ausgefallene Protamin-Insulin-Komplex.

Durch Ersatz der oben genannten Flüssigkeit durch ein bekanntes Trägermedium wurde der Niederschlag zu einem injizierbaren Insulinpräparat umgewandelt.

Wenn ein Niederschlag aus 300 |ig isoelektrisch in Poly-acrylamidgel unter Verwendung von 2% Ampholin (pH = 3 bis 10) in 6-molarem entionisiertem Harnstoff fokussiert wurde, zeigte der Niederschlag im wesentlichen nur ein Band.

Beispiel 15

In einem auf 5 °C gekühlten Raum wurde eine Säule mit einem Durchmesser von 2,6 cm und einer Höhe von 11 cm mit QAE Sephadex A-25 gefüllt, welches zuvor gequollen und in einer Pufferlösung aus 0,5 Mol Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan in 8 Mol Acetamid, eingestellt auf einen pH-Wert von 8,0 mit Eisessig, ins Gleichgewicht gebracht war.

300 mg Ochseninsulin, welches durch Gelfiltration auf Sephadex G-50 gereinigt worden war, wurden in 30 ml des genannten Puffers gelöst und in die Säule eingebracht, worauf 1 Stunde lang mit einer Geschwindigkeit von 80 ml/ Stunde eluiert wurde. Die Elution wurde dann fortgesetzt, und mit derselben Geschwindigkeit wurde ein linearer Gradient eingeführt, der durch 2000 ml des genannten Puffers und 2000 ml desselben Puffers, der ausserdem 0,15 Mol pro Liter Natriumchlorid enthielt, erzielt wurde.

Das Eluat wurde in Fraktionen geteilt. Die hochgereinig-ten Fraktionen wurden gesammelt und ihr Insulingehalt bestimmt. Nach Zumischen von m-Cresol, bis ein Gehalt von 0,2% erreicht war, wurde der gesamte Zinkgehalt der Lösung auf 0,5 Gew.% des Insulingehaltes mit einer 0,15molaren Zinkchloridlösung eingestellt, und danach wurde die zur Erreichung des isophanen Verhältnisses erforderliche Menge an Protaminsulfat in Form einer l%igen wässrigen Lösung zugesetzt. Die Mischung wurde vorsichtig gerührt, und nach einer Ruhezeit von 15 Minuten würden 7 Volumina 1/75-molarer Natriumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,3, welche 0,2% m-Cresol enthielt, zugesetzt,

worauf die Mischung weitere 16 Stunden bei 20 °C stehen gelassen wurde. Dadurch kristallisierte der amorph ausgeschiedene Protamin-Insulin-Komplex.

Durch Ersatz der oben genannten Flüssigkeit durch ein 5 bekanntes Trägermedium wurde der Niederschlag in ein injizierbares Insulinpräparat überführt.

Wenn ein Niederschlag von 300 ng isoelektrisch in Polyacrylamid unter Verwendung einer 2%igen Ampholinlösung (pH = 3 bis 10) in 6-molarem entionisiertem Harnstoff fo-lo kussiert wurde, zeigte der Niederschlag im wesentlichen nur ein Band.

Beispiel 16

In einem auf 5 °C gekühlten Raum wurde eine Säule mit i5 einem Durchmesser von 2,6 cm und einer Höhe von 12 cm mit QAE Sephadex A-25 gefüllt, welches zuvor in einem Puffer aus 0,05 Mol Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan in 7 Mol Acetonitril, eingestellt auf einen pH-Wert von 8,2 mit 5normaler Salzsäure, gequollen und ins Gleichgewicht ge-2o bracht worden war.

300 mg Ochseninsulin, welches durch Gelfiltration auf Sephadex G-50 gereinigt worden war, wurden in 30 ml des genannten Puffers gelöst, wobei der pH-Wert mit 2normaler NaOH auf 9,3 und dann mit 2normaler Salzsäure auf 8,2 25 eingestellt wurde. Diese Insulinlösung wurde in die Säule eingebracht, worauf 1 Stunde lang mit dem genannten Puffer bei einer Geschwindigkeit von 75 ml/Stunde eluiert wurde. Die Elution wurde dann fortgesetzt, und mit derselben Geschwindigkeit wurde ein linearer Gradient eingeführt, der 30 aus 1800 ml des genannten Puffers und 1800 ml desselben Puffers, der ausserdem 0,15 Mol pro Liter Natriumchlorid enthielt, resultuierte.

Das Eluat wurde in Fraktionen geteilt. Die hochgereinigten Fraktionen wurden gesammelt und der Insulingehalt be-35 stimmt. Nach Zumischen von m-Cresol bis zu einem Gehalt von 0,2% wurde der gesamte Zinkgehalt der Lösung mit 0,15molarer Zinkchloridlösung auf 0,5 Gew.% des Insulingehaltes eingestellt, und dann wurde die zur Erreichung des isophanen Verhältnisses notwendige Menge an Protaminsul-40 fat in Form einer 1 %igen wässrigen Lösung zugesetzt. Die Mischung wurde vorsichtig gerührt, und nach einer Ruhezeit von 15 Minuten wurden 6 Volumina 1/75 Natriumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,3, welcher 0,2% m-Cresol enthielt, zugegeben. Die Mischung wurde weitere 16 Stun-45 den lang bei 20 °C stehen gelassen, wodurch der amorph ausgefallene Protamin-Insulin-Komplex kristallisierte.

Durch Ersatz der genannten Flüssigkeit durch ein bekanntes Trägermedium wurde das Produkt in ein injizierbares Insulinpräparat überführt.

so Wenn 300 (ig Niederschlag im Polyacrylamidgel unter Verwendung von 2% Ampholin (pH = 3 bis 10) in 6molarem entionisiertem Harnstoff isoelektrisch fokussiert wurden, zeigte der Niederschlag im wesentlichen nur ein Band.

55

Beispiel 17

Beispiel 15 wurde wiederholt, wobei der Puffer jedoch in diesem Fall aus 0,05 Mol Tris-(hydroxymethyl)-aminome-than in 5 Mol wässrigem N-Methylacetamid bestand und 60 sein pH-Wert mit 5normaler Salzsäure auf 8,2 eingestellt war. Der Insulinlösung wurden zur Kristallisation nur 4 Volumina Phosphatpuffer zugemischt.

Beispiel 18

65 Die Vorgangsweise von Beispiel 16 wurde wiederholt, wobei die gesammelten hochgereinigten Insulinfraktionen in eine mit Sephadex G-25, welches in einem Medium aus 1/ 60molarem Dmatriummonohydrogenphosphat in lmolarem

7

631 625

Acetamid mit einem pH-Wert von 7,65 gequollen war, gepackte Kolonne eingebracht wurden, so dass das eingebrachte Volumen 20% des Gesamtvolumens der Säule nicht überstieg. Die Säule wurde dann mit dem genannten Medium mit einer Geschwindigkeit von 20 ml/Stunde x cm2 eluiert und die Insulin enthaltenden Eluatfraktionen gesammelt. Nach Bestimmung des Insulingehaltes wurde der gesamte Zinkgehalt der Lösung auf 0,5 Gew.% des Insulingehalts mit 0,15molarem Zinkchlorid in 1 molarem Acetamid eingestellt, und dann wurde 1/4 Volumen 0,1 molarer Salzsäure, enthaltend 1,5% m-Cresol, zugesetzt. Danach wurde die zur Erreichung des isophanen Verhältnisses notwendige Menge an Protaminsulfat zugegeben. Nach Stehenlassen für 16 Stunden bei 20 °C wurde der ausgeschiedene Protamin-s Insulin-Komplex kristallisiert. Das so erhaltene Produkt war von derselben Reinheit, wie das in Beispiel 16 beschriebene Produkt.

Durch Ersatz der genannten Flüssigkeit durch ein bekanntes Trägermedium kann der Niederschlag zur Herstellung in-lo jizierbarer Insulinpräparate verwendet werden.

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3 Blatt Zeichnungen

Claims (7)

631 625 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung eines stabilen Insulinpräparates mit Dauerwirkung und mit niedriger Antigenizität durch Umsetzung von sauren Gruppen des Insulins mit basischen Gruppen organischer Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion in einer wässrigen Pufferlösung durchgeführt wird, die ein proteindissoziierendes oder pro-teindepolymerisierendes Mittel enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Insulin aus Ochsenpankreas verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die basische Gruppen enthaltende organische Verbindung ein basisches Polypeptid, z.B. ein Protamin,

oder ein Spaltprodukt eines basischen Polypeptids ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass als proteindissoziierendes oder protein-depolymerisierendes Mittel Harnstoff verwendet wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die wässerige Pufferlösung Harnstoffe enthält, und dass das Reaktionsprodukt durch Verdünnen ausgefällt wird.

6. Anwendung des Verfahrens nach Anspruch 1 auf eine ' Insulin enthaltende Fraktion, die durch chromatographische Reinigung des Insulins unter Verwendung eines gepufferten wässrigen Eluenten, der das proteindissoziierende oder pro-teinpolymerisierende Mittel enthält, erhalten wurde.

7. Anwendung nach Patentanspruch 6 des Verfahrens nach einem der Patentansprüche 2 bis 5 auf eine Insulin enthaltende Fraktion, die durch chromatographische Reinigung des Insulins unter Verwendung eines gepufferten wässrigen Eluenten, der das proteindissoziierende oder proteinpolyme-risierende Mittel enthält, erhalten wurde.