Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania trwalego preparatu insulinowego o przedluzonym dzialaniu i malej zdolnosci wywolywania przeciw¬ cial, przeznaczonego do celów leczniczych. Preparaty insulinowe, stosowane do leczenia cu¬ krzycy, pochodza zazwyczaj z trzuski swin lub wolów, przy czym okolo 30% swiatowego zuzycia insuliny stanowi insulina wieprzowa, a okolo 70% insulina wolowa. Proponowano wytwarzanie insu¬ liny z innych zwierzat, np. owiec, ale jak dotad nie osiagnieto w tym zakresie zadnych istotnych wyników. Terapia insulinowa posiadala szereg niedogod¬ nosci, które manifestowaly sie inter alia jako uczu¬ lenia i lipodystrofia. Wiadomo od dawna, ze konwencjonalne leczenie insulinowe powoduje u wiekszosci pacjentów wy¬ twarzanie przeciwcial insuliny, które moze rirowa- dzic do wzrostu zapotrzebowania na insuline, po¬ niewaz nieznane ilosci insuliny wiaza sie z przeciw¬ cialami, a przy dalszym trwaniu procesu wiazania sie insulina staje sie nieskuteczna jako regulator poziomu cukru we krwi. Przez dluzszy czas przypuszczano, ze najpowaz¬ niejsza przyczyna tworzenia sie przeciwcial, a w konsekwencji wysokiego zuzycia insuliny byla obecnosc równych zanieczyszczen, wystepujacych w insulinie znajdujacej sie w sprzedazy. Jako przyklady tych zanieczyszczen mozna wymienic di- mer, insuliny, proinsuline, insuline posrednia, czyli stadium przejsciowe miedzy proinsulina i insulina, argini-noinsulina, ester etylowy insuliny, monode- zaminoinsulina i dwudezaminoinsulina. Pierwsze trzy. wymienione zwiazki sa znane z duzej zdolnosci wywolywania przeciwcial. Wiadomo równiez, ze czwarty i piaty, albo oba te zwiazki maja takze duza zdolnosc wywolywania przeciwcial, natomiast szósty i siódmy zwiazek i czasteczka insuliny jako taka tylko w niewielkim stopniu wywoluja tworze¬ nie przeciwcial, albo nawet nie wywoluja go wcale wedlug Schlichterull, Monocomponent Insulin and its Chemical Implications (16 marzec 1973). Wiadomo, ze usuniecie wymienionych zanie¬ czyszczen na drodze saczenia przez warstwe zelu i/lub wymiane jonowa jest mozliwe i ze w ten sposób otrzymuje sie insuline o wysokiej czystosci, zawierajaca zasadniczo jeden skladnik. Ostatnio znajduja sie w sprzedazy preparaty insulinowe po¬ zbawione w pewnym stopniu niektórych ze wspo¬ mnianych zanieczyszczen, co w wielu przypadkach powoduje spadek ilosci przeciwcial u ludzi chorych na cukrzyce. Stwierdzono, ze mozna otrzymac tak czyste pre¬ paraty insuliny wieprzowej i wolowej, ze nie po¬ woduja wcale lub tylko w niewielkim stopniu two¬ rzenie przeciwcial insuliny (wedlug Schlichterull* Monocomponent Insulin and its Chemical Impli¬ cations, 16 marzec 1973). Dowiedziono równiez, ze mozliwe jest wytwarzanie preparatów o przedlu¬ zonym dzialaniu i zasadniczo obnizonej zdolnosci99 927 3 wywolywania przeciwcial, jezeli produkcja oparta jest na insulinie wieprzowej o wysokiej czystosci (wedlug T. Deckert i in. Diabetologia, tom 10, str, 703—708, 1974). Jednak wiadomo równiez, ze wytwarza sie insuline wolowa w stanie czystym, która wedlug stosowanych obecnie metod anali¬ tycznych musi byc uznana za tak czysta, jak wy¬ twarzana insulina wieprzowa o wysokiej czystosci, przy . czym nie wywoluje ona wcale lub tyl/ko w niewielkim stopniu wywoluje przeciwciala pod¬ czas stosowania w postaci szybko dzialajacych pre¬ paratów o przedluzonym dzialaniu i malej zdol¬ nosci wywolywania przeciwcial. Takich prepara¬ tów o przedluzonym dzialaniu i malej zdolnosci wywolywania przeciwcial nie ma dotychczas w sprzedazy. Jest to powazna niedogodnosc, ponie¬ waz preparaty o szybkim dzialaniu, oparte na in¬ sulinie wolowej, maja znaczenie miedzynarodowe. Wytwarzanie przez zywy organizm przeciwcial -zwiazków chemicznych, takich jak insulina, moze wynikac z róznicy w pierwszorzedowej strukturze chemicznej (wedlug Argnilla E.R. i in. Immuno- chemistry of Insulin, Handbook of Physiology, rozdz. 9, str. 160, 1972), polegajacej na tym, ze zwiazek chemiczny ma niewygodna budowe prze¬ strzenna, odrzucana przez organizm (wedlug Arg- nila, EJR. i in., Immunology Conformation and Bio- logical Activity of Insulin, Diabetes, vol. 18, str. 194, 1969 lub, ze zwiazek chemiczny z powodu agregacji czasteczek posiada takie niewygodne wy¬ miary calkowite, ze z tego powodu jest równiez odrzucany przez organizm (wedlug Argnilla, E.R. i in., Immunochemistry of Insulin, Handbook of Physiology, rozdz. 9, str. 160, 1972). Poza tym mozna wywolac tworzenie przeciw¬ cial poprzez podawanie wraz ze zwiazkiem che¬ micznym komponenta, zdolnego do aktywowania mechanizmu immunologicznego. Wiele badan wykazalo, ze stan fizyczny insuliny odgrywa zasadnicza role w tworzeniu przeciwcial (Kumar i in., Horn, Metab. Res. 6, (1974) 185—177, Piers i in. Neth J. Med. 17 (1974) str. 234—258). Byc jmoze przyczyna, dla której szybko dzialajace preparaty insulinowe o wysokiej czystosci nie po¬ woduja lub powoduja tylko w^iiewielkim stopniu tworzenie przeciwcial jest to, ze poza wysoka czy¬ stoscia insulina w tym wypadku wystepuje w po¬ staci monomeru lub luznych agregatów czasteczek. /Natomiast poprzednio wytwarzane i sprzedawane preparaty szybko dzialajacej i wysoko oczyszczonej insuliny zawieraly ja w postaci zagregowanej i o wlasciwosciach powodujacych wytwarzanie przeciwcial. Fakt ten jest bardzo wymowny w od¬ niesieniu do insuliny wolowej, która prawdopo¬ dobnie posiada wieksze sklonnosci do tworzenia agregatów czasteczek niz insulina wieprzowa. Jak wiadomo insulina wolowa bez dodatków po¬ siada szerszy zakres wytracania izoelektrycznego niz insulina wolowa. Wiadomo takze, ze szeroki zakres wytracania izoelektrycznego mozna ograniczyc do takiej samej wielkosci, jaka posiada insulina wie¬ przowa, poprzez dodanie pewnych substancji, takich jak fenol lub m-krezal (wedlug brytyjskiego opisu patentowego nr 1222100). Uwaza sie, ze szerszy zakres wytracania izoelektrycznego insuliny wolo- . wej spowodowany jest tym, ze przy wartosciach bliskich pH obojetnemu tworzy ona agregaty czasteczek. Sposób wedlug wynalazku opiera sie na spostrze- zeniu, ze oczyszczona insuline mozna stabilizowac tak, aby podczas wytwarzania, przechowywania lub stosowania preparatów o przedluzonym dzia¬ laniu nie tworzyly sie agregaty czasteczek, wywo¬ lujacych powstawanie przeciwcial. Sposób wedlug wynalazku polega na prowadze¬ niu reakcji w wodnym roztworze buforowym, za¬ wierajacym srodek rozpuszczajacy lub depolimery- zujacy bialko, który podczas reakcji z zasada or¬ ganiczna, zawierajaca grupy aminowe, utrzymy¬ walby insuline w postaci rozpuszczalnego i stabil¬ nego monomeru albo luznych agregatów czaste¬ czek. Przykladami zasad organicznych, nadajacych sie do stosowania w sposobie wedlug wynalazku sa polipeptydy, np. poliarginina, somatostatyna, pro¬ tamina lub produkty jej trawienia, albo globina. Przykladem odpowiedniego niiepeptydowego zwiaz¬ ku zasadowego jest l,3-bis-(4-amino-2-metylochino- lilo^6-)-mocznik. Reakcje prowadzi sie dogodnie w obecnosci mocznika jako srodka rozpuszczajacego lub depo- limeryzujacego bialka. Korzystnie stezenie mocz¬ nika wynosi co najmniej 2 mole, zwlaszcza okolo 7 moli, zas produkt reakcji wytraca sie przez roz¬ cienczenie mieszaniny reakcyjnej. Sposób wedlug wynalazku mozna stosowac do in¬ suliny, otrzymanej z wielu róznych gatunków zwie¬ rzat, takich jak swinie, woly lub owce, lecz ma on szczególne zastosowanie do insuliny wolowej. Zamiast tego mozna stosowac równiez insuline syntetyczna, taka jak na przyklad syntetyczna in¬ sulina ludzka, pochodne insuliny lub jej analogi. Sposób wedlug wynalazku mozna realizowac, 40 mieszajac frakcje insuliny, otrzymana po oczysz¬ czeniu na drodze chromatograficznej przy uzyciu jako eluenta wodnego buforu, zawierajacego srodek rozpuszczajacy lub depolimeryzujacy bialko, z wod¬ nym roztworem zasady organicznej, zawierajacej 45 grupy aminowe, a nastepnie wydzielajac preparat insuliny. Takie (postepowanie skutecznie zabezpie¬ cza przed tworzeniem agregatów czasteczek dzieki temu, ze wysoce oczyszczonej insuliny nie wydzie¬ la sie od razu, co mogloby doprowadzic do zagre¬ gowania. Poza tym opisany sposób pozwala na bardzo proste otrzymywanie i efektywne oczyszcze¬ nie preparatu o przedluzonym dzialaniu, który wytraca sie w postaci trwalej. - Sposób wedlug wynalazku ilustruja szczególowo 55 nastepujace przyklady. Przyklad I. 250 mg rekrystalizowanej insu¬ liny wolowej rozpuszcza sie w 5,2 ml stabilizowa¬ nego roztworu buforu, zawierajacego 7 M odjoni- zowanego mocznika i 0,02 M tris o wartosci pH= 60 =8,1. Otrzymany roztwór miesza sie z 5,2 ml 7 M roztworu mocznika i pH mieszaniny nastawia sie na wartosc 8,1. Na kolumne o srednicy 5 cm, za¬ wierajacej warstwe DEAE — celulozy (Whatmann De 52) o wysokosci 2,1 cm, zrównowazonej po- 65 wyzszym roztworem buforowym wprowadza sie ,5 roztwór insuliny. Kolumne wymywa sie z szyb¬ koscia 75 ml/godz nastepujacymi roztworami: 2,5 godziny buforem, stosowanym do przygotowy¬ wania nanoszonej insuliny, 3,0 godziny buforem, stosowanym do przygotowa¬ nia mieszaniny, do którego dodano 0,0045 mola chlorku sodowego na litr, 12,0 godzin buforem, stosowanym do przygoto¬ wania mieszaniny, do którego dodano 0,011 mola chlorku sodowego na litr. Otrzymany eluat dzieli sie na frakcje. Frakcje 0 wysokiej czystosci laczy sie i oznacza zawartosc insuliny. W tej samej objetosci 7 M roztworu mocznika, jaka ma frakcja o wysokiej czystosci, rozpuszcza sie protamine w ilosci, potrzebnej do otrzymania stosunku izotonicznego insuliny o wy¬ sokiej czystosci do protaminy. Roztwór insuliny dodaje sie powoli, kroplami do mieszanego roztworu protaminy i ewentualnie po rozcienczeniu mocznika do stezenia, wynoszacego 1 M, wytraca sie kompleks protaminoinsuliny w stanie amorficznym. Osad oddziela sie przez odwirowanie. Wykazuje on praktycznie tylko jedno pasmo przy poddaniu 300 mg produktu ogniskowaniu izoelektrycznemu na zelu poliakrylamidowym, przy uzyciu 2% amfo- liny (pH=3—10) w 6 M odjonizowanym roztworze mocznika. Otrzymany osad stosuje sie do przygotowania preparatów do infekcji przez wytworzenie zawie¬ siny w znanym nosniku. Przyklad II. Stabilizowany roztwór buforowy przygotowuje sie przez zmieszanie obu roztworów 1 i 2 w takim stosunku, aby otrzymac wartosc pH równa 6,0. Roztwór 1 zawiera 7 M roztwór odjo- nizowanego mocznika i 0,13 M fosforanu jednoso- dowego, zas roztwór 2 zawiera 7 M roztwór odjo- nizowanego mocznika i 0,13 M fosforanu dwusodo- wego. 400 mg rekrystalizowanej wolowej insuliny roz¬ puszcza sie w 3 ml powyzszego buforu i za pomo¬ ca malej ilosci roztworu 2 doprowadza sie pH do wartosci 6,0, po czym mieszanine saczy sie. Na ko¬ lumne o srednicy 2,5 cm2, zawierajacej warstwe wymieniacza jonowego typu amberlit CG — 50 II, zrównowazonej powyzszym roztworem buforowym nanosi sie roztwór insuliny. Kolumne wymywa sie z szybkoscia 40 ml/igodz roztworem buforowym, stosowanym do przygotowania nanoszonej insuliny. Otrzymany eluat dzieli sie na frakcje. Frakcje o wysokiej czystosci laczy sie i oznacza zawartosc insuliny. W tej samej objetosci 7 M roztworu mocz¬ nika, jaka ma polaczona frakcja o wysokiej czy¬ stosci, rozpuszcza sie protamine w ilosci potrzebnej do otrzymania stosunku izotonicznego insuliny 0 wysokiej czystosci do protaminy. Roztwór insuliny dodaje sie powoli, kroplami do mieszanego roztworu protaminy i ewentualnie po rozcienczeniu mocznika do stezenia, wynoszacego 1 M, wytraca sie kompleks protaminoinsuliny w staniie amorficznym. Osad oddziela sie przez odwirowanie. Posiada on taka sama czystosc, jak produkt, opisany w przykladzie I. 927 6 Otrzymany osad stosuje sie do przygotowywania preparatów do iniekcji przez wytworzenie zawie¬ siny w znanym nosniku. Przyklad III. Powtarza sie postepowanie z przykladu I lub II, przy czym do roztworu pro¬ taminy wprowadza sie chlorek cynkowy, odpowia¬ dajacy ilosci 0,5% jonów cynkowych w przeliczeniu na insuline i 0,3% m-ikrezolu w stosunku do obje¬ tosci mieszaniny. Wartosc pH mieszaniny otrzymu- je sie w zakresie 6—9, co umozliwia wytracenie kompleksu protaminoinsuliny w postaci krysta¬ licznej. Osad oddziela sie przez odwirowanie. Wykazuje on praktycznie tylko jedno pasmo przy poddaniu 300 mg produktu ogniskowaniu izoelektrycznemu na zelu poliakrylamidowym, przy uzyciu 2% am- foliny (pH=3—10) w 6 M odjonizowanym roztwo¬ rze mocznika. Otrzymany osad stosuje sie do przygotowania preparatów do iniekcji przez wytworzenie zawie¬ siny w znanym nosniku. Przyklad IV. Powtarza sie postepowanie z przykladu I lub II, przy czym jako material o* wyjsciowy stosuje sie rekrystalizowana insuline za wolowa, oczyszczona przez saczenie na zelu Sep- hadex G-50. Otrzymany produkt posiada te sama czystosc, co produkt, opisany w" przykladzie I. Przyklad V. Powtarza sie postepowanie z przykladów I—IV, przy czym zamiast insuliny wolowej stosuje sie insuline wieprzowa. Otrzy¬ many kompleks protaminowo-insulinowy byl tak czysty, jak kompleks, otrzymany w przykladzie I. Przyklad VI. Powtarza sie postepowanie z przykladu V, przy czym jako material wyjsciowy stosuje sie insuline wieprzowa, otrzymana przez wysolenie surowego ekstraktu wodnego, uzyska¬ nego podczas produkcji insuliny przez dodanie sta- 40 lego chlorku sodowego do osiagniecia stezenia 3,5 M przy wartosci pH = 8,5. Otrzymany osad odsala sie w zwykly sposób wczesniej przed prze¬ prowadzeniem wymiany jonowej. Otrzymany produkt posiadal te sama czystosc, co 45 opisany w przykladzie I. Przyklad VII. Powtarza sie postepowanie z przykladu IV, przy czym otrzymany osad odsala sie przez saczenie na zelu Sephadex G-50. Otrzymany produkt posiadal te sama czystosc, co opisany w przykladzie I.. Przyklad VIII. Powtarza sie postepowanie z przykladu I lub II, przy czym zamiast protaminy stosuje sie poli-L-arginine o stopniu polimery- 55 zacji 296. Przyklad IX. Powtarza sie postepowanie z przykladu I, przy czym do polaczonych frakcji insuliny o wysokiej czystosci dodaje sie 0,2% wodnego roztworu chlorowodorku bis^(4^amino-2- 6o -metylochinolino-6)-mocznika w ilosci równej 10% wagowych insuliny, zawartej w tych frakcjach. Nastepnie ewentualnie po rozcienczeniu 0,025 M buforem fosforanu sodowego do stezenia mocznika 1 M i wartosci pH = 7,3 wytraca sie kompleks in- 65 suliny, który przez pewien czas utrzymuje sie99 927 8 w roztworze macierzystym, a potem oddziela sie przez odwirowanie. Otrzymany produkt mial te sama czystosc, co produkt, opisany w przykladzie I. Przyklad X. Powtarza sie postepowanie z przy¬ kladu IX, przy czym jako materialu wyjsciowego uzywa sie rekrystalizowanej insuliny wolowej, oczyszczonej przez saczenie na zelu Sephadex G-50. Otrzymany produkt mial te sama czystosc, jak produkt, opisany w przykladzie I. Przyklad XI. Powtarza sie postepowanie z przykladu IX i X, przy czym zamiast insuliny wieprzowej stosuje sie insuline wolowa. Otrzymany kompleks insuliny wolowej mial te sama czystosc jak kompleks opisany w przykla¬ dzie I. Przyklad XII. Powtarza sie postepowanie z przykladu IX, przy czym jako material wyjscio¬ wy stosuje sie insuline wieprzowa, otrzymana przez wysolenie surowego ekstraktu wodnego, uzyskanego podczas produkcji insuliny przez do¬ danie stalego chlorku sodowego do osiagniecia ste¬ zenia 3,5 M przy wartosci pH=8,5. Otrzymany osad odsala sie w zwykly sposób wczesniej przed prze¬ prowadzeniem wymiany jonowej. Otrzymany produkt mial taka sama czystosc, jak opisany w przykladzie I. Przyklad XIII. Powtarza sie postepowanie z przykladu XII, przy czym otrzymany osad odsala sie przez saczenie na zelu Sephadex G-50. Otrzymany produkt mial taka sama czystosc, jak opisany w przykladzie I. W celu zilustrowania zmiennych wlasciwosci immunogennych kompleksu protaminoinsulinowego, wytwarzanego sposobem wedlug wynalazku prze¬ prowadzono porównawcze badania na królikach, na których zwykle prowadzi sie badania wlasciwosci tworzenia przeciwcial przez insuline i podobne komponenty. W badaniach porównawczych zastosowano naste¬ pujace preparaty: 1. Zwykla NPH insuline wolowa, otrzymana w sposób konwencjonalny z rekrystalizowanej in¬ suliny wolowej, zawierajacej wspomniane zanie¬ czyszczenia. 2. Wysoce czysta NPH insuline wolowa, otrzy¬ mana w sposób konwencjonalny z oczyszczonej krystalicznej insuliny wolowej, pozbawionej wspo¬ mnianych zanieczyszczen przez oczyszczanie na drodze chromatograficznej. 3. Wysoce czysta NPH insuline wolowa, otrzy¬ mana sposobem wedlug wynalazku, opisanym w przykladzie III. Królikom wstrzykiwano podskórnie co 10 dni stala dawke 20 jednostek iniekcyjnych badanego preparatu insuliny. Nie zaobserwowano jednakze tworzenia sie jakichkolwiek przeciwcial po iniekcji zwykla NPH insuline wolowa bez uzycia adiu- wantów. Dlatego dla celów porównawczych za¬ adoptowano sposób immunizacji, zwykle stosowany przy wytwarzaniu przeciwcial, polegajacy na tym, ze preparat do pierwszej iniekcji emulguje sie w kompletnym adiuwancie Freunda, a nastepne emulguje sie w niekompletnym adiuwancie Freunda. Tworzenie przeciwcial insuliny badano w odste¬ pach 20-dniowych, stosujac sposób, opisany przez Ortved — Anderson i in. (Acta Endocr., (Kbh.) 69, 195—208, 1972). Na podstawie uzyskanych wyników, zilustrowa¬ nych na fig. 1, 2 i 3 na rysunkach, mozna stwier¬ dzic, ze istnieje mozliwosc wywolywania przeciw¬ cial dla zwyklej NPH insuliny wolowej, zmniejszo¬ ne tworzenie przeciwcial dla wysoce oczyszczonej NPH insuliny wolowej, podczas gdy praktycznie nie mozna wykazac wywolywania przeciwcial dla nowej NPH wolowej insuliny, otrzymanej sposobem wedlug wynalazku. Nalezy podkreslic, ze preparaty 2 i 3 oczyszczano takim samym sposobem na drodze chromatograficz¬ nej, zas jedyna róznica polegala na tym, ze prepa¬ rat 2 wytwarzano, wydzielajac najpierw insuline, a nastepnie poddajac reakcji z protamina sposobem wedlug wynalazku, podczas gdy preparat 3 otrzy¬ mywano, prowadzac reakcje w eluacie, zawieraja¬ cym mocznik, bez uprzedniego wydzielania insu¬ liny. Dalsza serie badan prowadzono, stosujac bardziej umiarkowany sposób immunizacji, w którym wy¬ kluczono poczatkowa stymulacje immunologiczna przy uzyciu niezywych bakterii, tzn. wstrzykiwane preparaty we wszystkich wypadkach emulgowano w niekompletnym adiuwancie Freunda. 80 Króliki poddawano iniekcji co 10 dni, stosujac stala dawke 20 jednostek iniekcyjnych. Wywolywanie przeciwcial insuliny badano w od¬ stepach 10-dniowych, stosujac nowy sposób, opi¬ sany ponizej. Na podstawie uzyskanych wyników, zilustrowanych na fig. 4, 5 i 6 na rysunkach, mozna stwierdzic brak jakiegokolwiek tworzenia przeciwcial dla nowej NPH wolowej insuliny, wy¬ twarzanej sposobem wedlug wynalazku. Na ry¬ sunku fig. 1, 2 i 3 przedstawiaja zawartosc przeciw- 40 cial w nierozcienczonej surowicy króliczej, badanej metoda Ortveda-Andersona. 20 jednostek iniek¬ cyjnych wstrzykuje sie podskórnie w ciagu okre¬ sów, zaznaczonych strzalka, przy czym za pierw¬ szym razem emulguje sie w kompletnym adiuwancie 45 Freunda, nastepnie w niekompletnym adiuwancie Freunda. Fig. 4, 5 i 6 na rysunkach przedstawiaja insuline znaczona izotopem I125 w nierozcienczonej surowicy króliczej, mierzona wedlug metody PEG. 20 jedno- 50 stek iniekcyjnych preparatu emulgowano w nie¬ kompletnym adiuwancie Freunda i wstrzykiwano podskórnie w ciagu okresu, zaznaczonego strzalka. Sposób oznaczania przeciwcial byl nastepujacy: 100 (.ii surowicy króliczej, 100 -j.il 125I — insuliny, 55 tj. 20 \x jedn./ml, 100 \xl roztworu insuliny, tj. 250 ^ jedn./ml i 700 jliI 0,04 M buforu fosforanowego o wartosci pH=7,4 z dodatkiem 0,15 M Naci oraz 0,5% ludzkiej albuminy inkubuje sie w ciagu 48 godzin w temperaturze 4°C. Nastepnie dodaje sie 60 500 jliI PEG 6000, 360 g/l, miesza sie w mikserze obrotowym i próbke odstawia sie na 1 godzine w temperaturze 20°C. Po odwirowaniu w ciagu 10 minut przy szybkosci 3000 obrotów na minute górna warstwe zlewa sie, zbiera sie osad i liczy 65 impulsy, pochodzace od izotopu 125I.9 Podczas kazdego badania stosuje sie próbke kontrolna, zawierajaca nadmiar surowicy swinki morskiej z przeciwcialami dla insuliny wolowej, maksymalnie zwiazanej oraz próbke surowicy kró¬ liczej, pochodzacej ze zwierzat, nie poddanych im- munizacji. Wyniki oblicza sie wedlug wzoru: Tm —T0 o/ b= • 100 T — To w którym T oznacza liczbeimpulsów dla oznaczonej próbki, To liczbe impulsów dla próbki bez wymie¬ niania kontrolnej, a Tm oznacza liczbe impulsów przy maksymalnym wiazaniu. PL PL PL PL PL PL PL