NO146698B

NO146698B - Fremgangsmaate for fremstilling av et stabilt langtidsvirkende insulinprodukt

Info

Publication number: NO146698B
Application number: NO760118A
Authority: NO
Inventors: Bruno Andre Hansen; Finn Hede Andresen
Original assignee: Nordisk Insulinlab
Priority date: 1975-01-15
Filing date: 1976-01-14
Publication date: 1982-08-16
Also published as: PT64696A; ATA21376A; FI760058A; DK8375A; GB1524431A; DD124379A5; JPS5946939B2; SE437219B; FI66751C; IE42395B1; IT1054211B; AR213088A1; FR2297634B1; IE42395L; IL48845A; NL166464C; NL166464B; BE837600A; DE2600971C2; NL7600338A

Description

Denne oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling

av et stabilt langtidsvirkende insulinprodukt med lav antigenisitet ved omsetning av høyrenset insulin med en organisk base inneholdende aminogrupper, fortrinnsvis polypeptidet protamin.

Til behandling av diabetes mellitus er det alminnelig å benytte insulinprodukter som er utvunnet av pankreas fra griser eller okser. Således er ca. 30 % av verdensforbruket av insulin basert på griseinsulin og ca. 70 % på okseinsulin.

Insulin fra andre dyrearter er foreslått, f.eks. saueinsulin,

men har hittil ikke oppnådd stor kommersiell betydning.

Den hittil utførte insulinterapi har medført en hel del

ulemper som bl.a. har vist seg ved allergi og lipodystrofi.

Det har lenge vært kjent at den vanlige insulinbehandling

for de fleste pasienter har ført til dannelse av antistoffer mot insulin, hvilket i noen tilfeller har medført et øket insulin-behov, idet ukjente mengder av insulin kan bindes til anti-stoffene og vil så lenge denne binding varer, være uvirksomt til regulering av blodsukkeret.

Man har lenge ment at den primære årsak til antistoffdannelsen og dermed et høyt insulinforbruk er tilstedeværelsen av forskjellige urenheter i normalt handelsinsulin.

Eksempler på slike urenheter er dimert insulin, pro-

insulin, intermediært insulin (stadiet mellom proinsulin og insulin), arginininsulin, etylester-insulin og mono-desamido-insulin og di-desamido-insulin. Av disse er det kjent at de tre første er sterkt antigene, og videre er det kjent at den fjerde eller den femte eller begge er sterkt antigene, mens den sjette og den syvende forbindelse samt selve insulinmole-kylet ikke eller bare i liten grad er antigent. Jfr.: Schlichtkrull, Monocomponent Insulin and its Clinical Implications, 16. mars 1973, samt britisk patent 1 285 023, svarende til tysk off.skrift 1 940 130.

Det er kjent å fjerne de nevnte urenheter ved gelfiltrering og/eller ionebytting, hvorved man kan oppnå høyrenset insulin som i det vesentlige bare inneholder en enkelt komponent. Således lyktes det allerede i eller før 1960 for R. David Cole,

se "The Chromatography of Insulin in Urea-containing Buffer",

J. Biol. Chem. 235 (1960), s. 2294-2299, å isolere høyrensede insulinprodukter ved ionebytterkromatografi under anvendelse

av urinstoffholdige bufferoppløsninger som elueringsmidler.

Også J. Arthur Mirsky og Kazunori Kawamura, se "Heterogeneity

of Crystalline Insulin", Endocrinology 78, (1966), s. 1115-1119, undersøkte sammensetningen av insulin fra mange forskjellige dyrearter, herunder også humant insulin, og isolerte høyrensede insulinfraksjoner ved gelfiltrering og separering ved poly-akrylamidelektroforese (DISC PAGE).

Britisk patent nr. 881 855 angår en generell fremgangsmåte til rensning av proteinstoffer ved en kromatografisk prosess, hvorved det som elueringsmiddel fortrinnsvis anvendes en alkohol-holdig oppløsning, så som 70 % etanol i en vandig buffer. Denne prosess kan avhengig av betingelsene under kromatograferingen, anvendes for utvinning av insulin i høyt utbytte eller til rensning av insulin, idet det som ionebytterharpiks er foreslått både kationebytterharpikser og anionebytterharpikser.

I de senere år er det markedsført insulinprodukter som

er befridd for flere eller færre av de nevnte urenheter og som også i mange tilfeller har ført til en minsket antistoffdannelse hos diabetikere.

Det har vist seg at hurtigvirkende produkter av både grise-og okseinsulin kan fremstilles i en så ren tilstand at de ikke eller bare i meget liten grad forårsaker dannelse av insulin-antistoffer. Jfr. Schlichtkrull, Monocomponent Insulin and its Clinical Implications, 16. mars k973. Videre har det vist seg at det er mulig å fremstille langtidsvirkende produkter med vesentlig nedsatt antigenisitet, når disse produkter dannes på grunnlag av høyrenset griseinsulin, jfr. T. Deckert et al. Diabetologia bind 10. s. 703-8, 1974. Derimot har det vist seg at selv om man fremstiller okseinsulin av en så høy renhet at det med nåværende analysemetoder må betraktes som like rent som det høyrensede griseinsulin man kan fremstille idag, og så rent at det som ovenfor nevnt ikke eller bare i liten grad forårsaker dannelse av antistoffer når det benyttes i hurtigvirkende produkter, er det ennå ikke markedsført langtidsvirkende lav-antigene produkter på grunnlag av høyrenset okseinsulin. Dette er en alvorlig ulempe, idet langtidsvirkende produkter på grunnlag av okseinsulin er internasjonalt mest anvendt.

Dannelse av antistoffer i den levende organisme mot en kjemisk forbindelse, f.eks. insulin, kan skyldes at det finnes kjemiske primære strukturforskjeller, se Arquilla E. R. et al: Immunochemistry of Insulin, Handbook of Physiology, kap. 9,

s. 160, 1972, at den kjemiske forbindelse har en slik sterisk oppbygning at den virker fremmed og uønsket for organismen, se Arquilla E. R. et al: Immunology Conformation and Biological Activity of Insulin, Diabetes, bind 18, s. 194, 1969, eller at den kjemiske forbindelse har en slik totalstørrelse i suspen-sjon (aggregatdannelse), at den virker fremmed og uønsket for organismen, se Arquilla E. R. et al: Immunochemistry of Insulin, Handbook of Physiology, kap- 9, s. 160, 1972.

Dessuten er det mulig å frembringe antistoffdannelse hvis det sammen med den kjemiske forbindelse administreres en komponent som kan aktivere immunapparatet, såsom de såkalte adjuvans-stoffer, f.eks. "Freunds complete adjuvant" og "Freunds incomplete adjuvant".

Flere undersøkelser tyder på at den fysiske tilstandsform

av insulin spiller en vesentlig rolle for antistoffdannelsen.

(Kumar et al: Horn. Metab. Res. 6 (1974) 175-177 og P.A. Piers et al: Neth J. Med. 17 (1974) s. 234-238.

At de hurtigvirkende, høyrensede insulinprodukter ikke

eller bare i liten grad forårsaker dannelse av antistoffer skyldes sannsynligvis at insulinene i disse tilfeller foruten å være høyrensede også er til stede i monomer form eller eventuelt bare inngår løse aggregatdannelser, mens man i de hittil fremstilte markedsførte langtidsvirkende høyrensede insulinprodukter oppnår å få insulinet til å opptre i en aggregat-dannet form og med slike egenskaper at det forårsaker dannelse av antistoffer. Dette problem er særlig utpreget for okseinsulin, hvilket sannsynligvis skyldes at okseinsulin er mer tilbøyelig til å danne aggregater enn griseinsulin er det.

Det er kjent at okseinsulin uten tilsetningsstoffer har en bredere isoelektrisk felningssone enn tilfellet er for griseinsulin. Det er videre kjent at denne brede isoelektriske felningssone kan innsnevres til det som er kjent for griseinsulin, ved tilsetning av visse stoffer, som f.eks. fenol eller m-kresol, se norsk patent nr. 122 090. Det må antas at denne bredere isoelektriske felningssone for okseinsulin skyldes at okseinsulinet aggregerer ved pH-verdier nær nøytralpunktet. An-vendelsen av fenolforbindelser, så som kresoler, til fremstilling av insulinprodukter inneholdende proteiner, er videre kjent fra svensk patent 111 488 og US-patent 3 509 120. Disse produkter er imidlertid ikke antigenfrie.

Oppfinnelsen er basert på den erkjennelse at det er mulig å stabilisere høyrenset insulin slik at dette hverken under frem-stillingen eller i langtidsvirkende produkter under henstand eller anvendelse danner slike aggregater som forårsaker anti-stoff dannelse . Selv om man tidligere har fremstilt høyrenset insulin, har man ikke tidligere vært oppmerksom på at de herav fremstilte produkter danner aggregater eller polymerisater som kan forårsake antigenisitet. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen karakteriseres ved at omsetningen mellom det høyrensede insulin og den organiske base inneholdende aminogrupper utføres i en vandig buffer-oppløsning, inneholdende en stabilisator, som under omsetningen opprettholder insulinet i oppløst og stabilisert monomer eller løst aggregert form, hvorefter det dannede insulinprodukt isoleres.

Eksempler på egnede organiske baser som kan anvendes ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, er de som vanligvis anvendes for å oppnå langtidsvirkende insulinprodukter, såsom polypeptider, f.eks. polyarginin, somatostatin, protamin eller spaltningspro-dukter herav eller globin. Et eksempel på en anvendelig base som ikke er et polypeptid, er surfen, dvs. 1,3-bis-(4-amino-2-metyl-6-kinolyl)-urinstoff. Den foretrukne base er protamin.

Stabilisatorer som kan opprettholde insulin (og andre proteiner) i stabilisert monomer eller løst aggreggert form, er vel-kjente fra litteraturen, jfr. f.eks. ovennevnte DE-OS 1 940 130; Cole, J. Biol.Chem. 235 (1960) og Elbaum et al., Biochemistry, vol. 13, nr. 6, 1974, side 1268-1278. Slike proteindissosierende stabilisatorer er særlig blitt anvendt ved kromatografisk rensning av proteiner for å motvirke dannelsen av hydrogenbindinger og polymerisasjon av proteinmolekylene. I de tilfeller, jfr. f.eks. DE-OS 1 940 130, hvor stabilisatorene har vært anvendt i forbindelse med rensningen av insulin, er de alltid blitt fjernet under isoleringen av det rensede insulin, og før dette eventuelt omdannes til langtidsvirkende produkter.

Ifølge oppfinnelsen utføres omsetningen hensiktsmessig i nærvær av urinsstoff som stabilisator. Eksempler på andre egnede stabilisatorer er lavere alkanoler, såsom metanol og etanol, di-alkylformamid, f.eks. dimetylformamid, acetamid, N-alkylacetamider, såsom N-metyl-acetamid, og acetonitril. Disse stabilisatorer virker som nevnt protein-dissosierende eller protein-depolymeriserende og er derfor effektive til å stabilisere insulinet på monomer eller løst aggregert form. Med løst aggregert form forstås en tilstand hvor insulinet reversibelt kan omdannes til monomer form, og likevekten forskyves mot monomer form i nærvær av den protein-dissosierende eller protein-depolymeriserende stabilisator.

Oppfinnelsen kan anvendes i samband med insulin fra mange forskjellige dyrearter, såsom griser, okser eller sauer, men oppfinnelsen har særlig betydning i samband med okseinsulin.

I alle tilfeller fjernes alle antigene urenheter i så høy grad som mulig eller ønskelig, før omsetningen med protaminet foretas. Denne rensning kan skje på i og for seg kjent måte, såsom ved gelfiltrering og/eller ionebytterkromatografi. Det således høyrens-ede insulin opprettholdes som nevnt i stabilisert monomer eller løst aggregert form under reaksjonen. Derved unngås den polymerisasjon eller aggregatdannelse som ellers kunne forekomme i fravær av stabilisatoren, såsom ved intermediær isolering og gjenoppløs-ning av det høyrensede insulin. ■Efter reaksjonen med protamin er insulinet fiksert i stabil monomer form og vil ikke kunne danne antigene polymerisater eller aggregater, selv om stabilisatoren fjernes og insulin-protamin-komplekset suspenderes i et vanlig bæremedium for injeksjon.

En foretrukket utførelsesform for oppfinnelsen karakteriseres ved at en insulinholdig fraksjon, som er oppnådd på kjent måte ved kromatografisk rensning av insulin under anvendelse av et bufret vandig elueringsmiddel inneholdende en stabilisator, som opprettholder insulinet i stabilisert monomer eller løst aggregert form, omsettes med en oppløsning av den organiske base inneholdende aminogrupper, hvorefter det dannede insulinprodukt som er et insulin-organisk amin-kompleks utfelles og isoleres. Derved oppnås en stor sikkerhet mot aggregatdannelsen, idet det høyrensede insulin ikke først isoleres som sådant med derav følgende risiko for aggregatdannelse. Videre er denne utførelsesform meget enkel, idet man direkte får utfelt det langtidsvirkende insulinprodukt i stabil form

Ifølge en annen hensiktsmessig utførelsesform for oppfinnelsen utføres omsetningen mellom høyrenset insulin og den organiske base inneholdende aminogrupper, i en vandig bufferoppløsning inneholdende oppløst urinstoff, hvorefter det dannede insulinprodukt utfelles ved fortynning av reaksjonsblandingen. En passende stabili-sering kan oppnås ved anvendelse av en buffer, som er ca. 7 molar med hensyn til urinstoff.

Efter utfeiningen av insulinproduktet, f.eks. et insulin-protamin-kompleks, kan dette suspenderes i et vanlig bæremedium for å oppnå et injiserbart produkt, med langtidsvirkning.

Insulin-protamin-produktet kan også isoleres eller utvinnes

på annen måte. Hvis man som stabilisator anvender et protein-dissosierende eller protein-depolymeriserende oppløsningsmiddel, kan dette skiftes ut med det ønskede bæremedium ved dekantering, filtrering eller sentrifugering og gjensuspendering av produktet i mediet. Såfremt stabilisatoren er et lettflyktig oppløsnings-middel, såsom metanol eller etanol, kan dette fjernes ved vakuum-fordampning før eller efter tilsetning av bæremediet.

Oppfinnelsen illustreres nærmere ved hjelp av følgende eksempler.

Eksempel 1

250 mg omkrystallisert okseinsulin oppløses i 5,2 ml stabilisert bufferoppløsning bestående av 7 molar avionisert urinstoff og 0,02 molar tris-(hydroksymetyl)-aminometan med en pH-verdi på 8,1. Oppløsningen blandes med 5,2 ml 7 molar urinstoffoppløsning. Blandingens pH-verdi innstilles på 8,1. En kolonne med en diameter på 5 cm pakkes med et 2,1 cm høyt lag av DEAE cellulose ("Whatman DE 52") og ekvilibreres med en bufferoppløsning med den ovennevnte sammensetning. Insulinoppløsningen innføres i kolonnen, og det elueres med en hastighet på 75 ml pr. time efter følgende skjema:

2,5 timer med en buffer med den ovennevnte sammensetning,

3 timer med en buffer med den ovennevnte sammensetning, tilsatt 0,0045 mol natriumklorid pr. liter, 12 timer med en buffer med den ovennevnte sammensetning, tilsatt 0,011 mol natriumklorid pr. liter.

Eluatet oppdeles i fraksjoner. De høyrensede fraksjoner samles, og insulininnholdet bestemmes. I en 7 molar urinstoff-oppløsning av samme volum som blandingen av de høyrensede fraksjoner oppløses protamin i den mengde som er nødvendig for å oppnå det isofane forhold mellom det høyrensede insulin og protaminet.

Insulinoppløsningen dryppes langsomt til protaminoppløsningen under omrøring, hvorved det, eventuelt efter en fortynning til en urinstoffkonsentrasjon på 1 molar, utfelles et protamin-insulin-kompleks i amorf tilstand.

Bunnfallet isoleres ved sentrifugering og oppviser i det vesentlige bare ett bånd, når 3 00 yg underkastes isoelektrisk fokusering i polyakrylamidgel under anvendelse av 2 % "Ampholine"

(system av amfotære alifatiske polyamino-polykarboksylsyrer)

(pH 3-10) i 6M avionisert urinstoff.

Dette bunnfall kan anvendes til fremstilling av injiserbare insulinprodukter ved oppslemning i kjente bæremedier.

Eksempel 2

En stabilisert bufferoppløsning fremstilles ved blanding av to oppløsninger I og II i et slikt forhold at pH-verdien blir 6,00.

Oppløsning I består av 7 molar avionisert urinstoff og

0,13 molar.natriumdihydrogenfosfat

Oppløsning II består av 7 molar avionisert urinstoff og

0,13 molar dinatriumhydrogenfosfat.

400 mg omkrystallisert okseinsulin oppløses i 3 ml av denne buffer, hvorefter pH-verdien efterjusteres til 6,00 med litt opp-løsning II, og den resulterende blanding filtreres.

En kolonne med en diameter på 2,5 cm pakkes med et 27 cm høyt lag av "Amberlite" ® harpiks CG-50 type II (svakt sur katione-bytterharpiks fremstilt på basis av polyakrylsyre) og ekvilibreres med en bufferoppløsning med den ovennevnte sammensetning. Insulinoppløsningen innføres i kolonnen, og det elueres med en hastighet på 4 0 ml pr. time med en bufferoppløsning med den ovennevnte sammensetning.

Eluatet oppdeles i fraksjoner. De opprensede insulinfraksjoner samles og insulininnholdet bestemmes. I en 7 molar urinstoff oppløsning med samme volum som blandingen av de høyrensede fraksjoner oppløses protamin i den mengde som er nødvendig for å oppnå det isofane forhold mellom det høyrensede insulin og protaminet.

Insulinoppløsningen settes langsomt til protaminoppløsningen under omrøring, hvorved det, eventuelt efter en fortynning til en urinstoffkonsentrasjon på 1 molar, utfelles et protamin-insulin-kompleks i amorf tilstand.

Bunnfallet isoleres ved sentrifugering og oppviser samme renhet som det i eksempel 1 beskrevne produkt.

Dette bunnfall kan anvendes for fremstilling av injiserbare insulinprodukter ved oppslemning i kjente bæremedier.

Eksempel 3

Fremgangsmåten ifølge eksempel 1 eller 2 gjentas, idet det i protaminoppløsningen innføres sinkklorid svarende til 0,5 % Zn-ioner i forhold til insulinmengden og 0,3 % m-kresol basert på blandingens volum. Blandingens pH-verdi opprettholdes i området 6-9, hvorved protamin-insulin-komplekset utfelles i krystallinsk tilstand.

Bunnfallet isoleres ved sentrifugering og oppviser i det vesentlige bare ett bånd, når 300 yg underkastes isoelektrisk fokusering i polyakrylamidgel under anvendelse av 2 % "Ampholine"

(pH 3-10) i 6M avionisert urinstoff.

Eksempel 4

Fremgangsmåten ifølge eksempel 1 eller 2 gjentas, idet det

som utgangsmateriale anvendes omkrystallisert okseinsulin som er renset ved gelfiltrering på "Sephadex<®> G-50" (dekstrangel tverr-bundet med epiklorhydrin).

Det fremstilte produkt har samme renhet som det i eksempel 1 beskrevne produkt.

Eksempel 5

Fremgangsmåtene ifølge eksempel 1 eller 2 gjentas, idet det istedenfor okseinsulin anvendes griseinsulin. Det dannede protamin-griseinsulin-kompleks er like rent som det i eksempel 1 fremstilte kompleks.

Eksempel 6

Fremgangsmåtene fra eksempel 1 eller 2 gjentas, idet det som utgangsmateriale anvendes griseinsulin fremstilt ved utsaltning av en ved insulinproduksjon dannet vandig råekstrakt ved tilsetning av NaCl til 3,5M ved pH 8,5. Den erholdte saltkake avsaltes på kjent måte før ionebytningen.

Det oppnådde produkt har samme renhet som det i eksempel 1 beskrevne produkt.

Eksempel 7

Fremgangsmåten ifølge eksempel 6 gjentas, idet den erholdte saltkake underkastes gelfiltrering på "Sephadex G-50".

Produktet har samme renhet som det i eksempel 1 beskrevne produkt.

Eksempel 8

Fremgangsmåten ifølge eksempel 1 eller 2 gjentas, idet det istedenfor protamin anvendes poly-L-arginin med en polymerisasjons-grad på 296.

Ved isoelektrisk fokusering i polyakrylamid under anvendelse av 2 % "Ampholine" (pH 3-10) i 6M avionisert urinstoff oppviser 3 00 yg bunnfall i det vesentlige kun ett bånd.

Eksempel 9

Fremgangsmåten ifølge eksempel 1 eller 2 gjentas, idet imidlertid de samlede høyrensede insulinfraksjoner tilsettes en 2 % vandig oppløsning av bis-(4-amino-2-metyl-6-kinolyl)-urinstoff-hydro-klorid i en mengde svarende til 10 vekt% av den tilstedeværende insulinmengde. Herved utfelles, eventuelt efter fortynning til en urinstoffkonsentrasjon på 1 molar med 0,025M Na-fosfatbuffer pH 7,3, et insulinkompleks som efter noen tids henstand kan isoleres ved sentrifugering. Det fremstilte-vprodukt har samme renhet som det i eksempel 1 beskrevne produkt.

Eksempel 10

Fremgangsmåten ifølge eksempel 9 gjentas, idet det som utgangsmateriale anvendes omkrystallisert okseinsulin som er renset ved gelfiltrering på "Sephadex G-50". Det fremstilte produkt har samme renhet som det i eksempel 1 beskrevne produkt.

Eksempel 11

Fremgantsmåten ifølge eksempel 9 gjentas, idet det istedenfor okseinsulin anvendes griseinsulin.

Det dannede griseinsulinkompleks er like rent som komplekset fremstilt ifølge eksempel 1.

Eksempel 12

Fremgangsmåten ifølge eksempel 9 gjentas, idet det som utgangsmateriale anvendes griseinsulin fremstilt ved utsaltning av en ved insulinproduksjon dannet vandig råekstrakt ved tilsetning av NaCl til 3,5M ved pH 8,5. Den erholdte saltkake avsaltes på kjent måte før ionebytningen. Det oppnådde produkt har samme renhet som produktet beskrevet i eksempel 1.

Eksempel 13

Fremgangsmåten ifølge eksempel 12 gjentas, idet den erholdte saltkake underkastes gelfiltrering på "Sephadex G-50".

Produktet har samme renhet som produktet beskrevet i eksempel 1.

For å illustrere de forbedrede immunogene egenskaper av det ifølge oppfinnelsen isolerte protamin-insulin-kompleks er det ut-ført sammenlignende forsøk på kaniner, idet disse dyr vanligvis anvendes ved undersøkelse av insulin og insulinlignende kompo-nenters antigene egenskaper.

I de sammenlignende undersøkelser er det anvendt følgende produkter: 1. Konvensjonelt NPH- okseinsulin fremstilt på vanlig måte fra omkrystallisert okseinsulin inneholdende de i beskrivelsen omtalte urenheter. 2. Renset NPH- okseinsulin fremstilt på vanlig måte fra renset krystallinsk okseinsulin, men befridd for de i beskrivelsen omtalte urenheter ved kolonnekromatografi. 3. Renset NPH-okseinsulin fremstilt ifølge oppfinnelsen som beskrevet i eksempel 3, Nytt NPH- okseinsulin.

(NPH = Nøytral Protamin Hagedorn insulin)

Kaninene ble injisert subkutant hver 10. dag med en konstant dose på 2 0 i.e. av det insulinprodukt som skulle undersøkes. Da det ikke var mulig å påvise noen vesentlig antistoffdannelse efter injeksjon av konvensjonelt NPH-okseinsulin uten adjuvans, var det for sammenligningens skyld nødvendig å anvende en immuniseringsprosedyre som normalt anvendes ved fremstilling av antistoffer, dvs. injisere insulinproduktene ved 1. injeksjon emulgert i Freunds Complete Adjuvans (FCA) og ved efterfølgende injek-sjoner emulgert i Freunds Incomplete Adjuvans (FIA) som avviker fra FCA ved ikke å inneholde drepte bakterier. Begge produkter inneholder forøvrig mineraloljer og emulgatorer. Tidspunktene for injeksjonene er vist med piler på figurene 1, 2 og 3.

Insulinantistoffdannelsen ble undersøkt med intervaller på 20 dager ved anvendelse av den av Ortved Andersen et al beskrevne

metode (Acta Endocr. (Kbh.) 69, 195-208, 1972). De oppnådde resultater er vist i fig. 1, 2 og 3, hvor prikkene angir insulin-bindingskapasiteten i yU/ml. Høy bindingskapasitet viser en høy mengde antistoffer.

Som det sees av resultatene var det mulig å påvise antistoffdannelse mot konvensjonelt NPH-okseinsulin og en nedsatt anti-stoff dannelse mot renset NPH-okseinsulin, mens det praktisk talt ikke var mulig å påvise noen antistoffdannelse mot det ifølge oppfinnelsen fremstilte nye NPH-okseinsulin. Det bemerkes at produkt 2 og 3 ble renset ved samme kromatografiske rensning, hvorved det rensede insulin oppfyller de renhetskriterier som er an-gitt i tysk offentliggjørelsesskrift 1 940 130, og den eneste forskjell var, at produkt 2 ble fremstilt ved først å isolere insulinet og derefter omsette det med protamin på kjent måte, mens derimot produkt 3 ble fremstilt ved å utføre omsetningen i det urinstoffholdige eluat uten forutgående isolering av insulinet.

Det er dessuten utført en annen serie forsøk med anvendelse av en mildere immuniseringsprosedyre, hvor den initiale sti-mulering av immunapparatet med drepte bakterier er utelatt, dvs. produktene er i alle tilfeller injisert emulgert i Freunds Incomplete Adjuvans. Kaninene ble injisert hver 10. dag med

en konstant dose på 20 i.e. (se pilene på fig. 4-6).

Insulin-antistoffdannelsen ble undersøkt med intervaller

på 10 dager ved anvendelse av en nyutviklet metode som er basert på utfelning med polyetylenglykol (PEG) av insulin-antiinsulin-125 komplekser under anvendelse av radioaktivt merket insulin, I insulin som sporstoff.

PEG metode til antistoffbestemmelse

100 yl kaninserum, 100 yl 12 5I-insulin, ca. 2 yU/ml, 100 yl insulinoppløsning, 250 yU/ml og 700 yl fosfatbuffer, 0,04M pH 7,4 med 0,15M NaCl og 0,5 % human albumin inkuberes 2 døgn ved 4°C. Det tilsettes 500 yl PEG 6000 (polyetylenglykol med middelmolekylvekt 6000), 360 g/l blandes på rotamixer, og prøven får stå i 1 time ved 20°C.

Sentrifugeres 10 minutter ved 3000 o/min., den overliggende 125

væske dekanteres fra og kastes, bunnfallet telles for I.

I hver oppsetning medtas en prøve med overskudd av marsvin-antiokseinsulin, maks. binding, og en prøve med kaninserum fra uimmuniserte kaniner, 0-prøve. Resultater utregnes som målt binding (%B) i prosent av maksimal binding.

hvor T = telletall for ukjent

TQ = " " O-prøve

TM = " " maks. binding.

De oppnådde resultater er vist i fig. 4, 5 og 6.

Som det sees av resultatene var det ikke mulig å påvise antistoffdannelse mot det ifølge oppfinnelsen fremstilte nye NPH-okseinsulin (fig. 6), mens de andre insuliner forårsaket en betydelig antistoffdannelse (fig. 4 og 5). Eftersom prøve-verdiene er bestemt med henvisning til en standard, er noen av verdiene under abscissen p.g.a. usikkerheter ved målingen.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et stabilt langtidsvirkende insulinprodukt med lav antigenisitet, ved omsetning av høyrenset insulin med en organisk base inneholdende aminogrupper, fortrinnsvis polypeptidet protamin, karakterisert ved at omsetningen utføres i en vandig bufferoppløsning inneholdende en stabilisator som under omsetningen opprettholder insulinet i oppløst og stabilisert monomer eller løst aggregert form, hvorefter det dannede insulinprodukt isoleres.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes okseinsulin.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at en insulinholdig fraksjon som er oppnådd på kjent måte ved kromatografisk rensning av insulin under anvendelse av et bufret, vandig elueringsmiddel inneholdende en stabilisator som opprettholder insulinet i oppløsning i stabilisert monomer eller løst aggregert form, omsettes med en vandig oppløsning av den organiske base inneholdende aminogrupper, hvorefter det dannede insulinprodukt utfelles og isoleres.

4. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1-3, karakterisert ved at det som stabilisator anvendes urinstoff.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at omsetningen mellom det høyrensede insulin og den organiske base inneholdende aminogrupper utføres i en vandig bufferoppløsning inneholdende oppløst urinstoff i en konsentrasjon på ca. 7 molar, hvorefter det dannede insulinprodukt utfelles ved fortynning av reaksjonsblandingen og isoleres.