CS208147B2 - Method of making the stabile low antigennous or the antigene of the plain insuline preparation of the protracted effect - Google Patents

Description

(54) Způsob výroby stabilního nízkoantigenního nebo antigenu prostého inzulínového preparátu o protrahované účinnosti

Vynález se týká způsobu výroby stabilního nízkoantigenního nebo antigenu prostého inzulínového preparátu o protrahované účinnosti, na podkladě reakce inzulínu s organickou bází obsahující aminoskupiny.

Při léčbě diabetes mellitus se používá obvykle přípravků odvozených z vepřové nebo hovězí slinivky. Přibližně 30 % světové spotřeby inzulínu je založeno na vepřovém inzulínu a přibližně 70 % na hovězím inzulínu. Byl navrhován inzulín z jiných zvířat, například ovčí inzulín, zatím však nedosáhl většího komerčního významu.

Inzulínová terapie zahrnovala dříve četné nevýhody, které se projevovaly mezi jiným alergií a lipodystrofií.

Dlouho bylo známo, Že obvyklá inzulínová terapie vyvolává u většiny pacientů tvorbu inzulínových protilátek, která může vést ke zvýšeným nárokům na inzulín, při níž mohou být vázána neznámé množství inzulínu protilátkami a pokračováním tohoto vázání se inzulín stává neúčinným jako regulátor cukru v krvi.

Dlouho bylo předpokládáno, že hlavní příčinou tvorby protilátky a následné vysoké spotřeby inzulínu je přítomnost různých nečistot v normálním komerčním inzulínu.

Jako příklady takových nečistot mohou být zmíněny inzulínový dimer, proinzulín, intermediámí inzulín (stadium mezi proinzulínem a inzulínem) argininový inzulín, ethylester inzulínu, mono-desamidoinzulín, didesamidoinzulín.

Je známo, že prvé tři z těchto sloučenin jsou vysoce antigenní. Je rovněž znémo, že čtvrtá nebo pátá nebo obě tyto sloučeniny jsou vysoce antigenní, zatímco ěestá a sedmé sloučenina a molekula inzulínu samotná jsou slabě antigenní nebo neantigenní; viz Schlichtcrull, Monocomponent Insulin and its Clinical Implications, 16. III. 1973.

Je známé odstranění zmíněných nečistot gelovou filtrací nebo/a pomocí výměny iontů, čímž je možné získat vysoce čištěný inzulín, obsahující v podstatě jedinou komponentu. V posledních letech byly prodávány inzulínová přípravky, které byly zbaveny do určitého stupně některé z uvedených nečistot a v mnoha případech docházelo u diabetiků ke snížené tvorbě protilátky.

Bylo nalezeno, že rychle účinkující přípravky jak vepřového, tak hovězího inzulínu, mohou být vyráběny v takové čistotě, že nevyvolávají nebo vyvolávají jen do určitého nízkého stupně tvorbu protilátky; viz Schlichtcrull, Monocomponent Insulin and its Clinical Implications, 16. III. 1973.

A byla zkoušena možnost vyrábět přípravky s prolongovanou účinností s podstatně redukovanou antigenitou v případě, že výroba je založena na vysoce čištěném vepřovém inzulínu, viz T. Deckert se sp., Diabetologia, sv. 10, str. 703 až 708, 1974.

Bylo však také nalezeno, že přes to, že hovězí inzulín je vyráběn v takové čistotě, že pomocí současných analytických metod musí být považován za stejně čistý jako vysoce čištěný vepřový inzulín, který může být dnes tak Čistý, že, jak je uvedeno shora, nevyvolává nebo jen do nízkého stupně, je-li ho použito v rychle účinkujících preparátech, přípravky s nízkou antigenitou a protrahováným účinkem založené na vysoce čištěném hovězím inzulínu nebyly dosud na trhu.

To je vážným nedostatkem, protože přípravkům založeným na hovězím inzulínu je dávána z mezinárodního hlediska přednost.

Tvorba protilátky v živém organismu proti chemické sloučenině jako inzulínu může být způsobena takovými chemickými rozdílnostmi v primární struktuře; viz E. R. Arquilla se sp.: Immunochemistry of insulin, Handbook of Physiology, Ch. 9, str. 160, 1972, přičemž chemická sloučenina mé strukturu, které je inkompatibilní organismu a jím odpuzovaná; E. R. Arquilla se sp.: Immunology Conformation and Biological Activity of Insulin, Diabetes, vol. 18, str. 194, 1969, nebo že chemické sloučenina mé takové celkové rozměry (agregaci), která je inkompatibilní organismu a jím odpuzovéna; E. R. Arquille a sp.: Immunochemistry of Insulin, Handbook of Physiology, Ch. 9, str. 60, 1972.

Déle je možné vyvolat tvorbu protilátky spolupodéním chemické sloučeniny a složky schopné aktivace imunitního mechanismu.

Četné testy mají sklon indikovat, že fyzikální stav molekuly inzulínu hraje důležitou úlohu při tvorbě protilátky. /Kumar se sp.: Horn. Metab. Res. 6. (1974) 185 až 177 a Piers se sp.: Neth. J. Med. 17 (1974) str. 234 až 238/.

Příčina, proč rychle účinkující vysoce čištěné inzulínové přípravky nevyvolávají tvorbu protilátky, nebo jenom do určitého stupně, spočívá v tom, že inzulíny v tě hto případech, mimo to, Že jsou vysoce čištěné, jsou přítomny v monomerní formě nebo ^Jvoří jen volné agregáty, zatímco v dříve vyráběných a prodávaných vysoce čištěných inzulínových přípravcích je inzulín patrně v agregované formě a s vlastnostmi, jejichž výsledkem je tvorba protilátky.

Tentb problém je velmi zdůrazněn s ohledem na hovězí inzulín, což je patrně způsobeno skutečností, že hovězí inzulín mé větší sklon к tvorbě agregátů než vepřový inzulín.

hovězím inzulínu bez aditiv je známo, že má širší izoelektrickou srážecí zónu nebo interval než vepřový inzulín. Je též známo, že tato široká izoelektrická zóna srážení může bý*t zúžena na totéž rozmezí jaké je známé pro vepřový inzulín přidáním některých sloučenin jako fenolu nebo m-lkresolu; brit. pát. spis č. 1 222 100.

Zmíněná širší izoelektrická srážecí zóna hovězího inzulínu je patině způsobena skutečnossí, Že hovězí inzulín tvoří agregace při hodnotách pH blízlých neutrálním.

Vynález je založen na poznatku, že je možné stabblizovat vysoce čištěný inzulín do té míry, že nevytváří během výroby nebo během skladování přípravků s protahovanou účinností nebo při užívání agregáty, které by mooiy vyvolávat tvorbu protilátky.

Tohoto cíle bylo dosaženo vynálezem, který je spoeCfický tím, že reakce se provádí s vysoce čišěnrým inzulínem ve stabiizovviné monommemí nebo uvolněné agregované formě.

Způsobem podle vynálezu se uvádí v reakci vysoce čištěný inzulín ve foraě staablizovaného monomeru nebo jako uvolněného agregátu s organickou sloučeninou obsaahjící bázické skupiny jako aninostopiny nebo substituované amino stopiny.

Výhodnou sloučeninou obsea^í^ bázické skupiny je polypeptid, například polyarginin, ssmiaosSaaií, trstaein nebo globin nebo prodat štěpení takového bázického ' polypeptidu. Jirým příkldeem vhodné bázické sloučeniny je 1,3-bis-/4-amiío-2-metih^rl-6-chinslylmoisviíl.

Podle vynálezu se reakce provádí účelně v příSoinosSi močoviny jako stabilizátoru. Příklady ostatních dalších stabbllzátoiů jsou nižší aL-kanoly, například ^e^e^t^n^c^oL a ethanol, dill·kyfčormaeidy, například dimethylfomamiá, кс^М, N-alkylacetamidy, nappíklad N-eethylacetlmid a lCiCooirril.

Tyto stabilizátory maj iissiilční nebo depolymerační účinek na proteiny a jsou tudíž účinné při stabiizzování inzulínu v eonommreí nebo volně agregované formě.

Vynálezu může být pouHto i v souuissosti s inzulínem z různých druhů zvířat jako prasat, hovězího dobytka nebo ovcí, je však významný zvláště ve spojení s hovězím inzulínee.

Výhodné provedení vynálezu je speeCfické v tom, že roztok inzulínu obsea^í^ stabilizátor se podrobí výměně iontů dudáním drátem obsáh^ícím sta^bli^i^átor, který obsahuje inzulín ve monomпсп! formě nebo uvolněné agregované formě, načež frakce inzulinu zbavená nečistot se přidává k roztoku obsáh^ícímu bázický polypeptid nebo produkt štěpení bázického polypeptidu a vysrážený inzulínový komplex se izoluje.

Tento způsob po sletuje účinnou ochranu proti agregaci tím, že vysoce čištěný inzulín se v důsledku násled^ícího nebezpečí agregace n^izoluje nejprve jako takový. Uvedený způsob je mimoto vdmi jednoduchý tím, že přípravek inzulínu s protlhOovaým účinkem se sráží přímo ve stabblní formě.

Vynález bude podrobně vysvětlen následujícími příklady.

PIíIlI 1

250 mg překrystaoovaného hovězího inzulínu bylo rozpuštěno v 5,2 Íl roztoku pufru obsaahlícihs 7 M (mooární) deionizovanou eoOivinu a 0,02 M tris(Уddroxelcthyl)imínomethanu o hodnotě pH 8,1.

Roztok byl smíchán s 5,2 ml 7 M moooviny. Hoáiota pH směsi byla upravena na 8,1. Sloupec o průměru 5 cm byl naplněn vrstvou DEAE celulózy vysoké 2,1 cm a doplněn rozookem pufru shora uvedeného složení. Roztok inzulínu byl uveden na kolonu a eluce prováděna rychlostí 75 ml za hodinu podle následujícího schématu:

2,5 hodiny pufrem shora uvedeného složení, hodiny pufrem shora uvedeného složení, ke kterému bylo přidáno 0,0045 mol chloridu sodného v litu, hodin pufrem shora uvedeného složení, ke kterému bylo přidáno 0,011 mol chloridu sodného v litru.

ELuát byl rozdělen ve frakce. Vysoce čištěné frakce byly shromážděny a stanoven obsah inzulínu. V 7 M roztoku mooooiny téhož objemu jaký maaí frakce vysoce čišěěného inzulínu byl rozpuštěn protamin v mnnožtví nezbytném pro dosažení isofenického poměru vysoce čištěného inzulínu k protaminu.

Roztok inzulínu byl přidán pomalu a po kapkách za míchání k roztoku protaminu a po případném zředění na 1 M koncennraci mooooiny se sráží komplex inzulínu v amoofní formě.

Sraženina byla izolována odstředěním a poskytovala prakticky pouze jediný pás, když 300 pg bylo podrobeno izoelektrckéému zaostřování v polyakгyaomdOovéo gelu a za poouití 2% Anmhhoinu (hodnota pH 3 až 10) v 6 M deionizované mooooině.

Této sraženiny lze pouužt k přípravě injekčních inzuinnových preparátů suspendováním v prostředí známého nosiče.

Příklad 2

Stabilioovený roztok pufru byl připraven smícháním dvou roztoků I a II v poměru upravujícím hodiotu pH na 6,0.

Roztok I obsahuje tedm0mo0lrmí deionizoveniou mooooinu a 0,13 m^oi^ir^ií natruumdihydrogerrfosfát.

Roztok II obsahuje tedmnmo0érní mooooinu a 0,13 mmoární dinatrimhydrogeenoof ét.

400 mg překrystaocvaného hovězího inzulínu bylo rozpuštěno ve 3 ml tohoto pufru a hodnota pH byla potom upravena na 6,0 malým mnoostvím roztoku II, načež byla získaná směs zfittoována.

Kolona o průměru 2,5 cm byla naplněna 27 cm vrstvou pryskyřice anmereit CG-50 typu II v ekvilibovvána rozookem pxufru výše uvedeného složení. Roztok inzulínu byl vnesen na sloupec, který byl eluovén rychlostí 40 ml roztoku ptďru výše uvedeného složení za hodinu.

Eluát byl rozdělen do frakci. Čištěné inzulínové frakce byly shromážděny a stanoven obsah inzulínu. V tndmimo0έrnío roztoku mooooiny stejného objemu jako směs čištěných frakcí byl rozpuštěn prot-amin v množní nezbytném pro získání isophenového poměru čištěného inzulínu k protaminu.

K roztoku proteminu byl za míchání přidán pomelu roztok inzulínu a po přípádném zředění na jednotnooérní konceenraci mooooiny byl vysrážen protamin-inzulínový komplex v amorfním stavu.

Sraženina byla izolována odstředěním a měla stejnou čistotu 'jako produkt popsaný v příkladu 1 .

. Sraženiny lze pouužt k přípravě injekčních inzulínových preparátů suspendováním ve známých nosičích.

Příklad 3

Postup z příkladu 1 nebo 2 byl opakován a do roztoku protaminu byl vnesen chlorid zinečnatý v konceetraci odpooíddjící 0,5 % iontů zinku, vztaženo na mnoosSví inzulínu a 0,3 % m-kresolu, vztaženo na objem směěs.

Hocdiota pH smmsi byla udržována v rozmezí 6 až 9 s tím výsledkem, že nový komplex byl vysrážen v krystalCckém stavu. *

Sraženina byla izolována odstředěním a obsahovala jediný pás, když 300 /ig, bylo podrobeno iontoforéze v pulyakrytamiUívém gelu za pouHtí 2% Ammpolinu (hodnota pH 3 až 10) v 6 M deionizovank moOolíoS.

Sraženiny lze pou!ít pro přípravu injekčních Ιο^Ι-πο^^Ο. preparátů suspedoováním ve známých nosičích.

Příklad 4

Byl opakován postup podle příkladu 1 nebo 2, avšak jako výchozího matteiálu bylo použito hovězího inzulínu čišsěnkho gelovou filtaací na Sephadexu G-50.

Připravený produkt byl stejné čistoty jako produkt popsaný v příkladu 1.

Příklad 5

Byl opakován postup podle příkladu 1 nebo 2 za po^iužií vepřového inzulínu místo hovězího inzulínu.

Odvozený komplex vepřového inzulínu s prltιmloaem byl stejně čistý jako komplex připravený v příkladu 1.

Příklad 6

Byl opakován postup podle příkladu 1 nebo 2 za poulítí vepřového inzulínu ' jako výchozí látky, připaaveného vysolením surového vodného extraktu vzniklého při výrobě íozuIíou přidáním NaCl do koncentrace 3,5 M roztoku při hodnotě pH 8,5.

Získaný solný koláč byl odsolen obvyklým způsobem před výměnou iontů. Připravený produkt byl stejné čistoty jako produkt popsaný v příkladu 1.

Pří]kaa7

Byl opakován způsob podle příkladu 6 a získaný solný koláč byl podroben gelové ^1·^ci na Sephadexu G-50.

Prodat měl stejnou čistotu jako produkt popsaný v příkladu 1.

P Píkl a d 8

Byl opakován postup podle příkladů 1 nebo 2, přičemž protamin byl nahrazen poly-L-arglnnnem (stupeň polymerace 296).

Když bylo 300 pg sraženiny podrobeno iontoforéze v pólyakrylamidovém gelu za použití 2% Ampholinu (pH - 3 až 10) v 6 M deionizováné močovině,* uvedená sraženina vykazovala v podstatě jediný pás.

Příklad 9

Byl opakován postup podle příkladů 1 nebo 2, avšak ke spojeným inzulínovým frakcím byl přidán 0,2% vodný roztok hydrochloridu bis-(4-amino-2-methyl-6-chinolyl)močoviny v množství ekvivalentním 10 % hmot, množství inzulínu přítomného v uvedených frakcích.

Takto byl po případném zředění močoviny na koncentraci 1 M 0,025 M pufrem z fosfátu sodného vysréžen inzulínový komplex, který byl ponechán po určitou dobu stát a potom byl izolován odstředěním.

Připravený produkt byl stejné čistoty jako produkt popsaný v příkladu 1.

Příklad 10

Byl opakován postup podle příkladu 9 za použití překryStalováného hovězího inzulínu, čištěného gelovou filtrací na Sephadexu G-50 jako výchozího materiálu. Připravený produkt byl stejné čistoty jako produkt popsaný v příkladu 1.

Příklad 11

Byly opakovány postupy podle příkladu 9 za použití vepřového inzulínu místo hovězího inzulínu.

Odvozený komplex vepřového inzulínu byl stejně čistý jako komplex připravený v příkladu 1 .

P ř í к Г a d 12

Byl opakován postup podle příkladu 9 za použití vepřového inzulínu jako výchozího materiálu připraveného vysolením vodného surového extraktu získaného při výrobě inzulínu přidáním NaCl za účelem získání 3,5 M roztoku při hodnotě pH 8,5. Získaný solný koláč byl odsolen obvyklým způsobem před výměnou iontů.

Připravený produkt byl stejné čistoty jako produkt popsaný v příkladu 1.

Příklad 13

Postup z příkladu 12 byl opakován a získaný solný koláč byl podroben gelové filtraci na Sephadexu G-50.

Produkt byl stejné Čistoty jako produkt popsaný v příkladu 1.

Příklad 14

Kolona o rozměrech 2,6 x 80 cm byla naplněna DEAE-Sephadexem, který byl předtím nabobtnén a ekvilibrovén v pufru z 0,15 M hydroxidu amonného v 7 M dimethylformamidu upra veném na hodnotu pH 9,0 5 N kyselinou chlorovodíkovou. ·300 mg . hovězího inzulínu Sletěného gelovou filtrací na Sephadexu G-50 bylo rozpuštěno ve 40 ml výše uvedeného pufru a uvedeno na sloupec, načež byla prováděna eluce po dobu 2 hodin výše uvedeným pufrem rychlostí 200 ml za hodinu.

Potom bylo v eluování pokračováno a při stejné ·rychlosti při lPeáimím gradientu, přičemž uvedený gradient se v/tváří z 2 700 ml výše uvedeného pufru a 2 700 ml pufru z 0,25 M hydroxidu amoorného v 7 . M dimethylformamidu, s hodnotou pH 9, upravenou kyselinou chlorovodíkovou.

-luát byl rozdělen na frakce. Vysoce čištěné frakce byly spojeny·a byl hodnocen obsah inzulínu. Hochnota pH byla upravena na 7,9 5 N kyselinou chlorovodíkovou a byl přidán m-taresol, až roztok obsahoval 0,2 % uvedeného m-tyesolu.

Když byl celkový obsah zinku roztoku nastaven na 0,5 % hmoonosti obsahu inzulínu, bylo přidáno rrloSství sířenu protaminu potřebné k získání isethanového poměru ve formě 1% vodného roztoku a směs byla pečlivě promíchána.

Po stání po dobu 15 při teplotě 20 °C bylo · přidáno 6 objemů pufru z.fosforečnanu sodného 1/75, hodnota pH = 7,3, obsí^hijícího 0,2 % m-toesolu a reakční směs byla ponechána po krátkém míchání stát při teplotě 20 °C po dobu 16 hodin.

Tímto způsobem amorfně vysrážený komplex prsnarin-iozulíou zkystaloval.

Náhradou výše uvedené kapaliny prostředím známého nosiče byla sraženina převedena v injekční inzulínový preparát.

Když bylo 300 yug sraženiny podroben? eleknřsfsřéze v . polyakrylnidovém gelu za použití 2% AmrPoSiou (pH - 3 až 10) v 6 M deionizované móoooině, uvedená sraženina vykazovala v podstatě pouze jediný pás. ’

Příklad 15

Kolona o průměru 2,6 cm a výšce 4,4 cm byla naplněna QE-Sephadexem, který byl předem nabobtnán a ekvilibrovén v pufru z 0,1 M nгSs-(hydooyme^thylarmOnomenhanu v 60 % obj. ethanolu, upraveném na hodnotu pH = 7,35 pomooí 5 N kyseliny chlorovodíkové.

250 mg hovězího inzulínu, čištěného gelovou filtrací na Sephadexu G-50 bylo rozpuštěno v 10 ml 0,1 M tris-pufn v 60% ethanolu, nastaveném na hodnotu pH = 8,5 kyselinou chlorovodíkovou a po filtraci byl roztok veden na sloupce.

Potom byl sloupec eluován ekvilibračním pufrem rychlostí 10 ml za hodinu. —luát byl rozdělen na frakce, vysoce čištěné frakce byly spojeny a byl stanoven obsah inzulínu. Potom · byl přidán m-lkesol, až · roztok obsahoval 0,2 % uvedeného m*lQřesslu, načež byl upraven celkový obsah zinku na 0,5 % hmot, obsahu inzulínu.

Potom bylo přidáno mOssví síranu protaminu potřebné k získání issphansvéhs poměru ve formě 1% roztoku a směs byla pečlivě promíchána. Po stání po dobu 15 minut . při teplotě 20 °C bylo přidáno 9 objemů pufru z fosforečnanu sodného 1/75, o hodnotě pH = · 7,3, obsahujícího 0,2 % hmot, m-kresolu a po krátkém míchání byla reakční směs ponechána stát při teplotě 20 °C po dobu 16 hodin.

Tím amorfně vysrážený komplex protamin-inzulín zkrystaloval.

Náhradou výše uvedené kapaliny prostředím známého nosiče byla sraženina převedena v injekční inzulínový preparát.

Když bylo 300 pg sraženiny podrobeno elektroforéze v polyakryammioovém gelu za použití 2% Ampholinu (pH = 3 až 10) v 6 M deionizované močovvny, uvedená sraženina vykazovala jenom jeden pás. .

Příklad 16

V cM^dicím boxu při tepLH^ 5 °C ^byla na^plněna ^kolona průměru 2,6 cm a výšk^{y 11} cm QAE-SehOαdexep A-25, který byl dříve bobtnán a ebrillboován v pafru obsahouícím 0,5 M tris-(hydroxymetOyiapmnnometOan v 8 M acetamidu upraveném na hodnotu pH = 8,0 ledovou kyselinou octovou.

300 mg hovězího inzulínu, který byl čištěn gelovou fittrací na Se^phadeexuG-50, bylo rozpuštěno ve 30 ml výše uvedeného pu*ru a uvedeno na kolonu, načež byla prováděna eluce po dobu 1 hodiny rychlostí 80 ml za hodinu.

Eluce pokračovala při stejné rychlosti íneeárníp gradientem, přičemž uvedený gradient byl připraven z 2 000 ml výše uvedeného pufru a 2 000 ml téhož pufru obsaaoUícíOč dále 0,15 M chloridu sodného.

Ю-uét byl dělen na frakce. Vysoce čiStěné frakce byly spojeny a byl stanoven obsah inzulínu. Po přidání m-kresolu až bylo dosaženo 0,2 % hmot, obsahu, byl upraven celkový obsah zinku na 0,5 % Oppo, rozookem 0,15 1 chloridu zinečnatého a potom bylo přidáno množství síranu μΊ^ΡίΝ!, nezbytné k získání isohOlnovéOo дотРги, ve foímě 1% vodného roztoku.

Směs byla pečlivě promíchána a po stání po dobu 15 minut bylo přidáno sedm objemů 1/75 M pufru z fosforečnanu sodného, hodnota pH 7,3, čbsaaojícíOo 0,2 % h^^č. m-kresolu, načež byla reakční směs odstavena po dobu dalších 16 hodin při teplotě 20 °C.

A^c^o^rfně vysréžený komplex hгčtlpin-inzulínu potom z^/stOLoval.

Náhradou výše uvedené kapaHny prostředím známého nosiče, byla sraženina převedena v injekční inzulínový preparát.

Když bylo 300 pg sraženiny podrobeno elektroforéze v holyakrylpmilvvép gelu za použití 2% . Amm^Hnu (pH = 3 až 10) v 6 M deionizované mo0olině, uvedená sraženina vykazovala jenom jediný pás.

Příklad 17

V mrazicím boxu, při teplotě 5 °C, byla naplněna kolona o průměru 2,6 cm a výšce 12 cm QAS-SehOаdexem A-25, který byl předtím bobtnán a ekviUboován v pu’ru sestávajícím z 0,05 M tгSs-(hydroypme0hylapmílOpet0lnu v 7 M aceton ttilu upraveném na hodnotu pH = 8,2 5 N.kyselinou chlorovodíkovou.

300 mg hovězího inzulínu, který byl čištěn gelovou filiací na Sephadexu G-50, bylo rozpuštěno ve 30 Pl výše uvedeného pufru, přičemž hodnota pH byla upravena na 9,3 2 N hydroxidem sodným a potom ·na 8,2 2 N kyselinou chlorovodíkovou a vedeno na sloupec, načež byla prováděna jednu hodinu elUoe výše uvedeným pufrem rychlostí 75 ml za hodinu.

Potom bylo pokračováno·v eluci, stejnou rychlostí lineárním gradientem, přičemž gradient byl vytvořen 1 800 ml výše uvedeného pxUfru a 1 800 ml téhož pufru, obsaauUícího navíc 0,15 M chloridu sodného.

Eluát byl rozdělen ve frakce. Vysoce či-štěné frakce byly spojeny a stanoven obsah inzulínu. Po přidání až bylo docíleno obsahu 0,2 % hmot,, byl celkový obsah zinku v roztoku upraven na 0,5 procenta UmotnostníUo obsahu inzulínu 0,15 M -r^ozo^l^í^m chl.oridu zineinatého a potom bylo přidáno m^nosst^íí síranu protaminu potřebného k získání ísopUinového poměru ve formě · 1% vodného roztoku.

Směs byla pečlivě promíchána a po stání po dobu 15 minut bylo přidáno 6 objemů 1/75 pxrfru z frsfoteδilnu sodného, hodnota pH = 7,3, obsaahjícího 0,2 % hmoo, ml^]ⁿes(^r.u, potom byla reakční směs ponechána stát po dobu dalších 16 hodin· při teplotě 20 °C.

Tím amorfně vysrážený komplex prrtamin-iizulíij zkrystalovala.

Náhradou výše uvedené kapaainy médiem známého nosiče byl produkt převeden v injekční iizulinr)vý preparát.

Když bylo 300 sraženiny podrobeno elektroforéze v pol^j^aki^ylmiio(^^,^(^m gelu za použití 2% Amm^nnu (pH = 3 až 10) v 6 M deionizované mooooině, uvedená sraženina vykazovala jenom jediný pás,

Příklad 18

Byl opakován příklad 16, avšak pufr obsahoval nyní 0,05 M trSs(hhidoox;mttUyl)aminomethanu v 5 M vodném N-methylacetamidu upraveném na hodnotu pH = 8,2 5 N kyselinou chlorovodíkovou a pouze 4 objemy fosfdivého pufru byly přidány k inzuinoovému roztoku při krystalizaci.

Když bylo 300/ug sraženiny podrobeno elektrolýze·v polyakryaamirovém gelu za použití 2% Amphurinu (pH = 3 až 10) v 6 M de^^z^vané mj^o^v-ně, uvedená sraženina vykazovala jenom jediný pás.

Příklad 19

Byl opakován postup podle příkladu 17, spojené vysoce čištěné iiZjlinr)oV frakcc? byly vedeny na kolonu naplněnou SepUldexem G-25, který byl bobtnán v prostředí obsahujícím 1/60 M iinltrjmπionohuddoreenorfátu v 1 M acetamidu o hodnotě pH 7,65, takže uvedený objem nepře^Si! 20 % celkového objemu kolony.

Kolona byla potom esovém výše uvedeným médiem rychlostí 20 ml za hodinu na cm a frakce rbsalující inzulín byly spojeny. Po stanovení obsahu inzulínu byl celkový obsah zinku v roztoku upraven na 0,5 procenta hmornostníhr obsahu inzulínu 0,15 M roztoku chloridu zinečnltéUo v 1 M acetamidu a pótom byla přidéna 1/4 obejmu · 1/100 M kyseeiny chlorovodíkové rbsaaující 1,5 % hmot, m-kresolu a množív! síranu protaminu, nezbytného k získání isophanového poměru.

^po stání ^po ^dobu ¹⁶ ^din ^při teplotě 20 °C sratenim komplexu protunin-inzulín zkr^ystllrolll. Produkt takto získaný byl stejné čistoty jako produkt popsaný v příkladu 17.

Náhradou výše uvedené kopalny médiem známého nosiče lze sraženiny porážt k přípravě injekčních iizulinooýCU preparátů.

Imiunologické zkoušky

S cílem ilustrovat změněné imwiogenní vlastnosti kommlexu protamin-inzulín izolovaného podle vynálezu, byly provedeny srovnávací zkoušky na králících, zvířatech používaných obvykle při studiu antigenních vlastností inzulínu a látek podobných inzulínu.

Při srovnávacích zkouškách byly použity následující preparáty:

1. Obvyklý· NPH hovězí inzulín připravený obvyklým způsobem z překrystalovaného hovězího inzulínu obsahuuícího nečistoty uvedené v přihlášce.

2. Cišténý NPH hovězí inzulín připravený obvyklým způsobem z čištěného krystaicckého hovězího inzulínu, avšak prostého nečistot uvedených v přihlášce pomocí sloupcová chromátografie.

3. Čištěný NPH hovězí inzulín připravený podle vynálezu jak je to popsáno v příkladu 3, nový NPH hovězí inzulín.

KrálkWm byly podány subkutánní injekce každého desátého dne ve formé konstantní dávky 20 I. U. inzulínováho preparátu, který měl být zkoušen.

Nebylo možné dokázat vznik néjaké esenciální protilátky po injekci obvyklého NPH hovězího inzulínu bez adjuvans a pro srovnání bylo tudíž nezbytná přijmout imiuiizační postup používaný obvykle při přípravě protilátek, tj. podávat injekčné inzulínové preparáty obsahuuící v prvé injekci emulgované Dreundovo kompllení adjuvans a v následujících injekcích emulgované Freundovo nekonal tni adjuvans. Časy injekcí jsou ukázány šipkami na připojených obr. 1, 2 a 3.

Tvorba inzulínové protilátky byla sledována v intervalu 20 dní za poožžtí způsobu popsaného Ortved-Andersenem se sp. (Acta Endoor. /Copenhagen/ 69, 195 už 2018, 1972).

Získané výsledky jsou uvedeny na obr. 1, 2 a 3, kde body ukázek vazebnou schopnost inzulínu v ^U/ml. (10~ meet^^^ních inzulínových jednotek na 1 ml.) Vysoká vazebná schopnost svédčí o vysokém protilátek.

Z výsledků je zřejmé, že bylo možno prokázat tvorbu protilátek na obvyklý NPH hovězí inzulín a sníženou tvorbu protilátek na čištěný NPH·hovězí inzulín, zatímco bylo prakticky nemožné ukázat jakoukoliv tvorbu protilátek na nový NPH hovězí inzulín připravený podle vynálezu.

Mělo by být uvedeno, že preparáty 2 a 3 byly čištěny sterým chromatografckým čišténím, přičemž jedným rozdílem je to, že preparát 2 byl připraven nejprve Izolací inzulínu a potom jeho reakcí známým způsobem s lrotaminep, zatímco preparát 3 byl připraven provedením reakce s protaminem v eluátu obsahujícím močovinu bez předchozí·izolace inzulínu.

Druhá série zkoušek byla provedena za poiuití mírnějšího imw!iizačního postupu, z néhož byla vypušténa počáteční stimulace reakce ipχmologiikého systému s FreumdoTým kommletním adjuvans, které obsahuje usmrcené bakterie, tj. injekčné podané preparáty byly ve všech případech emulgovány ve Freundové nekoppPetním adjuvans.

Králkkům byly aplikovány · každý desátý den injekce s konstantní dávkou 20 I. U. (viz šipky na obr. 4 až 6).

Tvorba inzulínové protilátky byla sled ována v intervalech 10 dnů za po^tí nové vyvinuté mmtody založené na porážtí srážení polyethylengPykoPem (PEG) iizžlín-aitinzžulioo^' vých kommpexů, s použitím radioaktivního značeného inzulínu, ¹²⁵J inzulínu, jako traceru:

PEG metoda hodnocení protilátek , ¹⁰⁰ μΐ králičtí o sér^a, I⁰⁰ μ¹ '²⁵J-inzulínu (^asi 2 ^U/ml), I⁰⁰ μ! roztoku inzulínu (250 μυ/ml) a 700 μΐ fosfátového pufru, 0,04 M, pH 7,4 a 0,15 M NaCl a 0,5 % lidského albuminu bylo inkubováoo po dobu 48 hodin při teplotě 4 °C. .

Bylo přidáno 500 μΐ PEG 6 000, 360 g/1 mixováno na mixéru a vzorek byl.ponechán stát ^po ^do^bu jedné ^ho^din^y při t-eptoté ²⁰ °C. ^po odstře^oí ^po ^dobu 10 minut při 3 00° Ho“¹ byl supernatant slit a odstraní a tylo stanoveno nooství ¹²¹J ^ve ^sraž^enině.

V každé zkouěce je zahrnut jako standard vzorek obsahhjící přebytek morěecího antihovězího inzulínu mn^ťH^lně vázaného a další vzorek s králičím sérem z neindikovaných králíků nevázaný”.

Výsledky vyjádřené jako změřená vazebnost , v procentech mtaimálně vázaného (% B) byly vypočteny následujícím způsobem:

T-T_o % B = ----T -T

M ¹ o

100, kde

T = počet imjulůů u ^КоххЗепёЬо vzoklui

Τθ = počet impulsů u átHy

Ty = počet impulsů mf-acimálně vázané látky”.

Získané výsledky jsou znázorněny na obr. 4, 5 a 6.

Z výsledků je zřejmé, Se nebylo možné dokázat nějakou význačnou tvorbu protilátek na nový NPH hovězí inzulín připravený podle vynálezu (obr. 6), zatímco u ostatních inzulínů vzrůstala význačně tvorba protilátek (obr. 4 a 5).

Protože hodnoty zkouěek jsou nastaveny na · standard, některé z hodnot se ob jeví jí pod absclsou v důsledku oepřesnooti měření.

Claims (2)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZ/

   1. Způsob výroby stabilního oízkraotigeooíhr nebo aotigeou prostého inzulínového preparátu o protrahované účinnooti reakcí inzulínu s organickou bází obsfΛující aeinostajpioy, vyznnauuící se tím, Se roztok inzulínu, s výhodou hovězího inzulínu, který je zbaven amtigernoích nečistot, ve vodném pufru o hodnotě pH 6 aS 9 a který obsahuje stabilizátor disociující nebo depollnerující protein, jako mooovinmu, Ci-C^-alkMool, zejména ethano nebo·methaool, di-ÍCj-Ci-alkyDacetamid nebo acetooOiril, udržuuící inzulín v rozpuštěné monommí nebo volně agregované formě, s výhodou mo!ovinu aS v sedmimorární konocnOraci, se uvádí do reakce s organickou bází obsahuudící aminoskupioy, s výhodou s polypeptidem, jako protaminem, poly-L-argioinem, soeetostat:Lnee nebo globinem nebo 1,3-bis-(4aeior-2-eethyl-6-chinoly!)močovinou, přičemS mooStví inzulínu a organické báze se blíSí isophaonovému pom^ru, oačeS se stabiizoovaný inzulínový preparát izoluje.
2. 2. Způsob podle bodu 1, vyznoaující se tím, Se roztok inzulínu ve vodném pufru, obsahujícím stabilizátor, s výhodou mmoovinu aS v sedmimmolmí konccnOraci, se podrobí iootoměnné cUromeatrr^aaii na mměJších aoiootů nebo katiootů, načeS se frakce obsahnuící iozulío, zbavená v podstatě nečistot, přidává k roztoku anorganické báze s aminoskupinami.