FI66751C - Foerfarande foer framstaellning av ett stabilt insulinpreparatmed laongtidsverkan - Google Patents
Foerfarande foer framstaellning av ett stabilt insulinpreparatmed laongtidsverkan Download PDFInfo
- Publication number
- FI66751C FI66751C FI760058A FI760058A FI66751C FI 66751 C FI66751 C FI 66751C FI 760058 A FI760058 A FI 760058A FI 760058 A FI760058 A FI 760058A FI 66751 C FI66751 C FI 66751C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- insulin
- reaction
- solution
- urea
- protamine
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
- C07K14/625—Extraction from natural sources
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
---'-""Ί Γβ1 KUULUTUSJULKAISU , . _ _ *f&T& utlAggningsskkipt 66751 C (45) Γηt: η ΐ 11 cyZnn jt ty 10 12 1984 Patent noddolat (51) K^ftm.CL A 61 K 37/26, C 07 C 103/52 SUO MINFIN LAND («) 760058 (21) Hilmnhptlyf—ΑΐϋΒΙοιΙριρίΗ 12.01.76 V1) (23) Altefiiyft-GIWtMatei 12.01.76 (41) TbNmHHklMM — BttvKeffaMlf 16.07.76
Patentti- ja rekisterihallitus /44¾ |« ‘ ui ΐιιΠιii,an pnw. —
Patent- och 1 efliterityralsen AmOtaw uchgd oeh mtsannew pnHtiml 31.08.84 (32)(33)(31) ί^ΠΤ4·“Τ eteeMue·—aeglrd prtortut 15.01.75 Tanska-Danmark(DK) 83/75 (71) Nordisk Insulinlaboratorium, Ved Stadion 2, DK-2820 Gentofte, Tanska-Danmark(DK) (72) Bruno Andre Hansen, Rtfdovre, Finn Hede Andresen, Hillereid, Tanska-Danmark(DK) (7*0 Berggren Oy Ab (5*0 Menetelmä stabiilin, pitkäaikaisesti vaikuttavan insuliinipreparaatin valmistamiseksi - Förfarande för framstälIning av ett stabilt insulin-preparat med längtidsverkan
Esillä oleva keksintö koskee menetelmää stabiilin, pitkäaikaisesti vaikuttavan insuliinipreparaatin valmistamiseksi, jolla on alhainen antigeenisyys, saattamalla insuliini reagoimaan aminoryhmiä sisältävän orgaanisen emäksen, sopivimmin poly-peptidin protamiinin kanssa.
Diabetes mellituksen käsittelyssä käytetään yleisesti sellaisia insuliinipreparaatteja, jotka on johdettu sian tai härän haimasta. Täten n. 30 % insuliinin maailmantuotannosta perustuu siasta saatuun insuliiniin ja suunnilleen 70 % härästä saatuun insuliiniin. On ehdotettu myös insuliinin valmistamista muista eläimistä, esim. lampaista, mutta tähän asti se ei ole saavuttanut oleellista kaupallista merkitystä.
Suoritettu insuliiniterapia on aikaisemmin aiheuttanut melkoisesti haittoja, jotka mm. ovat ilmenneet allergiana ja rasva-aineen vaihduntahäiriönä.
Pitkän aikaa on tiedetty, että useimpien potilaiden tavanomainen insuliinikäsittely on aikaansaanut insuliinin vasta-aineiden 66751 muodostumista, joka muutamissa tapauksissa on aiheuttanut lisääntyneen insuliinin tarpeen, koska tuntemattomia insuliini-määriä voi sitoutua vasta-aineisiin ja tällaisen sitoutumisen jatkuessa on insuliini tehotonta veren sokeripitoisuuden säätävänä aineena.
Pitkän aikaa on oletettu, että pääsyy vasta-aineiden muodostumiseen ja täten kasvaneeseen insuliinin kulutukseen on erilaisten epäpuhtauksien esiintyminen tavanomaisessa kaupan olevassa insuliinissa.
Esimerkkeinä tällaisista epäpuhtauksista mainittakoon insuliini-dimeeri, proinsuliini, välivaiheinsuliini (proinsuliinin ja insuliinin välivaihe), arginiini-insuliini, etyyliesteri-insuliini, mono-desamidoinsuliini ja di-desamidoinsuliini. Kolmen ensimmäisen näistä yhdisteistä tiedetään olevan erittäin antigeenisiä. On myös tunnettua, että neljäs tai viides tai molemmat näistä ovat erittäin antigeenisiä, kun taas kuudes ja seitsemäs yhdiste ja itse insuliinimolekyyli eivät ole ollenkaan tai ainoastaan hieman antigeenisiä. Vertaa: Schlichtkrull, Monocomponent Insulin and its Clinical Implications, 16.3.1973, GB-PS 1 285 023; DE-OS 1 940 130; FI-hakemus 2276/69; FI-P 52 522; CA-PS 920 946.
Näiden patenttien mukaan voidaan valmistaa pitkälle puhdistetun insuliinin kaikenlaisia sinänsä tunnettuja annostelumuotoja, kuten amorfisen sinkkiprotamiini-insuliinin ja kiteisen protamiini-insuliinin suspensioita. Lähtöaineena käytetään puhdistettua insuliinia, joka on geelisuodatettu, saostettu suolalla, erotettu linkoamalla, liuotettu uudelleen, saostettu isoelektrisesti ja kiteytetty uudelleen. Esimerkiksi sinkkiprotamiini-insuliinin valmistamiseksi liuotetaan puhdistettu insuliini uudelleen suolahappoon ja saatetaan reagoimaan sinkkikloridin ja protamiini-sulfaatin kanssa säilöntäaineen läsnäollessa. Tässä reaktiossa ei kuitenkaan käytetä missään vaiheessa karbamidia tai muita aggregoitumista ehkäiseviä yhdisteitä reaktioväliaineessa.
On tunnettua poistaa mainitut epäpuhtaudet geelisuodatuksen ja/tai ioninvaihdon avulla, jolloin on mahdollista saada erittäin puhdasta insuliinia, joka sisältää pääasiassa ainoastaan yhtä ainoata komponenttia. Niinpä onnistui jo vuonna 1960 tai aikaisemmin R. David Cole, katso "The Chromatography of Insulin 66751 in Urea-containing Buffer", J. Biol.Chem. 235 (1960), s. 2294-2299, eristämään pitkälle puhdistettuja insuliinipreparaatteja ioninvaihtokromatografiällä käyttäen karbamidipitoisia puskuriliuoksia eluointiaineina. Myös J. Arthur Mirsky ja Kazunori Kawamura, "Heterogenity of Crystalline Insulin", Endocrinology 78 (1966) s. 1115-1119, tutkivat monista eri eläinlajeista, ja myös ihmisestä, peräisin olevan insuliinin koostumusta ja eristivät pitkälle puhdistettuja insuliinitraktioita geelisuoda-tuksella ja erottamalla polyakryyliamidigeeli-elektroforeesia käyttäen (DISC PAGE).
GB-patenttijulkaisussa 881 885 on esitetty yleinen menetelmä proteiiniaineiden puhdistamiseksi kromatografisella menetelmällä, jossa eluointiaineena mieluimmin käytetään alkoholipitoista liuosta, kuten 70 % etanolia vesipuskurissa. Tätä menetelmää voidaan riippuen olosuhteista kromatografioinnissa käyttää insuliinin eristämiseen suurena saantona tai insuliinin puhdistamiseen, sillä ioninvaihtohartseina on esitetty sekä kationinvaihtohartseja että anioninvaihtohartseja.
Viime vuosina on markkinoitu insuliinipreparaatteja, joista on poistettu edellä mainitut epäpuhtaudet enemmän tai vähemmän täydellisesti ja jotka myös monessa tapauksessa ovat johtaneet vasta-aineiden muodostumisen vähenemiseen sokeritautipotilaissa.
On osoittautunut, että sekä sian että härän insuliinista voidaan valmistaa nopeasti vaikuttavia preparaatteja niin puhtaassa muodossa, että ne eivät aiheuta insuliini-vasta-aineiden muodostumista tai aiheuttavat tätä vain erittäin vähäisessä määrässä. Vertaa: Schlichtkrull, Monocomponent Insulin and its Clinical Implications, 16.3.1973. Edelleen on osoittautunut, että on mahdollista valmistaa pitkäaikaisesti vaikuttavia preparaatteja, joilla on huomattavasti alentunut antigeenisyys, kun nämä preparaatit muodostetaan käyttäen tehokkaasti puhdistettua sian insuliinia, vertaa T. Deckert et ai. Diabetologia, osa 10, s. 703-708, 1974. Sitä vastoin on osoittautunut, että vaikkakin härän insuliinia valmistetaan niin puhtaana, että nykyisiä analyyttisiä menetelmiä käytettäessä sitä on pidettävä yhtä puhtaana kuin sellaista sian insuliinia, jota voidaan nykyisin 4 66751 valmistaa, ja niin puhtaana, kuten edellä mainittiin, ettei se aiheuta vasta-aineiden muodostumista tai aiheuttaa sitä ainoastaan erittäin pienessä määrässä nopeasti vaikuttavana preparaattina käytettynä, ei kuitenkaan tähän asti ole markkinoitu sellaisia pitkäaikaisesti vaikuttavia, vähäantigeenisiä preparaatteja, jotka perustuvat tehokkaasti puhdistettuun härän insuliiniin. Tämä on huomattava haitta, koska pitkän aikaa vaikuttavat härän insuliiniin perustuvat preparaatit ovat kansainvälisesti eniten käytettyjä.
Vasta-aineiden muodostus eläinorganismissa kemiallista yhdistettä, kuten insuliinia, vastaan voi johtua tällaisista kemiallisista eroavaisuuksista primäärirakenteessa, vertaa Arquilla E.R. ym. Immunochemistry of Insulin, Handbook of Physiology, 9, s. 160, 1972, siitä että kemiallisella yhdisteellä on sellainen steerinen rakenne, joka ei sovellu organismin kanssa ja jota viime mainittu hylkii, vertaa Arquilla E.R. ym. Immunology Conformation and Biological Activity of Insulin Diabetes, vol. 18, s. 194, 1969, tai siitä, että kemiallisella yhdisteellä on sellainen koko suspensiossa (aggregaatti), että se ei sovellu yhteen organismin kanssa ja viimemainittu hylkii sitä, vertaa Arquilla, E.R. ym. Immunochemistry of Insulin, Handbook of Physiology, 9, s. 160, 1972.
Lisäksi on mahdollista aikaansaada vasta-aineiden muodostuminen antamalla yhdessä kemiallisen yhdisteen kanssa sellaista aineosaa, joka kykenee aktivoimaan immuniteettimekanismin, kuten nk. apuaineita, esimerkiksi Freundin täydellinen apuaine ja Freundin epätäydellinen apuaine.
Useat tutkimukset osoittavat, että insuliinin fysikaalisella tilalla on huomattava osuus vasta-aineiden muodostumisessa. (Kumar ym: Horm. Metab. Res. 6, (1974) 175-177, ja P.A. Priers ym: Neth J. Med. 17 (1974) s. 234-238).
Syy miksi nopeasti vaikuttavat erittäin puhtaat insuliiniprepa-raatit eivät aiheuta vasta-ainemuodostusta tai aiheuttavat sitä vain rajoitetusti, on oletettavasti, että näissä tapauksissa insuliinit ovat sen lisäksi, että ne ovat erittäin puhtaita, läsnä monomeerin muodossa tai muodostavat vain löyhiä aggre- 5 66751 gaatteja, kun taas aikaisemmin valmistetuissa ja markkinoiduissa, pitkän aikaa vaikuttavissa, erittäin puhtaissa insu-liinipreparaateissa insuliini esiintyi aggregaatin muodossa ja sillä oli sellaiset ominaisuudet, jotka aikaansaivat vasta-aineiden muodostumisen. Tämä probleema on erittäin huomattava härän insuliinista kysymyksen ollessa, joka johtuu luultavasti siitä, että härän insuliini on alttiimpaa muodostamaan aggregaatteja sian insuliiniin verrattuna.
Härän insuliinilla tiedetään olevan ilman lisäaineita laajempi isoelektrinen saostumisvyöhyke tai alue kuin sian insuliinilla. Tiedetään myös, että tämä laaja isoelektrinen saostusalue voidaan rajoittaa samaan suuruuteen kuin tunnetulla sian insuliinilla lisäämällä määrättyjä aineita, kuten fenolia tai m-kresolia, vert. tanskalainen patenttijulkaisu n:o 116 527. Mainitun laajemman härän insuliinin isoelektrisen saostusvyöhykkeen oletetaan johtuvan siitä, että härän insuliini muodostaa aggregaatteja lähellä neutraalipistettä olevissa pH-arvoissa.
Keksintö perustuu siihen havaintoon, että on mahdollista stabiloida pitkälle puhdistettu insuliini niin, ettei valmistuksen tai pitkäaikaisesti vaikuttavien preparaattien varastoimisen tai käytön aikana muodostu sellaisia aggregaatteja, jotka aiheuttavat vasta-aineiden muodostumisen. Vaikkakin on aikaisemmin valmistettu pitkälle puhdistettua insuliinia, ei ole aikaisemmin huomattu, että siitä valmistetut preparaatit muodostavat aggregaatteja tai polymeraatteja, jotka voivat aiheuttaa antigeenisyyttä. Keksinnön mukainen menetelmä on tunnettu siitä, että pitkälle puhdistetun insuliinin ja aminoryhmiä sisältävän orgaanisen emäksen reaktio suoritetaan vesipitoisessa puskuri-liuoksessa, joka sisältää stabilisaattorin, joka reaktion aikana pysyttää insuliinin liuotettuna ja stabiloidussa monomeeri-sessa tai löyhästi aggregoidussa tilassa, minkä jälkeen muodostunut insuliinipreparaatti eristetään.
Esimerkkejä sopivista orgaanisista emäksistä, joita voidaan käyttää keksinnön mukaisessa menetelmässä, ovat ne, joita tavallisesti käytetään pitkäaikaisesti vaikuttavien insulii-nituotteiden valmistamiseksi, kuten polypeptidit, esim. poly-arginiini, somatostatiini, protamiini tai sen lohkomistuotteet tai globiini. Esimerkkinä käyttökelpoisesta emäksestä, joka 6 66751 ei ole polypeptidi, on surfeeni eli 1,2-bis-(4-amino-2-metyyli- 6-kinolyyli)karbamidi. Suositeltu emäs on protamiini.
Stabilisaattoreita, jotka kykenevät pitämään insuliinin (ja muut proteiinit) stabiilissa monomeerisessa tai löyhästi agg-regoituneessa tilassa, tunnetaan hyvin kirjallisuudesta, katso esimerkiksi edellä mainittua DE-OS 1 940 130; Cole, J., Biol. Chem. 235 (1960) ja Elbaum et ai., Biochemistry, voi. 13, nr.
6, 1974, s. 1268-1278. Tällaisia proteiinia dissosioivia stabilisaattoreita on etenkin käytetty proteiinien kromatografisessa puhdistuksessa vetyionisidosten syntymisen ja proteiini-molekyylien polymeroitumisen ehkäisemiseksi. Niissä tapauksissa, joissa stabilisaattoreita on käytetty insuliinii) puhdistamisen yhteydessä, katso esimerkiksi DE-OS 1 940 130, ne on aina poistettu puhdistettua insuliinia eristettäessä ja ennenkuin tämä mahdollisesti muutetaan pitkäaikaisesti vaikuttavaksi tuotteeksi.
Keksinnön mukaan reaktio suoritetaan tarkoituksen mukaisesti karbamidin läsnäollessa stabilisaattorina. Esimerkkejä muista sopivista stabilisaattoreista ovat alemmat alkanolit, kuten metanoli ja etanoli, dialkyyliformamidi, esim. dimetyyliform-amidi, asetamidi, N-alkyyliasetamidi, kuten N-metyyliasetamidi, ja asetonitriili. Nämä stabilisaattorit vaikuttavat proteiinia dissosioivasti tai depolymeroivasti ja ne ovat tämän vuoksi tehokkaita stabiloimaan insuliinin monomeeriseen tai löyhästi aggregoituneeseen tilaan. Löyhästi aggregoituneella tilalla ymmärretään tilaa, josta insuliini voi palautua monomeeriseen tilaan, ja tasapaino siirtyy monomeerista tilaa kohti proteiinia dissosioivan tai depolymeroivan stabilisaattorin läsnäollessa .
Keksintöä voidaan käyttää monesta eri eläinlajista, kuten siasta, härästä tai lampaasta saadun insuliinin yhteydessä, mutta keksintö on erityisen merkityksellinen härän insuliinin yhteydessä.
Kaikissa tapauksissa poistetaan kaikki antigeeniset epäpuhtaudet niin pitkälle kuin on mahdollista tai haluttua, ennenkuin reaktio protamiinin kanssa suoritetaan. Tämä puhdistus voidaan suorittaa sinänsä tunnetulla tavalla, kuten geelisuodatuksella ja/tai ioninvaihtokromatografiällä. Tällä tavalla pitkälle puh- 7 66751 distettu insuliini pysyy kuten sanottu stabiloidussa monomee-risessa tai löyhästi aggregoituneessa tilassa reaktion kuluessa. Täten vältetään se polymerointi tai aggregoituminen, joka muuten saattaisi esiintyä ilman stabilisaattoria, kuten eristettäessä välillä ja liuotettaessa uudelleen pitkälle puhdistettu insuliini. Reaktion jälkeen protamiinin kanssa insuliini on kiinnitetty stabiiliin monomeeriseen tilaan eikä se voi muodostaa antigeenisiä polymeraatteja tai aggregaatteja, vaikkakin stabilisaattori poistetaan ja insuliini-protamiini-kompleksi suspen-doidaan tavanomaiseen kantajaväliaineeseen ruiskeena annettavaksi.
Keksinnön edullinen sovellutusmuoto on tunnettu siitä, että insuliinipitoinen fraktio, joka on saatu puhdistamalla insuliini kromatografisesti käyttäen puskuroitua vesipitoista elu-ointiainetta, joka sisältää stabilisaattorin, joka pysyttää insuliinin stabiloidussa monomeerisessa tai löyhästi aggregoituneessa tilassa, sekoitetaan aminoryhmiä sisältävän emäksen liuoksen kanssa, minkä jälkeen muodostunut insuliinipreparaat-ti eristetään. Täten saadaan aggregaatinmuodostus estettyä suurella varmuudella, sillä pitkälle puhdistettua insuliinia ei ensin eristetä sellaisenaan, josta aiheutuisi vaara aggregaatin-muodostuksesta. Edelleen tämä menetelmä on hyvin yksinkertainen, sillä välittömästi tehokkaaseen puhdistukseen liittyen saadaan pitkäaikaisesti vaikuttava insuliinipreparaatti stabiilissa tilassa .
Keksinnön erään toisen edullisen sovellutusmuodon mukaan suoritetaan pitkälle puhdistetun insuliinin ja aminoryhmiä sisältävän orgaanisen emäksen reaktio vesipitoisessa puskuriliuoksessa, joka sisältää liuotettua karbamidia, minkä jälkeen reaktiotuote saostetaan laimentamalla reaktioseosta. Sopiva stabilointi saadaan aikaan käyttämällä puskuria, joka on noin 7-molaarinen karbamidiin nähden.
Keksintöä kuvataan lähemmin seuraavien esimerkkien avulla.
66751 8
Esimerkki 1 250 mg uudelleenkitetytettyä härän insuliinia liuotetaan 5,2 ml:aan stabiloitua puskuriliuosta, joka sisältää 7 moolia de-ionisoitua ureaa ja 0,02 moolia tris, jonka pH-arvo on 8,1.
'Liuos sekoitetaan 5,2 ml:n kanssa 7-molaarista urealiuosta. Seoksen pH säädetään arvoon 8,1. Kolonni, jonka halkaisija on 5 cm, täytetään 2,1 cm:n paksuisella DEAE-selluloosakerrok-sella ("Whatman DE 52") ja tasapainotetaan puskuriliuoksella, jolla on edellä mainittu koostumus. Insuliiniliuos johdetaan kolonniin ja eluoidaan tässä nopeudella 75 ml tunnissa seuraa-vaa kaaviota käyttäen: 2,5 tuntia puskurilla, jolla on edellä mainittu koostumus 3 tuntia puskurilla, jolla on edellä mainittu koostumus lisättynä 0,0045 moolia natriumkloridia litraa kohden 12 tuntia puskurilla, jolla on edellä mainittu koostumus lisättynä 0,011 moolia natriumkloridia litraa kohden.
Eluaatti jaetaan fraktioihin. Perusteellisesti puhdistetut fraktiot otetaan talteen ja määrätään niiden insuliinipitoi-suus. 7-molaariseen urealiuokseen, jolla on sama tilavuus kuin perusteellisesti puhdistettujen fraktioiden seoksella, liuotetaan protamiinia määrässä, joka on välttämätön aikaansaamaan isofaanisen suhteen voimakkaasti puhdistetun insuliinin ja protamiinin välillä.
Insuliiniliuos lisätään hitaasti tipoittain protamiiniliuokseen samalla sekoittaen, jolloin mahdollisesti sen jälkeen, kun urea-väkevyys on laimennettu 1-molaariseksi, saostuu protamiini-insuliinikompleksi amorfisessa tilassa.
Sakka erotetaan sentrifugoimalla ja siinä esiintyy oleellisesti ainoastaan yksi juova kun 300 ^ug sitä käsitellään isoelektrisen fokusoinnin avulla polyakryyliamidigeelissä käyttäen 2-%:ista "Ampholine ® " (amfotääristen alifaattisten polyamino-polykarb-oksyylihappojen sarja) (pH 3-10) 6-deionisoidussa ureassa.
Tätä sakkaa voidaan käyttää ruiskeena annettavien insuliinival-misteiden valmistamiseksi Imettämällä se tunnettuihin kantaja-väliaineisiin .
9 66751
Esimerkki 2
Stabiloitu puskuriliuos valmistetaan sekoittamalla kahta liuosta I ja II sellaisessa suhteessa, että pH-arvoksi saadaan 6,0. Liuos I käsittää 7-molaarista deionisoitua karbamidia ja 0,13-molaarista mononatriumfosfaattia. Liuos II käsittää 7-molaarista deionisoitua karbamidia ja 0,13-molaarista dinatriumfosfaat-tia. 400 mg uudelleen kiteytettyä häräninsuliinia liuotetaan 3 ml:aan tätä puskuria, minkä jälkeen pH jälkisäädetään arvoon 6,0 pienellä määrällä liuosta II ja saatu seos suodatetaan.
Kolonni, jonka halkaisija on 2,5 cm, täytetään 27 cm korkea kerros "Amberlite ® “-hartsia CG-50 tyyppiä II ja tasapainotetaan puskuriliuoksella, jolla on edellä esitetty koostumus. Insuliiniliuos syötetään kolonniin ja eluoidaan nopeudella 40 ml tunnissa puskuriliuoksella, jolla on edellä esitetty koostumus.
Eluaatti jaetaan jakeisiin. Puhdistetut insuliinijakeet yhdistetään ja insuliinipitoisuus määritetään. 7-molaariseen karb-amidiliuokseen, jonka tilavuus on sama kuin puhdistettujen ja-keiden, liuotetaan protamiinia sellaisin määrin, joka tarvitaan puhdistetun insuliinin ja protamiinin isofaanisen suhteen aikaansaamiseksi.
Insuliiniliuos lisätään hämmentäen hitaasti protamiiniliuokseen, minkä jälkeen, mahdollisesti laimentamisen jälkeen karbamidin 1-molaariseen väkevyyteen, protamiini-insuliini-kompleksi saostuu amorfisessa muodossa. Sakka eristetään linkoamalla, ja sillä on sama puhtaus kuin esimerkissä 1 esitetyllä tuotteella.
Tätä sakkaa voidaan käyttää ruiskeina annettavien insuliinival-misteiden valmistamiseksi liettämällä se tunnettuihin kantaja-väliaineisiin .
Esimerkki 3
Esimerkin 1 tai 2 mukainen menetelmä toistetaan, jolloin protamiiniliuokseen lisätään sinkkikloridia, joka vastaa 0,5 % Zn-ioneja insuliinimäärään nähden ja 0,3 % m-kresolia laskettuna seoksen tilavuudesta. Tällöin saostuu protamiini-insuliini-kompleksi kiteisessä muodossa.
10 66751
Sakka eristetään linkoamalla, ja se antaa olennaisesti vain yhden nauhan, kun 300 ,ug fokusoidaan isoelektrisesti polyakryyli- (ίδ amidigeelissä käyttäen 2 % "Ampholine ^ " (pH 3-10) 6-M deioni-soidussa karbamidissa.
Tätä sakkaa voidaan käyttää ruiskeina annettavien insuliinivalmis-teiden valmistamiseksi Imettämällä se tunnettuihin kantajaväli-aineisiin.
Esimerkki 4
Esimerkin 1 mukainen menetelmä toistetaan, jolloin lähtöaineena käytetään sian insuliinia, joka on valmistettu insuliinin valmistuksessa muodostuneesta vesipitoisesta raakauutteesta lisäämällä NaCl 3,5-M väkevyyteen saakka pH-arvossa 8,5. Saadusta suolakakusta erotetaan suola tunnetulla tavalla ennen ioninvaihtoa .
Saadulla preparaatilla on sama puhtaus kuin esimerkissä 1 kuvatulla tuotteella.
Esimerkki 5
Esimerkin 4 mukainen menetelmä toistetaan ja saatu suolakakku (R) geelisuodatetaan "Sephadex ^ G-50" käyttäen.
Tuotteella on sama puhtaus kuin esimerkissä 1 kuvatulla tuotteella .
Esimerkki 6
Esimerkin 1 tai 2 mukainen menetelmä toistetaan, mutta yhdistettyihin, perusteellisesti puhdistettuihin insuliinifraktioihin lisätään bis-(4-amino-2-metyyli-kinolyyli-6-)-urea-hydrokloridin 2 %:sta vesiliuosta määrässä, joka vastaa 10 paino-% läsnä olevasta insuliinimäärästä. Tällöin saostuu mahdollisesti sen jälkeen, kun ureaväkevyys on laimennettu arvoon 1-m 0,025-m natri-umfosfaattipuskurilla, pH 7,3, insuliinikompleksi, joka seisty-ään jonkin aikaa voidaan erottaa sentrifugoimalla. Valmistetulla tuotteella on sama puhtaus kuin esimerkissä 1 kuvatulla tuotteella.
66751 Ί1
Esimerkki 7
Esimerkin 6 mukainen menetelmä toistetaan, mutta lähtöaineena käytetään uudelleenkiteytettyä häräninsuliinia, joka on puhdistettu geelisuodattama11a "Sephadex ® G-50" käyttäen. Valmistetun tuotteen puhtaus on sama kuin esimerkissä 1 kuvatun tuotteen puhtaus.
Esimerkki 8
Esimerkin 6 mukainen menetelmä toistetaan, mutta lähtöaineena käytetään sianinsuliinia, joka on valmistettu erottamalla, suo-laamalla insuliinin valmistuksessa muodostunut vesipitoinen raakauute ja lisäämällä NaCl:ää väkevyyteen 3,5-m saakka pH-arvossa 8,5. Muodostuneesta suolakakusta erotetaan suola tunnetulla tavalla ennen ioninvaihtoa. Saadun tuotteen puhtaus on sama kuin esimerkissä 1 kuvatun tuotteen puhtaus.
Esimerkki 9
Esimerkin 8 mukainen menetelmä toistetaan ja saatu suolakakku suodatetaan geelin avulla "Sephadex ® G-50" käyttäen.
Tuotteella on sama puhtaus kuin esimerkissä 1 kuvatulla tuotteella .
Keksinnön mukaisesti valmistetun protamiini-insuliini-kompleksin muuttuneiden immunogeenisten ominaisuuksien osoittamiseksi on suoritettu vertailevia kokeita kaneilla, joita eläimiä tavallisesti käytetään tutkittaessa insuliinin ja insuliinin tapaisten komponenttien antigeenisiä ominaisuuksia.
Vertailevissa kokeissa käytettiin seuraavia valmisteita: 1. Tavanomainen NPH-häräninsuliini, joka on valmistettu uudelleen kiteytetystä häräninsuliinista, joka sisältää edellä esitettyjä epäpuhtauksia.
2. Puhdistettu NPH-häräninsuliini, joka on valmistettu uudelleen kiteytetystä häräninsuliinista, mutta josta edellä esitetyt epäpuhtaudet on poistettu kolonnikromatografiällä.
3. Uusi NPH-häräninsuliini, joka on valmistettu keksinnön mukaisesti esimerkissä 3 esitetyllä tavalla.
12 66751 NPH-insuliini on protamiini-insuliinista tavallisesti käytetty termi, joka tarkoittaa "neutraalia protamiini-Hagedorn-insu-liinia".
"Tavallinen NPH-insuliini" valmistettiin aseptisesti. 150 mg (4000 KY) uudelleen kitetyttyä häräninsuliinia liuotettiin 40 ml:aan vettä lisäämällä 2 ml 0,1N suolahappoa, ja jatkuvasti hämmentäen lisättiin 75 mg m-kresolia, 30 mg fenolia, 800 mg glyseriiniä, 143 ,ug protamiinisulfaattia sekä 41 ,ug sink- 2 + kikloridiliuosta, jossa oli 10 mq Zn /ml.
Liuoksen tilavuus säädettiin 50,0 mlzksi, minkä jälkeen se steriloitiin suodattamalla ja merkittiin "liuos I".
Sitten valmistettiin liuos, jossa oli 75 mg m-kresolia, 30 mg fenolia, 800 mg glyseriiniä ja 184 mg Na^PO^.t^O 45 mlzssa vettä. pH säädettiin arvoon 7,7 1N natriumhydroksidilla, minkä jälkeen liuoksen tilavuus säädettiin 50,0 mlzksi. Liuos steriloitiin suodattamalla ja merkittiin "liuos II".
Liuos II lisättiin hämmentäen liuokseen I. Seos sai seistä 48 tuntia täydellistä kiteytymistä varten.
Saatu suspensio, joka sisälsi "tavallista NPH-insuliinia", käytettiin immunisointiin jäljempänä esitetyllä tavalla (kuvat 1 ja 4).
"Puhdistettu NPH-insuliini" valmistettiin aseptisesti. Edellä esitetty menettely toistettiin käyttämällä kromatografisesti puhdistettua insuliinia, joka oli kiteytetty sinkillä, sekä 35 ^ul sinkkikloridiliuosta (10 mg Zn^+/ml).
Saatu suspensio merkittiin "puhdistettu NPH-insuliini" ja sitä käytettiin immunisointiin jäljenpänä esitetyllä tavalla (kuvat 2 ja 5).
"Uusi NPH-insuliini" valmistettiin aseptisesti 4°Czssa. 550 mlzaan uudelleen kiteytetyn häräninsuliinin ioninvaihtokromato-grafiasta saatua eluaattia, joka sisälsi 395 mg insuliinia, lisättiin hämmentäen 900 mg m-kresolia, 330 mg fenolia ja 281 ^,ul 13 66751 sinkkikloridiliuosta, joka sisälsi 9,9 mg Zn2+/ml. Liuos steriloitiin suodattamalla ja merkittiin A.
37,62 mg protamiinisulfaattia liuotettiin 50 mliaan 7M deioni-soitua karbamidia ja saatu liuos steriloitiin suodattamalla ja merkittiin B.
Liuos B lisättiin hämmentäen liuokseen A ja saatu liuos sai seistä tunnin samalla hämmentäen.
Seosta laimennettiin jatkuvasti hämmentäen 3,6 litralla tislattua vettä, johon oli lisätty 5,4 g m-kresolia, ja 2,16 g fenolia, kunnes sen karbamidikonsentraatio oli 1-molaarinen, ja steriloitiin suodattamalla. Laimentaminen suoritettiin 5 tunnin kuluessa, ja seos sai seistä 24 tuntia täydellistä kiteytymistä varten.
Saatu suspensio väkevöitiin noin 300 ml:n tilavuuteen suodattamalla membraanisuodattimen läpi, jonka huokosläpimitta oli 3 ^um. NPH-kiteet erotettiin linkoamalla 200 G:llä ja suspen-doitiin välittömästi uudelleen märkinä kiteinä 300 ml:aan steriiliä standardi-NPH-väliainetta, joka käsittää 0,15 % m-kresolia, 0,06 % fenolia ja 1,6 % glyseriiniä 0,0133-molaari-sessa natriumfosfaattipuskurissa, jonka pH on 7,3. Uudelleen suspendoidut NPH-kiteet jätettiin seisomaan tunniksi.
Menetelmä toistettiin kuusi kertaa, minkä jälkeen suspension tilavuus säädettiin niin, että se sisälsi 1,5 mg insuliinia vastaten 40 KY/ml.
Suspension insuliinikonsentraatio määritettiin näytteillä, joista kiteet erotettiin linkoamalla ja vapautettiin fenolista ja m-kresolista pesemällä 70 % etanolilla. Pestyt kiteet liuotettiin sitten 1M etikkahapon tunnettuun tilavuuteen, minkä jälkeen insuliinikonsentraatio määritettiin fotometrisesti mittaamalla ekstinktio 276 nm:ssä.
Kokonaissaanto oli 110 ml suspensiota, joka merkittiin "uusi NPH-insuliini" ja käytettiin immunisointiin jäljempänä esitetyllä tavalla (kuvat 3 ja 6).
14 66751
Vertailevat kokeet suoritettiin ruiskuttamalla kaneihin ihonalaisesti joka kymmenes päivä 20 KY:n vakioannoksina tutkittavaa insuliinivalmistetta. Koska ei ollut mahdollista osoittaa mitään olennaista vasta-aineen muodostusta tavanomaisen NPH-häräninsuliinin ruiskeen jälkeen ilman apuainetta, oli vertailun vuoksi pakko käyttää immunisoimismenetelmää, jota tavallisesti käytetään vasta-aineita valmistettaessa, eli ruiskuttaa insuliinivalmisteita ensimmäisen kerran emulgoi-tuina Freundin täydelliseen apuaineeseen ja seuraavina kertoina emulgoituina Freundin epätäydelliseen apuaineeseen.
Insuliinivasta-aineen muodostusta tutkittiin 20:n päivän välein käyttäen Ortved Andersen et ai.:in kehittämää menetelmää (Acta Endocr. (Kbh.) 69, 195-208, 1972).
Saadut tulokset on esitetty kuvissa 1, 2 ja 3.
Kuten tuloksista ilmenee, oli mahdollista osoittaa vasta-aineen-muodostusta tavanomaisella NPH-häräninsuliinilla ja vähentynyttä vasta-aineen muodostusta puhdistetulla NPH-häräninsuliinilla, kun taas ei ollut käytännöllisesti katsoen mahdollista osoittaa minkäänlaista vasta-aineen muodostusta keksinnön mukaisesti valmistetulla uudella NPH-häräninsuliinilla. Huomattakoon, että valmisteet 2 ja 3 puhdistettiin samaa kromatografista puhdistusta käyttäen, ja ainoa ero oli, että valmiste 2 valmistettiin eristämällä ensin insuliini ja saattamalla se tämän jälkeen reagoimaan protamiinin kanssa tunnetulla tavalla, kun sitä vastoin valmiste 3 valmistettiin suorittamalla reaktio karbamidipitoisessa eluaatissa ilman edeltävää insuliinin eristämistä.
Lisäksi on suoritettu sarja kokeita käyttäen lievempää immu-noimismenetelmää, jossa immuunivalmisteen alustava stimulaatio tapetuilla bakteereilla on jätetty pois, eli valmisteita on joka kerta ruiskutettu emulgoituina Freundin epätäydelliseen apuaineeseen. Kaneihin ruiskutettiin joka 10. päivä 20 KY:n vakio-annos .
Insuliinivasta-aineen muodostusta tutkittiin 10 päivän välein käyttäen jäljempänä esitettyä uutta menetelmää.
15 66751 PEG-menetelmä vasta-aineen määrittämiseksi 1 25 100 yUl kaninseerumia, 100 ^ul I-insuliinia, noin 2 ^uY/ml, 100 ^ul insuliiniliuosta, 250 ^uY/ml ja 700 ^ul fosfaatti-puskuria, 0,04-M, pH 7,4 sekä 0,15-M NaCl ja 0,5 % ihmisal-bumiinia inkuboidaan 2 vuorokautta 4°C:ssa. Lisätään 500 ^ul PEG 6000, 360 g/1 sekoitetaan pyörivässä sekoittimessa, ja näytteiden annetaan seistä tunnin 20°C:ssa.
Lingotaan 10 minuuttia 3000 k/min, supernatantti dekantoidaan 1 25 ja heitetään pois, sakassa lasketaan I.
Jokaiseen erään otetaan mukaan näyte, jossa on ylimäärin marsun-anti-insuliinia, maks. sidonta, ja näyte kaninseerumia immunoi-mattomista kaneista, O-näyte. Tulokset lasketaan seuraavasti:
T - T
%B = -- · 100 T - T M o jossa T = tuntemattoman laskumäärä
Tq = O-näytteen " T,. = maks. sidonnan "
M
Saadut tulokset on esitetty kuvissa 4, 5 ja 6.
Kuten tuloksista näkyy, keksinnön mukaan valmistetulla uudella NPH-häräninsuliinilla (kuva 6) ei ollut mahdollista osoittaa vasta-aineen syntymistä, kun sen sijaan muut insuliinit aiheuttivat huomattavaa vasta-aineen syntymistä (kuvat 4 ja 5).
Koska koetulokset on määritetty standardiin nähden, muutamat arvot ovat abskissan alapuolella johtuen mittauksen epävarmuudesta.
Claims (5)
1. Menetelmä stabiilin pitkäaikaisesti vaikuttavan insuliini-preparaatin valmistamiseksi, jolla on alhainen antigeenisyys, saattamalla pitkälle puhdistettu insuliini reagoimaan orgaanisen aminoryhmiä sisältävän emäksen kanssa, sopivimmin poly-peptidin protamiinin kanssa, tunnettu siitä, että reaktio suoritetaan vesipitoisessa puskuriliuoksessa, joka sisältää stabilisaattorin, joka reaktion aikana pysyttää insuliinin liuotettuna ja stabiloidussa monomeerisessa tai löyhästi agg-regoitunessa tilassa, minkä jälkeen muodostunut insuliinipre-paraatti eristetään.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että käytetty insuliini on härän insuliini.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että insuliinipitoinen fraktio, joka on saatu puhdistamalla insuliini kromatografisesti käyttäen puskuroitua vesipitoista eluointiainetta, joka sisältää stabilisaattorin, joka pysyttää insuliinin liuotettuna stabiloidussa monomeerisessa tai löyhästi aggregoituneessa tilassa, sekoitetaan aminoryhmiä sisältävän orgaanisen emäksen vesiliuoksen kanssa, minkä jälkeen muodostunut insuliinipreparaatti eristetään.
4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että stabilisaattori on karbamidi.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pitkälle puhdistetun insuliinin ja aminoryhmiä sisältävän orgaanisen emäksen reaktio suoritetaan vesipitoisessa puskuriliuoksessa, joka sisältää liuotettua karbamidia, jonka väkevyys on noin 7-molaarinen, minkä jälkeen reaktiotuote saos-tetaan laimentamalla reaktioseosta.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK8375AA DK140801B (da) | 1975-01-15 | 1975-01-15 | Fremgangsmåde til fremstilling af et stabilt langtidsvirkende insulinpræparat. |
| DK8375 | 1975-01-15 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI760058A FI760058A (fi) | 1976-07-16 |
| FI66751B FI66751B (fi) | 1984-08-31 |
| FI66751C true FI66751C (fi) | 1984-12-10 |
Family
ID=8089535
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI760058A FI66751C (fi) | 1975-01-15 | 1976-01-12 | Foerfarande foer framstaellning av ett stabilt insulinpreparatmed laongtidsverkan |
Country Status (36)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5946939B2 (fi) |
| AR (1) | AR213088A1 (fi) |
| AT (1) | AT362492B (fi) |
| BE (1) | BE837600A (fi) |
| BR (1) | BR7600206A (fi) |
| CA (1) | CA1094549A (fi) |
| CH (1) | CH631625A5 (fi) |
| CS (1) | CS208147B2 (fi) |
| DD (1) | DD124379A5 (fi) |
| DE (1) | DE2600971C2 (fi) |
| DK (1) | DK140801B (fi) |
| EG (1) | EG11988A (fi) |
| ES (1) | ES444558A1 (fi) |
| FI (1) | FI66751C (fi) |
| FR (1) | FR2297634A1 (fi) |
| GB (1) | GB1524431A (fi) |
| GR (1) | GR58608B (fi) |
| HU (1) | HU175142B (fi) |
| IE (1) | IE42395B1 (fi) |
| IL (1) | IL48845A (fi) |
| IN (1) | IN143279B (fi) |
| IT (1) | IT1054211B (fi) |
| KE (1) | KE2919A (fi) |
| LU (1) | LU74175A1 (fi) |
| MX (1) | MX4052E (fi) |
| MY (1) | MY7900169A (fi) |
| NL (1) | NL166464C (fi) |
| NO (1) | NO146698C (fi) |
| NZ (1) | NZ179733A (fi) |
| OA (1) | OA05209A (fi) |
| PL (1) | PL99927B1 (fi) |
| PT (1) | PT64696B (fi) |
| RO (1) | RO71576A (fi) |
| SE (1) | SE437219B (fi) |
| YU (1) | YU8376A (fi) |
| ZA (1) | ZA7658B (fi) |
Families Citing this family (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK374579A (da) * | 1979-09-07 | 1981-03-08 | Nordisk Insulinlab | Fremgangsmaade til fremstilling af et injucerbart insulinpraeparat |
| US4459226A (en) * | 1982-02-26 | 1984-07-10 | Eli Lilly And Company | Process for recovering insulin |
| US4801575A (en) * | 1986-07-30 | 1989-01-31 | The Regents Of The University Of California | Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier |
| AU609769B2 (en) * | 1987-02-10 | 1991-05-09 | Drug Delivery Systems Inc. | Electrolytic transdermal delivery of proteins |
| US4878892A (en) * | 1987-02-10 | 1989-11-07 | Drug Delivery Systems Inc. | Electrolytic transdermal delivery of polypeptides |
| US6221367B1 (en) | 1992-06-15 | 2001-04-24 | Emisphere Technologies, Inc. | Active agent transport systems |
| US5714167A (en) | 1992-06-15 | 1998-02-03 | Emisphere Technologies, Inc. | Active agent transport systems |
| US5447728A (en) | 1992-06-15 | 1995-09-05 | Emisphere Technologies, Inc. | Desferrioxamine oral delivery system |
| US5629020A (en) * | 1994-04-22 | 1997-05-13 | Emisphere Technologies, Inc. | Modified amino acids for drug delivery |
| US5643957A (en) | 1993-04-22 | 1997-07-01 | Emisphere Technologies, Inc. | Compounds and compositions for delivering active agents |
| US5750147A (en) | 1995-06-07 | 1998-05-12 | Emisphere Technologies, Inc. | Method of solubilizing and encapsulating itraconazole |
| US6051258A (en) | 1995-06-07 | 2000-04-18 | Emisphere Technologies, Inc. | Proteinoid emulsions and methods for preparation and use thereof |
| EP2077132A1 (en) | 2008-01-02 | 2009-07-08 | Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG | Dispensing device, storage device and method for dispensing a formulation |
| EP2662472B1 (de) | 2009-03-31 | 2019-02-27 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Verfahren zur Beschichtung einer Oberfläche eines Bauteils |
| US9265910B2 (en) | 2009-05-18 | 2016-02-23 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Adapter, inhalation device, and nebulizer |
| UA107097C2 (en) | 2009-11-25 | 2014-11-25 | Бьорінгер Інгельхайм Інтернаціональ Гмбх | Dispenser |
| WO2011064163A1 (en) | 2009-11-25 | 2011-06-03 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Nebulizer |
| US10016568B2 (en) | 2009-11-25 | 2018-07-10 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Nebulizer |
| JP5874724B2 (ja) | 2010-06-24 | 2016-03-02 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | ネブライザ |
| EP2694220B1 (de) | 2011-04-01 | 2020-05-06 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Medizinisches gerät mit behälter |
| US9827384B2 (en) | 2011-05-23 | 2017-11-28 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Nebulizer |
| WO2013152894A1 (de) | 2012-04-13 | 2013-10-17 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Zerstäuber mit kodiermitteln |
| JP6643231B2 (ja) | 2013-08-09 | 2020-02-12 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | ネブライザ |
| EP2835146B1 (en) | 2013-08-09 | 2020-09-30 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Nebulizer |
| HUE055604T2 (hu) | 2014-05-07 | 2021-12-28 | Boehringer Ingelheim Int | Porlasztó |
| DK3139983T3 (da) | 2014-05-07 | 2023-09-11 | Boehringer Ingelheim Int | Beholder og indikatoranordning, samt forstøver |
| JP6580070B2 (ja) | 2014-05-07 | 2019-09-25 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 容器、ネブライザ、及び使用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1285023A (en) * | 1968-08-09 | 1972-08-09 | Novo Terapeutisk Labor As | Improvements in or relating to injectable insulin preparations |
| US3758683A (en) * | 1971-04-30 | 1973-09-11 | R Jackson | Insulin product |
-
1975
- 1975-01-15 DK DK8375AA patent/DK140801B/da not_active IP Right Cessation
-
1976
- 1976-01-06 ZA ZA00760058A patent/ZA7658B/xx unknown
- 1976-01-07 IN IN41/CAL/76A patent/IN143279B/en unknown
- 1976-01-07 GR GR49734A patent/GR58608B/el unknown
- 1976-01-12 NZ NZ179733A patent/NZ179733A/xx unknown
- 1976-01-12 CA CA243,587A patent/CA1094549A/en not_active Expired
- 1976-01-12 FI FI760058A patent/FI66751C/fi not_active IP Right Cessation
- 1976-01-13 LU LU74175A patent/LU74175A1/xx unknown
- 1976-01-13 IE IE62/76A patent/IE42395B1/en unknown
- 1976-01-13 SE SE7600284A patent/SE437219B/xx not_active IP Right Cessation
- 1976-01-13 DE DE2600971A patent/DE2600971C2/de not_active Expired
- 1976-01-13 IT IT19221/76A patent/IT1054211B/it active
- 1976-01-14 YU YU00083/76A patent/YU8376A/xx unknown
- 1976-01-14 OA OA55703A patent/OA05209A/xx unknown
- 1976-01-14 NL NL7600338.A patent/NL166464C/xx not_active IP Right Cessation
- 1976-01-14 NO NO760118A patent/NO146698C/no unknown
- 1976-01-14 GB GB1309/76A patent/GB1524431A/en not_active Expired
- 1976-01-14 PL PL1976186526A patent/PL99927B1/pl unknown
- 1976-01-14 MX MX764822U patent/MX4052E/es unknown
- 1976-01-14 AT AT21376A patent/AT362492B/de not_active IP Right Cessation
- 1976-01-14 FR FR7600854A patent/FR2297634A1/fr active Granted
- 1976-01-14 BR BR7600206A patent/BR7600206A/pt unknown
- 1976-01-14 DD DD190805A patent/DD124379A5/xx unknown
- 1976-01-14 PT PT64696A patent/PT64696B/pt unknown
- 1976-01-14 RO RO7684491A patent/RO71576A/ro unknown
- 1976-01-15 CS CS76270A patent/CS208147B2/cs unknown
- 1976-01-15 IL IL48845A patent/IL48845A/xx unknown
- 1976-01-15 HU HU76NO198A patent/HU175142B/hu unknown
- 1976-01-15 BE BE163542A patent/BE837600A/xx not_active IP Right Cessation
- 1976-01-15 CH CH47076A patent/CH631625A5/de not_active IP Right Cessation
- 1976-01-15 ES ES444558A patent/ES444558A1/es not_active Expired
- 1976-01-16 JP JP51003293A patent/JPS5946939B2/ja not_active Expired
- 1976-01-17 EG EG16/76A patent/EG11988A/xx active
-
1978
- 1978-01-14 AR AR261924A patent/AR213088A1/es active
-
1979
- 1979-02-07 KE KE2919A patent/KE2919A/xx unknown
- 1979-12-30 MY MY169/79A patent/MY7900169A/xx unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI66751C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av ett stabilt insulinpreparatmed laongtidsverkan | |
| US4183849A (en) | Therapeutic insulin preparation and a process for the production of a stable insulin preparation with protracted effect | |
| Brange | Galenics of insulin: the physico-chemical and pharmaceutical aspects of insulin and insulin preparations | |
| Bromer et al. | Preparation and properties of fluoresceinthiocarbamyl insulins | |
| US5631347A (en) | Reducing gelation of a fatty acid-acylated protein | |
| EP0194864B1 (en) | Novel peptides | |
| Erlanson et al. | Purification and characterization of two proteins with co-lipase activity from porcine pancreas | |
| CA1172978A (en) | .alpha.-AMYLASE INACTIVATOR, A PROCESS FOR ITS PREPARATION, AN AGENT BASED ON THIS INACTIVATOR AND ITS USE | |
| FI77876B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av humaninsulin eller en treoninb30-ester av humaninsulin eller ett salt eller komplex daerav. | |
| EP0216833B1 (en) | Novel insulin derivatives and pharmaceutical preparations containing these derivatives | |
| KR20020073184A (ko) | 글루카곤 유사 펩티드 1 화합물을 용해시키는 방법 | |
| US3907676A (en) | Process for purifying insulin | |
| IE50892B1 (en) | Process for preparing insulin esters | |
| Svendsen et al. | Isolation and characterization of the folate-binding protein from cow's milk | |
| Edmundson et al. | Isolation and characterization of concanavalin A polypeptide chains | |
| Hjorth et al. | Purification and identification of high molecular weight products formed during storage of neutral formulation of human insulin | |
| EP0032655B2 (en) | A process in purification and concentration of the factor viii-complex | |
| Free et al. | Separation and properties of multiple components of bovine growth hormone | |
| CA1113412A (en) | Proteinic active substances | |
| JP3470135B2 (ja) | 成長ホルモンの結晶体を製造する方法およびそれにより得られる結晶体 | |
| JP2566919B2 (ja) | α−インタ−フエロンの製造方法 | |
| EP0146842B1 (en) | Novel calcitonin and collection thereof | |
| Covelli et al. | Carboxymethylation of the histidyl residues of insulin | |
| FI73130B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av renat insulin laempat foer beredning av foer kliniskt bruk anvaendbara injicerbara insulinberedningar. | |
| US3989821A (en) | Polypeptides |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed |
Owner name: NORDISK INSULINLABORATORIUM |