DE2600971A1 - Therapeutisches insulinpraeparat sowie verfahren zur herstellung eines stabilen insulinpraeparats mit dauerwirkung. - Google Patents

Therapeutisches insulinpraeparat sowie verfahren zur herstellung eines stabilen insulinpraeparats mit dauerwirkung.

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Description

GS/Ha/an
Patentanwalts
Or-Ing. SAönwold-Dr.-lng. Ih. Meyer- Or.-lng. BshoW
D,. FuBS-DipUhem./^vV1HTiKbIr
DipL-Cbem. Carola Keller-Dipl. !ng. Selttng
5 Köln 1. Deichmannhaui
12. Januar I976
Nordisk Insulinlaboratorium,
Ved Stadion 2, DK-2820 Gentofte (Dänemark)
Therapeutisches Insulinpräparat sowie Verfahren zur Herstellung eines stabilen Insulinpräparats mit Dauerwirkung
Die Erfindung betrifft ein therapeutisches Insulinpräparat sowie ein Verfahren zur Herstellung eines stabilen Insulinpräparats mit Dauerwirkung und niedriger Antigenizität beim Umsatz von Insulin mit einer basische Gruppen enthaltenden organischen Verbindung.
Zur Behandlung von Diabetes Mellitus benutzt man normalerweise aus Schweine- oder Ochsenpankreas gewonnene Insulinpräparate. Der globale Verbrauch an Insulin setzt sich wie folgt zusammen: etwa 3Ο?ό Schweineinsulin und etwa 70% Ochseninsulin. Man hat auch bereits vorgeschlagen, von anderen Tieren, beispielsweise Schafen, Insulin "· zu gewinnen, das jedoch bisher keine grosse kommerzielle Bedeutung erlangt hat.
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Die bisher erfolgte Insulintherapie ist mit verschiedenen Mängeln behaftet, Unter diesen Folgeerscheinungen sind zu nennen Allergie und Lipodystrophie.
Es ist schon lange bekannt, dass die übliche Insulinbehandlung bei den meisten Patienten zur Bildung von Insulin-Antikörpern führt, was in einzelnen Fällen einen erhöhten Insulinbedarf nach sich zieht, indem nicht bekannte Insulinmengen an die Antikörper gebunden werden können und dadurch für die Dauer dieser Bindung -zur Regelung des Blutzuckers unwirksam sind.
Man hat seit längerem die Auffassung vertreten, dass die Antikörperbildung und damit der grosse Insulinbedarf primär durch verschiedene Verunreinigungen in normalem HändeIsinsulin verursacht werden.
Als Beispiele solcher Verunreinigungen sind zu nennen dimeres Insulin, Proinsulin, intermidiäres Insulin (das Stadium zwischen Proinsulin und Insulin), Arginin-Insulin, Äthylester-Insulin, Mono-Desamido-Insulin und Di-Desamido-Insulin. JDs ist bekannt, dass die erstgenannten drei Stoffe stark antigen sind, und dass auch die an vierter Stelle und/oder die an fünfter Stelle genannte Verunreinigung eine starke antigene Wirkung aufweisen, während die sechste und siebte Verbindung sowie das Insulinmolekül selbst nicht oder zumindest nur im geringen Ausmass antigen sind, vgl.: Schlichtcrull, Monocomponent Insulin and its Clinical Implications, 16. März 1973·
Es ist bekannt, die vorerwähnten Verunreinigungen durch Gelfiltration und/oder Ionenaustausch zu entfernen, wodurch man weitgehend gereinigtes Insulin erhält, das Im wesentlichen nur eine Komponente enthält. In den letzten Jahren sind von einigen oder mehreren der vorerwähnten Verunreinigungen befreite Insulinpräparate auf den Markt gebracht worden, die in vielen Fällen bei Diabetikern auch zu einer verminderten Antikörperbildung geführt haben.
Es hat sich herausgestellt, dass schnellwirkende Präparate aus Schweineinsulin und Ochseninsulin in so reinem Zustand herstellbar sind, dass sie keine oder zumindest eine sehr geringfügige Antikörperbildung verursachen, vgl. Schlichtcrull, Monocomponent Insulin and its Clinical Implications, 16. März 1973· Es bat sich des weiteren gezeigt, dass es möglich ist, Präparate mit Dauerwirkung und mit wesentlich reduzierter Antigenizität herzustellen, wenn· diese Präparate
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auf der Basis von weitgehend gereinigtem Schweineinsulin hergestellt werden, vgl. T. Deckert et al. Diabetologia, Band 10, S. 703-8, 1974. Es steht jedoch ebenfalls fest, dass zwar so reines Ochseninsulin herstellbar ist, welches nach den heutigen Analysenmethoden als eben so rein bezeichnet v/erden muss wie heute herstellbares hochgereinigtes Schweineinsulin, und dass dieses Ochseninsulin in schnellwirkenden Präparaten wie bereits erwähnt keine oder nur eine geringfügige Antikörperbildung verursacht, dass andererseits aber auf dem Markt bisher noch keine niedrig antigenen Präparate mit Dauerwirkung auf der Basis von hochgereinigtem Ochseninsulin verfügbar sind. Dies ist ein erheblicher Mangel, da Präparate mit Dauerwirkung auf der Basis von Ochseninsulin international die gebräuchlichsten sind.
Die Bildung von Antikörpern gegen eine chemische Verbindung, beispielsweise Insulin, im lebenden Organismus ist auf solche chemischen primären Strukturunterschiede zurückführbar, vgl. Arquilla E.R. et al: Immunochemistry of Insulin, Handbook of Physiology, Kap. 9, S. 160, 1972, dass die chemische Verbindung einen solchen sterischen Aufbau hat, dass sie auf den Organismus als fremd und unerwünscht wirkt, siehe Arquilla, E.R. et al: Immunology Conformation and Biological Activity of Insulin, Diabetes, Band 18, S. 194, 1969, oder dass die chemische Verbindung eine solche Totalgrösse (aggregation) aufweist, dass ihre Wirkung für den Organismus fremd und unerwünscht ist, siehe Arquilla, E.R. et al: Immunochemistry of Insulin, Handbook of Physiology, Kap. 9, S. I60, 1972.
Eine Antikörperbildung wird auch dadurch hervorgerufen, dass zusammen mit der chemischen Verbindung eine den Immunapparat aktivierende Komponente verabreicht wird.
Mehrere Untersuchungen deuten darauf hin, dass die physikalische Zustandsform von Insulin bei der Bildung von Antikörpern eine wesentliche Rolle spielt. (Kumar et al: Horn. Metab. Res. 6, (1974) 175-177, und P.A. Piers et al: Neth J. Med. 17 (1974) c. 234-238.
Der Umstand, dass die schnellwirkendenden hochreinen Insulinpräparate keine oder zumindest nur eine unwesentliche Bildung von Antikörpern verursachen, ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass die Insuline in diesen Fällen nicht nur sehr rein sind sondern auch in monomerer Form vorliegen oder eventuell nur lose Aggregationen : bilden, während man bei den bisher hergestellten, auf dem Markt
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verfügbaren hochreinen Irisulinpräparaten mit Dauerwirkung erreicht, dass, das Insulin in einer aggregierten Form auftritt und die Bildung von Antikörpern bedingende Eigenschaften aufweist. Dieses Problem ist bei Ochseninsulin besonders ausgesprochen, was vermutlich darauf zurückzuführen ist, dass Ochseninsulin mehr zur Bildung von Aggregaten neigt als Schweineinsulin.
Ochseninsulin ohne Zusatzstoffe weist bekanntlich eine breitere isoelektrische Ausfällzone auf als Schweineinsulin. Es ist ebenfalls bekannt, dass diese breite isoelektrische Fällungszone durch Zusatz gewisser Stoffe, beispielsweise von Phenol oder m~Cresol auf den Breitenwert der Fällungszone für Schweineinsulin verengert werden kann, vgl. die dänische Patentschrift Nr. 116.527· Es ist anzunehmen, dass diese breitere isoelektrische Fällungszone des Ochseninsulins dem Umstand zuzuschreiben ist, das"s Ochseninsulin bei pH-Werten in der Nähe des Neutralpunktes aggregiert.
Die Erfindung fusst auf der Erkenntnis, dass es möglich ist, hochreines Insulin so zu stabilisieren, dass es weder bei seiner Herstellung noch in Präparaten mit Dauerwirkung während deren Aufbewahrung oder Benutzung Aggregate bildet, die eine Antikörperbildung verursachen.
Diese Stabilisierung wird durch die im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebene Massnahme erreicht.
Beim erfindungsgemässeh Verfahren wird das hochgereinigte' Insulin in stabilisierter monomerer oder lose aggregierter Form mit einer basischen Komponente, beispielsweise Arginin, Somatostatin, Protamin oder Globin umgesetzt.
Diese Reaktion erfolgt erfindungsgemäss zweckmässig in Gegenwart eines Stabilisators, z.B. m-Cresol oder Glucose.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist mit Insulin von vielen verschiedenen Tierarten, beispielsweise Schweinen, Ochsen oder Schafen durchführbar, jedoch bei Ochseninsulin von besonderer Bedeutung.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass eine einen Stabilisator enthaltende Insulinlösung
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einem Ionenaustausch unter;/orf en wird, indem :nan mit einem Elutionsmittel eluiert, welches einen die stabilisierte monomere oder lose aggregierte Form des Insulins aufrechterhaltenden Stabilisator enthält, und danach eine von Verunreinigungen befreites Insulin enthaltende Fraktion einer Lösung zusetzt, die ein basisches Polypeptid enthält. Der ausgefällte Polypeptidinsulinkomplex v/ird dann isoliert. Man vermeidet so mit grosser Sicherheit die Aggregatbildung, da das hochreine Insulin nicht zunächst als solches isoliert wird, was Gefahr einer Aggregatbildung mit sich führen würde. Dieser Prozess ist dazu sehr einfach, weil dabei das Insulinpräparat mit Dauerwirkung in stabiler Form direkt ausgefällt v/ird.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert
BEISPIEL 1
250 mg rekristallisiertes Ochseninsulin wird in 5,2 ml stabilisierter Pufferlösung bestehend aus 7 molaren entionisiertem Harnstoff und 0,02 molarem Tris mit einem pH-Wert von 8,1 gelöst. Die Lösung wird mit 5,2 ml 7 molarer Harnstofflösung vermischt. Der pH-Wert des Gemischs wird auf 8,1 eingestellt. Eine Kolonne mit einem Durchmesser von 5 cm0 wird mit einer 2,1 cm hohen Schicht von DEAE Zellulose (Whatraann DE 52) gepackt und mit einer Pufferlösung obengenannter Zusammensetzung äquilibriert. Die Insulinlösung wird in die Kolonne eingegeben, und es wird mit einer Geschwindigkeit von 75 ml per Stunde nach folgendem Schema eluiert:
2,5 Stunden mit einem Puffer vorgenannter Zusammensetzung
3 Stunden mit einem Puffer obenangegebener Zusammensetzung und mit einem Zusatz von 0,0045 Mol Natriumchlorid per Liter
12 Stunden mit einem Puffer wie oben angegeben mit einem Zusatz von 0,011 Mol Natriumchlorid per Liter.
Das Eluat wird in Fraktionen aufgeteilt. Die hochgereinigten Fraktionen werden gesammelt, und der Insulingehalt wird bestimmt. In einer 7-molären Harnstofflösung mit dem Volumen des Gemischs aus den hochgereinigten Fraktionen wird diejenige Protaminmenge gelöst, welche zur Erzielung des isophanen Verhältnisses zwischen dem hochreinen Insulin und dem Protamin erforderlich ist.
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Die Insulinlößung wird der Protaminlccung lengsam. tropfenweise unter Umrührung zugegeben, wodurch, gegebenenfalls nach einer Verdünnung auf eine Harnstoffkonzentration von 1- molar, ein Protarain-Insulin-Komplex in amorphem Zustand ausgefällt wird.
Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren isoliert Lind weist im wesentlichen nur ein Band auf, wenn 300 /ug einer isoelektrischen Fokusierung in Polyacrylamidgel unter Verwendung von 2% Ampholin (pH 3-10) in 6 M entionisiertem Harnstoff unterworfen werden.
BEISPIEL 2
Das Verfahren gemäss Beispiel 1 wird wiederholt, wobei in die Protaminlösung eine 0,5% Zn-Ionen im Verhältnis zur Insulinmenge entsprechende Menge Zinkchlorid sowie 0,3% m-Cresol auf der Basis des Gemischvolumens eingeführt werden. Dadurch wird der Protamin-Insulin-Komplex in kristallinem Zustand ausgefällt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren isoliert und weist im wesentlichen nur ein Band auf, wenn 300 /Ug einer isoelektrischen Fokusierung in Polyacrylamidgel unter Verwendung von 2% Ampholin (pH 3-10) in 6 M entionisiertem Harnstoff unterworfen werden.
BEISPIEL 3
Das Verfahren gemäss Beispiel 1 wird wiederholt, wobei als Ausgangsmaterial durch Gelfiltration auf Sephadex G-^Ö^ gereinigtes, rekristallisiertes Ochseninsulin verwendet wird.
Das hergestellte Präparat ist ebenso rein wie das im Beispiel 1 beschriebene Erzeugnis.
BEISPIEL 4
Die Verfahren gemäss Beispiel 1 und 2 werden wiederholt, wobei jedoch als Ausgangsmaterial durch Aussalzen eines bei der Insulinproduktion anfallenden wässrigen P^ohextrakts durch Zusatz von Salz bis 3j5 M bei einem pH von 8,5 hergestelltes Schweineinsulin verwendet wird. Der gebildete Salzkuchen wird in bekannter Weise vor dem Ionenaustausch entsalzt.
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Das so erhaltene Präparat j st ebenso reir- wie das im Beispiel 1 beschriebene Produkt.
BEISPIEL 5
Das Verfahren gemäss Beispiel 4 wird vn.ederh.olt. Der gebildete Salzkuchen wird einer Gelfiltration auf Sephadex G-50-·' unterworfen.
Das Produkt ist ebenso rein wie das im Beispiel 1 beschriebene.
BEISPIEL 6
Die Verfahren gemäss Beispiel 1-3 werden wiederholt, wobei jedoch statt Ochseninsulin Schweineinsulin verwendet wird.
Der gebildete Protamin-Schweineinsulin-Komplex ist ebenso rein wie der im Beispiel 1 hergestellte Komplex.
BEISPIEL 7
Das Verfahren gemäss Beispiel 1 wird wiederholt, wobei jedoch statt dem Protamin PoIy-L-Arginin mit einem Polymerisationsgrad von 295 verwendet wird. Der ausgefällte Niederschlag wird.wie im Beispiel 1 isoliert.
BEISPIEL 8
Das Verfahren gemäss Beispiel 1 wird wiederholt. Dabei wird aber den hochreinen Insulinfraktionen eine 0,2%-ige wässrige Lösung von bis-(4-Amino-2-Methyl-Chinolyl-6) Harnstoffhydrochlorid in"einer 10 Gew.% der in den Fraktionen vorhandenen Insulinmenge entsprechenden Menge zugesetzt wird. Hierdurch wird, eventuell nach einer Ver- · dünnung bis auf eine Harnstoffkonzentration von 1 molar mit 0,025 M Na-Phosphatpuffer pH: 7,3» ein Insulinkomplex ausgefällt, der einige 'Zeit absteht und dann durch Zentrifugieren isoliert werden kann. Das hergestellte Präparat hat die gleiche Reinheit wie das im Beispiel 1 beschriebene Produkt.
BEISPIEL 9
Das Verfahren gemäss Beispiel 8 wird wiederholt, wobei als Ausgangs-
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material durch Gelfiltration auf Gepliade;: G-50 gereinigtes, rekristallisiertes Ochseninsulin benutzt wird. Das hergestellte Präparat hat die gleiche Reinheit wie das im Beispiel 1 beschriebene Produkt.
BEISPIEL 10
Das Verfahren gemäss den Beispielen 8 und 9 wird wiederholt, wobei jedoch statt Ochseninsulin Schweineinsulin verwendet wird.
Der hierbei gewonnene Schweineinsulinkomplex hat die gleiche Reinheit wie der gemäss Beispiel 1 hergestellte^ .Komplex.
BEISPIEL 11
Das Verfahren gemäss Beispiel 8 wird wiederholt. Als Ausgangsmaterial dient ein durch Aussalzen eines bei der Insulinproduktion anfallenden wässrigen Rohextrakts durch Zusatz von Salz bis 3»5 M.bei einem pH von 8,5 hergestelltes Schweineinsulin. Der gebildete Salzkuchen wird in bekannter ¥eise vor dem Ionenaustausch entsalzt.
BEISPIEL 12
Das Verfahren gemäss Beispiel 11 wird wiederholt, wobei der anfallende Salzkuchen einer Gelfiltration auf Sephadex G-50 unterworfen wird.
Das Produkt hat die gleiche Reinheit wie das im Beispiel 1 beschriebene .
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Claims (12)

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung eines stabilen Insulinpräparats mit Dauerwirkung und mit niedriger Antigenizität durch Umsetzen von Insulin mit einer basische: Gruppen enthaltenden organischen Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion mit einem hochgereinigten Insulin in stabilisierter monomerer oder lose aggregierter Form erfolgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Ochseninsulin verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die basische Gruppen enthaltende organische Verbindung ein basisches Polypeptid oder ein Spaltprodukt eines basischen Polypeptide ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3> dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid ein Protamin ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeich-
n e t, dass die Reaktion in Gegenwart eines Stabilisators erfolgt«
6. Verfahren nach Anspruch 5> dadurch gekennzeichnet, dass der Stabilisator ein Phenol ist.
7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Stabilisator Glucose verwendet wird.
8. Verfahren zur Herstellung eines stabilen Insulinpräparats mit Dauerwirkung und niedriger Antigenizität, dadurch gekennzeichnet, dass eine einen Stabilisator enthaltende Insulinlösung einem Ionenaustausch unterworfen wird, indem man mit einem Eluenten eluiert, der einen die stabilisierte monomere oder lose aggregierte Form des Insulins aufrechterhaltenden Stabilisator enthält, urd. dass dann einer ein basisches Polypeptid oder ein Spaltprodukt eines basischen Polypeptids enthaltenden Lösung eine von Verunreinigungen befreites Insulin enthaltende Fraktion zugesetzt wird, \ronach der ausgefällte Polypeptidinsulinkomple'x isoliert wird.
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9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Eluent Harnstoff als Stabilisator enthält.
10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das basische Polypeptid Polyarginin, Somatostatine Protamin oder Globin ist.
11. Therapeutische Insulinkomposition, enthaltend ein stabiles Insulinpräparat nach Anspruch 1 bis 10.
12. Arzneimittel zur Behandlung von Diabetes mellitus, gekennzeichnet durch ein Insulinpräparat nach Anspruch bis 11.
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