DE69331507T2

DE69331507T2 - Verfahren zur Reinigung von menschlichem, rekombinantem Serumalbumin

Info

Publication number: DE69331507T2
Application number: DE69331507T
Authority: DE
Inventors: Naoto Fuluhata; Syoichi Ishikawa; Kaeko Kamide; Masahide Kondo; Munehiro Noda; Takao Ohmura; Wataru Ohtani; Kazuhiro Oohara; Akinori Sumi; Kazuya Takeshima; Kazumasa Yokoyama
Original assignee: Mitsubishi Pharma Corp
Current assignee: Mitsubishi Pharma Corp
Priority date: 1992-05-20
Filing date: 1993-05-18
Publication date: 2002-08-29
Anticipated expiration: 2013-05-19
Also published as: ES2170060T3; EP0570916A2; KR940005800A; US5440018A; DE69331507D1; EP0570916B1; EP0570916A3; EP1099708A1; KR100386762B1; DK0570916T3; CA2096572A1

Description

BEREICH DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von rekombinantem humanem Serumalbumin, bei dem das humane Serumalbumin durch eine Kombination von Schritten aufgereinigt wird, um ein im wesentlichen reines Serumalbumin zu ergeben.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Albumin, insbesondere humanes Serumalbumin (HSA), ist ein wichtiges Protein im Blutsystem. Das Protein wird in der Leber produziert und besitzt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung des normalen osmotischen Drucks der Körperflüssigkeiten, wie im Blut. Es dient weiterhin als Träger für verschiedene Moleküle.
HSA wird bei verschiedenen klinischen Zuständen verabreicht. Im Fall eines Schocks bei Verbrennungen, ist es z. B. im allgemeinen notwendig, HSA häufig zu verabreichen, um das Blutvolumen wieder herzustellen und andere krankheitsbedingte Symptome zu lindern. Patienten, die an einer Hypoproteinämie und fetaler Erythroblastose leiden, benötigen manchmal eine HSA-Behandlung.
Mit anderen Worten, eine übliche Indikation für die HSA- Verabreichung ist der Verlust von Körperflüssigkeiten, wie z. B. während einer chirurgischen Behandlung, Schock, Verbrennungsverletzung oder Hypoproteinämie, die zu einem Ödem führen können.
Zurzeit wird HSA hauptsächlich als Fraktionsprodukt aus dem Blut gewonnen. Solch ein Herstellungsverfahren hat allerdings die Nachteile, dass es nicht ökonomisch ist und die Versorgung mit dem Blut sporadisch ist. Weiterhin enthält das gesammelte Blut manchmal nicht-gewünschte Substanzen, wie Hepatitisviren. Daher ist es notwendig ein Material zu entwickeln, welches als Austausch für das HSA verwendet werden kann.
Die Fortschritte in letzter Zeit bei der rekombinanten DNA- Technologie haben es möglich gemacht, verschiedene Arten von nützlichen Polypeptiden mikrobiell herzustellen und es werden bereits eine Anzahl von Säugetier-Polypeptiden durch verschiedene Mikroorganismen hergestellt. Bezüglich HSA ist die Etablierung von Techniken zur Herstellung (von HSA) im großen Maßstab durch rekombinante Verfahren und anschließender hochgradiger Aufreinigung in der Entwicklung.
Techniken zur Isolation und Reinigung von HSA aus Plasma wurden von verschiedenen Standpunkten aus untersucht und in die Praxis umgesetzt. Z. B. sind das Ethanol- Franktionierungsverfahren von E.J. Cohn et al., das PEG- Fraktionierungsverfahren, das Ammoniumsulfat- Franktionierungsverfahren und dergl. wohl bekannte Verfahren. Zusätzlich zu diesen Verfahren wurden verschiedene Aufreinigungsverfahren vor kurzem entwickelt, wie z. B. ein Verfahren mit einem Anionenaustauscher und einer Hitzebehandlung bei 60ºC für 10 Stunden, die zusammen angewendet werden (JP-A-2-191226 entsprechend EP-A-367220) und ein Verfahren, bei dem eine Anionenaustauschbehandlung, eine Kationenaustauschbehandlung und eine Hitzebehandlung bei 60ºC für 10 Stunden in Kombination durchgeführt werden (JP-A- 3-17123 entsprechend EP-A-428758). (Der Begriff "JP-A", wie er hierin verwendet wird, bedeutet "ungeprüfte veröffentliche japanische Patentanmeldung".)
im Falle der Herstellung von HSA mittels Gentechnologie ist es allerdings sehr wahrscheinlich, dass eine entsprechende HSA-Präparation mit verschiedenen farbgebenden Komponenten kontaminiert sind, diese sind in den Ausgangsmaterialien vorhanden oder werden durch die Mikroorganismen während der Kultivierung des Wirtsorganismus ausgeschieden oder werden während der Aufreinigung des erhaltenen HSA hinzugefügt. Diese Kontaminationen binden an das HSA und verursachen so ein Verfärben des HSA selbst. Wesentlicher ist, dass solche Kontaminationen nicht ausreichend mit Hilfe eines bisher bekannten Verfahrens zur Aufreinigung von HSA aus Plasma entfernt werden können.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Unter Berücksichtigung der vorhergenannten Probleme des Standes der Technik berücksichtigt, haben die Erfinder intensive Studien durchgeführt und als Ergebnis gelang es ihnen ein Verfahren zur wirksamen Aufreinigung von HSA, erhalten durch gentechnologische Techniken, zu entwickeln.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von humanem Serumalbumin, erhalten mittels Gentechnologie, das keine vom Herstellungswirt stammenden Substanzen oder andere Kontaminationen enthält und im wesentlichen frei von einer Färbung ist.
Genauer betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten humanen Serumalbumins, umfassend die Schritte:
(1) Behandlung eines Kulturüberstandes eines Wirts, der humanes Serumalbumin exprimiert, mit einer ersten Ultrafiltrationsmembran mit einem Molekulargewichtsausschluß von 100.000 bis 500.000 und anschließend mit einer zweiten Ultrafiltrationsmembran mit einem Molekulargewichtsausschluß von 1.000 bis 50.000, um ein erstes Filtrat zu erhalten;
(2) Hitzebehandlung des ersten Filtrats bei 50 bis 70ºC für 30 Minuten bis 5 Stunden, um eine erhitzte Probe zu erhalten;
(3) Säurebehandlung der erwärmten Probe bei einem pH von 3 bis 5, um eine säurebehandelte Probe zu erhalten;
(4) Behandlung der säurebehandelten Probe mit einer Ultrafiltrationsmembran mit einem Molekulargewichtsausschluß von 100.000 bis 500.000, um ein zweites Filtrat zu erhalten;
(5) Inkontaktbringen des zweiten Filtrats mit einem Kationenaustauscher bei einem pH von 3 bis 5 und einer Salzkonzentration von 0,01 bis 0,2 M und anschließend Aussetzen des Kationenaustauschers einem pH von 8 bis 10 und einer Salzkonzentration von 0,2 bis 0,5 M, um ein erstes Eluat zu erhalten;
(6) Inkontaktbringen des ersten Eluats mit einem Träger für eine hydrophobe Chromatographie bei einem pH von 6 bis 8 und einer Salzkonzentration von 0,01 bis 0,5 M und Gewinnen der nicht-adsorbierten Fraktion, um ein zweites Eluat zu erhalten; und
(7) Inkontaktbringen des zweiten Eluats mit einem Anionanaustauscher bei einem pH von 6 bis 8 und Gewinnen der nicht-adsorbierten Fraktion, um das Albumin zu erhalten.
Ein weiterer Schritt (8) kann bei dem obigen Verfahren angewendet werden, bei dem das erhaltene Eluat des Schritts (7) in Kontakt gebracht mit einem Chelatharz und die erhaltenen nicht-adsorbierten Fraktionen gewonnen werden.

KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN

Fig. 1 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer HPLC- Analyse von HSA erhalten nach dem Aufreinigungsschritt der hydrophoben Chromatographie zeigt.
Fig. 2 ist ein Diagramm, das die Bindungskurve von Laurinsäure an HSA zeigt.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Der Begriff "im wesentlichen reines HSA", wie er hierin verwendet wird, bedeutet, dass eine 25%-ige wässrige Lösung von gereinigtem HSA kontaminierende Proteine und Polysaccharide in einer Menge von höchstens 0,1 ng/ml oder kleiner bzw. 1 ng/ml oder geringer enthält oder dass die Reinheit des aufgereinigten HSAs 99,999999% oder größer ist.
Bei dem erfindungsgemässen Verfahren kann der Schritt (6) durch einen anderen Schritt (6) ersetzt werden, bei dem das erhaltene Eluat des Schrittes (5) in Kontakt gebracht wird mit einem Träger einer hydrophoben Chromatographie bei einem pH von 6 bis 8 und einer Salzkonzentration von 1 bis 3 M und anschließend wird der Träger einem pH von 6 bis 8 und einer Salzkonzentration von 0,1 bis 0,5 M ausgesetzt.
Ebenso kann der Schritt (7) des erfindungsgemässen Verfahrens durch einen anderen Schritt (7) ersetzt werden, bei dem wird das erhaltene Eluat des Schrittes (6) in Kontakt mit einem Anionenaustauscher bei einem pH von 6 bis 8 und einer Salzkonzentration von 0,001 bis 0,05 M gebracht und anschließend wird der Anionenaustauscher einem pH von 6 bis 8 und einer Salzkonzentration von 0,05 bis 1 M ausgesetzt.
Weiterhin kann das erfindungsgemässe Verfahren weiterhin einen Salzpräzipitationsschritt (Aussalzen) enthalten, der Schritt (5), Schritt (6) oder Schritt (7) folgt, bei dem wird die Salzpräzipitation durchgeführt durch Aussetzen des ersten Eluats, des zweiten Eluats oder des Albumins bei einem pH von 3 bis 5 einer Salzkonzentration von 0,5 bis 3 M um eine Präzipitation zu erzielen und Lösen des Präzipitats in einem Puffer.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden genau beschrieben.

(1) REKOMBINANTES HSA

Der HSA-produzierende Wirt, hergestellt durch gentechnologische Verfahren, wie er erfindungsgemäss verwendet werden kann, ist nicht begrenzt, so lange das HSA mittels Gentechnologieverfahren hergestellt wird, damit kann der Wirt aus Wirten, wie sie im Stand der Technik bekannt sind, ausgewählt werden, genauso wie aus solchen Wirten, wie sie in der Zukunft entwickelt werden. Beispiele für Wirte schließen mikrobielle Zellen, wie Escherichia coli, verschiedene Hefearten, Bacillus subtilis und dergl. und tierische Zellen ein. Insbesondere bevorzugte Wirte sind Hefegarten, insbesondere die die zu der Gattung Saccharomyces gehören, wie Saccharomyces cerevisiae oder zur Gattung Pichia, wie Pichia pastoris. Auxotrophe Stämme oder Antibiotika-sensitive Stämme können ebenfalls verwendet werden. Saccharomyces cerevisiae AH22 (a, his 4, leu 2, can 1), Pichia pastoris GTS115 (his 4) und ähnliche Stämme werden bevorzugt verwendet.
Die Herstellung der HSA-produzierenden Wirte, die Herstellung von HSA durch kultivieren der Wirte und Isolieren und Gewinnen von HSA aus den erhaltenen Kulturmedien können unter Verwendung von bekannten Techniken oder modifizierten Verfahren davon erreicht werden. Z. B. kann eine Herstellung von einem HSA-produzierenden Wirt (oder einem HSA- produzierenden Stamm) erreicht werden unter Verwendung eines Verfahrens, bei dem ein natürliches humanes Serumalbumingen verwendet wird (JP-a-58-56684 entsprechend EP-A-73646, JP-A- 58-90515 entsprechend EP-A-79739 und JP-A-58-15051 entsprechend EP-A-91527), ein Verfahren, bei dem ein modifiziertes humanes Serumalbumingen verwendet wird (JP-A- 62-29985 und JP-A-1-98486 entsprechend EP-A-206733), ein Verfahren, bei dem eine synthetische Signalsequenz verwendet wird (JP-A-1-240191 entsprechend EP-A-329127), ein Verfahren, bei dem eine Serumalbuminsignalsequenz verwendet wird (JP-A- 2-167095 entsprechend EP-A-319641), ein Verfahren, bei dem ein rekombinantes Plasmid in das Chromosom eingeführt wird (JP-A-3-72889 entsprechend EP-A-399455), ein Verfahren, bei dem die Wirte fusioniert werden (JP-A-3-53877 entsprechend DP-A-409156), ein Verfahren, bei dem Mutationen in einem Methanol-enthaltendem Medium generiert werden, ein Verfahren, bei dem ein mutanter AOX&sub2;-Promotor verwendet wird (EP-A- 506040), ein Verfahren, bei dem HSA in B. subtilis exprimiert wird (JP-A-62-215393 entsprechend EP-A-229712), ein Verfahren bei dem HSA in Hefe exprimiert wird (JP-A-60-41487 entsprechend EP-A-123544, JP-A-63-39576 entsprechend EP-A- 248657 und JP-A-63-74493 entsprechend EP-A-251744) und ein Verfahren, bei dem HSA in Pichia exprimiert wird (JP-A-2- 104290 entsprechend EP-A-344459).
Das Verfahren, bei dem Mutationen in einem Methanolenthaltenden Medium generiert werden, wird wie folgt durchgeführt.
Zuerst wird ein Plasmid, enthaltend eine Transkriptionseinheit, die so konstruiert ist, dass HSA unter Kontrolle eines AOX1-Promotors exprimiert wird, wird in die AOX1-Genregion eines entsprechenden Wirts eingeführt, bevorzugt einer Pichia-Hefe, bevorzugter Pichia-Stamm GTS115 (NRRL-Depositionsnummer Y-15851) (JP-A-2-104290 entsprechend EP-A-344459) um eine Transformante zu erhalten. Da diese erhaltene Tranformante nicht sehr gut in einem Methanolenthaltendem Medium wächst, wird eine Mutation der Transformante durch Kultivieren der Transformanten in einem Methanol-enthaltendem Medium bewirkt, um einen mutanten Stamm zu isolieren, der in der Lage ist in dem Medium zu wachsen. Die Metanolkonzentration in dem Medium kann in einem Bereich von ca. 0,01 bis 5% liegen. Das Medium kann entweder synthetisch oder natürlich sein und die Kultivierung kann durchgeführt werden bei 15 bis 40ºC für 1 bis 1000 Stunden.
Das Kultivieren eines HSA-herstellenden Wirts (ein HSA- Herstellungsverfahren) kann unter Verwendung von bekannten Verfahren durchgeführt werden, wie sie in vorhergenannten Referenzen offenbart sind oder gemäss einem Verfahren, offenbart in JP-A-3-83595, bei dem eine Inhibition der HSA- Herstellerzellen durch eine hohe Substratkonzentration vermieden wird, indem graduell eine hochkonzentrierte Glucoselösung zu dem Medium mittels einer Zuführ-Batch- Fermentation durchgeführt wird, dabei werden sowohl Herstellerzellen als auch das Produkt in hoher Konzentration hergestellt oder gemäss einem anderen Verfahren, wie in der JP-A-4-293495 entsprechend EP-A-504823 offenbart, bei dem die Herstellung von HSA verbessert ist, in dem Fettsäuren zu dem Medium gegeben werden.
Die Isolation und die Gewinnung von HSA kann gemäss bekannten Verfahren, wie sie in obengenannten Referenzen offenbart sind, durchgeführt werden oder gemäss dem Verfahren, offenbart in JP-A-3-103188 entsprechend EP-A-420007, bei dem Proteasen durch Hitzebehandlung inaktiviert werden oder ein Verfahren zur Hemmung der Färbung, offenbart in JP-A-4-54198 entsprechend US-Patent 5 132 404 oder EP-A-464590, wo HSA von den färbenden Substanzen getrennt wird, indem mindestens ein Adsorbent ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Anionenaustauscher, hydrophoben Trägern und Aktivkohle verwendet wird.
Das Medium zur Kultivierung des transformierten Wirts kann hergestellt werden durch Zugabe von Fettsäuren mit 10 bis 26 Kohlenstoffatomen oder Salzen davon zu einem bekannten Medium und Kultivieren der Transformante unter bekannten Bedingungen. Das Medium kann entweder synthetisch oder natürlich sein, bevorzugt ist ein Flüssigmedium. Ein geeignetes synthetisches Medium kann z. B. zusammengesetzt sein aus: Kohlenstoffquelle, wie verschiedene Saccharide und dergl.; Stickstoffquelle, wie Harnstoff, Ammoniaksalze, Nitrate und dergl.; Spurenelementen, wie verschiedene Vitamine, Nukleotide und dergl.; und anorganischen Salzen, wie Mg, Ca, Fe, Na, K, Mn, Co, Cu und dergl. Ein Beispiel für solch ein Medium ist YNB-Flüssigmedium, das aus 0,7% Hefe- Stickstoffbasis (Difco) und 2% Glucose besteht. Ein Beispiel für ein nützliches natürliches Medium ist YPD-Flüssigmedium, das aus 1% Hefeextrakt (Difco), 2% Bactopepton (Difco) und 2% Glucose besteht. Der pH des Mediums kann neutral, schwach basisch oder schwach sauer sein. Im Falle eines Methanolassimilierendem Wirts kann das Medium weiterhin versetzt sein mit Methanol in einer Menge von ca. 0,01 bis 5%.
Das Kultivieren des Wirts kann bevorzugt bei 15 bis 43ºC durchgeführt werden (20 bis 30ºC für Hefestämme, 20 bis 37ºC für bakterielle Stämme) für 1 bis 1000 Stunden durch statisches oder Schüttel-Kultivieren oder Batch, Semi-Batch oder kontinuierliche Kultivierung unter Agitation und Belüftung.
Dabei ist es wünschenswert eine Impfkultur vor der Batch- Kultivierung herzustellen. Die Impfkultivierung kann unter Verwendung des vorhergenannten YNB-Flüssigmediums oder YPD- Flüssigmediums, bevorzugt bei 30ºC (Hefe) oder 37ºC (Bakterien) für 10 bis 100 Stunden durchgeführt werden.
Nach Beendigung der Kultivierung für das HSA aus dem erhaltenen Kulturmedium oder den Zellen in normaler Art und Weise gewonnen.

(2) AUFREINIGUNG VON HSA

(i) ULTRAFILTRATION

Andere Hochmolekulargewichtssubstanzen als HSA, genauso wie Substanzen mit einem kleinen Molekulargewicht, werden abgetrennt und aus dem Kulturüberstand, der nach Abtrennung der HSA-produzierenden Wirtzellen erhalten wurde, durch Ultrafiltrationstechniken entfernt.
Substanzen mit hohem Molekulargewicht werden unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran mit einem Molekulargewichtsausschluß von ca. 100.000 bis 500.000, bevorzugt ca. 300.000 entfernt und Substanzen mit kleinem Molekulargewicht werden unter Verwendung einer anderen Ultrafiltrationsmembran mit einem Molekulargewichtsausschluß von ca. 1.000 bis 50.000, bevorzugt ca. 10.000 bis 30.000 entfernt.
Zum Zeitpunkt, wenn Substanzen mit hohem Molekulargewicht entfernt werden, wird gleichzeitig eine Abtrennung der verbliebenen HSA-produzierenden Wirtzellen erreicht und die Einkonzentration der Flüssigkeit wird zum Zeitpunkt der Entfernung von Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht erzielt.

(ii) HITZEBEHANDLUNG

Die konzentrierte Lösung, wie sie im obigen Schritt (i) erhalten wurde, wird einer Hitzebehandlung bei 50 bis 70ºC für ca. 30 Minuten bis 5 Stunden, bevorzugt bei 60ºC für ca. 1 bis 3 Stunden unterworfen.
Bevorzugt wird die Erwärmung in Anwesenheit eines Stabilisationsmittels durchgeführt. Bevorzugte Beispiele für den Stabilisator schließen Acetyltryptophan und eine organische Carbonsäure mit 6 bis 18 Kohlenstoffatomen oder ein Salz davon ein. Der Stabilisator kann in Kombination verwendet werden. Acetyltryptophan kann in einer Menge von ca. 1 bis 100 mM verwendet werden. Beispiel für die organische Carbonsäure mit 6 bis 18 Kohlenstoffatomen schließen Capronsäure (6 Kohlenstoffatome), Caprylsäure (8 Kohlenstoffatome), Caprinsäure (10 Kohlenstoffatome), Laurinsäure (12 Kohlenstoffatome), Palmitinsäure (16 Kohlenstoffatome), Ölsäure (18 Kohlenstoffatome) und dergl. ein. Beispiele für Salze davon schließen Alkalimetallsalze, wie Natriumsalz, Kaliumsalz und dergl. ein und Erdalkalimetallsalze, wie Kalziumsalz und dergl. Die organische Carbonsäure mit 6 bis 18 Kohlenstoffatomen oder ein Salz davon können in einer Menge von ca. 1 bis 100 mM verwendet werden.
Bei der Hitzebehandlung kann die Entwicklung einer Färbung, hervorgerufen durch das Erhitzen verhindert werden durch Zugabe einer Thiolverbindung (z. B. Mercaptoethanol, Cystein, reduziertes Glutathion oder dergl.) in einer Menge von ca. 1 bis 100 mM, bevorzugt von 5 bis 30 mM und Aminoguanidin in einer Menge von 10 bis 1.000 mM. Ein Teil dieses Schritts wurde bereits in der JP-A-3-103188 offenbart.

(iii) SÄUREBEHANDLUNG

Die hitzebehandelte Lösung des obigen Schritts (ii) wird einer pH-Einstellung auf ca. 3 bis 5, bevorzugt 4 bis 4,6, mit einer Säure unterworfen, anschließend kann sie für einen Zeitraum von ca. 1 bis 12 Stunden ruhen. Beispiele für die Säure schließen Essigsäure, Salzsäure, Phosphorsäure, Schwefelsäure und dergl. ein.

(iv) ULTRAFILTRATION

Bei diesem Schritt werden polymerisierte Hochmolekulargewichtskontaminationen durch Ultrafiltration entfernt. Substanzen mit hohem Molekulargewicht werden unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran mit einem Molekulargewichtsausschluß von ca. 100.000 bis 500.000, bevorzugt 300.000, entfernt. Wenn notwendig, kann ein Pufferaustausch für die folgende Kationenaustauscherbehandlung unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran mit einem Molekulargewichtsausschluß von ca. 1.000 bis 50.000, bevorzugt von ca. 10.000 bis 30.000, durchgeführt werden.

(v) KATIONENAUSTAUSCHERBEHANDLUNG

Verwendbare Kationenaustauscher sind solche mit einer Sulfogruppe, Carboxygruppe und dergl. Beispiele für die Sulfogruppe-enthaltenden Kationenaustauscher schließen Sulfoagarose (Handelsname S-Sepharose®, erhältlich von Pharmacia), Sulfopropyl-Dextran (Handelsname SP-Sephadex®, erhältlich von Pharmacia), Sulfopropyl-Polyvinyl (Handelsname SP-Toyopearl®, erhältlich von Tosoh Corp.) und dergl. ein. Beispiele der Carboxylgruppe-enthaltenden Kationenaustauscher schließen Carboxymethyl-Dextran (Handelsname cm-Sephadex® erhältlich von Pharmacia; und Handelsname cm-Cellulofine®, erhältlich von Seikagaku Corp.) und dergl. ein.
Der Austauscher kann mit einer entsprechenden Menge Puffer, wie einem Acetatpuffer mit einem pH von ca. 3 bis 5, bevorzugt 4 bis 4,6, und enthaltend ein Salz, wie Natriumchlorid in einer Konzentration von ca. 0,01 bis 0,2 M, bevorzugt 0,05 bis 0,1 M äquilibriert sein. Der gleiche Puffer kann zum Inkontaktbringen und zum Waschen verwendet werden. Eluierung kann mit einem geeigneten Puffer, wie einem Phosphatpuffer mit einem pH von im allgemeinen 8 bis 10, bevorzugt 8,5 bis 9,5, der ein Salz, wie Natriumchlorid in einer Konzentration von im allgemeinen 0,2 bis 0,5 M, bevorzugt 0,3 bis 0,4 M enthält, durchgeführt werden.

(vi) HYDROPHOBE CHROMATOGRAPHIE

Träger zur Verwendung bei der hydrophoben Chromatographie schließen solche enthaltend eine Alkylgruppe (Butylgruppe, Octylgruppe, Octyldecylgruppe und dergl.), jede Gruppe mit 4 bis 18 Kohlenstoffatome und solche enthaltend eine Phenylgruppe ein. Beispiele für eine Butylgruppe-enthaltende Träger schließen Butylagarose, Butylpolyvinyl (Handelsname Butyl Toyopearl®, erhältlich von Tosoh Corp.) und dergl. ein, solche mit einem Octylgruppe-enthaltenden und einem Octyldecylgruppe-enthaltenden Träger schließen Octylagarose bzw. Octyldecylagarose ein und solche mit einem Phenylgruppeenthaltenden Träger schließen Phenylcellulose (Handelsname Phenyl Cellulofine®, erhältlich von Seikagaku Corp.) und dergl. ein.
Bei diesem Schritt kann HSA aus den nicht-adsorbierten Fraktionen gewonnen werden. In diesem Fall kann das Inkontaktbringen unter Verwendung eines entsprechenden Puffers, wie einem Phosphatpuffer mit einem pH von ca. 6 bis 8, bevorzugt 6,5 bis 7, enthaltend ein Salz, wie Natriumsalz in einer Konzentration von ca. 0,05 bis 0,5 M, bevorzugt 0,05 bis 0,2 M, durchgeführt werden.
HSA kann auch durch Elution nach Adsorption an die vorhergenannten Träger gewonnen werden. In diesem Fall wird das Inkontaktbringen unter Waschen unter Verwendung eines entsprechenden Puffers, wie einem Phosphatpuffer mit einem pH von ca. 6 bis 8, bevorzugt 6,5 bis 7, enthaltend ein Salz, wie Natriumsalz in einer Konzentration von ca. 1 bis 3 M, bevorzugt 1,5 bis 2 M, durchgeführt. Das Eluieren kann mit einem entsprechenden Puffer, wie einem Phosphatpuffer mit einem pH von ca. 6 bis 8, bevorzugt 6,5 bis 7, enthaltend ein Salz, wie Natriumchlorid in einer Konzentration von ca. 0,01 bis 0,5 M, bevorzugt 0,05 bis 0,2 M, durchgeführt werden.

(vii) ANIONENAUSTAUSCHERBEHANDLUNG

Beispiel für ein Anionenaustauscher schließen solche ein, enthaltend eine Diethylaminoethylgruppe (DEAE), solche enthaltend eine quaternäre Aminoethylgruppe (QAE) und dergl. Beispiele für DEAE-Gruppe-enthaltende Anionenaustauscher schließen DEAE-Agarose (Handelsname DEAE-Sepharose®, erhältlich von Pharmacia), DEAE-Dextran (Handelsname DEAE- Sephadex®, erhältlich von Pharmacia), DEAE-Polyvinyl (Handelsname DEAE-Toyopearl®, erhältlich von Tosoh Corp.) und dergl. ein. Beispiele für QAE-Gruppe enthaltende Anionenaustauscher schließen QAE-Agarose (Handelsname QAE- Sepharose®, erhältlich von Pharmacia), QAE-Polyvinyl (Handelsname QAE-Toyopearl®, erhältlich von Tosoh Corp.) und dergl. ein.
Bei diesem Schritt kann das HSA aus den nicht-adsorbierten Fraktionen gewonnen werden. In diesem Fall kann das Inkontaktbringen unter Verwendung eines entsprechenden Puffers, wie einen Phosphatpuffer mit einem pH von ca. 6 bis 8, bevorzugt 6,5 bis 7 und einer Salzkonzentration von ca. 0,01 bis 0,1 M durchgeführt werden.
HSA kann ebenfalls durch Eluieren nach Adsorption an den vorhergenannten Träger gewonnen werden. In diesem Falle wird das Inkontakbringen und das Waschen unter Verwendung des gleichen Puffers, wie er oben beschrieben wurde, durchgeführt, mit der Ausnahme, dass das Salz, wie Natriumchlorid in einer Konzentration von 0,001 bis 0,05 M enthalten ist und die Elution mit dem gleichen Puffer mit einer Salzkonzentration von 0,05 bis 1 M durchgeführt wird.

(viii) AUSSALZEN

Bei diesem Schritt wird das HSA spezifisch durch Zugabe einer Salzkomponente zu der Probenlösung zu einer Gesamtsalzkonzentration von ca. 0,1 bis 3 M, bevorzugt 0,5 bis 1,5 M und anschließendem Einstellen der erhaltenen Lösung auf einen pH von 3 bis 5, bevorzugt 3,5 bis 4, 5, präzipitiert. Verunreinigungen im flüssigen Überstand werden durch Abtrennen des HSA-Präzipitats entfernt.
Das so präzipitierte HSA wird in einer geeigneten Pufferlösung gelöst. Obwohl nicht besonders eingeschränkt, sind verwendbare Salzkomponenten zur Einstellung der Ionenstärke Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Ammoniumsulfat, Natrium- (oder Kalium-) Thiocyanat, Natriumsulfat und dergl. Obwohl ebenfalls nicht besonders eingeschränkt, kann das Abtrennen des präzipitierten HSA aus dem flüssigen Überstand erreicht werden durch bevorzugt Zentrifugation, Druckabtrennung, Querstrommembranabtrennung und dergl.
Dieser Schritt kann bevorzugt nach dem Anionenaustauscherschritt (vii) durchgeführt werden, kann sich aber auch zwischen dem Kationenaustauscherschritt (v) und dem hydrophoben Chromatographieschritt (vi) befinden oder zwischen dem hydrophoben Chromatographieschritt (vi) und dem Anionenaustauschschritt (vii).

(ix) CHELATHARZBEHANDLUNG

Die obigen Aufreinigungsschritte können weiterhin einen Schritt enthalten, der es erlaubt, dass das HSA in Kontakt mit einem Chelatharz kommt, dieses hat einen spezifischen Ligandenanteil. Dieser Schritt kann bevorzugt nach der Anionenaustauscherbehandlung oder der Aussalzungs- Präzipitationsbehandlung durchgeführt werden, je nach dem welche später erfolgt.
Bevorzugt sind die Trägeranteile des Chelatharzes von hydrophober Natur. Beispiele für solch eine Art von Trägerteil schließt ein Copolymer aus Styrol und Divinylbenzol ein, ein Copolymer aus Acrylsäure und Methacrylsäure und dergl.
Beispiele für den Ligandenanteil schließen eine Thioharnstoffgruppe, genauso wie eine Polyamingruppe (einschließlich einer Polyalcylenpolyamingruppe, wie Polyethylenpolyamin oder dergl.), die in einem Molekül eine Vielzahl von Subgruppen, bestehend aus einer Polyolgruppe, wie einer N-Methylglucamingruppe, einer Iminogruppe, einer Aminogruppe, einer Ethyleniminogruppe und dergl. enthält, ein. Beispiele für bevorzugte kommerziell erhältliche Chelatharze mit dem oben beschriebenen Träger und Ligandenanteilen schließen DIAION CRB02® (Ligandenteil N- Methylglucamin, erhältlich von Mitsubishi Kasei Corp.), DIAION CR20® (Ligandenanteil -NH(CH&sub2;CH&sub2;NH)nH, erhältlich von Mitsubishi Kasei Corp.), LEWATIT TP214® (Ligandenanteil, -NHCSNH&sub2;, erhältlich von Bayer) und AMERLITE CG4000® ein, alle haben als Trägerteil ein Copolymer aus Styrol und Divinylbenzol.
Bevorzugte Bedingungen für die Chelatharzbehandlung sind die folgenden.
PH: Sauer oder neutral (pH 3 bis 9, bevorzugt 4 bis 7),
Zeitraum: mindestens 1 Stunde, bevorzugt 6 Stunden oder mehr,
Ionenstärke: 50 mmho oder weniger, bevorzugt 1 bis 10 mmho,
Mischverhältnis: 0,1 bis 100 g, bevorzugt 1 bis 10 g des Harzes, bezogen auf 250 mg HSA (Naßbasis).
Bei diesem Prozeß werden kontaminierende, färbende Substanzen, die aus dem Ausgangsmaterial oder vom Wirt stammen, in das Chelatharz adsorbiert, womit eine Reduktion der Färbung von HSA erreicht wird.
Die Schritte (v), (vi), (vii) und (ix) können unter Verwendung einer Säule oder in diskontinuierlichen Schritten durchgeführt werden, wobei die Verwendung einer Säule bevorzugt wird.
So durch die obigen Schritte (i) bis (vii) und der zusätzlichen Aussalzungs- und Chelatharzbehandlungsschritte gereinigtes HSA ist im wesentlichen frei von einer Färbung, was bedeutet, dass der Grad an Färbung des aufgereinigten HSA in einem Bereich von ca. 0,001 bis 0,005, ausgedrückt als A&sub5;&sub0;&sub0; nm/A&sub2;&sub8;&sub0; nm-Verhältnis in einer 25%igen HSA-Lösung ist. Der Begriff "eine 25%ige HSA-Lösung", wie er hierin verwendet wird, bedeutet eine Lösung von 25% Protein, die kontaminierende Proteine in einer Menge unterhalb der Nachweisgrenze enthält, nämlich 0,1 ng/ml, die nicht aufgereinigtes HSA sind. Das Verfärben von HSA wird auf ein Niveau von der 1/2 bis 1/10 durch die Chelatharzbehandlung gemäss der vorliegenden Erfindung reduziert. Insbesondere die Absorption bei ca. 500 nm, d. h. die rötliche Verfärbung, wird auf ein Niveau von 1/3 bis 1/10 reduziert.
Weiterhin können Fettsäuren, die HSA adsorbieren oder binden, welche aus dem Medium oder dem Wirt stammen oder von dem Wirt sezeniert werden, durch die Chelatharzbehandlung entfernt werden.
Die Mengen an Fettsäuren, die an das HSA adsorbiert sind, welches über die obigen Schritt (i) bis (vii) aufgereinigt wurde, so wie der zusätzliche Aussalzungsschritt, sind auf ein Niveau von 1/10 oder kleiner, bevorzugt 1/100 oder kleiner, durch die Chelatharzbehandlung reduziert.
Die Menge an Fettsäuren, adsorbiert an HSA, kann gemessen werden gemäss einem allgemein verwendeten Verfahren, die Duncombe's Extraktionsverfahren (Clin. Chim. Acta., 9, 122- 125 (1964)) oder Acyl-CoA-Synthetase (ACS)- Acyl-CoA-Oxidase (ACOD)- Verfahren, bei dem ACS und ACOD verwendet werden.
Das Duncombe's Extraktionsverfahren umfaßt im Prinzip das Umwandeln der Fettsäuren in Kupfersalze unter Verwendung eines Kupferreagens, Extrahieren mit Chloroform und anschließend Unterwerfen des Extrakts einer Farbentwicklung mit Bathocuproin. Das Verfahren kann einfach unter Verwendung eines Kits, wie NEFA-Test Wako® (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) durchgeführt werden, welches Bathocuproin enthält.
Andererseits umfaßt das ACS-ACOD-Verfahren im Prinzip das reagieren der Fettsäure mit Acyl-CoA-Sythetase und Acyl-CoA- Oxidase um H&sub2;O&sub2; herzustellen und darstellen des so geformten H&sub2;O&sub2; durch eine Farbentwicklung unter Verwendung einer Oxidationskondensationsreaktion einer chromogenen Substanz in Anwesenheit von Peroxidase. Dieses Verfahren kann ebenfalls einfach unter Verwendung eines Messkits, wie NEFAC-Test Wako® (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) durchgeführt werden.
Substanzen, die durch das Entfettungsverfahren der vorliegenden Erfindung entfernt werden, sind Fettsäuren und Ester davon, die von den Ausgangsmaterialien zur HSA- Produktion stammen, wie solche, die aus dem Blut, einem Medium, einem Wirt stammen oder solche die durch den Wirt seziniert werden.
Beispiele für zu entfernenden Fettsäuren schließen gesättigte Fettsäuren mit 8 bis 20 Kohlenstoffatome, wie Palmitinsäure, Stearinsäure und dergl. und ungesättigte Fettsäuren mit 16 bis 20 Kohlenstoffatome, wie Ölsäure, Linolsäure, Arachidonsäure und dergl. ein.
Da dieser Schritt effektiv zur Entfernung von solchen Fettsäuren ist, kann er zur Entfettung von HSA-Molekülen, an denen Fettsäuren angeheftet sind, angewendet werden, unabhängig vom Ursprung des HSAs.

(4) PHARMAZEUTISCHE PRÄPARATION

Das so erhaltene HSA kann in pharmazeutische Präparationen durch allgemeine Verfahren, wie eine 10-stündige Hitzesterilisation bei 60ºC, Ultrafiltration, Filtersterilisation, Dispension, Gefriertrocknung und dergl. eingearbeitet werden. Beispiele für die pharmazeutische Präparation ist eine Flüssigpräparation, die HSA in einer Menge von 5 bis 25% enthält mit einem pH von ca. 6,4 bis 7,4 und mit einem osmotischen Druckverhältnis von ca. 1.
Die HSA-enthaltende pharmazeutische Präparation kann Stabilisatoren enthalten, die Acetyltryptophan oder ein Salz davon (z. B. Natriumsalz) und Natriumcaprylat einschliessen. Jeder Stabilisator kann in einer Menge von ca. 0,001 bis 0,2 M, bevorzugt 0,01 bis 0,05 M in einer 25%igen HSA-Lösung verwendet werden. Der Natriumgehalt kann 2,7 mg/ml oder weniger sein. Die HSA-Präparation kann weiterhin pharmazeutisch annehmbare Additive, wie Natriumchlorid und dergl. enthalten.
Im allgemeinen können die Stabilisatoren vor den vorhergenannten Präparationsschritten, wie einer 10-stündigen Hitzesterilisation bei 60ºC, Ultrafiltration, Dispension, Gefriertrocknung und dergl., zugegeben werden. Damit kann nicht nur die Lagerungsstabilität von HSA sondern auch dessen Stabilität während des Herstellungsverfahren der pharmazeutischen Präparation gemäss der vorliegenden Erfindung verbessert werden.
Die so erhaltene HSA-enthaltende pharmazeutische Präparation kann klinisch als Injektion in der gleichen Weise wie bisher HSA-Präparationen, die von Plasma stammten, verwendet werden. Z. B. können sie zum Zwecke der schnellen Erhöhung des Blutvolumens, hauptsächlich zum Zeitpunkt eines Schocks, Versetzen des Volumens des zirkulären Bluts, Verbessern der Hypoproteinämie oder Aufrechterhalten des Collagenosmotischen Drucks verwendet werden. Zur besseren Darstellung, können die HSA-enthaltende pharmazeutische Präparation wirksam zur Behandlung von Hypoalbumämie aufgrund des Verlusts von Albumin (Verbrennungswunden, nephrotischen Syndroms oder dergl.) oder durch Reduktion der Albuminsynthesefähigkeit (Leberzirrose oder dergl.), genauso wie zur Behandlung von hämorrhalgischen Schock und dergl. verwendet werden.
Die pharmazeutische Präparation kann graduell durch intravenöse Injektion oder intravenöser Tropfinfusion verabreicht werden, mit einer Dosis von im allgemeinen 20 bis 50 ml als 25% HSA-Lösung (5 bis 12,5 g HSA) pro Verabreichung bei einem Erwachsenen. Die Dosis kann in Abhängigkeit vom Alter, Symptomen, Gewicht und dergl. des Patienten verändert werden.
Eigenschaften des aufgereinigten rekombinanten HSAs.

(5) AUFGEREINIGTES HSA

Das gemäss dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltene HSA ist eine homogene Substanz mit einem Molekulargewicht von ca. 67.000 und einem isoelektrischen Punkt von 4,6 bis 5,0. Das HSA besteht aus einem Monomer und enthält im wesentlichen keine Dimere, Polymere oder Zersetzungsprodukte. In der Tat ist der Gesamtgehalt an Dimeren, Polymeren und hydrolysierten Produkten ca. 0,01% oder kleiner.
Weiterhin enthält das HSA im wesentlichen keine Kontaminationen, die vom Herstellungswirt stammen, wie Protein, Polysaccharid und dergl., d. h. Kontamination mit einer Antigenizität nachweisbar durch Immunoassay, wie EIA, RIA, PHA usw. Somit enthält das HSA im wesentlichen keine Kontaminationen, die vom Fett stammen, mit einer Antigenizität nachweisbar mit Hilfe eines Immunoassays. Im Falle einer 25% HSA-Lösung ist der Proteingehalt 1 ng/ml oder geringer, bevorzugt 0,1 ng/ml oder kleiner und der Polysaccharidgehalt 10 ng/ml oder kleiner, bevorzugt 1 ng/ml oder kleiner. In diesem Fall berechnet sich die Reinheit des HSA auf 99,999999% oder größer, bevorzugter 99,9999999% oder größer.
Der Verfärbungsgrad der 25% HSA-Lösung ist im Bereich von 0,01 bis 0,05 ausgedrückt als A&sub3;&sub5;&sub0;/A&sub2;&sub8;&sub0;-Verhältnis, von 0,001 bis 0,02 ausgedrückt als A&sub4;&sub5;&sub0;/A&sub2;&sub8;&sub0;-Verhältnis und von 0,001 bis 0,005 ausgedrückt als A&sub5;&sub0;&sub0;/A&sub2;&sub8;&sub0;-Verhältnis.
Weiterhin ist die Menge an Fettsäure verbunden mit dem HSA ein Molekül oder weniger, bevorzugt 0,1 Molekül oder weniger pro HSA-Molekül.
Gemäss der vorliegenden Erfindung kann rekombinantes HSA wirksam aufgereinigt werden. Weiterhin wird gemäss der vorliegenden Erfindung im wesentlichen reines rekombinantes HSA bereitgestellt, dieses enthält keine vom Herstellerwirt stammenden Substanzen und andere Kontaminationen und ist im wesentlichen frei von einer Verfärbung.
Die folgenden Beispiele werden zur besseren Darstellung der vorliegenden Erfindung bereitgestellt. Es ist klar, dass die Beispiele nicht den Bereich von der vorliegenden Erfindung einschränken.

REFERENZBEISPIEL 1

(1) Verwendeter Stamm Pichia pastoris GCP101

Ein Pichia pastoris-Stamm, PC4130, erhalten gemäss dem Verfahren offenbart in JP-A-2-104290, wurde hergestellt durch Verdauen eines Plasmids pPGPl, enthaltend eine Transkriptionseinheit, die so konstruiert wurde, dass ihr HSA unter der Kontrolle eines AOX1-Promotors exprimiert, mit NcoI und anschließend Ersetzen des NotI-verdauten Fragments für den AOX1 im Genbereich von Pichia pastoris-Stamm GTS115 (his4). Der Stamm wächst in einem Medium, enthaltend Methanol als Kohlenstoffquelle (Mut -Stamm) gut, aufgrund der Deletion des AOX1-Gens.
Der Stamm PC4130 wurde in 3 ml YPD-Medium angeimpft (1% Hefeextrakt, 2% Bacto-Pepton und 2% Glucose). Nach 24 Stunden Kultivieren wurden die Zellen von 50 ml YPD-Medium angeimpft, so dass die Zellendichte eingestellt ist auf eine anfängliche Trübung bei einer OD&sub5;&sub4;&sub0; von 0,1. Nach 3 Tagen Kultivieren bei 30ºC wurden die erhaltenen Zellen wieder in 50 ml YPD-Medium mit einer anfänglichen Zelltrübung von 0,1 bei OD&sub5;&sub4;&sub0; angeimpft. Anschließend wurde das Subkultivieren alle 3 Tage in der gleichen Weise wiederholt. Nach jeder Subkultivierung wurden die Zellen mit sterilem Wasser verdünnt und auf eine 2% MeOH-YNBw/oa.a.-Platte gegossen (0,7% Hefe-Stickstoff-Basis ohne Aminosäuren, 2% Methanol und 1,5% Agarpulver) und mit einer Animpfungsgröße von 10&sup7; Zellen/Platte, gefolgt von einer 5-tägigen Kultivierung bei 30ºC, um die Anwesenheit/Abwesenheit von Kolonien zu bewerten. Zwanzig Kolonien wurden gefunden auf der 2% MeOH- YNBw/oa.a.-Platte nach 12 Tagen der sukzessiven Subkultivierung gefunden. Mut&supmin;-Stämme wachsen auf dem 2% MeOH-YNBw/oa.a.-Medium kaum, während Mut&spplus;-Stämme gut wachsen können. D. h. das Erscheinen von einer Kolonie bedeutet, dass der Stamm die Kapazität von erhöhter Methanolassimilation erworben hat und dass ein Mut&spplus;-Stamm erhalten wurde. Einer dieser erhaltenen Kolonien wurde entsprechend mit sterilem Wasser verdünnt und auf einer 2% MeOH-YNBw/oa.a.-Platte ausgestrichen, um einzelne Kolonien zu isolieren. Eine der erhaltenen einzelnen Kolonien wurde als GCP101 bezeichnet.

(2) KULTIVIEREN DES STAMMS

(ERSTE IMPFKULTUR)

Ein 1 ml-Teil des Stamms, der in Glycerol eingefroren war, wurde in 1.000 ml-baffled-Erlenmeyer-Kolben, enthaltend 200 ml YPD-Medium (siehe Tabelle 1) angeimpft und bei 30ºC für 24 Stunden unter Schütteln kultiviert.

TABELLE 1 ZUSAMMENSETZUNG DES YPD-MEDIUMS

Komponenten Konzentration (g/L)

Hefeextrakt 10
Pepton 20
Glucose 20

(ZWEITE IMPFKULTUR)

Das Medium der ersten Impfkultur wurde an einem 10 l-Jar- Fermentor, enthaltend 5 l YPD-Medium, angeimpft und die zweite Impfkultivierung wurde bei 30ºC für 24 Stunden unter Agitation und mit einer Belüftungsrate von 5 l pro Minute durchgeführt. Bei der Impfkultivierung wurde der pH des Mediums nicht kontrolliert.

(HAUPTKULTUR)

Das Medium der zweiten Impfkultur wurde in einen 1.200 l- Fermentor, enthaltend 250 l eines Batch-Kulturmediums (siehe Tabelle 2), transferiert und das Batch-Kultivieren wurde unter Agitation und Belüftung unter einem internen Druck von 0,5 kg/cm² und einer maximalen Belüftungsrate von 800 l/min unter atmosphärischem Druck gestartet. Die Agitationsrate wurde so kontrolliert, dass das Niveau an gelöstem Sauerstoff im Medium auf ca. 50 bis 30% der Sättigungskonzentration an gelöstem Sauerstoff gehalten wurde. Wenn das Glycerol in dem Batch-Kulturmedium verbraucht war, wurde mit der Zugabe eines Nährmediums (siehe Tabelle 3) gestartet. Zuführraten für das Medium wurde so mit Hilfe eines Computers kontrolliert, dass sich Methanol nicht in dem Kulturmedium anreicherte, womit eine Kultivierung bei hoher Dichte erzielt wurde. Der pH des Mediums wurde auf ein festgelegtes Niveau von 5,85 durch Zugabe von 28% wässrigem Ammoniak reguliert. Zum Entschäumen des Kulturmediums wurde ein Antischaummittel (Adecanol®, hergestellt von Asahi Denka Kogyo K.K.) in einer Menge von 0,30 ml/l zum Zeitpunkt des Beginns der Batch-Kultur zugegeben, anschließend wurde eine kleine Menge, wenn notwendig, zugefügt.

TABELLE 2 ZUSAMMENSETZUNG DES BATCH-KULTURMEDIUMS

Komponenten Menge pro Liter

Glycerol 50,0 g
H&sub3;PO&sub4; (85%) 14,0 ml
CaSO&sub4;·2H&sub2;O 0,6 g
K&sub2;SO&sub4; 9,5 g
MgSO&sub4;·7H&sub2;O 7,8 g
KOH 2,6 g
Biotin-Lösung *1 1,6 ml
YTM-Lösung *2 4,4 ml
*1 Biotin-Lösung: 0,2 g/l
*2 YTM-Lösung:

Komponenten Menge pro Liter

FeSO&sub4;·7H&sub2;O 65,0 g
CuSO&sub4;·5H&sub2;O 6,0 g
ZnSO&sub4;·7H&sub2;O 20,0 g
MnSO&sub4;·4-5H&sub2;O 3,0 g
H&sub2;SO&sub4; 5,0 ml

TABELLE 3 ZUSAMMENSETZUNG DES NÄHRMEDIUMS

Komponenten Menge

YTM-Lösung 2 ml
Methanol 1.000 ml

REFERENZBEISPIEL 2

Ein HSA-Expressionsplasmid pMM042 wurde unter Verwendung eines AOX2-Promotors konstruiert (eine Mutante des natürlichen AOX2-Promotors (YEAST, 5, 167-177, 1988; Mol. Cell. Biol., 9, 1316-1323, 1989), bei dem die 255ste Base stromaufwärts vom Initiationscodon des Promotors von T zu C verändert ist) isoliert aus dem Stamm GCP101, erhalten in Referenzbeispiel 1. Das so konstruierte Plasmid wurde in Pichia pastoris GTS115 eingeführt, um eine Transformante UHG42-3 zu erhalten (EP-A-506040). Anschließend wurde die so erhaltene Transformante gemäss dem Verfahren des Referenzbeispiels 1 kultiviert, so dass die Transformante HSA produzieren konnte.

BEISPIEL 1

[i] ISOLIERUNG DES KULTURÜBERSTANDS - MEMBRANFRAKTIONEN (I) UND (II) -

Ein Anteil von ca. 800 l des Kulturmediums, erhalten im Referenzbeispiel 1, wurde einer Druckfiltration unterworfen, um den Kulturüberstand zu isolieren. Der erhaltene Überstand wurde anschließend mit eine Ultrafiltrationsmembran mit einem Molekulargewichtsausschluß von 300.000 behandelt. Anschließend wurde das erhaltene Filtrat auf ein Volumen von ca. 80 l unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran mit einem Ausschlußmolekulargewicht von 30.000 einkonzentriert [Membranfraktion (I)].
Anschließend wurde die Membranfraktion (I) einer Hitzebehandlung bei 60ºC für 3 Stunden in Anwesenheit von 5 mM Natriumcaprylat, 10 mM Cystein und 100 mM Aminoguanidin bei pH 7,5 unterworfen. Die so erhaltene hitzebehandelte Lösung wurde schnell auf ca. 15ºC heruntergekühlt, der pH wurde auf 4,5 eingestellt und anschließend mit einer Ultrafiltrationsmembran mit einem Molekulargewichtsausschluß von 300.000 behandelt [Membranfraktion (II)]. Anschließend wurde unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran mit einem Molekulargewichtsausschluß von 30.000 der Puffer in der erhaltenen Albuminlösung durch einen 50 mM-Acetatpuffer (pH 4,5), enthaltend 50 mM Natriumchlorid, ersetzt.

[ii] KATIONENAUSTAUSCHERBEHANDLUNG

Die so im obigen Schritt [i] erhaltene Albuminlösung wurde auf eine Säule gepackt mit 5-Sepharose® gegeben, die wurde vorher mit einem 50 mM-Acetatpuffer (pH 4,5), enthaltend 50 mM Natriumchlorid äquilibriert, die Säule wurde ausführlich mit dem gleichen Puffer gewaschen und anschließend wurde die Elution mit einem 0,1 M-Phosphatpuffer (pH 9), enthaltend 0,3 M Natriumchlorid, durchgeführt.
Der Polysaccharidgehalt vor und nach der Kationenaustauscherbehandlung wurde gemäss dem Phenol- Schwefelsäure-Verfahren bestimmt, um festzustellen, dass der Polysaccharidgehalt auf ein 1/20 durch diese Behandlung reduziert wurde.

[iii] HYDROPHOBE CHROMATOGRAPHIE

Die von der S-Sepharose® in Säule eluierte Albuminlösung wurde auf eine Säule gepackt mit Phenyl-Cellulofine® aufgetragen, diese wurde vorher mit 50 mM Phosphatpuffer (pH 6,8), enthaltend 0,15 M Natriumchlorid, äquilibriert. Da das Albumin nicht an Phenyl-Cellulofine® unter diesen Bedingungen adsorbiert, wurden die durch die Säule gegangenen Fraktionen als Albuminfraktionen gesammelt.
Die rückgewonnene Albuminlösung wurde auf ein Volumen von ca. 50 l unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran mit einem Molekulargewichtsausschluß von 30.000 konzentriert und zur gleichen Zeit wurde der Puffer der Albuminlösung durch einen 50 mM-Phosphatpuffer (pH 6,8) ersetzt.

[iv] ANIONENAUSTAUSCHERBEHANDLUNG

Die so mit hydrophober Chromatographie, einkonzentrierte und Puffer-ausgetauschte Albuminlösung des obigen Schritts [iii] wurde auf eine Säule gepackt mit DEAE-Sepharose® gegeben, diese wurde vorher mit 50 mM Phosphatpuffer (pH 6,8) äquilibriert. Unter solchen Bedingungen adsorbiert Albumin nicht an die DEAE-Sepharose , sondern läuft durch die Säule.

[v] AUSSALZEN DES HSA

Zu einer 5%-HSA-Lösung wurde Natriumchlorid zu einer Endkonzentration von 1 M gegeben. Die erhaltene Lösung wurde auf einen pH von 3,5 mit Essigsäure eingestellt, um HSA zu präzipitieren und das so präzipitierte HSA wurde von dem flüssigen Überstand durch Zentrifugation abgetrennt, wobei ein Entfernen der Verunreinigungen erzielt wurde. Das Albuminpräzipitat kann als Injektion durch Lösen in einer Flüssigkeit, Einkonzentrieren und Puffer-austauschen der so gelösten Lösung unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran mit einem Molekulargewichtsausschluß von 30.000, Zugabe eines Stabilisators zur so behandelten Lösung, wenn notwendig, und anschließend Unterwerfen der erhaltenen Lösung einer Filtersterilisation, verwendet werden.

[vi] HPLC-ANALYSE DES AUFGEREINIGTEN HSA

Die HSA-Präparation enthalten nach dem Aufreinigungsschritt der hydrophoben Chromatographie wurde mit einer HPLC- Gelfiltration mit den folgenden Bedingungen analysiert.
(a) Säule: TSK-Gel G3000SWxL® (Tosoh Corp.)
(b) Eluent: 0,3 M NaCl/50 mM Phosphatpuffer
(c) Nachweis: Absorption bei 280 nm
Wie in der Fig. 1 gezeigt, wurde für die aufgeweichte HSA- Präparation ein einzelner Peak eines HSA-Monomers gefunden.

[vii] ANALYSE DER KOMPONENTEN, DIE VON DER HEFE STAMMEN

Ein Kulturüberstand eines Hefestamms, der nicht Albumin herstellt, wurde teilweise gemäss dem Aufreinigungsverfahren der vorliegenden Erfindung aufgereinigt und in eine Proteinfraktion und einer Polysaccharidfraktion getrennt. Kaninchen wurden mit der Protein- oder der Polysaccharidfraktion immunisiert. Unter Verwendung einer Antiserumpräparation, die so erhalten wurde, wurde der Nachweis von Komponenten, die von der Hefe stammen, in der aufgereinigten Albuminlösung unter Verwendung eines Enzymimmungssays (EIA) durchgeführt.
Die Ergebnisse des Nachweis von Komponenten, die von der Hefe stammen, in einer Probe erhalten nach dem Aussalzungsschrittes, sind in der Tabelle 4 dargestellt. Die Probe wurde der Messung unterworfen, nachdem die Albuminkonzentration auf 250 mg/ml eingestellt wurde.
Der Gesamtgehalt an von Hefe stammenden Proteinen in der 250 mg/ml Albuminlösung wurde mit 1360 ng/ml im Falle einer Probe erhalten nach Behandlung mit der hydrophoben Chromatographie bestimmt und betrug 5,4 ng/ml in einer Probe nach Anionenaustauscherbehandlung, somit zeigt sie eine Reduktion des Gesamtgehalts auf ein Niveau von 1/250 durch den letztgenannten Aufreinigungsschritt. Weiterhin wurden Proteine, die von der Hefe stammen, nicht in der Aufreinigungsprobe erhalten nach dem Aufsalzungsschritt innerhalb der Nachweisgrenze aufgezeigt.

[viii] EIGENSCHAFTEN DES AUFGEREINIGTEN HSA

(1) MOLEKULARGEWICHT

Die Messungen des Molekulargewichts wurden gemäss dem vorgenannten HPLC-Gelfiltrationsverfahren durchgeführt. Das Molekulargewicht des aufgereinigten HSA, gemäss der vorliegenden Erfindung, wurde mit ca. 67.000 bestimmt, dies ist fast das gleiche wie das von HSA aus Plasma.

(2) ISOELEKTRISCHER PUNKT

Der isoelektrische Punkt wurde mit Polyacrylamid- Gelelektrophorese gemessen, z. B. unter Verwendung von Phastsystem® (Pharmacia). Der isoelektrische Punkt des erfindungsgemäss aufgereinigten HSA wurde mit ca. 4,9 bestimmt, dieser ist fast identisch mit dem von HSA aus Plasma.

(3) FÄRBUNGSGRAD

Absorptionen bei 280 nm, 350 nm und 450 nm wurden gemessen und die Verfärbungsgrade wurden kalkuliert als A&sub3;&sub5;&sub0;/A&sub2;&sub8;&sub0;- Verhältnis und als A&sub4;&sub5;&sub0;/A&sub2;&sub8;&sub0;-Verhältnis. Das A&sub3;&sub5;&sub0;/A&sub2;&sub8;&sub0;- Verhältnis und als A&sub4;&sub5;&sub0;/A&sub2;&sub8;&sub0;-Verhältnis des erfindungsgemässen aufgeweichten HSA wurde bestimmt mit ca. 0,02 bzw. ca. 0,01, diese waren fast identisch zu dem von HSA aus Plasma.

BEISPIEL 2

Das Kulturmedium, erhalten im Referenzbeispiel 2, wurde in der gleichen Weise behandelt wie in den Verfahren beschrieben in Beispiel 1. Die Eigenschaften des so aufgereinigten HSA war im wesentlichen wie die des aufgereinigten HSA offenbart in Beispiel 1 bezüglich des Molekulargewichts, des isoelektrischen Punkts und des Färbegrads, sowie dem Polysaccharidgehalt, dem Gelfiltrationsmuster und Gehalt an Komponenten aus der Hefe.

BEISPIEL 3

Ein 1 ml-Teil der 25%-Lösung des aufgereinigten HSA, erhalten in Beispiel 1, wurde mit 1 g DIAION CRB02® (ein Chelatharz mit einem Styrol-Divinylbenzol-Copolymer als Trägeranteil und einer N-Methylglucamingruppe als Ligandenteil, hergestellt von Mitsubishi Kasei Corp.) vermischt und die erhaltene Mischung wurde für 24 Stunden bei Raumtemperatur bei einem pH von 6,8 und einer Ionenstärke von 5 mmho gerührt. Das Harz wurde dann mit destilliertem Wasser gewaschen, um die nicht-absorbierte Fraktion zu gewinnen. Anschließend wurde das so aufgereinigte HSA bezüglich seiner Eigenschaften, wie in Beispiel 1 aufgeführt, untersucht. Das Molekulargewicht, der isoelektrische Punkt und die Muster der Gelfiltration des so erhaltenen HSA war gleich dem HSA erhalten in Beispiel 1.

(1) ANALYSE DER KOMPONENTEN AUS DER HEFE

Die Ergebnisse des Nachweises der Komponenten aus der Hefe in der 25% HSA-Lösung durch EIA, zusammen mit den Ergebnissen des Beispiel 1, sind in der Tabelle 4 gezeigt. TABELLE 4 ERGEBNISSE DES NACHWEIS DER KOMPONENTEN AUS DER HEFE

(2) FÄRBEGRAD

Die Absorption bei 280 nm, 350 nm, 450 nm und 500 nm wurde gemessen und die Färbegrade wurden berechnet als A&sub3;&sub5;&sub0;/A&sub2;&sub8;&sub0;- Verhältnis und als A&sub4;&sub5;&sub0;/A&sub2;&sub8;&sub0;-Verhältnis und A&sub5;&sub0;&sub0;/A&sub2;&sub8;&sub0;- Verhältnis. Das A&sub3;&sub5;&sub0;/A&sub2;&sub8;&sub0;-Verhältnis, das A&sub4;&sub5;&sub0;/A&sub2;&sub8;&sub0;- Verhältnis und das A&sub5;&sub0;&sub0;/A&sub2;&sub8;&sub0;-Verhältnis des erfindungsgemässen HSA wurde bestimmt auf ca. 0,02, ca. 0,01 bzw. ca. 0,002, dies ist im wesentlichen identisch zu dem von HSA aus Plasma.

(3) GEHALT AN GEBUNDENER FETTSÄURE

Messungen wurden unter Verwendung des NFEA-Test Wako® (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) durchgeführt. Der Gehalt an gebundener Fettsäure war ca. 1,6 mol (pro mol HSA) vor der Chelatsäurebehandlung, wurde aber wesentlich durch die Behandlung auf 0,037 mol pro mol HSA reduziert.

BEISPIEL 4

Das im Referenzbeispiel 2 erhaltene Kulturmedium wurde in der gleichen Weise behandelt wie im Beispiel 1. Die Eigenschaften der 25%-Lösung des so aufgereinigten HSA war im wesentlichen identisch zu denen offenbart in Beispielen 1 und 3 hinsichtlich des Molekulargewichts, des isoelektrischen Punkts, des Färbungsgrads, des Musters der Gelfiltration und des Gehalts an Komponenten aus der Hefe.

BEISPIEL 5

Die 25%-Lösung HSA, erhalten in Beispiel 3, wurde hinsichtlich der Absorption bei 280 nm und 500 nm untersucht. In diesem Fall wurde der Färbegrad als A&sub5;&sub0;&sub0;/A&sub2;&sub8;&sub0;-Verhältnis berechnet. Weiterhin wurden andere HSA-Proben durch Wiederholung des Verfahrens von Beispiel 3 hergestellt, mit Ausnahme, daß DIAION CR 20® (Mitsubishi Kasei Corp.) oder LEWATIT TP214® (Bayer) verwendet wurden anstelle von DIAION CRB02® und die Absorptionen wurden gemessen, um die Färbegrade zu berechnen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 5 dargestellt. Als Kontrollen wurden verschiedene HSA-Proben unter Verwendung von anderen Trägern, als die Chelatharze der vorliegenden Erfindung, sowie anderen Kationenaustauscherarten, Anionenaustauscherarten und Träger für hydrophobe Chromatographie durchgeführt, die Ergebnisse sind ebenfalls in der Tabelle 5 gezeigt. TABELLE 5 FÄRBUNGSGRAD
Bemerkung (*): Färbegrad als OD&sub5;&sub0;&sub0;/OD&sub2;&sub8;&sub0;-Verhältnis, welches als 1,0 definiert wurde im Falle von aufgereinigtem HSA, erhalten durch Referenzbeispiel 1 und Beispiel 1.

BEISPIEL 6 (MESSWELLENLÄNGEN)

Absorption der 25%-Lösung HSA, erhalten in Beispiel 3, wurde bei Wellenlängen von 350 nm bis 650 nm gemessen. Abnehmende Absorptionsgrade wurden gefunden. Das niedrigste Verhältnis wurde bei einer Wellenlänge von 500 nm gefunden. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 6 gezeigt.

TABELLE 6 ABNEHMENDER ABSORPTIONSGRAD

Abnahmeverhältnis (%)

A&sub3;&sub5;&sub0;/A&sub2;&sub8;&sub0; 57
A&sub4;&sub0;&sub0;/A&sub2;&sub8;&sub0; 37
A&sub4;&sub5;&sub0;/A&sub2;&sub8;&sub0; 35
A&sub5;&sub0;&sub0;/A&sub2;&sub8;&sub0; 20
A&sub5;&sub5;&sub0;/A&sub2;&sub8;&sub0; 34
A&sub6;&sub0;&sub0;/A&sub2;&sub8;&sub0; 54
A&sub6;&sub5;&sub0;/A&sub2;&sub8;&sub0; 56

Ausgangsmaterial: 100%

BEISPIEL 7

Das Verfahren des Beispiels 3 wurde wiederholt mit Ausnahme, das DIAION CR20® (Mitsubishi Kasei Corp.) verwendet wurde anstelle des Chelatharzes DIAION CRB02® bei dem Behandlungsschritt unter Verwendung von 1 ml 25% rekombinanter HSA-Lösung. DIAION CR20® ist ein Chelatharz mit einer -NH(CH&sub2;CH&sub2;NH)nH-Gruppe als Ligand, angeheftet an den Styrol-Divinylbenzol-Copolymerträger. Wenn das so gewonnene HSA auf anhängende Fettsäuren untersucht wurde, wurden ähnliche Ergebnisse wie im Falle des Beispiels 6 erhalten.

BEISPIEL 8

Das Verfahren des Beispiels 3 wurde wiederholt mit Ausnahme, dass LEWATIT TP214® (Bayer) anstelle des Chelatharzes DIAION CRB02® bei dem Behandlungsschritt von 1 ml 25% rekombinante HSA-Lösung verwendet wurde. LEWATIT TP214® ist ein Chelatharz mit einer -NHCSNH&sub2;-Gruppe als Ligand, gebunden an den Styrol-Divinylbenzol-Copolymerträger. Wenn das so gewonnene HSA auf gebundene Fettsäuren untersucht wurde, wurden ähnliche Ergebnisse wie im Falle des Beispiels 6 erhalten.

BEISPIEL 9

REINHEIT

Antikörper gegen Hefekomponenten wurden hergestellt, um Verunreinigungen an Hefekomponenten mit einer hohen Sensitivität nachzuweisen. Nach Kultivieren von nicht- Albumin-herstellender Hefe wurden Hefekomponenten teilweise aus dem Kulturüberstand aufgereinigt und in einer Proteinfraktion und einer Polysaccharidfraktion getrennt. Jede Fraktion wurde zur Immunisierung von Kaninchen verwendet, um einen Antikörper gegen die Proteinfraktion und einen Antikörper gegen die Polysaccharidfraktion zu erhalten. Ein EIA wurde unter Verwendung dieser Antikörper entwickelt. Bei dem EIA-System lag die Nachweisgrenze für das Protein bzw. Polysaccharid bei 0,1 ng/ml bzw. 1 ng/ml. In von Beispiel 3 erhaltenem aufgereinigtem HSA wurden bei einer Konzentration von 250 mg/ml keine Hefekomponenten unter Verwendung dieses EIA-Systems nachgewiesen. D. h. die Gehalte von Hefe stammenden Proteinen und Polysacchariden im aufgereinigten rekombinanten Albumin bei einer Konzentration von 25% war weniger als 0,1 ng/ml bzw. weniger als 1, ng/ml. Mit anderen Worten die Reinheit des rekombinanten Albumins war größer als 99,999999%. Auf kontaminierende DNA wurde mit dem Threshold-Verfahren, wie in Science, 240, 1182 (1988) beschrieben, untersucht. Im aufgereinigten rekombinanten Albumin wurde keine DNA in einem 2 ml-Extrakt einer 25% - Albuminlösung nachgewiesen. Da die Nachweisgrenze dieses Systems 4 pg/2 ml einer 25% Albumin war, war die Menge an kontiminierenden DNA kleiner als dieser Wert. Pyrogene wurden unter Verwendung eines Reagenskits, Endospacy (Seikagaku Corp.) gemessen. Der Pyrogengehalt war kleiner als 0,1 EU/ml bei 25% rekombinanten Albumin, ein ausreichend niedriger Wert. Bei dem Pyrogentest unter Verwendung von Kaninchen wurde kein Temperaturanstieg bei einer Dosierung von 2,5 g/kg beobachtet.

ZUSAMMENSETZUNG UND STRUKTUR

Um sich die Zusammensetzung und Struktur des rekombinanten Albumins anzuschauen, wurde eine Aminosäureanalyse durchgeführt und in einem CD-Spektrum gemessen. Die Aminosäurezusammensetzung und die N- und C-terminale Sequenz des rekombinanten Albumins war identisch zu der von Plasmaalbumin. Die Ergebnisse waren somit in Einklang mit der Sequenz der c-DNA. Peptide mapping des rekombinanten Albumins wurde durchgeführt. Albumin wurde durch Lysyl-Endopeptiase abgebaut, anschließend wurde jedes Peptid mittels Umkehrphasen HPLC getrennt. Als Ergebnis des Vergleichs der Peptid-mapping-Muster war das Elutionsprofil des rekombinanten Albumins konsistent mit dem von Plasmaalbumin.
Um die höhere Struktur des rekombinanten Albumins zu untersuchen wurde ein CD-Spektrum des Albumins gemessen. Das CD-Spektrum des rekombinanten Albumins war identisch in Form und Ausdehnung zu dem von Plasmaalbumin in der Region von 350 nm bis 195 nm.

BIOLOGISCHE CHARAKTERISIERUNG

Eins der wichtigsten biologischen Funktionen von Albumin ist die Ligandenbindung. Albumin bindet verschiedene Materialien. Die Bindungsfähigkeit von Albumin an drei typische Materialien wurden untersucht. Bilirubin wurde ausgewählt, um ein Pigment zu repräsentieren. Warfarin wurde zur Darstellung von Arzneimitteln verwendet und Laurinsäure als Repräsentant für die Fettsäure. Das Binden dieser drei Materialien wurde mittels dem Scatchard-Plotmodell analysiert. Die Bindungskonstanten und die Zahl an Bindungsstellen dieser drei Materialien an rekombinantes Albumin war konsistent mit denen von Plasmaalbumin. Die Bindungskurven von Laurinsäure an Albumin sind in der Fig. 2 als ein Beispiel gezeigt.
Wie in Fig. 2 gezeigt, ist die Bindungskurve von rekombinantem Albumin konsistent mit der von Plasmaalbumin.
Die Ergebnisse der Bindungsaffinität von rekombinanten Albumin mit diesen Liganden war im wesentlichen identisch zu den von Plasmaalbumin, was auf die biologische Äquivalents zwischen den beiden Albuminen hindeutet.

VORKLINISCHE STUDIE

Vorläufige Daten wurden während vorklinischer Studien bei Tieren gesammelt. Die Halbwertszeit von rekombinanten Albumin in Hundeblut war im wesentlichen identisch zu der von Plasmaalbumin (rekombinantes Albumin; 6,3±0,5 Tage, Plasmaalbumin; 6,0±0,7 Tage).
Die folgenden hämodynamischen Parameter wurden in den Hunden getestet: Blutdruck; zentraler Venendruck; Druck in der Lungenarterie; Herzausstoss; Blutgas; Atmung und Elektrocardiogramm. Bei Dosen von 0,5 bis 1,5 g/kg wurden die gleichen Ergebnisse für rekombinantes Albumin und für Plasmaalbumin erhalten.
Die Ergebnisse eines Pyrogentests unter Verwendung von Kaninchen zeigten keinen Temperaturanstieg bei Dosen bis 2,5 g/kg.
Ein akuter Toxizitätstest von rekombinantem Albumin zeigte keine Toxizität in Affen und Ratten bis zu Dosen von 12,5 g/kg.

BEISPIEL 10

In einem entsprechenden Volumen des mit destilliertem Wasser zur Injektion wurden 5 g von der Hefe-stammendes HSA, erhalten in Beispiel 1, 107,3 mg Acetyltryptophannatriumsalz und 66,5 mg Natriumcaprylat gelöst, um eine 20 ml pharmazeutische Präparation enthaltend 25% der HSA zu erhalten. Die erhaltene pharmazeutische Präparation bestand aus 25% HSA, 0,02 M Acetyltryptophannatriumsalz und 0,02 M Natriumcaprylat. Der Natriumchloridgehalt wurde mit der 3,7 mg/ml bestimmt, der pH war 7,0 und der osmotische Druck war ca. 1, ausgedrückt als Verhältnis gegenüber physiologischer Salzlösung.

BEISPIEL 11

Die Lagerstabilität der HSA-enthaltenden pharmazeutischen Präparation, erhalten in Beispiel 10, wurde untersucht. Die Bestimmung von Dimeren (Molekulargewichtsverteilung) wurde durch Gelfiltrationsanalyse durchgeführt, die des Färbungsgrades durch Absorptionsanalyse (A&sub3;&sub5;&sub0;/A&sub2;&sub5;&sub0;) und die der Polymere oder Zersetzungsprodukte durch Elektrophorese (SDS-PAGE). Die Ergebnisse sind in Tabellen 7 und 8 gezeigt. Gemäss der vorliegenden Erfindung tritt Chelatinieren des HSA aus. Der Gehalt an Dimeren nahm graduell zu, wenn bei 40ºC, Polymere oder Zersetzungsprodukte wurden aber nicht gefunden. TABELLE 7 CRYOKONSERVIERUNGSTEST BEI -20ºC FÜR 8 WOCHEN TABELLE 8 BESCHLEUNIGTER LAGERUNGSTEST BEI 40ºC FÜR 3 MONATE
Während die vorliegende Erfindung ausführlich und unter Bezugnahme von spezifischen Ausführungsformen beschrieben wurde, ist es für den Fachmann klar, dass verschiedene Veränderungen und Modifikationen gemacht werden können, ohne dass der Schutzumfang verlassen wird.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von rekombinanten humanen Serumalbumin, umfassend die Schritte:

(1) Behandlung eines Kulturüberstandes eines Wirts, der humanes Serumalbumin exprimiert, mit einer ersten Ultrafiltrationsmembran mit einem Molekulargewichtsausschluß von 100.000 bis 500.000 und anschließend mit einer zweiten Ultrafiltrationsmembran mit einem Molekulargewichtsausschluß von 1.000 bis 50.000, um ein erstes Filtrat zu erhalten;

(2) Hitzebehandeln des ersten Filtrats bei 50 bis 70ºC für 30 Minuten bis 5 Stunden, um eine erhitzte Probe zu erhalten;

(3) Säurebehandlung der erhitzten Probe bei einem pH von 3 bis 5, um eine säurebehandelte Probe zu erhalten;

(4) Behandeln der säurebehandelten Probe mit einer Ultrafiltrationsmembran mit einem Molekulargewichtsausschluß von 100.000 bis 500.000, um ein zweites Filtrat zu erhalten;

(5) Unterwerfen des zweiten Filtrats einem Kationenaustauscher bei einem pH von 3 bis 5 und einer Salzkonzentration von 0,01 bis 0,2 M und anschließend Aussetzen des Kationenaustauschers einem pH von 8 bis 10 und einer Salzkonzentration von 0,2 bis 0,5 M, um ein erstes Eluat zu erhalten;

(6) Inkontaktbringen des ersten Eluats mit einem Träger für eine hydrophobe Chromatographie bei einem pH von 6 bis 8 und einer Salzkonzentration von 0,01 bis 0,5 M und Gewinnen der nicht-adsorbierten Fraktionen, um ein zweites Eluat zu erhalten; und

(7) Inkontaktbringen des zweiten Eluats mit einem Anionanaustauscher bei einem pH von 6 bis 8 und einer Salzkonzentration von 0,01 bis 0,1 M und Gewinnen der nicht-adsorbierten Fraktionen, um das Albumin zu gewinnen.

2. Verfahren zur Herstellung von humanem Serumalbumin gemäss Anspruch 1, wobei im Schritt (6) die Salzkonzentration von 1 bis 3 M und anschließend der Träger einer Salzkonzentration von 0,01 bis 0,5 M ausgesetzt wird, um ein zweites Eluat zu erzielen.

3. Verfahren zur Herstellung von humanem Serumalbumin gemäss Anspruch 1, wobei im Schritt (7) das zweite Eluat in Kontakt gebracht wird mit einem Anionenaustauscher bei einem pH von 6 bis 8 und einer Salzkonzentration von 0,001 bis 0,05 M und anschließend wird der Anionenaustauscher einem pH von 6 bis 8 und einer Salzkonzentration von 0,05 bis 1 M ausgesetzt.

4. Verfahren zur Herstellung von humanem Serumalbumin gemäss Anspruch 1, weiter umfassend einen Salzkonzentrationsschritt folgend dem Schritt (5), Schritt (6) oder Schritt (7), dieser Salzpräzipitationsschritt umfaßt Aussetzen des ersten Eluats, zweiten Eluats oder Albumins bei einem pH von 3 bis 5 einer Salzkonzentration von 0,1 bis 3 M, um ein Präzipitat zu erhalten und Lösen dieses Präzipitats in einem Puffer.

5. Verfahren zur Herstellung von humanem Serumalbumin gemäss Anspruch 1, weiterhin umfassend das Aussetzen des Albumins vom Schritt (7) einem Chelatharz und Gewinnen der nicht-adsorbierten Fraktionen, um Albumin zu erhalten.

6. Verfahren zur Herstellung von humanem Serumalbumin gemäss Anspruch 5, wobei das Chelatharz eine Austauschgruppe als eine Liganden hat, die in der Lage ist eine Chelatformation zu machen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Polyolgruppe, einer Polyamingruppe und einer Thioharnstoffgruppe.

7. Verfahren zur Herstellung von humanem Serumalbumin gemäss Anspruch 1, wobei der Hitzebehandlungsschritt (2) in Anwesenheit einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Acetyltryptophan, einer organischen Carbonsäure und organischem Carbonsäuresalz, durchgeführt wird.

8. Verfahren zur Herstellung von humanem Serumalbumin gemäss Anspruch 1, wobei der Hitzebehandlungsschritt (2) in Anwesenheit einer Thiolverbindung durchgeführt wird.

9. Verfahren zur Herstellung von humanem Serumalbumin gemäss Anspruch 1, wobei der Hitzebehandlungsschritt (2) in Anwesenheit von Aminoguanidin durchgeführt wird.