DE69431097T2

DE69431097T2 - Verfahren zur Herstellung von humanem Serumalbumin

Info

Publication number: DE69431097T2
Application number: DE69431097T
Authority: DE
Inventors: Kaoru Kobayashi; Shinobu Kuwae; Toyoo Ohda; Tomoshi Ohya; Kenji Tomomitsu
Original assignee: Mitsubishi Pharma Corp
Current assignee: Mitsubishi Pharma Corp
Priority date: 1993-11-26
Filing date: 1994-11-25
Publication date: 2003-02-06
Anticipated expiration: 2014-11-26
Also published as: TW418256B; ES2179835T3; US5759819A; EP0655503B1; KR950014308A; EP0655503A1; CA2136564A1; US5631145A; CA2136564C; DE69431097D1; DK0655503T3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG:

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verbesserung eines Verfahrens zur Herstellung von Humanserumalbumin (nachfolgend als HSA bezeichnet) durch Kultivierung eines Wirts, der mittels Genmanipulationstechniken transformiert wurde.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG:

HSA ist eine der wesentlichen, das Blutplasma bildenden Komponenten und wird in pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Behandlung von massiven Blutungen, Schock, Verbrennungen, Hypoproteinämie oder fötaler Erythroblastose verwendet.
Gegenwärtig wird HSA hauptsächlich als ein fraktioniertes Produkt aus Blutspenden gewonnen. Ein solcher Herstellungsverfahren weist jedoch Probleme auf, da es wirtschaftlich nachteilig und die Blutversorgung sporadisch ist. Ferner kann das Blut selbst mit einem Problem behaftet sein, da Blut unerwünschte Substanzen enthalten kann, wie beispielsweise Hepatitisviren.
Die kürzliche Entwicklung rekombinanter DNA-Techniken machte die Herstellung verschiedener nützlicher Polypeptide durch Mikroorganismen und Zellen möglich und es wurden Anstrengungen bezüglich der Erforschung, Entwicklung und Herstellung von HSA in grossem Massstab mittels Genmanipulationstechniken durchgeführt. Aufgrund der geringen Produktionsausbeuten besteht jedoch ein noch nicht überwundenes Problem bezüglich der Einführung von Techniken für hohe Reinheit, geringe Kosten und industrielle Herstellung von HSA.
Die Kultivierung eines durch Genmanipulationstechniken hergestellten HSA produzierenden Wirts in einem Medium wurde bei 30ºC durchgeführt, sofern der Wirt ein Hefestamm ist (JP-A-3-83595 und JP-A-4-299984, entsprechend EP-A-506 040; der Ausdruck "JP-A", wie er hier verwendet wird, bedeutet eine "ungeprüfte veröffentlichte, japanische Patentanmeldung").

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG:

Unter den obigen Umständen ist es ein erfindungsgemässes Ziel, die Produktivität der HSA-Herstellung zu erhöhen, insbesondere durch Verbesserung der Kultivierungsbedingungen.
Mit dem Verlangen, das obige Ziel zu erreichen, haben die hiesigen Erfinder intensive Studien durchgeführt und haben herausgefunden, dass die Produktivität der HSA-Herstellung erhöht, die Wachstumsausbeute des HSA produzierenden Wirts verbessert und die Färbung des Produkts inhibiert werden kann, wenn ein durch Genmanipulationstechniken hergestellter, HSA-erzeugender Wirt bei einer Temperatur von 21-29ºC kultiviert wird. Die vorliegende Erfindung wurde auf Basis dieses Befunds erhalten.
Folglich wird erfindungsgemäss ein Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Humanserumalbumin bereitgestellt, das die Kultivierung eines Humanserumalbumin-erzeugenden Wirts, der durch Genmanipulationstechniken hergestellt wurde, bei einer Temperatur von 21-29ºC umfasst.
Weitere Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung sind aus der nachfolgenden Beschreibung ersichtlich.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG:

Der erfindungsgemäss zu verwendende, durch Genmanipulationstechniken hergestellte, HSA-erzeugende Wirt ist nicht sonderlich beschränkt, mit der Massgabe, dass er mittels Genmanipulationstechniken hergestellt wird, und es können beliebige der in den veröffentlichten Berichten offenbarten Wirte und solche, die in der Zukunft entwickelt werden, frei nach Wunsch verwendet werden. Illustrative Beispiele für derartige Wirte schliessen Zellen von Mikroorganismen ein, wie beispielsweise Escherichia coli, Hefen oder Bacillus subtilis, sowie tierische Zellen, die durch Genmanipulationstechniken zu HSA-erzeugenden Zellen gemacht wurden. Erfindungsgemäss ist es wünschenswert, einen Hefestamm zu verwenden, insbesondere einen solchen, der zum Genus Saccharomyces gehört, wie beispielsweise Saccharomyces cerevisiae, zum Genus Pichia, wie beispielsweise Pichia pastoris, oder zum Genus Kluyveromyces, wie beispielsweise Kluyveromyces lactis. Es kann auch ein auxotropher Stamm oder ein Antibiotika-empfindlicher Stamm verwendet werden. G 418- sensitive Stämme, wie beispielsweise Saccharomyces cerevisiae AH 22 (a, his 4, leu 2, can 1), Pichia pastoris GTS 115 (his 4) und Kluyveromyces lactis MW98-8C (α, uraA, arg, lysK&spplus;, pKD1&sup0;) können ebenfalls bevorzugt verwendet werden.
Die Herstellung des HSA-erzeugenden Wirts, die Herstellung von HSA durch Kultivierung des Wirts und die Isolierung und Abtrennung des HSA aus der Kulturbrühe werden gemäss bekannten Verfahren, die geringfügig modifiziert werden können, durchgeführt. Beispielsweise kann die Herstellung eines HSA-erzeugenden Wirts (oder eines HSA-erzeugenden Stammes) bewirkt werden unter Anwendung eines Verfahrens, worin ein natürliches Humanserumalbumin-Gen verwendet wird (JP-A-58-56684, entsprechend EP-A-73 646, JP-A-58-90515, entsprechend EP-A-79 739 und JP-A-58-150517, entsprechend EP-A-91 527), ein Verfahren, worin ein neues Humanserumalbumin-Gen verwendet wird (JP-A-62-29985 und JP-A-1-98486, entsprechend EP-A-206 733), ein Verfahren, worin eine synthetische Signalsequenz verwendet wird (JP-A-1-240191, entsprechend EP-A-329 127), ein Verfahren, worin eine Serumalbumin-Signalsequenz verwendet wird (JP-A-2-167095, entsprechend EP-A-319 641), ein Verfahren, worin ein rekombinantes Plasmid in ein Chromosom eingefügt wird (JP-A-3-72889, entsprechend EP-A-399 455), ein Verfahren, worin Wirte miteinander verschmolzen werden (JP-A-3-53877, entsprechend EP-A-409 156), ein Verfahren, worin in einem methanolhaltigen Medium eine Mutation erzeugt wird, ein Verfahren, worin ein AOX&sub2;- Mutationspromotor verwendet wird (JP-A-4-299984, entsprechend EP-A-506 040), ein Verfahren, worin HSA in B. subtilis exprimiert wird (JP-A-62-215393, entsprechend EP-A-229 712), ein Verfahren, worin HSA in Hefe exprimiert wird (JP-A-60-41487, entsprechend EP-A-123 544, JP-A-63-39576, entsprechend EP-A-251 744 und US-PS 4 937 193, und JP-A-63-74493, entsprechend EP-A-28 637) und ein Verfahren, worin HSA in Pichia exprimiert wird (JP-A-2-104290, entsprechend EP-A-344 459).
Das Verfahren, in dem in einem methanolhaltigen Medium eine Mutation erzeugt wird, wird in der folgenden Weise durchgeführt. Zuerst wird ein 5' nicht-codierender Bereich des HSA-Gens aus einem eine Transkriptionseinheit enthaltenden Plasmid pHSA113, das so aufgebaut ist, dass es HSA unter der Steuerung eines AOX1-Promotors exprimiert, entfernt (siehe JP-A-2-103290, entsprechend EP-A-344 459 bezüglich des Plasmids pHSA113 und JP-A-63-39584, entsprechend EP-A-244 598 bezüglich des AOX&sub1;-Promotors), wodurch ein HSA-Expressionsplasmid pPGP1 hergestellt wird. Dann wird das Plasmid pPGP1 in die AOX&sub1;- Genregion eines geeigneten Wirts, vorzugsweise eine Pichia-Hefe, weiter bevorzugt den Pichia-Stamm GTS 115 (NRRL Hinterlegungs-Nr. Y-15851) gemäss einem Verfahren, das in JP-A-2-104290, entsprechend EP-A-344 459, offenbart ist, integriert, wodurch ein Transformant erhalten wird (PC4130, wenn Pichia-Stamm GTS 115 verwendet wird). Da der so erhaltene Transformant in einem methanolhaltigen Medium nicht gut wächst (Mut&supmin;-Stamm), wird die Mutation des Transformanten durch Kultivierung des Transformanten in einem methanolhaltigen Medium gemäss einem Verfahren, das in JP-A-4-299984, entsprechend EP-A-506 040, offenbart ist, bewirkt, wodurch ein Mutantenstamm isoliert wird, der in der Lage ist, in dem Medium zu wachsen. Die Methanolkonzentration in dem Medium kann im Bereich von etwa 0,0001-5% (vorzugsweise etwa 1-5%) liegen. Das Medium kann entweder synthetisch oder natürlich sein und die Kultivierung kann bei 15-40ºC (vorzugsweise um 30ºC) für 1-1.000 Stunden (vorzugsweise etwa 20-120 Stunden) durchgeführt werden. Beispiele für das natürliche Kulturmedium schliessen YP-Medium (1% Hefeextrakt und 2% Polypepton) ein.
Die Kultivierung eines HSA-erzeugenden Wirts (ein HSA- Herstellungsverfahren) kann unter Anwendung bekannter Verfahren durchgeführt werden, die in den zuvor genannten Literaturstellen offenbart sind, oder gemäss einem Verfahren, das in JP-A-3-83595 offenbart ist, worin eine Hochkonzentrations-Substratinhibierung der HSA- Erzeugerzellen durch langsame Zugabe einer hochkonzentrierten Glucoselösung zu einem Medium mittels einer Fermentation unter schubweiser Zuführung vermieden wird, wodurch die Erzeugung sowohl der Erzeugerzellen als auch des Produkts in hohen Konzentrationen ermöglicht wird, oder gemäss einem anderen Verfahren, das in JP-A-4-293495, entsprechend EP-A-504 823, und US-PS 5 334 512 offenbart ist, worin die Produktivität von HSA durch Zugabe von Fettsäuren zu dem Medium verbessert wird.
Die Isolierung und Abtrennung von HSA kann unter Anwendung bekannter Verfahren durchgeführt werden, die in den zuvor genannten Literaturstellen offenbart sind, oder gemäss einem Verfahren, das in JP-A-3-103188, entsprechend EP-A-420 007, und US-PS 4 132 404 offenbart ist, worin Proteasen durch Wärmebehandlung inaktiviert werden, oder nach einem Verfärbungs-Inhibitionsverfahren, das in JP-A-4-54198, entsprechend US-PS 5 294 699 oder EP-A-464 590, offenbart ist, worin HSA von färbenden Substanzen unter Verwendung mindestens eines Adsorptionsmittels, ausgewählt aus Anionenaustauschern, hydrophoben Trägern und Aktivkohle, abgetrennt wird.
Als Medium zur Kultivierung eines transformierten Wirts kann ein üblicherweise im Stand der Technik verwendetes Medium angewandt werden, und die Kultivierung des Transformanten kann unter bekannten Bedingungen durchgeführt werden. Das Medium kann entweder synthetisch oder natürlich sein, bevorzugt ist jedoch ein flüssiges Medium. Beispielsweise kann ein geeignetes synthetisches Medium zusammengesetzt sein aus: Kohlenstoffquellen, wie beispielsweise verschiedenen Sacchariden; Stickstoffquellen, wie beispielsweise Harnstoff, Ammoniumsalzen, Nitraten; Spurennährmitteln, wie verschiedenen Vitaminen und Nukleotiden; und anorganischen Salzen, wie beispielsweise von Mg, Ca, Fe, Na, K, Mn, Co und Cu. Ein illustratives Beispiel für ein solches Medium ist flüssiges YNB-Medium, das aus 0,7% Hefe-Stickstoff- Base (Difco) und 2% Glucose besteht. Ein illustratives Beispiel für ein geeignetes natürliches Medium ist flüssiges YPD-Medium, das aus 1% Hefeextrakt (Difco), 2% Bacto Pepton (Difco) und 2% Glucose besteht. Der pH-Wert des Mediums kann neutral, schwach basisch oder schwach sauer sein und liegt vorzugsweise im Bereich von 5,7 bis 6,5. Im Fall eines methylotrophen Wirts kann das Medium ferner mit Methanol in einer Menge von etwa 0,01-5% angereichert sein.
Sofern nur die Herstellbarkeit von HSA in Betracht gezogen wird, kann die Kultivierung eines Wirts bei 21-25ºC durchgeführt werden, weiter bevorzugt bei 21-23ºC.
Wenn die Kultivierungstemperatur höher ist als der obige Bereich, werden das Wachstum des Wirts und die HSA- Produktion inhibiert und die Verfärbung des HSA nimmt zu.
Wenn der Wirt bei einer Temperatur unterhalb des obigen Bereichs kultiviert wird, sind erhöhte Kosten und ein komplizierter Betrieb zur Steuerung der Temperatur erforderlich, da die Kultivierung exotherm ist. Folglich kann in der praktischen Anwendung die Kultivierung bei 21-29ºC, vorzugsweise 21-28ºC, weiter bevorzugt 23-28ºC, am meisten bevorzugt 25-27ºC, durchgeführt werden.
Die Kultivierung des HSA-erzeugenden Wirts, beispielsweise eines Hefestammes, innerhalb des obigen Temperaturbereichs ermöglicht nicht nur die Erhöhung HSA-Ausbeute um einen Faktor 1,3-1,5, sondern verringert ferner die Verfärbung von HSA um 10-30% im Vergleich zu der herkömmlichen Kultivierung bei 30ºC.
Der Kultivierungszeitraum reicht von 1-1.000 Stunden, vorzugsweise 20-360 Stunden, durch statische oder Schüttelkultivierung oder ansatzweise, halbansatzweise oder kontinuierliche Kultivierung unter Rühren und Belüften. Es ist wünschenswert, vor der ansatzweisen Kultivierung mittels statischer oder Schüttelkultivierung oder der ansatzweisen, halbansatzweisen oder kontinuierlichen Kultivierung unter Rühren und Belüftung eine Impfkultur herzustellen. Die Impfkultivierung kann durchgeführt werden unter Verwendung des zuvor genannten, flüssigen YNB- oder YPD-Mediums, vorzugsweise bei 30ºC (für einen Hefewirt) oder 37ºC (für einen Bakterienwirt) für 10-100 Stunden.
Nach Beendigung der Kultivierung wird HSA von dem resultierenden Kulturmedium, den mikrobiellen Abbauprodukten oder Zellen gemäss bekannten Isolier- und Reinigungsverfahren abgetrennt.
Die nachfolgenden Beispiele dienen der weiteren Illustration der vorliegenden Erfindung. Es ist jedoch ersichtlich, dass die Beispiele lediglich dem Zweck der Darstellung dienen und nicht als eine Definition der Grenzen der vorliegenden Erfindung anzusehen sind.

BEISPIEL 1

(1) Herstellung eines HSA-erzeugenden Wirtstammes:

Ein 5' nicht-codierender Bereich des HSA-Gens wurde aus einem Plasmid pHSA113, das in JP-A- 2 104290, entsprechend EP-A-344 459, beschrieben ist und eine Transkriptionseinheit enthält, die so aufgebaut ist, dass sie unter der Steuerung eines AOX&sub1;-Promotors HSA exprimiert, entfernt, wodurch ein HSA-Expressionsplasmid pPGP1 hergestellt wurde. Dann wurde gemäss einem Verfahren, das in JP-A-2-104290, entsprechend EP-A-344 459, offenbart ist, das HSA-Expressionsplasmid pPGP1 mit NotI aufgeschlossen und das resultierende NotI- aufgeschlossene Fragment wurde mit dem AOX&sub1;-Genbereich eines Pichia pastoris-Stammes GTS 115 (his4) substituiert, wodurch ein Transformant PC4130 hergestellt wurde. Der Stamm wächst aufgrund der Entfernung des AOX&sub1;-Gens nicht gut in einem Medium, das Methanol als Kohlenstoffquelle enthält (Mut&supmin;-Stamm).
Der Stamm PC4130 wurde in 3 ml YPD-Medium (1% Hefeextrakt, 2% Bacto Pepton und 2% Glucose) inokuliert. Nach 24 Stunden Kultivierung wurden die Zellen in 50 ml YPD-Medium in einer solchen Weise inokuliert, dass die Zelldichte eine Anfangstrübung, entsprechend einem OD&sub5;&sub4;&sub0; von 0,1 aufwies. Nach 3-tägiger Kultivierung bei 30ºC wurden die resultierenden Zellen erneut in 50 ml YPD- Medium bei einer anfänglichen Zellturbidität von 0,1 bei OD&sub5;&sub4;&sub0; inokuliert. Danach wurde eine solche Kultivierung alle 3 Tage in der gleichen Weise durchgeführt. Nach jeder Subkultivierung wurden die Zellen mit sterilem Wasser verdünnt und auf eine 2% MeOH-YNBw/oa.a.-Platte (0,7% Hefe-Stickstoff-Base ohne Aminosäuren, 2% Methanol und 1,5% Agarpulver) in einer Inokulumgrösse von 10&sup7; Zellen/Platte gegossen, gefolgt von 5-tägiger Kultivierung bei 30ºC, wodurch die Anwesenheit oder Abwesenheit von Kolonien beurteilt wurde. Auf der 2% MeOH-YNBw/oa.a.-Platte wurden nach 12-tägiger aufeinanderfolgender Subkultivierung 20 Kolonien gefunden. Mut&supmin;-Stämme würden auf dem 2% MeOH-YNBw/oa.a.-Medium kaum wachsen, während Mut&spplus;-Stämme gut wachsen. Daher bedeutet das Auftreten einer Kolonie, dass es sich um einen Mut&spplus;- Stamm handelt, der die Fähigkeit zur erhöhten Methanolassimilierung erworben hat. Eine dieser so erhaltenen Kolonien wurde in geeigneter Weise mit sterilem Wasser verdünnt und zur Isolierung einzelner Kolonien auf einer 2% MeOH-YNBw/oa.a.-Platte ausgestrichen. Eine der resultierenden Einzelkolonien wurde als GCP101 bezeichnet.
Unter Verwendung eine AOX&sub2;-Promotors [eine Mutante des natürlichen AOX&sub2;-Promotors (YEAST, 5, 167-177, 1988; Mol. Cell. Biol., 9, 1316-1323, 1989), worin die 255. Base oberhalb des Startcodons des Promotors von T auf C verändert ist], der aus dem Stamm GCP101 isoliert wurde, wurde ein HSA-Expressionsplasmid pMM042 aufgebaut. Das so aufgebaute Plasmid wurde in Pichia pastoris GTS115 eingeführt, wodurch ein Transformant UHG42-3 (EP-A-506 040) erhalten wurde.

(2) Zusammensetzung des Mediums:

Für die Impfkultur wurde YPD-Medium (2% Bacto Pepton, 1% Hefeextrakt und 2% Glucose) verwendet. Die Zusammensetzungen des Ansatzkulturmediums und des Nährmediums sind in Tabelle 1 bzw. Tabelle 2 gezeigt.

TABELLE 1

Zusammensetzung des Ansatzkulturmediums

Komponenten Menge pro Liter

Glycerin 50,0 g
H&sub3;PO&sub4; (85%) 14,0 ml
CaSO&sub4;·2H&sub2;O 0,6 g
K&sub2;SO&sub4; 9,5 g
MgSO&sub4;·7H&sub2;O 7,8 g
KOH 2,6 g
Biotinlösung*1 1,6 ml
YTM-Lösung*2 4,4 ml
*1: Biotinlösung: 0,2 g/l
*2: die YTM-Lösung hatte die folgende Zusammensetzung:

Komponenten Menge pro Liter

FeSO&sub4;·7H&sub2;O 65,0 g
CuSO&sub4;·5H&sub2;O 6,0 g
ZnSO&sub4;·7H&sub2;O 20,0 g
MnSO&sub4;·4-5H&sub2;O 3,0 g
H&sub2;SO&sub4; 5,0 ml

TABELLE 2

Zusammensetzung des Nährmediums

Komponenten Menge

YTM-Lösung 2 ml
Methanol 1.000 ml

(3) Kultivierungsverfahren unter Verwendung eines 3 l-Fermentors:

1. Impfkultur:

Eine 1 ml-Portion des Stammes UHG42-3, die in einer eingefrorenen Lagerampulle enthalten war, wurde in einen 300 ml-Erlenmeyer-Kolben (baffled), der 50 ml YDP-Medium enthielt, inokuliert und bei 30ºC für 24 Stunden unter Schütteln kultiviert. Nach 24-stündigem Kultivieren wurde eine 14 ml-Portion der Kulturbrühe in 700 ml des Ansatzkulturmediums inokuliert.

2. Hauptkultur:

Eine 14 ml-Portion der Impfkulturbrühe wurde in einen 3 l- Minikessel-Fermentor, der 700 ml des Ansatzkulturmediums enthielt, inokuliert und einer belüfteten Rührkultivierung unterzogen. Bei Kultivierungstemperaturen von 21, 23, 25, 27, 28 und 30ºC wurden separate Hauptkulturen durchgeführt. Die oberen und unteren Grenzwerte der Rührgeschwindigkeit wurden auf 200 bzw. 1.000 U/min eingestellt. Die Hauptkultivierung wurde durch Steuerung der Menge des in dem Medium gelösten Sauerstoffs auf etwa 50% der Sauerstoff-Sättigungslösungskonzentration durchgeführt. Als das Glycerin in dem Ansatzkulturmedium verbraucht war, wurde mit der Zugabe eines Nährmediums begonnen. Der pH-Wert des Mediums wurde auf ein konstantes Niveau von 6,2 gesteuert. Die Entschäumung wurde durch bedarfsweise Zugabe eines Schaumverhinderers zu dem Medium bewirkt. Die Kultivierung wurde für 360 Stunden durchgeführt.

(4) Kultivierungsverfahren unter Verwendung eines 1.200 l-Fermentors:

1. Erste Impfkultur:

Eine 1 ml-Portion des Stammes UHG43-3, die in Glycerin eingefroren worden war, wurde in einen 1.000 ml- Erlenmeyer-Kolben (baffled), der 200 ml YPD-Medium enthielt, inokuliert und bei 30ºC für 24 Stunden unter Schütteln kultiviert.

2. Zweite Impfkultur:

Die erste Impfkulturbrühe wurde in einem 10 l-Kessel- Fermentor, der 5 l YPD-Medium enthielt, inokuliert und die zweite Impfkultivierung wurde bei 30ºC für 24 Stunden unter Rühren durchgeführt. Die Kultivierung wurde durchgeführt unter Steuerung der Menge des in dem Medium gelösten Sauerstoffs auf etwa 50% der Sauerstoff- Sättigungslösungskonzentration. In der Impfkultivierung wurde der pH-Wert des Mediums nicht gesteuert.

3. Hauptkultur:

Die zweite Impfkulturbrühe wurde in einen 1.200 l- Fermentor, der 250 l eines Ansatzkulturmediums enthielt, übertragen und einer belüfteten Rührkultivierung unterzogen. Bei Kultivierungstemperaturen von 23, 25, 27, 29 und 30ºC wurden separate Hauptkulturen durchgeführt. Die Rührgeschwindigkeit wurde so eingestellt, dass das Niveau des gelösten Sauerstoffs in dem Medium bei etwa 50-30% der Sauerstoff-Sättigungslösungskonzentration gehalten wurde. Als das Glycerin in dem Ansatzkulturmedium verbraucht war, wurde mit der Zugabe eines Nährmediums begonnen. Der pH-Wert des Mediums wurde auf einen festen Wert von 5,85 gesteuert. Zur Entschäumung des Kulturmediums wurde bei Bedarf ein Schaumverhinderer zugegeben. Die Kultivierung wurde für 360 Stunden durchgeführt.

TESTBEISPIEL 1 - Messung der Zelldichte

Bei jeder in Beispiel 1 durchgeführt Kultivierungstemperatur wurden periodisch Kulturbrüheproben genommen. Jede dieser so entnommenen Proben wurde mit destilliertem Wasser in einer solchen Weise verdünnt, dass der OD&sub5;&sub4;&sub0;-Wert zum Zeitpunkt der Messung auf 0,3 oder weniger eingestellt wurde, und dann wurde die Absorbanz der verdünnten Probe bei 540 nm unter Verwendung eines Spektrofotometers (UV 200, hergestellt von Shimadzu Corp.) gemessen. In diesem Test wurde die Menge an trockenen Zellen in jeder Probe anhand der Absorbanz auf Basis der Formel OD&sub5;&sub4;&sub0;/5,2 berechnet. Die maximale Zellkonzentration bei jeder Kultivierungstemperatur ist in den Tabellen 3 und 4 gezeigt.

TESTBEISPIEL 2 - Bestimmung der HSA-Ausbeute und des Verfärbungsgrads

Bei jeder der in Beispiel ein durchgeführten Kultivierungstemperaturen wurden periodisch Kulturbrüheproben genommen und jede der so entnommenen Proben wurde bei 15.000 U/min für 5 Minuten zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde durch Ultra Free C3HV (ein 0,45 um-Filter zur Sterilisation, hergestellt von Millipore Products) filtriert und unter den folgenden Bedingungen der HPLC-Gelfiltrationsanalyse unterzogen.
Säule: Tosoh TSK-Gel G3000SWx1
Mobile Phase: 0,3 M NaCl, 50 mM Na-Phosphat, 0,1% NaN&sub3;, pH 6,5
Flussgeschwindigkeit: 0,7 ml/min
Injektion: 50 ml
Nachweis: A&sub2;&sub8;&sub0;, A&sub3;&sub5;&sub0; (zwei Wellenlängen)
Die Ergebnisse der Auswertung der HSA-Ausbeute und des Verfärbungsgrades sind in den Tabellen 3 und 4 gezeigt. Die HSA-Ausbeute ist angegeben als der Prozentsatz der Gesamt-HSA-Produktion (g) bei jeder Kultivierungstemperatur, wobei die Gesamt-HSA-Produktion (g) die bei Kultivierung bei 30ºC erhalten wurde, als 100% angesehen wurde.
Die Absorbanzen bei 350 nm und 280 nm wurden für jede der Kulturen unmittelbar vor Beendigung der Kultivierung (nach 359 Stunden) gemessen, wodurch der Verfärbungsgrad als A&sub3;&sub5;&sub0;/A&sub2;&sub8;&sub0; bestimmt wurde. TABELLE 3 TABELLE 4
Erfindungsgemäss kann die HSA-Produktivität eines durch Genmanipulationstechniken erhaltenen Wirts durch Kultivierung des Wirts bei einer Temperatur von 21-29ºC erhöht werden. Die Kultivierung unter diesen Bedingungen kann auch die Wachstumsausbeute des HSA-erzeugenden Wirts verbessern, sowie den Verfärbungsgrad des erzeugten HSA verringern.
Während die vorliegende Erfindung detailliert und unter Bezugnahme auf spezifische Ausführungsformen beschrieben wurde, ist es dem Fachmann ersichtlich, dass verschiedene Veränderungen und Modifikationen drin vorgenommen werden können, ohne vom Geist und Umfang davon abzuweichen.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Humanserumalbumin, das die Kultivierung eines Humanserumalbumin-erzeugenden Hefestammes bei einer Temperatur von 21-25ºC umfasst.

2. Verfahren gemäss Anspruch 1, worin der Humanserumalbumin-erzeugende Wirt bei einer Temperatur von 21-23ºC kultiviert wird.

3. Verfahren gemäss Anspruch 1, worin der Humanserumalbumin-erzeugende Wirt ein Hefestamm ist, der ausgewählt ist aus Hefe des Genus Saccharomyces, Pichia oder Kluyveromyces.

4. Verfahren gemäss Anspruch 1, worin der Humanserumalbumin-erzeugende Wirt aus Saccharomyces cerevisiae AH 22 erhalten wird.

5. Verfahren gemäss Anspruch 1, worin der Humanserumalbumin-erzeugende Wirt aus Pichia pastoris GTS 115 erhalten wird.