DE69832709T2

DE69832709T2 - Verfahren zur herstellung von fremden proteinen

Info

Publication number: DE69832709T2
Application number: DE69832709T
Authority: DE
Inventors: Toyoo Hirakata-shi OHDA; Tomoshi Hirakata-shi OHYA; Shinobu Hirakata-shi KUWAE; Masao Hirakata-shi OHYAMA; Kaoru Hirakata-shi KOBAYASHI; Yahiro Hirakata-shi UEMURA
Original assignee: Mitsubishi Pharma Corp
Current assignee: Mitsubishi Pharma Corp
Priority date: 1997-04-03
Filing date: 1998-04-03
Publication date: 2006-07-06
Anticipated expiration: 2018-04-04
Also published as: ATE312195T1; EP1004673A1; EP1004673A4; ES2255154T3; AU746670B2; NO994788L; US6309864B1; KR100389729B1; WO1998044146A1; BR9808472A; KR20010005979A; CN1257549A; EP1004673B1; CA2286395C; AU6522898A; CA2286395A1; PL335975A1; DE69832709D1; NO994788D0

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Verbesserung bei einem Herstellungsverfahren für HSA (Humanserumalbumin), das das Kultivieren einer durch Genmanipulation hergestellten Hefe umfaßt.
Stand der Technik
Obschon ein breiter Bereich als Pharmazeutika brauchbarer Proteine wie etwa Humanserumalbumin (hierin nachstehend als HSA bezeichnet), das eine Hauptproteinkomponente des Plasmas ist, und dergleichen durch Fraktionierung einer Körperflüssigkeit hergestellt wird, sieht sich dieses Verfahren der Schwierigkeit des Beschaffens des Ausgangsmaterials gegenüber und die hergestellten Zubereitungen weisen eine starke Möglichkeit einer Verunreinigung mit einem Virus und dergleichen auf. Das Aufkommen der rekombinanten DNA-Technologie in den letzten Jahren hat die Herstellung derartiger Proteine durch Mikroorganismen und Zellen ermöglicht, was die Untersuchung und Entwicklung der Produktion eines heterologen Proteins durch Gentechnik in großem Maßstab fördert. Die Ausbeute ist jedoch noch immer niedrig und eine Produktion in großem Maßstab ist nicht erreichbar.
Das Verfahren zum Erhöhen der Produktion eines heterologen Proteins schließt ein Verfahren, das das Zusetzen einer Fettsäure oder eines Salzes davon zu einem Medium unter Erhöhen der Produktion von rekombinantem HSA (hierin nachstehend als rHSA bezeichnet) (JP-A-4-293495) umfaßt und ein Verfahren ein, das das Zusetzen einer hohen Konzentration eines Tensids mit einer Polyalkylengruppe umfaßt (japanische Patentanmeldung unter dem PCT offengelegt unter kohyo Nr. 3–500969 = W090/02808).
Die EP-A-O 470 575 offenbart ein verbessertes Verfahren zum Herstellen von Esterase, das das Kultivieren eines Esterase produzierenden Mikroorganismus in einem Medium umfaßt. Die WO-A-90/03430 offenbart ein verbessertes Medium für die Kultivierung tierischer Zellen und die Herstellung davon abgeleiteter natürlicher und rekombinanter Produkte. Die US-A-S 024 947 offenbart ein Medi um, das das Wachstum von Insektenzellen und die Produktion rekombinanter Proteine dadurch unterstützt.
Im Hinblick auf einen derartigen technischen Hintergrund zielt die vorliegende Erfindung darauf ab, die Herstellungsmenge von HSA durch ein spezielles Verbessern der Kulturbedingungen zu erhöhen.
Offenbarung der Erfindung
Die Erfinder haben eingehende Untersuchungen bei dem Bestreben, die vorstehend angeführten Probleme zu lösen, ausgeführt und fanden, daß die Herstellungsmenge von HSA durch Kultivieren einer durch Genmanipulation hergestellten Hefe in einem Medium, das eine Fettsäure oder ein Salz davon und ein Tensid umfaßt, erhöht werden kann, was zum Abschluß der vorliegenden Erfindung führte.
Demgemäß stellt die Erfindung Folgendes bereit.

(1) Ein Herstellungsverfahren für HSA (Humanserumalbumin), das das Kultivieren einer durch Genmanipulation hergestellten Hefe in einem Medium, das eine Fettsäure oder ein Salz davon und ein Tensid in einer Konzentration von höchstens 0,5 g/l enthält und das Ernten des HSA aus der Kultur umfaßt.
(2) Das Herstellungsverfahren aus vorstehend (1), wobei die Fettsäure 10 bis 26 Kohlenstoffatome aufweist.
(3) Das Herstellungsverfahren aus vorstehend (1), wobei das Medium eine Fettsäure oder ein Salz davon in einer Konzentration von 0,01–10 Gew./Vol.% enthält.
(4) Das Herstellungsverfahren aus vorstehend (1), wobei das Tensid ein nichtionisches Tensid mit einem Molekulargewicht von 100–100000 ist.

Bei der vorliegenden Erfindung ist der Wirt eine Hefe, die die Gattung Saccharomyces oder die Gattung Pichia sein kann. Ein auxotropher Stamm und antibiotikaempfindlicher Stamm dieser Wirte kann ebenfalls verwendet werden. Vor zugsweise können der Stamm Saccharomyces cerevisiae AH22, der ein G418-empfindlicher Stamm ist (a, his 4, leu 2, can 1) und der Stamm Pichia pastoris GTS115 (his 4, NRRL-Hinterlegung Nr. Y-15851) verwendet werden.
Zum Beispiel kann ein HSA-produzierender Wirt (oder ein HSA-produzierender Stamm) durch ein Verfahren unter Verwenden eines bekannten HSA-Gens (JP-A-58-56684, JP-A-58-90515, JP-A-58-150517), ein Verfahren unter Verwenden eines neuen HSA-Gens (JP-A-62-29985, JP-A-1-98486), ein Verfahren unter Verwenden einer synthetischen Signalsequenz (JP-A-1-240191), ein Verfahren unter Verwenden einer Serumalbuminsignalsequenz (JP-A-2-167095), ein Verfahren, daß den Einbau eines rekombinanten Plasmids in ein Chromosom (JP-A-3-72889), ein Verfahren, das das Fusionieren von Wirten umfaßt (JP-A-3-53877), ein Verfahren, das die Mutation in einem Methanol enthaltenden Medium umfaßt, ein Verfahren unter Verwenden eines Mutante-AOX2-Promotors (JP-A-6-90768, JP-A-4-299984), Expression von HSA durch Bacillus subtilis (JP-A-62-25133), Expression von HSA durch Hefe (JP-A-60-41487, JP-A-63-39576, JP-A-63-74493) und Expression von HSA durch Pichia-Hefe (JP-A-2-104290) hergestellt werden.
Von diesen Verfahren wird das eine Mutation in einem methanolhaltigen Medium verursachende Verfahren wie folgt ausgeführt. Ein Plasmid mit einer Transkriptionseinheit zum Exprimieren von HSA unter der Kontrolle des AOX1-Promotors wird in die AOX1-Genregion eines geeigneten Wirts, vorzugsweise Pichia-Hefe, insbesondere der Stamm Pichia pastoris GTS115, durch ein herkömmliches Verfahren unter Ergeben einer Transformante eingeführt (siehe JP-A-2-104290). Diese Transformante weist ein schwaches Vermehrungsvermögen in einem methanolhaltigen Medium auf. So wird gemäß dem in der JP-A-4-299984 offenbarten Verfahren diese Transformante in einem methanolhaltigen Medium unter Verursachen einer Mutation kultiviert und nur der zum Wachstum befähigte Stamm wird isoliert. In diesem Fall ist die Methanolkonzentration ungefähr 0,0001%–5%. Das Medium kann synthetisch oder natürlich sein. Die Kulturbedingungen sind 15°C–40°C, 1 Stunde–1000 Stunden.
Solange das zum Kultivieren eines transformierten Wirts zu verwendende Medium eine Fettsäure oder ein Salz davon und ein Tensid enthält, unterliegt es kei ner besonderen Einschränkung bezüglich der anderen Komponenten und ein auf diesem Gebiet bekanntes Medium wird normalerweise verwendet. Das Kultivieren eines transformierten Wirts in einem eine Fettsäure oder ein Salz davon und ein Tensid enthaltenden Medium ermöglicht das Erhöhen der Produktionsmenge eines heterologen Proteins. Außerdem wird von dem Enzym, das der Wirt selbst ausscheidet, erwartet, daß es die Zersetzung des heterologen Proteins unterdrückt.
Beispiele der Fettsäure schließen vorzugsweise die mit 10 bis 26 Kohlenstoffatomen ein.
Beispiele der vorstehend angeführten Fettsäure schließen gesättigte und ungesättigte Fettsäuren wie etwa Myristinsäure, Palmitinsäure, Palmitölsäure, Ölsäure, t-Vaccensäure, Linolsäure, Linolensäure, Linolsäure und Arachidonsäure ein. Die Salze dieser Fettsäuren sind zum Beispiel ein Alkalimetallsalz wie etwa Natriumsalz, Kaliumsalz und Calciumsalz, Erdalkalimetallsalze und organische Aminsalze ein, wobei einem Ölsäure oder ein Salz davon enthaltenden Medium der Vorzug gegeben wird.
Der Fettsäuregehalt in dem Medium ist 0,01–10 Gew./Vol.-%, vorzugsweise 0,2– 5 Gew./Vol.-%.
Das bei der vorliegenden Erfindung zu verwendende Tensid ist ein nicht-ionisches Tensid mit vorzugsweise einem hohen Molekulargewicht von 100 bis 100000.
Beispiele des vorstehend angeführten nicht-ionischen Tensids schließen ein Polyalkylenglykol (z. B. Polypropylenglykol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 1000–10000, vorzugsweise 2000–6000), Polyoxyalkylencopolymer (z. B. Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Copolymer mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 100–100000, vorzugsweise 1000–30000), hydriertes Rizinusöl-Polyalkylenderivat [z. B. hydriertes Rizinusöl-Polyoxyethylen(20)-ether, hydriertes Rizinusöl-Polyoxyethylen(40)-ether, hydriertes Rizinusöl-Polyoxyethylen(100)-ether], Rizinusöl-Polyoxyalkylenderivat [z. B. Rizinusöl-Polyoxyethylen(20)-ether, Rizinusöl-Polyoxyethylen(40)-ether, Rizinusöl-Polyoxyethylen(100)ether], Polyoxyethylensorbitanfettsäureester (z. B. Polyoxyethylensorbitanmono oleat, Polyoxyethylensorbitanmonostearat, Polyoxyethylensorbitanmonopalmitat, Polyoxyethylensorbitanmonolaurat), Sorbitanfettsäureester, Alkylphenolpolyoxyethylenether, Polyoxyethylensorbitfettsäureester, Polyoxyethylen-hydriertes Rizinusöl und Polygycerinfettsäureester ein. Es ist insbesondere bevorzugt, daß das Medium ein Polyalkylenglykol, Polyoxyethylenpolyoxypropylen-Copolymer (Warenzeichen Pluronic) oder Polyoxyethylensorbitanfettsäureester (Warenzeichen Tween) enthält.
Der Tensidgehalt in einem Medium ist vorzugsweise höchstens 0,5 g/l.
Das Medium kann ein synthetisches Medium oder ein natürliches Medium sein, wobei einem synthetischen Medium der Vorzug gegeben wird. Es kann ein festes Medium oder flüssiges Medium, vorzugsweise ein flüssiges Medium sein. Zum Beispiel enthält ein synthetisches Medium im allgemeinen verschiedene Saccharide als Kohlenstoffquelle, Harnstoff, ein Ammoniumsalz und Nitrat als Stickstoffquelle, verschiedene Vitamine und ein Nukleotid als Spurennährstoffe und anorganische Salze (z. B. Mg, Ca, Fe, Na, K, Mn, Co, Cu und dergleichen). Beispiele des Mediums schließen ein flüssiges YNB-Medium [0,7% Hefestickstoffgrundlage (hergestellt durch Difco), 2% Glucose] ein. Beispiele des natürlichen Mediums schließen ein flüssiges YPD-Medium (1% Hefeextrakt (hergestellt durch Difco), 2% Bactopepton (hergestellt durch Difco), 2% Glucose] ein. Wenn ein Methanol benützender Wirt verwendet wird, kann ein methanolhaltiges Medium verwendet werden. In diesem Fall ist die Methanolkonzentration vorzugsweise etwa 0,01–5%.
Das bei der vorliegenden Erfindung verwendete Medium kann leicht durch Zusetzen einer Fettsäure oder eines Salzes davon und eines Tensids zu einem herkömmlich bekannten Medium hergestellt werden.
Andere Kultivierungsbedingungen sind den für ein herkömmliches Verfahren angewendeten ähnlich.
Die Kulturtemperatur ist zum Beispiel 15°C–40°C, im allgemeinen 20°C–37°C. Wenn der Wirt eine Hefe ist, ist sie vorzugsweise 20°C–30°C und wenn der Wirt ein Bakterium ist, ist sie vorzugsweise 30°C–37°C. Die Kulturzeit ist im allge meinen 1 Stunde–1000 Stunden.
Das Kultivieren wird durch eine Satzkultur oder Satzkultur mit geregelter Fütterung oder kontinuierliche Kultur unter Stillstehen oder Schütteln, Rühren oder Belüftung, vorzugsweise Satzkultur mit geregelter Fütterung mittels eines Fermenters ausgeführt. Zum Beispiel wird Glucose in hoher Konzentration portionsweise einer Satzkultur mit geregelter Fütterung zugefügt, indem eine Hemmung produzierender Zellen durch eine hohe Substratkonzentration vermieden wird, wodurch hohe Zell- und Produktkonzentrationen erhalten werden (JP-A-3-83595).
Es ist bevorzugt, daß vor dieser Kultivierung eine Vorkultur durchgeführt wird. Das Medium für die Vorkultur kann zum Beispiel flüssiges YNB-Medium oder flüssiges YPD-Medium sein. Die Bedingungen für die Vorkultur sind vorzugsweise eine Kulturzeit von 10 Stunden–100 Stunden, eine Temperatur von etwa 30°C bei Hefen und etwa 37°C bei Bakterien.
Nach Abschluß des Kultivierens wird das HSA durch ein bekanntes Trenn- und Reinigungsverfahren aus der Kultur geerntet. Hierin verwendet umfaßt die Kultur jede Substanz, die HSA enthalten kann, wie etwa ein Kulturmedium und eine Hefe, was insbesondere ein Kulturüberstand, ein Filtrat davon, eine Bakterienzelle und eine Zelle ist.
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden durch Beispiele und ein Versuchsbeispiel, auf die die vorliegende Erfindung nicht eingeschränkt ist, genau erläutert.
Beispiel 1
(1) Herstellung eines verwendeten Bakterienstammes
Unter Verwenden eines Mutante-AOX2-Promotors [natürlicher AOX2-Promotor (YEAST, 5, 167–177 (1988), oder Mol. Cell. Biol., 9, 1316–1323 (1989)), bei dem das 255. Nukleotid stromaufwärts des Startkodons von T in C geändert wurde] wurde ein Plasmid pMM042 für die HSA-Expression aufgebaut und in den Stamm Pichia pastoris GTS115 unter Ergeben einer Transformante des Stamms UHG42-3 eingeführt wurde (JP-A-4-29984).
(2) Zusammensetzung des Mediums
Für die Vorkultur wurde YPD-Medium (2% Bactopepton, 1% Hefeextrakt, 2% Glucose) verwendet. Die Zusammensetzung des für die Hauptkultur verwendeten Satzmediums wird in Tabelle 1 dargestellt und die Zusammensetzung des Fütterungsmediums wird in Tabelle 2 dargestellt. Die Zusammensetzung der Lösung von *2 in Tabelle 1 und Tabelle 2 wird in Tabelle 3 dargestellt. Wie in Tabelle 1 und Tabelle 2 dargestellt war der Ölsäuregehalt des in diesem Beispiel verwendeten Satzmediums und Fütterungsmediums auf 0,5 Gew./Vol.-% eingestellt. Tabelle 1: Zusammensetzung des Satzmediums

*1: Biotin 0,2 g/l, *2: siehe Tabelle 3

*2: siehe Tabelle 3

(3) Kulturverfahren mittels eines Fermenters
➀ Vorkultur
Eine Bakterienzellensuspension (1 ml, etwa OD_54D ≒ etwa 10) wurde in YPD-Medium (50 ml) eingeimpft und 24 Stunden der Schüttelkultur bei 30°C unterzogen.
➁ Hauptkultur
Die Vorkultur (14 ml) wurde in das Satzmedium (700 ml) eingeimpft und der Rührkultur unter Belüften in einem Miniglasfermenter unterzogen. Die Kulturtemperatur war 25°C, der pH war 5,8. Adekanol LG-109 (hergestellt durch Asahi Denka Kogyo), das ein Polyoxyethylentensid ist, wurde dem Medium in einer Konzentration von 0,4 g/l zugesetzt.
Als sich bei der Satzkultur die Hefe zu ausreichend hoher Dichte vermehrt hatte und das Glycerin in dem Medium verbraucht worden war, wurde das Fütterungsmedium zugefügt und 360 Stunden kultiviert, um die Produktion von HSA zu gestatten.
Nach dem Abschluß des Kultivierens wurden der Kultur Proben entnommen und die Menge der HSA-Produktion wurde durch das in den folgenden Beispielen beschriebene Verfahren gemessen. Im Ergebnis war die Menge 114%, wenn die Produktion ohne Ölsäure 100% war.
Beispiel 2
Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1, ausgenommen daß die Ölsäurekonzentration des Fütterungsmediums auf 1 Gew./Vol.-% eingestellt war, wurde das Kultivieren ausgeführt. Die Menge der HSA-Produktion war 125%.
Beispiel 3
Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1, ausgenommen daß die Ölsäurekonzentration des Fütterungsmediums auf 5 Gew./Vol.-% eingestellt war, wurde das Kultivieren ausgeführt. Die Menge der HSA-Produktion war 127%.
Beispiel 4
Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1, ausgenommen daß das Tensid in dem Fütterungsmedium Pluronic L-61 (durchschnittliches Molekulargewicht 2000, Ethylen oxid:Propylenoxid = 10:90, hergestellt durch Asahi Denka Kogyo) war, das ein Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Copolymer ist, wurde das Kultivieren ausgeführt.
Bezugsbeispiel Quantitative Bestimmung der HSA-Konzentration
Ein Teil der isolierten Kultur wurde zentrifugiert und der Überstand wurde Filtriert, nachdem er klar geworden war, was von der quantitativen Bestimmung durch Gelfiltrationsanalyse durch HPLC gefolgt wurde.
Gemäß der vorliegenden Erfindung, kann die Menge des durch eine Hefe produzierten HSA erhöht werden und die Zersetzung des HSA durch ein durch die Hefe selbst ausgeschiedenes Enzym kann gehemmt werden, wodurch die Menge des geernteten HSA erhöht werden kann. Die vorliegende Erfindung umfaßt das Kultivieren einer HSA-Hefe in einem eine Fettsäure oder ein Salz davon und ein Tensid enthaltenden Medium und ist ein leichtes und einfaches Verfahren.

Claims

Herstellungsverfahren für HSA (Humanserumalbumin), das das Kultivieren einer durch Genmanipulation hergestellten Hefe in einem Medium, das eine Fettsäure oder ein Salz davon und ein Tensid in einer Konzentration von höchstens 0,5 g/l enthält und das Ernten des HSA aus der Kultur umfaßt.
Herstellungsverfahren des Anspruchs 1, wobei die Fettsäure 10 bis 26 Kohlenstoffatome aufweist.
Herstellungsverfahren des Anspruchs 1, wobei das Medium eine Fettsäure oder ein Salz davon in einer Konzentration von 0,01–10 Gew./Vol.% enthält.
Herstellungsverfahren des Anspruchs 1, wobei das Tensid ein nichtionisches Tensid mit einem Molekulargewicht von 100–100000 ist.