JP3133774B2 - 新規な宿主−ベクター系 - Google Patents
新規な宿主−ベクター系Info
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- JP3133774B2 JP3133774B2 JP03062693A JP6269391A JP3133774B2 JP 3133774 B2 JP3133774 B2 JP 3133774B2 JP 03062693 A JP03062693 A JP 03062693A JP 6269391 A JP6269391 A JP 6269391A JP 3133774 B2 JP3133774 B2 JP 3133774B2
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- Japan
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- plasmid
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- vector system
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/145—Fungal isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/845—Rhizopus
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規な宿主−ベクター
系に関し、さらに詳しくは、カビの一種であるリゾープ
ス・ニベウス（Rhizopus niveus)を宿主とし、藻菌類の
プラスミドをベクターとする新規な宿主−ベクター系に
関する。
系に関し、さらに詳しくは、カビの一種であるリゾープ
ス・ニベウス（Rhizopus niveus)を宿主とし、藻菌類の
プラスミドをベクターとする新規な宿主−ベクター系に
関する。
【０００２】
【従来の技術】インターフェロン、インターロイキンと
いった有用タンパク質をバクテリアを形質転換すること
により製造する方法は確立されつつある。それと同時に
バクテリアを用いた場合の問題点も明らかになってきて
いる。例えばバクテリアは目的とする有核生物のタンパ
ク質（例えばホルモン、酵素）の生産量が少なく、かつ
該タンパク質が菌体外へ分泌されにくい。さらに、イン
ターフェロン及びインターロイキンを大腸菌を用いて作
った場合、これら人工のタンパク質と天然のタンパク質
との間では１次構造は同じであるが、２次構造が異な
り、その結果人工のタンパク質は人体内で異物（抗原）
として認識されてしまう。そこで使用に際しては人工の
タンパク質をリネーチャーする必要がある。
いった有用タンパク質をバクテリアを形質転換すること
により製造する方法は確立されつつある。それと同時に
バクテリアを用いた場合の問題点も明らかになってきて
いる。例えばバクテリアは目的とする有核生物のタンパ
ク質（例えばホルモン、酵素）の生産量が少なく、かつ
該タンパク質が菌体外へ分泌されにくい。さらに、イン
ターフェロン及びインターロイキンを大腸菌を用いて作
った場合、これら人工のタンパク質と天然のタンパク質
との間では１次構造は同じであるが、２次構造が異な
り、その結果人工のタンパク質は人体内で異物（抗原）
として認識されてしまう。そこで使用に際しては人工の
タンパク質をリネーチャーする必要がある。
【０００３】ところで「くものすカビ」、「けかび」の
ような藻菌類は、発酵工業において広く使用され、リゾ
ープスはその一種である。リゾープス等のカビは、体外
への酵素分泌力が高く（例えばアミラーゼの分泌量は液
体培養：２０ｇ／リットル、固体培養：３０ｇ／ｋｇで
ある）、かつ細胞外へ分泌するために得られる蛋白質は
１次構造のみならず２次構造も天然の蛋白質と同じであ
る。そこでカビを形質転換して蛋白質の製造に用いるこ
とが期待される。しかし、従来カビの形質転換法は確立
されているものが少なく、リゾープスについては全くな
かった。
ような藻菌類は、発酵工業において広く使用され、リゾ
ープスはその一種である。リゾープス等のカビは、体外
への酵素分泌力が高く（例えばアミラーゼの分泌量は液
体培養：２０ｇ／リットル、固体培養：３０ｇ／ｋｇで
ある）、かつ細胞外へ分泌するために得られる蛋白質は
１次構造のみならず２次構造も天然の蛋白質と同じであ
る。そこでカビを形質転換して蛋白質の製造に用いるこ
とが期待される。しかし、従来カビの形質転換法は確立
されているものが少なく、リゾープスについては全くな
かった。
【０００４】そこで本発明者らは、先に種々検討した結
果カビの一種であるリゾープスの形質転換法を提供する
ことに成功した〔特開平２─５３４８０号〕。
果カビの一種であるリゾープスの形質転換法を提供する
ことに成功した〔特開平２─５３４８０号〕。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかし、酵素をリゾー
プスを宿主として用いて生産するに適したベクターはこ
れまでのところ知られていない。そこで本発明の目的
は、酵素の菌体外分泌量が大きいリゾープスを宿主とし
て用い、酵素を生産するに適した宿主−ベクター系を提
供することにある。
プスを宿主として用いて生産するに適したベクターはこ
れまでのところ知られていない。そこで本発明の目的
は、酵素の菌体外分泌量が大きいリゾープスを宿主とし
て用い、酵素を生産するに適した宿主−ベクター系を提
供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、リゾープス・
ニベウスの染色体中及び／又は細胞質内に藻菌類のプラ
スミドを含む宿主−ベクター系に関する。
ニベウスの染色体中及び／又は細胞質内に藻菌類のプラ
スミドを含む宿主−ベクター系に関する。
【０００７】以下本発明について説明する。本発明にお
いては、宿主として糸状菌リゾープス・ニベウス（Rhiz
opus niveus)（ＩＦＯ４８１０）を用いる。
いては、宿主として糸状菌リゾープス・ニベウス（Rhiz
opus niveus)（ＩＦＯ４８１０）を用いる。
【０００８】一方、ベクターとしては、藻菌類のプラス
ミドを用いる。ベクターとして藻菌類のプラスミドを用
いることにより、初めて宿主であるリゾープス・ニベウ
スを形質転換することができる。藻菌類としては、例え
ば、ムコール属〔Mucor circinelloides, Mucor javani
cus 〕、フィコミセス属〔Phycomyces blakesleeanus,
Phycomyces nitens 〕、アブシディア属〔Absidia glau
ca, Absidia coerulea, Absidia megaspora 〕等を例示
できる。
ミドを用いる。ベクターとして藻菌類のプラスミドを用
いることにより、初めて宿主であるリゾープス・ニベウ
スを形質転換することができる。藻菌類としては、例え
ば、ムコール属〔Mucor circinelloides, Mucor javani
cus 〕、フィコミセス属〔Phycomyces blakesleeanus,
Phycomyces nitens 〕、アブシディア属〔Absidia glau
ca, Absidia coerulea, Absidia megaspora 〕等を例示
できる。
【０００９】また藻菌類のプラスミドとしては、例え
ば、プラスミドｐＬｅｕ４、ｐＰＳ１１、ｐＭＡ６７、
ｐＪＬ１、ｐＪＬ２、ｐＭＣＬ１３０２、ｐＭＣＬ００
２、ｐＪＰＬｅｕ４、ｐＰＰＬｅｕ４、ｐＬｅｕ４１、
ｐＪＰＬｅｕ４１又はｐＰＰＬｅｕ４１等を例示でき
る。
ば、プラスミドｐＬｅｕ４、ｐＰＳ１１、ｐＭＡ６７、
ｐＪＬ１、ｐＪＬ２、ｐＭＣＬ１３０２、ｐＭＣＬ００
２、ｐＪＰＬｅｕ４、ｐＰＰＬｅｕ４、ｐＬｅｕ４１、
ｐＪＰＬｅｕ４１又はｐＰＰＬｅｕ４１等を例示でき
る。
【００１０】尚、上記プラスミドは、以下の方法により
入手できる。ｐＬｅｕ４は、ロンセロ（Roncero)，M.I.
G.ら、Gene，84 335-343(1989) に記載の方法により入
手できる。ｐＰＳ１１は、T.スアレツ(Suarez)ら、Mol.
Gen. Genet. 212, 120-123, 1988 に記載の方法により
フィコミセス・ブラケスリアヌス(Phycomyces blakesle
eanus)（ＮＲＲＬ１５５５株）から入手できる。
入手できる。ｐＬｅｕ４は、ロンセロ（Roncero)，M.I.
G.ら、Gene，84 335-343(1989) に記載の方法により入
手できる。ｐＰＳ１１は、T.スアレツ(Suarez)ら、Mol.
Gen. Genet. 212, 120-123, 1988 に記載の方法により
フィコミセス・ブラケスリアヌス(Phycomyces blakesle
eanus)（ＮＲＲＬ１５５５株）から入手できる。
【００１１】ｐＭＡ６７は、L.デッキンソン(Dickinso
n) らの方法〔Carlsberg Research Communications 52,
243-252, 1987 〕により、ｐＭＣＬ１３０２から入手
できる。ｐＪＬ１及びｐＪＬ２は、J.L.レビュエッタ
（Revuetta) らの方法〔Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.
83, 7344-7347, 1986 〕により、フィコミセス・ブラケ
スリアヌス(Phycomyces blakesleeanus)（Ａ４５９株）
から入手できる。
n) らの方法〔Carlsberg Research Communications 52,
243-252, 1987 〕により、ｐＭＣＬ１３０２から入手
できる。ｐＪＬ１及びｐＪＬ２は、J.L.レビュエッタ
（Revuetta) らの方法〔Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.
83, 7344-7347, 1986 〕により、フィコミセス・ブラケ
スリアヌス(Phycomyces blakesleeanus)（Ａ４５９株）
から入手できる。
【００１２】ｐＭＣＬ１３０２及びｐＭＣＬ００２は、
R.ファン・ヘースウィック（van Heeswijck)の方法
〔Carlsberg Research Communications 51, 433-443, 1
986 〕により、ムコール・シルシネロイデス・エフ・ル
シタニコス（Mucor circinelloides f. lusitanicus)
（ＣＢＳ２２７．４９株）＝ムコール・ラセモサス（Mu
cor racemosus)（ＡＴＣＣ１２１６６株）から入手でき
る。
R.ファン・ヘースウィック（van Heeswijck)の方法
〔Carlsberg Research Communications 51, 433-443, 1
986 〕により、ムコール・シルシネロイデス・エフ・ル
シタニコス（Mucor circinelloides f. lusitanicus)
（ＣＢＳ２２７．４９株）＝ムコール・ラセモサス（Mu
cor racemosus)（ＡＴＣＣ１２１６６株）から入手でき
る。
【００１３】ｐＪＰＬｅｕ４は、ｐＪＬ２の０．９ｋｂ
ｐのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片をｐＬｅｕ４のＳａｍＩ
に挿入することより得ることができる。ｐＪＰＬｅｕ４
１は、ｐＪＰＬｅｕ４をＡｖａＩとＳａｌＩで消化し、
７．２ｋｂｐの断片を自己連結して得られる。
ｐのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片をｐＬｅｕ４のＳａｍＩ
に挿入することより得ることができる。ｐＪＰＬｅｕ４
１は、ｐＪＰＬｅｕ４をＡｖａＩとＳａｌＩで消化し、
７．２ｋｂｐの断片を自己連結して得られる。
【００１４】ｐＰＰＬｅｕ４は、ｐＰＳ１１の５．２ｋ
ｂｐのＢａｍＨＩ断片をｐＬｅｕ４のＳａｍＩに挿入す
ることより得ることができる。ｐＰＰＬｅｕ４１は、ｐ
ＰＰＬｅｕ４をＡｖａＩとＳａｌＩで消化し、１１．５
ｋｂｐの断片を自己連結して得られる。
ｂｐのＢａｍＨＩ断片をｐＬｅｕ４のＳａｍＩに挿入す
ることより得ることができる。ｐＰＰＬｅｕ４１は、ｐ
ＰＰＬｅｕ４をＡｖａＩとＳａｌＩで消化し、１１．５
ｋｂｐの断片を自己連結して得られる。
【００１５】ｐＬｅｕ４１は、ｐＬｅｕ４をＡｖａＩと
ＳａｌＩで消化し、６．３ｋｂｐの断片を自己連結して
得られる。
ＳａｌＩで消化し、６．３ｋｂｐの断片を自己連結して
得られる。
【００１６】上記ベクターは、宿主であるリゾープス・
ニベウスの染色体中に挿入されているか、リゾープス・
ニベウスの細胞質内に含まれているか、あるいはリゾー
プス・ニベウスの染色体中に挿入され、かつ細胞質内に
も含まれている。宿主であるリゾープス・ニベウスの染
色体中に挿入されているベクターは、１つ又は２つ以上
である。また、細胞質内に含まれるベクターの数も１つ
又は２つ以上である。
ニベウスの染色体中に挿入されているか、リゾープス・
ニベウスの細胞質内に含まれているか、あるいはリゾー
プス・ニベウスの染色体中に挿入され、かつ細胞質内に
も含まれている。宿主であるリゾープス・ニベウスの染
色体中に挿入されているベクターは、１つ又は２つ以上
である。また、細胞質内に含まれるベクターの数も１つ
又は２つ以上である。
【００１７】本発明の上記宿主−ベクター系は、特開平
２−５３４８０号に記載の方法により製造することがで
きる。即ち、リゾープス・ニベウスの胞子を培養して発
芽管を得、この発芽管又は胞子もしくは菌糸をノボザイ
ム２３４、キチナーゼ及びキトサナーゼで処理してプロ
トプラスト化細胞とし、この細胞を藻菌類のプラスミド
の存在下でポリエチレングリコールで処理して藻菌類の
プラスミドを含む融合細胞とし、得られた融合細胞を再
生することにより、本発明の宿主−ベクター系を得るこ
とができる。尚、上記製造方法において藻菌類のプラス
ミドは、環状のまま用いても、または適当な制限酵素で
切断した線状のものを用いても良い。一般的傾向とし
て、環状のまま用いた方が形質転換頻度は高く、線状の
ものを用いると、染色体中に挿入される割合が高くな
る。
２−５３４８０号に記載の方法により製造することがで
きる。即ち、リゾープス・ニベウスの胞子を培養して発
芽管を得、この発芽管又は胞子もしくは菌糸をノボザイ
ム２３４、キチナーゼ及びキトサナーゼで処理してプロ
トプラスト化細胞とし、この細胞を藻菌類のプラスミド
の存在下でポリエチレングリコールで処理して藻菌類の
プラスミドを含む融合細胞とし、得られた融合細胞を再
生することにより、本発明の宿主−ベクター系を得るこ
とができる。尚、上記製造方法において藻菌類のプラス
ミドは、環状のまま用いても、または適当な制限酵素で
切断した線状のものを用いても良い。一般的傾向とし
て、環状のまま用いた方が形質転換頻度は高く、線状の
ものを用いると、染色体中に挿入される割合が高くな
る。
【００１８】
【実施例】以下本発明を実施例によりさらに説明する。
【００１９】実施例１ （栄養要求変異株の取得） リゾープス・ニベウスの胞子懸濁液１０6 〜１０7 個／
ｍｌ）１ｍｌにＵＶ照射（０．００３６Ｊ／ｃｍ2 ）を
し、生存率を測定した後に平板完全寒天培地に塗布し
た。３７℃で約２０日間培養した後に胞子を回収し、生
理食塩水で洗浄した。次いでこの胞子を３０℃で液体最
少培地中で静置培養し、Ｇ３ガラスフィルターでろ過し
た。この操作を菌の生育が見られなくなるまで繰り返し
行った。得られた胞子を生理食塩水で懸濁し、平板酸性
完全寒天培地（２．４％ポテトデキストロース（Ｄｉｆ
ｃｏ），０．１％ＨＣｌ，１．５％寒天）に塗布し、３
０℃で２〜３日間培養した。培養後、各種アミノ酸、核
酸を添加した最少寒天培地（２％グルコース、０．２％
アスパラギン、０．０５％ＫＨ2 ＰＯ4 ，０．０２５％
ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ，１．５％精製寒天）にレプリカ
した。レプリカした胞子の中からｌｅｕ要求性変異株を
常法により選択し、R.ニベウスＭ３７株を得た。
ｍｌ）１ｍｌにＵＶ照射（０．００３６Ｊ／ｃｍ2 ）を
し、生存率を測定した後に平板完全寒天培地に塗布し
た。３７℃で約２０日間培養した後に胞子を回収し、生
理食塩水で洗浄した。次いでこの胞子を３０℃で液体最
少培地中で静置培養し、Ｇ３ガラスフィルターでろ過し
た。この操作を菌の生育が見られなくなるまで繰り返し
行った。得られた胞子を生理食塩水で懸濁し、平板酸性
完全寒天培地（２．４％ポテトデキストロース（Ｄｉｆ
ｃｏ），０．１％ＨＣｌ，１．５％寒天）に塗布し、３
０℃で２〜３日間培養した。培養後、各種アミノ酸、核
酸を添加した最少寒天培地（２％グルコース、０．２％
アスパラギン、０．０５％ＫＨ2 ＰＯ4 ，０．０２５％
ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ，１．５％精製寒天）にレプリカ
した。レプリカした胞子の中からｌｅｕ要求性変異株を
常法により選択し、R.ニベウスＭ３７株を得た。
【００２０】（リゾープス・ニベウスの形質転換） 先に得られたｌｅｕ要求性変異株であるR.ニベウスＭ３
７株の胞子２〜５×１０7 個を水に懸濁し、Ｇ１ガラス
フィルターでろ過し、ろ液をＧ３ガラスフィルターでろ
過した。ろ液を２５００ｒｐｍで７分間遠心分離して沈
澱を５〜８ｍｌの１％グルコース、２０％酵母抽出物、
２％ポリペプトン、０．０１Ｍプロリン溶液に懸濁し、
３０℃で４．５〜５時間振盪培養（３００ｒｐｍのレシ
プロシェーカー）した。発芽管の形成を顕微鏡で確認し
た後にＧ１ガラスフィルターでろ過し、ろ液を３０００
ｒｐｍで３分間遠心分離した。沈澱を５ｍｌの緩衝液Ａ
（１３．２ｍＭクエン酸、３３ｍＭ Ｎａ2 ＨＰＯ4 、
０．３Ｍマンニトール）に懸濁し、３０００ｒｐｍで３
分間遠心分離した。沈澱を再度緩衝液Ａに懸濁し、３０
００ｒｐｍで３分間遠心分離した。
７株の胞子２〜５×１０7 個を水に懸濁し、Ｇ１ガラス
フィルターでろ過し、ろ液をＧ３ガラスフィルターでろ
過した。ろ液を２５００ｒｐｍで７分間遠心分離して沈
澱を５〜８ｍｌの１％グルコース、２０％酵母抽出物、
２％ポリペプトン、０．０１Ｍプロリン溶液に懸濁し、
３０℃で４．５〜５時間振盪培養（３００ｒｐｍのレシ
プロシェーカー）した。発芽管の形成を顕微鏡で確認し
た後にＧ１ガラスフィルターでろ過し、ろ液を３０００
ｒｐｍで３分間遠心分離した。沈澱を５ｍｌの緩衝液Ａ
（１３．２ｍＭクエン酸、３３ｍＭ Ｎａ2 ＨＰＯ4 、
０．３Ｍマンニトール）に懸濁し、３０００ｒｐｍで３
分間遠心分離した。沈澱を再度緩衝液Ａに懸濁し、３０
００ｒｐｍで３分間遠心分離した。
【００２１】沈澱を２ｍｌの緩衝液Ａに懸濁し、ノボザ
イム（Ｎｏｖｏｚｙｍ）２３４（ノボ社製）３５ｍｇ、
キチナーゼＡＢＣ（アドバンス バイオファクチャーズ
社製）１４ｍｇ、キトサナーゼ（和光社製）１０ユニッ
トを５ｍｌのＡ液に懸濁したものを添加した。３０℃で
１．５〜２時間振盪培養（６０ｒｐｍのレシプロシェー
カー）し、プロトプラストの形成を顕微鏡で確認した後
Ｇ２ガラスフィルターでろ過した。ろ液を４５０ｒｐｍ
で４分間遠心分離した。沈澱を５ｍｌの緩衝液Ｂ（１０
ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ６．３）、５０ｍＭ ＣａＣ
ｌ2、０．３Ｍマンニトール）に懸濁し、４５０ｒｐｍ
で４分間遠心分離することを２回繰り返した。沈澱を２
００μｌの緩衝液Ｂにゆっくり懸濁し、プラスミドｐＬ
ｅｕ４〔ロンセロ（Ｒｏｎｃｅｒｏ），Ｍ．Ｉ．Ｇ．
ら、Ｇｅｎｅ，８４３３５−３４３（１９８９）：プラ
スミドｐＬｅｕ４はムコール・サーシンロイズ（Mucor
circienelloides)のｌｅｕＡ遺伝子とムコール・サーシ
ンロイズ中でのＡＲＳ領域を有する〕懸濁液（約１０〜
２０μｇのｐＬｅｕ４を１０μｌの１０ｍＭ ＭＯＰＳ
（ｐＨ６．３）、５０ｍＭ ＣａＣｌ2 、１ｍｇ／２０
μｌヘパリン溶液に懸濁）１０μｌと混合した。氷中で
５分間放置し、１０μｌの緩衝液Ｃ（１０ｍＭＭＯＰＳ
（ｐＨ６．３）、５０ｍＭ ＣａＣｌ2 、４０％ＰＥＧ
４０００溶液）を添加した。氷中で２５分間放置した
後１．２５ｍｌの緩衝液Ｃをさらに添加して、室温で２
５分間放置した。１０ｍｌの緩衝液Ｂと混合し、６００
ｒｐｍで３分間遠心分離した。
イム（Ｎｏｖｏｚｙｍ）２３４（ノボ社製）３５ｍｇ、
キチナーゼＡＢＣ（アドバンス バイオファクチャーズ
社製）１４ｍｇ、キトサナーゼ（和光社製）１０ユニッ
トを５ｍｌのＡ液に懸濁したものを添加した。３０℃で
１．５〜２時間振盪培養（６０ｒｐｍのレシプロシェー
カー）し、プロトプラストの形成を顕微鏡で確認した後
Ｇ２ガラスフィルターでろ過した。ろ液を４５０ｒｐｍ
で４分間遠心分離した。沈澱を５ｍｌの緩衝液Ｂ（１０
ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ６．３）、５０ｍＭ ＣａＣ
ｌ2、０．３Ｍマンニトール）に懸濁し、４５０ｒｐｍ
で４分間遠心分離することを２回繰り返した。沈澱を２
００μｌの緩衝液Ｂにゆっくり懸濁し、プラスミドｐＬ
ｅｕ４〔ロンセロ（Ｒｏｎｃｅｒｏ），Ｍ．Ｉ．Ｇ．
ら、Ｇｅｎｅ，８４３３５−３４３（１９８９）：プラ
スミドｐＬｅｕ４はムコール・サーシンロイズ（Mucor
circienelloides)のｌｅｕＡ遺伝子とムコール・サーシ
ンロイズ中でのＡＲＳ領域を有する〕懸濁液（約１０〜
２０μｇのｐＬｅｕ４を１０μｌの１０ｍＭ ＭＯＰＳ
（ｐＨ６．３）、５０ｍＭ ＣａＣｌ2 、１ｍｇ／２０
μｌヘパリン溶液に懸濁）１０μｌと混合した。氷中で
５分間放置し、１０μｌの緩衝液Ｃ（１０ｍＭＭＯＰＳ
（ｐＨ６．３）、５０ｍＭ ＣａＣｌ2 、４０％ＰＥＧ
４０００溶液）を添加した。氷中で２５分間放置した
後１．２５ｍｌの緩衝液Ｃをさらに添加して、室温で２
５分間放置した。１０ｍｌの緩衝液Ｂと混合し、６００
ｒｐｍで３分間遠心分離した。
【００２２】沈澱を１ｍｌの１％グルコース、２％酵母
抽出物、２％ポリペプトン、０．３Ｍマンニトール溶液
に懸濁し、この懸濁液をエッペンドルフチューブに移し
た。３０℃で３０分間静置培養し、１０００ｒｐｍで１
分間遠心分離した。沈澱を１ｍｌの０．４Ｍマンニトー
ル溶液に懸濁し、１０００ｒｐｍで１分間遠心分離する
操作を２回繰り返した。沈澱を１００μｌの０．４Ｍマ
ンニトール溶液に懸濁し、５ｍｌの１％精製寒天を含む
Ｄ培地（ＳＩＶ最少培地＋０．３５Ｍマンニトール、
０．２％Ｈ2 ＳＯ4 を４８℃で溶解）と混合した。次
に、１．５％精製寒天を含む平板Ｄ培地状に重層し、３
０℃で２〜３日間培養した。各々の単集落をＳＩＶ最少
培地へレプリカして保存した。即ち、プラスミドｐＬｅ
ｕ４は、ｌｅｕ要求性変異株であるR.ニベウスＭ３７株
を相補し、プラスミドｐＬｅｕ４がR.ニベウスＭ３７株
内でベクターとして機能することが明らかになった。
抽出物、２％ポリペプトン、０．３Ｍマンニトール溶液
に懸濁し、この懸濁液をエッペンドルフチューブに移し
た。３０℃で３０分間静置培養し、１０００ｒｐｍで１
分間遠心分離した。沈澱を１ｍｌの０．４Ｍマンニトー
ル溶液に懸濁し、１０００ｒｐｍで１分間遠心分離する
操作を２回繰り返した。沈澱を１００μｌの０．４Ｍマ
ンニトール溶液に懸濁し、５ｍｌの１％精製寒天を含む
Ｄ培地（ＳＩＶ最少培地＋０．３５Ｍマンニトール、
０．２％Ｈ2 ＳＯ4 を４８℃で溶解）と混合した。次
に、１．５％精製寒天を含む平板Ｄ培地状に重層し、３
０℃で２〜３日間培養した。各々の単集落をＳＩＶ最少
培地へレプリカして保存した。即ち、プラスミドｐＬｅ
ｕ４は、ｌｅｕ要求性変異株であるR.ニベウスＭ３７株
を相補し、プラスミドｐＬｅｕ４がR.ニベウスＭ３７株
内でベクターとして機能することが明らかになった。
【００２３】ＳＩＶ最少培地 Ａ液 蒸留水・・・・・・・・・・４８０ｍｌ 窒素源 アスパラギン・・・ ２ｇ ５０倍濃縮液（注１）・・・ ２０ｍｌ 粉末寒天・・・・・・・・・ １５ｇ Ｂ液 蒸留水・・・・・・・・・・４９０ｍｌ グルコース・・・・・・・・ ２０ｇ Ａ液、Ｂ液を別個にオートクレーブした後混合する。 注１：５０倍濃縮液 KH2 PO4 ・・・・・・・・・２５０ｇ MgSO4 -7H2 O・・・・・・・ ２５ｇ 微量元素溶液（注２）・・・ ５ｍｌ 14%(W/W)CaCl2 溶液・・・・ １０ｍｌ チアミン・HCl ・・・・・・１００ｍｇ 蒸留水・・・・・・・・・１０００ｍｌ 保存のためクロロホルム２〜３ｍｌ添加する。 注２：微量元素溶液 クニン酸・H2 O・・・・・・ ２ｇ Fe(NO3 )3 ・9H2 O ・・・・ １．５ｇ ZnSO4 ・7H2 O ・・・・・・ １ｇ MnSO4 ・H2 O ・・・・・・３００ｍｇ CuSO4 ・5H2 O ・・・・・・ ５０ｍｇ NaMoO4 ・2H2 O ・・・・・ ５０ｍｇ
【００２４】得られた形質転換体について全ＤＮＡを抽
出し、サザン解析を行った結果、プラスミドｐＬｅｕ４
は、R.ニベウスＭ３７株の染色体上にタンデムに挿入し
ているか、または細胞質内に存在することが明らかとな
った。さらに、形質転換体の全ＤＮＡを用いて大腸菌を
形質転換したところプラスミドｐＬｅｕ４が完全な形で
回収された。このことから、プラスミドｐＬｅｕ４がR.
ニベウスＭ３７株内でＡＲＳ活性を有し、自己複製でき
ることが示された。
出し、サザン解析を行った結果、プラスミドｐＬｅｕ４
は、R.ニベウスＭ３７株の染色体上にタンデムに挿入し
ているか、または細胞質内に存在することが明らかとな
った。さらに、形質転換体の全ＤＮＡを用いて大腸菌を
形質転換したところプラスミドｐＬｅｕ４が完全な形で
回収された。このことから、プラスミドｐＬｅｕ４がR.
ニベウスＭ３７株内でＡＲＳ活性を有し、自己複製でき
ることが示された。
【００２５】実施例２ 実施例１で用いた環状のプラスミドｐＬｅｕ４（制限酵
素地図を図１に示す）を４種の制限酵素〔Pst I 、Bgl
II、Sal I 、Sca I 〕で切断した断片を用いて、実施例
１と同様にして形質転換を行った。その結果、何れの断
片を用いてもｌｅｕ栄養要求性は相補された。尚、得ら
れた形質転換体の全ＤＮＡをサザン解析した結果、環状
のプラスミドを用いた場合に比べて染色体への挿入割合
は高かった。
素地図を図１に示す）を４種の制限酵素〔Pst I 、Bgl
II、Sal I 、Sca I 〕で切断した断片を用いて、実施例
１と同様にして形質転換を行った。その結果、何れの断
片を用いてもｌｅｕ栄養要求性は相補された。尚、得ら
れた形質転換体の全ＤＮＡをサザン解析した結果、環状
のプラスミドを用いた場合に比べて染色体への挿入割合
は高かった。
【００２６】実施例３ R.ニベウスをＰＤ培地または最小培地に植菌し、３０℃
で約１０日間培養し胞子を作らせた。菌糸ごとに胞子嚢
をかき取り、３０ｍｌの滅菌水に懸濁し、強攪拌して胞
子嚢に包まれた胞子を遊離させた。Ｇ３ガラスフィルタ
ーで懸濁液から胞子だけを集めた。胞子懸濁液は、室温
で３０００ｒｐｍ、１０分間遠心して胞子を集めた。胞
子を１回生理食塩水で洗浄した後、０．０１Ｍのプロリ
ンを添加したＹＰＧ液体培地（１％グルコース、２％ポ
リペプトン、２％酵母抽出物）に２〜５ｘ１０7 コ／ｍ
ｌの割合で胞子を懸濁した。滅菌した綿栓付試験管に胞
子懸濁液を入れ、胞子から発芽管が生じるまで、約５時
間３０℃、３００ｒｐｍで振盪培養した。その後、Ｇ１
ガラスフィルター発芽直後の胞子より過度に発芽した胞
子を分離して除去した。濾過液は、遠心で集菌し、０．
３ｘＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（１３．３ｍＭクエン
酸、３３ｍＭ Ｎａ2 ＨＰＯ4 、ｐＨ５．６）で２回洗
浄し、緩衝液を交換した。
で約１０日間培養し胞子を作らせた。菌糸ごとに胞子嚢
をかき取り、３０ｍｌの滅菌水に懸濁し、強攪拌して胞
子嚢に包まれた胞子を遊離させた。Ｇ３ガラスフィルタ
ーで懸濁液から胞子だけを集めた。胞子懸濁液は、室温
で３０００ｒｐｍ、１０分間遠心して胞子を集めた。胞
子を１回生理食塩水で洗浄した後、０．０１Ｍのプロリ
ンを添加したＹＰＧ液体培地（１％グルコース、２％ポ
リペプトン、２％酵母抽出物）に２〜５ｘ１０7 コ／ｍ
ｌの割合で胞子を懸濁した。滅菌した綿栓付試験管に胞
子懸濁液を入れ、胞子から発芽管が生じるまで、約５時
間３０℃、３００ｒｐｍで振盪培養した。その後、Ｇ１
ガラスフィルター発芽直後の胞子より過度に発芽した胞
子を分離して除去した。濾過液は、遠心で集菌し、０．
３ｘＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（１３．３ｍＭクエン
酸、３３ｍＭ Ｎａ2 ＨＰＯ4 、ｐＨ５．６）で２回洗
浄し、緩衝液を交換した。
【００２７】発芽した胞子は、ノボザイム（Ｎｏｖｏｚ
ｙｍ）２３４（ノボ社製）５ｍｇ／ｍｌ、キチナーゼＡ
ＢＣ（アドバンス バイオファクチャーズ社製）２ｍｇ
／ｍｌ、キトサナーゼ（和光社製）１．５２ｍｇ／ｍｌ
を含む７ｍｌの上記緩衝液に懸濁した。この懸濁液をプ
ラスチックチューブに入れ、３０℃、４０ｒｐｍで１．
５〜２時間震盪培養した。プロトプラスト懸濁液の残さ
を除去し濾液を７０ｘｇ、４分間スィングロータで遠心
し集菌した。集菌したプロトプラストを緩衝液Ａで２回
ずつ洗浄し、４００μｌの緩衝液Ａ（１０ｍＭＭＯＰＳ
（ｐＨ６．３）、５０ｍＭ ＣａＣｌ2 、０．３Ｍマン
ニトール）に懸濁した。この懸濁液１００μｌに対し
て、あらかじめ１０μｌの緩衝液Ｃ（緩衝液Ａ＋ヘパリ
ン（５０ｍｇ／ｍｌの濃度で添加））に溶解し、氷中に
２０分以上放置しておいたプラスミドＤＮＡ溶液と混合
した。混合液を氷中で５分間放置し、４０％ＰＥＧ溶液
（４０％ＰＥＧ ４０００、１０ｍＭＭＯＰＳ（ｐＨ
６．３）、５０ｍＭ ＣａＣｌ2 ）１０μｌを添加し、
穏やかに混合し、さらに氷中で２５分間放置した。
ｙｍ）２３４（ノボ社製）５ｍｇ／ｍｌ、キチナーゼＡ
ＢＣ（アドバンス バイオファクチャーズ社製）２ｍｇ
／ｍｌ、キトサナーゼ（和光社製）１．５２ｍｇ／ｍｌ
を含む７ｍｌの上記緩衝液に懸濁した。この懸濁液をプ
ラスチックチューブに入れ、３０℃、４０ｒｐｍで１．
５〜２時間震盪培養した。プロトプラスト懸濁液の残さ
を除去し濾液を７０ｘｇ、４分間スィングロータで遠心
し集菌した。集菌したプロトプラストを緩衝液Ａで２回
ずつ洗浄し、４００μｌの緩衝液Ａ（１０ｍＭＭＯＰＳ
（ｐＨ６．３）、５０ｍＭ ＣａＣｌ2 、０．３Ｍマン
ニトール）に懸濁した。この懸濁液１００μｌに対し
て、あらかじめ１０μｌの緩衝液Ｃ（緩衝液Ａ＋ヘパリ
ン（５０ｍｇ／ｍｌの濃度で添加））に溶解し、氷中に
２０分以上放置しておいたプラスミドＤＮＡ溶液と混合
した。混合液を氷中で５分間放置し、４０％ＰＥＧ溶液
（４０％ＰＥＧ ４０００、１０ｍＭＭＯＰＳ（ｐＨ
６．３）、５０ｍＭ ＣａＣｌ2 ）１０μｌを添加し、
穏やかに混合し、さらに氷中で２５分間放置した。
【００２８】これに、１．２５ｍｌの４０％ＰＥＧ溶液
をさらに添加して、室温で２５分間放置した後、１０ｍ
ｌの緩衝液Ａで希釈し、５０ｘｇで４分間スウィングロ
ーターで遠心し集菌した。集菌したプロトプラストに
０．３Ｍマンニトールを含有するＹＰＧ液体培地１ｍｌ
を加え、３０℃で３０分間静置した。静置後、０．４Ｍ
マンニトールで２回プロトプラストを洗浄した後、最少
培地にプレーティングした。現れたコロニーの数を測定
し、使用したＤＮＡの量で割り算して１μｇ当たりのコ
ロニー数を求めた。結果を表１及び表２に示す。
をさらに添加して、室温で２５分間放置した後、１０ｍ
ｌの緩衝液Ａで希釈し、５０ｘｇで４分間スウィングロ
ーターで遠心し集菌した。集菌したプロトプラストに
０．３Ｍマンニトールを含有するＹＰＧ液体培地１ｍｌ
を加え、３０℃で３０分間静置した。静置後、０．４Ｍ
マンニトールで２回プロトプラストを洗浄した後、最少
培地にプレーティングした。現れたコロニーの数を測定
し、使用したＤＮＡの量で割り算して１μｇ当たりのコ
ロニー数を求めた。結果を表１及び表２に示す。
【００２９】
【表１】
【００３０】
【表２】
【００３１】尚、上記実験で使用したＤＮＡ（プラスミ
ド）は、図２〜図４に示すフローチャートに従って、以
下に説明するようにして作製した。
ド）は、図２〜図４に示すフローチャートに従って、以
下に説明するようにして作製した。
【００３２】ｐＪＰＬｅｕ４：プラスミドｐＪＬ２より
０．９ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片を単離し、Ｔ
４ポリメラーゼで末端を平滑化した。この断片と、Ｓａ
ｍＩ消化及びアルカリホスファターゼを用いて脱リン酸
化したプラスミドｐＬｅｕ４をＴ４ＤＮＡリガーゼを用
いて連結してｐＪＰＬｅｕ４を得た。
０．９ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片を単離し、Ｔ
４ポリメラーゼで末端を平滑化した。この断片と、Ｓａ
ｍＩ消化及びアルカリホスファターゼを用いて脱リン酸
化したプラスミドｐＬｅｕ４をＴ４ＤＮＡリガーゼを用
いて連結してｐＪＰＬｅｕ４を得た。
【００３３】ｐＪＰＬｅｕ４１：プラスミドｐＪＰＬｅ
ｕ４をＡｖａＩとＳａｌＩで消化し、得られた７．２ｋ
ｂｐの断片をＴ４ポリメラーゼを用いて末端を平滑化し
た後、自己連結して得られた。
ｕ４をＡｖａＩとＳａｌＩで消化し、得られた７．２ｋ
ｂｐの断片をＴ４ポリメラーゼを用いて末端を平滑化し
た後、自己連結して得られた。
【００３４】ｐＰＰＬｅｕ４：プラスミドｐＰＳ１１よ
り５．２ｋｂｐのＢａｍＨＩ断片を単離し、Ｔ４ポリメ
ラーゼで末端を平滑化した。この断片と、ＳａｍＩ消化
及びアルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化したプ
ラスミドｐＬｅｕ４をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結
してｐＰＰＬｅｕ４を得た。
り５．２ｋｂｐのＢａｍＨＩ断片を単離し、Ｔ４ポリメ
ラーゼで末端を平滑化した。この断片と、ＳａｍＩ消化
及びアルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化したプ
ラスミドｐＬｅｕ４をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結
してｐＰＰＬｅｕ４を得た。
【００３５】ｐＰＰＬｅｕ４１：プラスミドｐＰＰＬｅ
ｕ４をＡｖａＩとＳａｌＩで消化し、１１．５ｋｂｐの
断片をＴ４ポリメラーゼを用いて末端を平滑化した後、
自己連結して得られた。
ｕ４をＡｖａＩとＳａｌＩで消化し、１１．５ｋｂｐの
断片をＴ４ポリメラーゼを用いて末端を平滑化した後、
自己連結して得られた。
【００３６】ｐＬｅｕ４１：プラスミドｐＬｅｕ４をＡ
ｖａＩとＳａｌＩで消化し、６．３ｋｂｐの断片をＴ４
ポリメラーゼを用いて末端を平滑化した後、自己連結し
て得られた。
ｖａＩとＳａｌＩで消化し、６．３ｋｂｐの断片をＴ４
ポリメラーゼを用いて末端を平滑化した後、自己連結し
て得られた。
【図１】 プラスミドｐＬｅｕ４の制限酵素地図であ
る。
る。
【図２】 プラスミドｐＪＰＬｅｕ４及びプラスミドｐ
ＪＰＬｅｕ４１の作製方法を示す。
ＪＰＬｅｕ４１の作製方法を示す。
【図３】 プラスミドｐＰＰＬｅｕ４及びプラスミドｐ
ＰＰＬｅｕ４１の作製方法を示す。
ＰＰＬｅｕ４１の作製方法を示す。
【図４】 プラスミドｐＬｅｕ４１の作製方法を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:785） (56)参考文献 特開 平２−53480（ＪＰ，Ａ) 特表 昭62−501885（ＪＰ，Ａ) Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．, Ｖｏｌ．54，Ｎｏ．10，ｐ．2689−2696 （1990) Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，Ｖｏ ｌ．212，ｐ．120−123（1988) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 C12N 1/15 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (5)
- 【請求項１】 リゾープス・ニベウスの染色体及び/又
は細胞質内にムコール属のプラスミドを含む宿主−ベク
ター系。 - 【請求項２】 ムコール属のプラスミドが、ｐＬｅｕ
４、ｐＪＰＬｅｕ４、ｐＰＰＬｅｕ４、ｐＬｅｕ４１、
ｐＪＰＬｅｕ４１、またはｐＰＰＬｅｕ４１である請求
項１に記載の宿主−ベクター系。 - 【請求項３】 ムコール属のプラスミドが、ムコール・
サーシンロイズ由来のプラスミドである請求項１に記載
の宿主−ベクター系。 - 【請求項４】 ムコール属のプラスミドが、ムコール・
サーシンロイズ由来のＡＲＳ領域を有するプラスミドで
ある請求項１に記載の宿主−ベクター系。 - 【請求項５】 ムコール属のプラスミドが、ｐＭＣＬ１
３０２、ｐＭＣＬ００２またはｐＭＡ６７である請求項
１に記載の宿主−ベクター系。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT91116890T ATE140974T1 (de) | 1990-10-04 | 1991-10-03 | Wirt-vektor-system |
| DE69121159T DE69121159T2 (de) | 1990-10-04 | 1991-10-03 | Wirt-Vektor-System |
| EP91116890A EP0479301B1 (en) | 1990-10-04 | 1991-10-03 | A host vector system |
| US08/165,881 US5436158A (en) | 1990-10-04 | 1993-12-14 | Rhizopus host vector system |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2-267357 | 1990-10-04 | ||
| JP26735790 | 1990-10-04 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04218382A JPH04218382A (ja) | 1992-08-07 |
| JP3133774B2 true JP3133774B2 (ja) | 2001-02-13 |
Family
ID=17443698
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03062693A Expired - Lifetime JP3133774B2 (ja) | 1990-10-04 | 1991-03-04 | 新規な宿主−ベクター系 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5436158A (ja) |
| JP (1) | JP3133774B2 (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7883872B2 (en) * | 1996-10-10 | 2011-02-08 | Dyadic International (Usa), Inc. | Construction of highly efficient cellulase compositions for enzymatic hydrolysis of cellulose |
| US5811381A (en) * | 1996-10-10 | 1998-09-22 | Mark A. Emalfarb | Cellulase compositions and methods of use |
| DK1117808T3 (da) * | 1998-10-06 | 2005-04-25 | Mark Aaron Emalfarb | Transformaationssystem inden jfjor området filamentöse svampeværter: I chrysosporium |
| US8680252B2 (en) | 2006-12-10 | 2014-03-25 | Dyadic International (Usa), Inc. | Expression and high-throughput screening of complex expressed DNA libraries in filamentous fungi |
| US9862956B2 (en) | 2006-12-10 | 2018-01-09 | Danisco Us Inc. | Expression and high-throughput screening of complex expressed DNA libraries in filamentous fungi |
| WO2009033071A2 (en) * | 2007-09-07 | 2009-03-12 | Dyadic International, Inc. | Novel fungal enzymes |
| JP6637712B2 (ja) * | 2015-10-13 | 2020-01-29 | 花王株式会社 | Ｃ４ジカルボン酸の製造方法 |
| JP6650546B1 (ja) | 2019-08-01 | 2020-02-19 | 日本食品化工株式会社 | α−１，６−グルコシル転移反応を触媒する活性を有するタンパク質 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK601984D0 (da) * | 1984-12-14 | 1984-12-14 | Hansens Lab | Fremgangsmaade til fremstilling af genprodukter |
| CA1333777C (en) * | 1988-07-01 | 1995-01-03 | Randy M. Berka | Aspartic proteinase deficient filamentous fungi |
| JPH0253480A (ja) * | 1988-08-19 | 1990-02-22 | Nippon Shokuhin Kako Co Ltd | リゾープスの形質転換法 |
| EP0481008B1 (en) * | 1989-07-07 | 1997-11-12 | Unilever Plc | Process for preparing a protein by a fungus transformed by multicopy integration of an expression vector |
-
1991
- 1991-03-04 JP JP03062693A patent/JP3133774B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-12-14 US US08/165,881 patent/US5436158A/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５４，Ｎｏ．１０，ｐ．２６８９−２６９６（１９９０） |
| Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，Ｖｏｌ．２１２，ｐ．１２０−１２３（１９８８） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04218382A (ja) | 1992-08-07 |
| US5436158A (en) | 1995-07-25 |
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