JPS62190085A - Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原の酵母による製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、組萌えＤＮＡ技術を使用するＢ型肝炎ウィル
スの表面抗原の製造法に関する。更に本発明は、酵母を
用＾たＢψ肝炎ウィルスの表面抗原の製造法に関する。

史に本発明は、Ｂ晴肝炎ウィルスの表面抗原をコーｒす
る新規組換えＤＮＡ　Ｋ関する。史に本発明は、該新規
組戻えＤＮＡで形質転換された新規微生物に関する。

背景技術 近年、組換えＤＮＡ技術が発展し、非常に多数の有用な
ポリペプチドの微生物による製造がＯＴ目ヒとなって来
た。すなわち、例えばヒト成長ホルモン。

真核生物のインターフェロン、ヒトインシュリン。

ヒトゾロインシュリンなどの多くの、四俵生物由来のポ
リペプチドが、ｔでに微生物によって製造されている。

これらの研究は現在も進行中であり、将来他の各種のポ
リペブチｒが、微生物によって装造されるものと期待さ
れている。有用なポリペプチドの１つとして、８ｍ肝炎
ウィルスの表面抗原がある。

Ｂ型肝炎（血清肝炎）ウィルスはヒトに感染し、漫性の
弱質感染症として現われ、重篤な肝疾蝋、癌へと進行し
、量後には死に到るものである。週とんどの場合、Ｂ型
肝炎は治癒できるが、多くの人々、時にアフリカ、アク
アの多くの人々は、゛１４注的なりｇ肝炎ウィルスの保
有者であり、肝炎が流行する危険性を有して＾る。

Ｂ型肝炎の効果的な予防法は、通常高度に１ｒｔｌ　製
したＢｆｉ肝炎ウィルスの表面抗原であるＢ型肝炎のワ
クチン金投与する方法である。かかるワクチンは、ウィ
ルスによる感染を防ぐのに有効であり、ｌ陪に輸血を必
要とする人々、透析患者、あるいにこれら患者と接する
病院職員らにとって極めて有用である。更には、かかる
ワクチンは、新たなウィルス保有者の発生を阻止するの
に有効であり＼従って、地球上からＢ型肝炎ウィルスを
撲滅できる可能性がある。

Ｂ型肝炎ウィルスは、培養細胞には感染せず、従って感
染したヒトあるいは″礁長頌からのみ得ることができる
。かかる理由により、Ｂ型肝炎ウィルスに対する免疫に
用Ａる抗原を製造するため釦、十分な殴のＢ型肝炎ウィ
ルスが得られず、また十分な１が維持できなかった。

Ｂ型肝炎ウィルスのワクチン（儂、通常、Ｂ型肝炎つィ
ルス渫有者の血漿からＢ型肝炎ウィルスの表面抗原を単
ｌｉ＃Ｉ精製して得られる。しかしながらかかる表面抗
原は、血漿中で非常に低濃度でしか存在しな力ために、
精製に多くの労力を必要とする。従って、今日まで工業
的規模で、目的とするＢ型肝炎ウィルスのワクチンを製
造することは非常に困難であった。

発明の開示 本発明により、メタノール、非異化代謝産物抑制炭素源
、あるいは炭素源欠除に対して応答性の調節遺伝子領域
の支配下にある、Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原をコード
する遺伝子配列を含む組換えＤＮＡで形質転換された酵
母を培養することにより、高収率でＢ型肝炎ウィルスの
表面抗原が得られることが見出された。

本発明により、調節遺伝子領域及びポリペプチドコード
遺伝子領域を含む新規ＤＮＡ断片であって、骸ポリペプ
チドコード遺伝子領域カニＢ型肝炎ウィルスの表面抗原
またはその一部をコードし、該調節遺伝子領域が、該ポ
リペプチドコード遺伝子領域の５′末端に位置した時に
メッセンジャーＲＮＡの転写をコントロールできる新規
ＤＮＡ断片が提供される。調節遺伝子領域、Ｂ型肝炎ウ
ィルスの表面抗原（ＨＢｓＡｇ　）遺伝子、及び転写終
結部分の組合わせを、以後発現カセットまたは発現単位
と云う。

本発明で用込る調節遺伝子領域は、次の少なくとも＾ず
れか１つの条件に対して応答性を示すものである。すな
わち、培養基中にメタノールが存在し、発現カセットを
保持する宿主生物が該メタノールと接触する条件； 培養基中にメタノール以外の非異化代謝産物抑制炭素源
が存在し、発現カセットを保持する宿主生物が該炭素源
と接触する条件； 及び、培養基中に炭素源の欠除の状態が生じ、発現カセ
ットを保持する宿主生物が、異化代謝産物抑制炭素及び
エネルヂー源を基に生育後、該炭素源の欠除の状態と接
触する条件の少なくとも＾ずれか１つの条件である。

更に本発明により、上記発現カセットを１呆持する新規
線状及び環状のプラスミドが提供される。

更に本発明により、上記線状又は環状のプラスミドで形
質転換された酵母株の本質的に純粋な培養物が提供され
る。

更に本発明により、目的とする蛋白の発成が起る条件下
で上記シラスミげにより形質転換された酵母株を培養す
ることからなる、Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原の製造法
が提供される。

本発明で用＾る調節遺伝子領域は、 （１）　　メタノール； （２）グリセロール、がラクトース、アセテートなどの
非異化代謝産物抑制炭素源；又は、（３）　　グリコー
ス、エタノール、フルクトースなどの異化代謝産物抑制
炭素源（この場合には、引き続いて炭素源欠除の状態が
起こる）を含む培地に対して応答性を示すことを臂徴と
して有するものである。

上記条件全満足する調節遺伝子領域の例としては、第１
，２及び３図の制限酵素地図で示したものが挙げられる
。第１図で示した調節遺伝子領域は、Ｐｉｃｈｉａ　ｐ
ａｓｔｏｒｉｓのジヒドロキシアセトンシンターゼ（Ｄ
ＡＳ　）遺伝子から誘導される。嬉２図で示した調節遺
伝子領域は、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓの一級ア
ルコールオキシダー＋Ｐ（ＡＯＸｌ）遺伝子から誘導さ
れる（　Ｐｉｃｈｉａは、ＡｏＸｌ及びＡＯＸ　２で示
される２つのアルコールオキシダーゼ遺伝子ｅ持って藝
る）。第６図で示した調節遺伝子領域は、Ｐｉｃｈｉａ
　ｐａｓｔｏｒｉｓのｐ４０遺伝子から誘導される。

当業者により、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓのよう
なメチロトローフ酵母から、上記の如き′特性を有する
他のＡｊｉｉ５遺伝子領域金率畦できることが判るであ
ろう。

そして上記と同様の特性を有するかかる調節遺伝子領域
も、本発明で使用できる。

Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原（ＨＢｓＡｇ　）の遺伝子
はすでに単離されており（ＶａｌｅΩｚｕｅｌａｇ）ｐ
（１９７９）、Ｎａｔｕｒｅ２８０，８１　５）、ｐＨ
ＢＢ−５（第６図参照及びＶａｌｅｎｚｕｅｌａら、（
１９８２）。

Ｎａｔｕｒｅ　２９８　ｐ　　３４７　）　　、　　ｐ
ＨＢｖ　−Ｔ　−Ｉ　Ａ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ　、　　
ＥＰＡ　７３　、　６５７　）　　ｚ　　ｐＨＢｓ　−
５６（ＡＴＣＣ受託、ｇ４０．０４７　；　ＥＰＡ１２
０．５５１）などの各種ベクターを適当な制限酵素によ
り処理することによって入手し得る。

ＢＨ１肝炎ウィルスの表面抗原の遺伝子は、Ｂａ１３１
エキソヌクレアーゼ処理により、５′末端の非コーげ領
域を除去することができる。ＨＢｓＡｇ遺伝子の３′末
端部分は、エンドヌクレアーゼ消化及びリンカ−の付加
により、非コード領域を除去することができる。ＨＢＳ
Ａｇ遺伝子は、更に、ＤＮＡ断片の組換え用として制限
酵素認識部位を挿入することができる。かくして得られ
るＤＮＡ　Ｔｒｒ片は＼ＦｒｏＲＩ−５ｔｕＩ挿入部位
を含み、次のヌクレオチｒ配列を有する。

本発明の、調節遺伝子領域及び構造遺伝子からなるＤＮ
Ａ構築体は、微生物和導入して、各種の方法により、増
幅、再生１発現を行なうことがで傘る。酵母中で自律重
複１＃１１！を行なうためには、自律的複製配列（ＡＲ
８）の要素が有用である。これらの例としては、Ｐｉｃ
ｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｇから誘導されるＰＡＲＳ１及
びＰＡＲＳ２が挙げられる（発明者Ｃｒｅｇｇ。

譲受人Ｐｈ１ｌｌｉｐｓ　Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ　Ｃｏ、
のＵ、８．　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｒ＋ＳＮ　６６６．
５７７　）。ＤＮＡ構築体が宿主形質転換体の染色体中
に組込まれる場合には、ＡＲ８！素は用いる必ｒｌ！嫁
なめ。このように染色体中に組込まれる形質転喫を達成
するための好ましい方法は、発明者（：　ｒ　ｅｇｇ　
＊譲受人Ｐｈ１ｌｌｉｐｓ　Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ　Ｃｏ
、のＵ　、　８．　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　８．Ｎ、
　７９１．０１５に記載されており、かかる方法では、
１つの（第１の）挿入ＤＮＡ断片断片１マ択マーカー他
の１つの（第２の）挿入ＤＮＡ断片を含む、組込みベク
ター用の部位を用＾ている。

第１及び第２の挿入ＤＮＡ断片鉱、その長さがそれぞれ
少なくとも２００ヌクレオチにであって、Ｐｉｃｈｉａ
属のｒツムＤＮＡの部分と相同である。組込みベクター
の各種配列要素は、連続して配列して線状のＤＮＡ析片
断片成しており、発現カセット及び選択マーカー遺伝子
は、第１の挿入ＤＮＡ断片の３′末端と第２の挿入ＤＮ
Ａ断片の５′末端との間に位置するように配列されてい
る。第１及び＠２の挿入ＤＮＡ断片は、お互いに、Ｐｉ
ｃｈｉａのｒツム中での配位と同様に配位して＾る。

宿主株の形質転換に用いるＤＮＡ中には、少なくとも１
つの選択マーカーが含まれていることが盛装である。選
択マーカーが含まれていることによって、ＤＮＡが導入
された生物の選択及び単離が容易となる。選択マーカー
によって、形質転換生物に、宿主が本来有してｌ、Ｑな
い表現１ｊｉ特性が付与される。例えば、非形質転換生
物が特定のアミノ酸生合成経路を欠失して＾る場合、こ
れら宿主にアミノ酸産生能力を付与せしめることができ
る。

当業者により、本発明で用＾るベクターには、更に、バ
クテリアシラスミＦＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ
等のＤＮＡ配列が挿入されて＾てもよ＾ことが理解でき
よう。これら配列によって、バクテリア宿主中でのベク
ターの増幅及び維持が可能となる。

本発明の上記した如舟プラスミドは、形質転換し得る酵
母株に対して用＾られる。本発明の新規ＤＮＡ断片の酵
母における発現は、当該形質転換生物を炭素源欠除の状
聾にさらすことによってコントロールできる。各種の異
化代謝産物抑制及び非異化代謝産物抑制炭素源の基での
生育の後、炭素源欠除の状態にさらすことよって、遺伝
子産物の発現が誘導され、本発明の調節遺伝子領域の支
配の基に維持される。形質転換された酵母の適当な種で
、目的とする遺伝子産物を発現させる他の方法としては
、形質転換酵母をメタノールを基にして生育せしめる方
法がある。目的とする遺伝子産物の発現を誘導する他の
１つの方法は、形質転換酵母を非異化代謝産物抑制炭素
源を含む培池で生育せしめる方法である。

本発明の調節遺伝子領域に、各種条件下に誘導されるこ
とが判っており、従ってすべての酵母株における発現に
有用である。しかして、メタノ−゛　　　ルあるｂは非
異化代謝産物抑制炭素源を基にして生育し得る酵母によ
り、外来すなわち異１蛋白が直接産生きれ、一方異化代
謝産物抑制爽素源を基にして生育し得る酵母を、該炭素
源の存在下に生育せしめた後、炭素源欠除の状・唄にさ
らすことによっても、外米蛋白を産生せしめることがで
きる。

本発明の製造法において好ましｂ形質転換酵母株は、以
下の如き属である。

Ｃａｎｆｊ　ｌ　ｄａ　＋ Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ。

Ｈａｎｓｅｎｕｌａ。

Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ。

Ｐｉｃｈｉａ、　ａｎｄ これら属の酵母は、取扱いの安全性、生育条件等が確立
されておｇ当業者に周知であるので好ましいＱ 特に好ましい酵母株は、メタノールを炭素源及びエネル
ギー源として生育し得る酵母株である。

メタノールを基に生育し得ることが知られた酵母として
は、以下の如き媚がある。Ｃａｎｄｉｄａ、　Ｋｌｏｅ
−ｃｋｃｒａ、　８ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、　Ｐｈ
ｏｄｏｔｏｒｕｌａ、　Ｈａｎｓｅｎｕｌａ。

Ｔｏ　ｒｕｌｏｐ　Ｕ　ｉＳ及びＰｉｃｈｉａである。

本発明の調節遺伝子領域は、炭素源欠除の条件と同様に
非異化代謝産物抑制炭素源の基での生育によって誘導さ
れるため、グルコース、アセアート、グリセロール、エ
タノール、ラクトース、がラクトース、フルクトース、
スクロース、これらの混合物等を基に生育し得る酵母株
も本発明の実施に有用である。宿主生物を、グリセロー
ル、ゴラクトースなどの適当な非異化代ａ産物抑制で非
メタール炭素源を基に生−＃せしめることにより、ある
＾は宿主生物を、エタノール、グルコース。

フラクトースなどの適当な異化代謝産物抑制炭素源を基
に生育せしめ次いで炭素源欠除の状態にさらすことによ
って、本発明の調節遺伝子領域のコントロールのもとて
遺伝子産物の発現を行なわしめることができる。

特に好ましｂ宿主酵母株は、変異株Ｐｉｃｈｉａｐａｓ
ｔｏｒｉｓ　Ｇ　Ｓ　１１５であり、これはヒスチジン
産生能を欠失した変異株である。０８１１５は変異体表
現型ｈｉｓ　４を有し、ヒスチジン合成経路におけるヒ
スチジンデヒドロゲナーゼ（ｈｉｓｔｉｄｉｎｏｌｄｅ
ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　）　コード遺伝子を欠失Ｌ／
テｌ、−、ル。

Ｇ５１１５はＰｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ　ＮＲＲ
Ｌ　Ｙ−１１４３０から誘導されｔｈｅ　Ｎｏｒｔｈｅ
ｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＣｅｎｔｅ
ｒ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｄｅ
ｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ｉｎ
　Ｐｅｏｒｉａ、　ｌ１ｌｉｎｏｉｓに寄託されており
、受託番号ＮＲＲＬ　ｙ　−１５８５１が与えられてい
る。この宿主は、ヒスチジン合成経路を欠失した栄誉要
求株であるため有用である。他のＤＮＡ配列のなかでも
、侍にＨＩＳ　４遺伝子機能をコードする配列を含むベ
クターでこの宿主を形質転換した場合には、より確かに
形質転換宿主を選択することができる。

本発明の実施の上で有用な池の１つの酵母株は、変異株
Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ　Ｇ　Ｓ　１９０であ
ジ、アルギニン合成経路にお＾てアルギニノスクシネー
トリアーゼコード遺伝子を欠失した変異株である。

Ｇ５１９０はＰｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ　ＮＲＲ
Ｌ　Ｙ　−１１４”＋Ｄから誘導され、　　ｔｈｅ　Ｎ
ｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔ
ｅｓ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕ
ｒｅ　ｉｎ　Ｐｅｏｒｉａ、　ｌ１ｌｉｎｏｉｓに寄託
されており、受託番号ＮＲＲＬ　Ｙ　−１８０１４が付
与されている。

更に好まし匹他の１つの酵母株は、二重栄Ｉｉ！−要求
株ＰＰＦ１であり、これはヒスチジン及びアルギニン合
成経路を欠失している。ＰＰＦ　ｉはヒスチジン合成経
路におけるヒスチジンデヒドロデナーゼコード遺伝子及
びアルギニン合成経路におけるアルギニノスクシネート
リアーゼコード遺伝子を欠失じたものである。ＰＰＦ　
１　（’！、ｔｈｅ　ＮｏｒｔｈｅｒｎＲｅｇｉｏｎａ
ｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　ｔｈｅ　
Ｕｎｉｔｅｄ　ＳｔａｔｅｓＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏ
ｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ｉｎ　Ｐｅｏｒｉａ、　
ｌ１ｌｉｎｏｉｓに舒託されており、受託番号ＮＲＲＬ
　ｙ　−１８０１７が付与されている。

ＥＳ　Ｃｈｅ　ｒユｃｈｉａ　ｃｏユニもまた本発明の
デラスミｒの好適な何主である。当業者により、Ｅ、　
ｃｏｌｉの多くの株が好ましい宿主であることが理解で
きよう。本発明で粗したいくつかの株を以下に挙げる。

ＭＣ１０６１未知 ＬＥ３９２　　　　　　　　　　　　ＡＴＣＣす、５３
５７２ＭＭ２９４　　　　　　　ＡＴＣＣ≠３３６２５
Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓの形質転換実験法はす
でに文献に記載されており、また以下に（実施例１）詳
細に記述した。

Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓは、細胞壁を酵素的に
消化してスフェロプラストとすることによって転質転換
される。スフェロプラストは、次−で、導入するＤＮＡ
と混合しカルシウムイオンとポリエチレングリコールの
存在下にインキユペートシ、次いでヒスチジンのな＾選
択培地で生育せしめる・導入するＤＮＡ　Ｂ　、宿主株
では欠失したＨｆＦ４４　ｅ含んでおり、かくして形質
転換細胞のみが、選択培地で生存する。

当業者にとっては、組換え宿主から異種蛋白を抽出する
多くの方法は公知である。細胞を粉砕し、蛋白を濃縮す
る及び／又は粉砕されたａ胞から抽出する公知のいずれ
の方法も、本発明により製造されたＨＢｓＡｇの回収に
採用できる。

形質転換細胞は、前記した如去発現のだめの好適な榮件
下で生育される。次＾で細胞を破壊し、溶′ｆｖ１部分
と不溶部分につ＾て、ＨＢｓＡｇの分析を行なう。溶解
部分については、商業的に入手し得る”　ＡＵＳＴＲＩ
Ａ”　ＩＩ　”分析キット金用込て、２２ｎｍの粒子を
分析する。溶解部分と不溶部分について、ＨＢＳＡｇモ
ノマーに対する抗血清及び放射活性１２５Ｉ−ラベル化
プロティンＡｉ用いたウェスタンプロッティング法によ
り、七ツマ−の分析を行なう。

以下に本発明を実施例により更に詳細にするが、これら
実施例に本発明は限定されない。

実施例 本実施例を通じて使用する略号は以下の如き意味を示す
。

８ＤＳ　ニドデシル硫酸ナトリウム ＥＤＴＡ　：エチレンジアミン四酢酸 ＴＥＭＥＤ　：　Ｎ　、　Ｎ　、　Ｎ’　、　Ｎ’−テ
トラメチレンジアミン ＤＴＴ　ニジチオスレイトール ＥＳＡ　：ウシ血清アルブミン ＥｔＢｒ　：臭化エチジウム ＰＭＳＦ’　：フェニルメタンスルホニルフルオリトＣ
１：キュリー Ｚｙｍｏ１ｙａｓｅ６Ｄ、０ＤＤ ８ｏｕｒｓｅ　：マイルスラボラトリーズ社製以下の実
施例で使用する緩＠液及び溶液は、下に示す組成を有す
る。

１Ｍトリス緩衝准：　Ｈ２Ｏ８００紅にトリス塩基１２
１．１．９を俗解し、濃塩酸 （６５％）を加えて−を調整 し、最終的なＰｌ″Ｉ調整前に溶液 を室温に冷却し、最終容量１ ｔとなるように希釈する。

ＴＥ緩衝液ニドリス緩衝液（ｐＨ−７，４）０．０１　
Ｍ中にＥＤＴＡ　１．ＯｍＭを含む。

ＰＢＳ　（リン酸緩：１０ｍＭリン酸ナトリウム衝化生
理食塩水）　　（ｐＨ７，０） ０．１５　Ｍ　ＮａＣｌ ８ＤＳ　’ｒルロー：６２．５ｍＭトリスーＨＣｔ（ｐ
Ｈディングバッファ　６．８） −２％８Ｄ８ １０％グリセロール １００麿ジテオスレイトー ル ０．００１％ブロモフェノール ブルー ＹＰＤ培地：１％酔母（Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ　）エ
キス ２％ペプトン（８ａｃｔｏ−ｐｅｐｔｏｎｅ）２％デキ
ストロース ８Ｄ培地：　６．７５　＆酵母窒素源（アミノ酸含ます
）　ＣＤＩＦＣＯ） ２％デキストロール １を水 ＳＥＤ　：　Ｉ　Ｍソルビトール ２５　ｍＭＥＤＴＡ ５　Ｑ　ｍＭ　ＤＴＴ ８０Ｅ緩衝液：　９−１　＆ソルビトール１．４７＆ク
エン酸ナトリウ ム ０．１　６８　ｉ　ＥＤＴＡ ５０紅Ｈ２０ −−−−ＨＣｔでｐ）１５．８に調整 ＣａＳ　：　Ｉ　Ｍソルビトール １３　ｍＭ　ＣａＣｌ２ 一−−−濾過滅菌 ＰＥＧ浴液：２０％ポリエチレングリコール−６６５０ １０ｍＭ　ＣａＣｌ２ １Ｑ　ｍＭ　）　リス−ＨＣ１（ｐｌ（７，４） 一−−濾過滅菌 ＳＯ８：１Ｍソルビトール Ｑ、３　ｘ　ＹＰＤ培地 Ｉ　Ｄ　ｍＭ　ＣａＣｌ２ 基礎塩組成物（形質転換Ｐｉｃｈｉａ生育用）Ｈ，ｐｏ
ｔ　８５％　　　　　　　４．２１ｎＬＣａＳＯ４・２
Ｈ２００−１８９ に２８０．　　　　　　　　　　２．８６１１ＭｇＳＯ
４・７Ｈ２０２，３４＆ ＫＯＨＤ、６５　＆ Ｐｉｃｈｉａ朱養培地（Ｇ５１１５／ｐＢＳＡＧ５生育
用）１１／を水 Ｈ，ＰＯ，（８５％）　　　　　　３．５ｍｇＣａ８０
４・２Ｈ２００−１５ に２ＳＯ４２−３８ Ｍｇ８０．−２Ｈ２０１，９５ ＫＯＨＤ・６５ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２００，０６５ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２００−００６ ＺｎＳＯ４−７Ｈ２００，０２０ ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ０−００３ ビオチン　　　　　　　　　０．００００４１炭素源　
　　　　　　　　　２０−１００．９微量塩液（Ｇ５１
１５（ｐＢＳＡ　ＧＩ５　ｘ）生育用〕ＩＩ／を水 ＣｕＳα、−５Ｈ２００，０６ ＫＩ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，０
８Ｍｎ５Ｏ４−Ｈ２Ｏ０−３ Ｎ０−３Ｎａ２・２Ｈ２０［１−２ Ｈ３ＢＯ３ｏ、ｏ　２ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２０２−０ ＦｅＣｔ３・６Ｈ２０４−８ Ｈ２Ｓｏ、　　　　　　　　　　　　　　３−５れ／ｌ
（濁シを除くた め〕 オースリア（Ａｕｓｒｉａ）希釈緩衝液４．３　ｍＭ　
Ｎａ２ＨＰＯ４ １，５ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ。

２．７　　ｍＭ　ＫＣｌ ０．１５　Ｍ　ＮａＣ１ １％ウシ血清アル デミン ０．０　２　％　す　　ト　　リ　　ラムアジド 一一一最終−−７，４ 可溶化緩衝液 １０ｄリン酸ナト リウム緩衝液（ｐＨ ７，５） ０−５　Ｍ　ＮａＣ１ ０，１％）す）ンＸ−１００ ２ｍＭ　ＰＭＳＦ 他に特定されていない限シ、上記溶液は基本（１ｘ）濃
度を示している。実施例を通して異なる濃度を用いた場
合には、基本（１ｘ）ｉ！ｉ度の倍数として表わした。

実施例１ Ａ、細胞の生育 １．　　Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ　Ｇ３１１５
　（ＮＲＲＬ　ｙ−１５８５１）のコロニー′ｆｔＹＰ
Ｄ培地約１ｒ：Ｊｍｌに接種し、６０℃で１２−２０時
間振盪培養する。

２、約１２−２０時間後、細胞を希釈して０Ｄ６ｏ。

約０．０１−０．１　、！：し、ＹＰＤ培地中６０℃で
約６−８時間、細胞を対数増殖期に維持する。

３、＜５−８時間後、０Ｄ６ｏｏ約０．１の種培養物０
．５Ｎ（あるいは当量）をＹＰＤ培地１００紅に接種す
る。次いで６０℃で約１２−２０時間振盪する。

４−　０Ｄ６００が約０．２−０．３になった時（約１
６−２０時間後）に、得られる培養物に１５００＆で５
分間遠心する。

Ｂ、スフェロプラストの調製 １、細胞を滅菌水１０紅で１度洗う。（ステップ１−５
において、それぞれ１５００Ｊで５分間遠心する〕 ２、細胞を新たに調製したｓｇＤｌ　０　ＪＭで１度洗
う。

６、滅菌１Ｍソルビトールで２回細胞を洗う。

４、　８ＣＥ緩衝ｆ１Ｏｍｌ中に細胞を再懸濁する。

５、　４　ｍｙ　／　ｍｌ　Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ　６肌
０００（マイルスラボラトリーズ社製）５−１０μｔを
加える。細胞を６０℃で３０−６０分間インキュベート
する。

形質転換法において、スフェロプラストの調製は、精確
さを要する工程であるので、スフェロプラストの形成を
次のようにして追跡する。すなわち、ｚｙｍｏｌｙａｓ
ｅを加える６１」及び直後、そしてインキュベーション
の各時期に、細胞の一部１００μｔを５％ＳＤＳ　９０
０μを及び１Ｍソルビトール９００μｔに加える。そし
て細胞がＳＤＳ甲で浴解し、ソルビトール中では俗解し
ない時点で（通常６０分から６０分の間）、インキュベ
ーションを止める。

６、　スフェロプラストを滅−１１１Ｍンルビトール１
０就中で、Ｉ　Ｏｏ、９　、５−１０分子ＴｉＪ遠心す
ルコとによって、２回洗う。（遠１９の時間及びスピー
ドは変えてもよく、スフェロプラストがペレット状にな
るまで十分に遠心し、しかし破れる程には遠心しない。

） Ｚ　滅菌ＣａＳ　Ｉ　ＱｍＪで１度細胞を洗う。

８、　０ａＳ　Ｏ−６Ｎ中に細胞を再懸濁する。

Ｃ０形質転換 １、　　ＤＮＡサンプル（２０μｔまで）を、滅菌ポリ
エチレンチューブ１２Ｘ７５ｍｍに加える。

（ＤＮＡは水又はＴＥ緩慟液中に入れておく。少量ＤＮ
Ａで最大の形質転換が起こるためには、５■／就の超音
波処理Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡ　１μＬをサンプルに加え
るのがよい。） ２、　スフェロプラスト１０μｔを、それぞれのＤＮＡ
サンプルに加えて室温で２０分間インキュベートする。

６、　それぞれのサンプルにＰＥ（）　ｂ液１Ｎを加え
、室温で約１５分間インキュベートする。

４、サンプルを１０００＆で５−１０分間遠心し、ｐＥ
ｏ浴液でデカントする。

５、　サンプルをＳＯ８１５０μを中に再懸濁し、室温
で６０分間インキュベートする。

６、滅菌１Ｍソルビトール８５０μｔを加え、次いで下
記の如くして、サンプルの一部をプレートする。

１、　再生用寒天培地の処方 ａ、寒天−ＫＣｔを含むバクト寒天（ＢａｃｔＯ−ａｇ
ａｒ　）　９　！ｌ−，ＫＣｔｌ　３−４９　、及び水
２４０紅を圧熱滅菌する。

ｂ、グルコ−ｘｌＯＸｋ含む（１０Ｘ　Ｇ’１ｕｃｏｓ
ｅ−）デキストロース２０ｇ、及び水１ＱＱｍ＃を圧熱
滅菌する。

ｃ、８ｃ１０Ｘを含む（１［Ｉ　Ｘ　ＳＣ−）酵母窒素
源（アミノ酸室まず）　６．７５．９　、及び水１００
縮を圧熱滅菌する。（適当なアミノ酸又は核酸を、像度
２００μｇ／肋まで、オートクレーブ前又は後に加える
。） ｄ、グルコ−、ｘ、１ＱＸ３　Ｑｍｂ及びＳＣ１０Ｘ　
３０ｍｒを、寒天−ＫＣ１溶液３００　ｍｌに加えるｏ
Ｏ−２ｔｒｙ／　ｍｌビオチン０．６　ｍＡ及び他の適
当なアミノ酸又は核酸を、濃度２０μｉ　／　ａｔまで
加える。再生用陳天ｔｌ−５５−６０℃に保持する。

２、形質転換サンプルのブレーティング形質転換サンプ
ルを用意する少なくとも６０分前に、プレートａシ１Ｑ
ｍＡの再生用寒天を注ぎ、底面に寒天層を形成する。形
質転換サンプルがＳＯＳ中にある間は、再生用寒天の一
部１Ｑｍｌを４５−５０’Ｃのバス中のチューブに分け
ておく。

それぞれのサンプルの総量を４５−５０℃に保たれた再
生用寒天の一部１［］ｍｌに加え、再生用寒天１０ｍ１
の欅大層上に、注ぐ。

６、調製されたスフェロプラストの決定１つのサンプル
から１０μｔを取シ、１及ソルビトール９９０μｔで１
００倍に希釈する。１００倍希釈液の１０μｔを取り、
１Ｍソルビトール９９０μｔを加えて更に１００倍に希
釈する。それぞれの希釈液の一部１００μｔをＹＰＤ寒
天培地に広け、スフェロプラスト化されていない細胞の
！度を決定する。それぞれの希釈液１００μｔを、ヒス
チジン４０μ９／ｒｎｂｔｌ−富む再生用寒天１０紅に
加え、全実生スフェロプラストを決定する。望ましい形
質転換実験によれは、全実生スフェロプラストは１−３
ｘ１［１７／ｍＪであシ、スフェロプラスト化されてい
ない細胞は、ｌＸ１０”／ｍＪである０ ４、　プレートを６０℃で６−５日間インキュベートす
る。

実施例■ １、　プラスミドｐＰＧ２．５　（プラスミドｐＰＧ４
．０の約２−５　ＫｂＰ　ＥｃｏＲＩ−８ａｔＩ断片を
含む、ｐＢＲ３２２に基づくプラスミドであシ、該プラ
スミドは一部アルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸｌ
　）及び調節遺伝子領域を含み、Ｅ−Ｃ０１ｉ　（ＮＲ
ＲＬ　Ｂ−１５８６８゜ｔｈｅ　Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒ
ｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏ
ｆｔｈｅ　　Ｕｎｉｔｅｄ　　５ｔａｔｅｓ　　Ｄｅｐ
ａｒｔｍｅｎｔ　　ｏ’ｆ　　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ
ｉｎ　Ｐｅｏｒｉａ、　ｌ１ｌｉｎｏｉｓ　）宿主から
入手することができる）を、Ｂａｍ　ＨＩで消化した。

２、線状化されたプラスミド’ｉ　ＢＡＬ３１で消化し
た。

６゜得られるＤＮＡ　’ｉクレノー断片で処理して平滑
末端を得、、　　ＥｃｏＲＩ　！Ｊンカーに連結させた
。

４、得られるＤＮＡ断片をＥ、ｃｏｌｉ　ＭＭ２９４株
に導入した。

５、下記の配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い
たコロニーハイブリダイゼーション法によシ、形質転換
体の分析を行なった。

５雪ＴＴＡＴＴＣＧＡＡＡＣＧＧＧＡＡＴＴＣＣ。

このオリゴヌクレオチドは、ＡＴＧ開始コドソを含んで
いないがそれに到るまでのＡＯＸＩプロモーター配列を
含んでおＦ）、ＥｃｏＲＩ　！ｊンカーに融合している
。

６、　陽性クローンのＤＮＡ配列をマクサムイルバート
法によシ決定した。６つの全ての陽性クローンは、以下
の配列を有していた。

５　’　、　、　、ＴＴＡＴＴＣＧＡＡＡＣＧＡＧＧＡ
ＡＴＴＣＣ、、，３°。

それらすべては、ＡＴＧの”Ａ″（上記配列において下
線で示した）を保付していた。この人は、害にならない
と決定された。他のすべてのクローンも、これら＃性ク
ローンの紡導体であった。

得られるクローンは、実験上、ｐＡＯＰｌ　、　ｐＡＯ
Ｐ２゜ｐＡＯＰとそれぞれ命名した。

Ｚ　他の２つのクローンについても、同様にＢＡＬ３１
　／　ＩＪンカー一連結生成物の分析によシ、同定を行
なった。それらは次の配列を有していた。

５’　、　、　、ＴＡＡＴＴＡＴＴＣ（）ＧＡＡＴＴＣ
Ｃ，、，３’ｐＡＯＸ１　　　勝ＲＩ これらクローンを、ｐＡＯＰ５　、　ｐＡＯＰ６と命名
した。

上記した方法の変法によシ、プラスミドｐＰＧ２．５ｆ
、ＢａｍＨＩに代わってＡｓｕＩＩで切断し、得られる
縁状化断片をクレノー断片で処理しく　ＢＡＬ３１処理
は行なわない）、次いで、ＥｃｏＲＩ　＋）ンカーに連
結した。°得られるプラスミドは１．ＡＯＸ１プロモー
ター配列を含んでおｆｉ、ＡＴＧ開始コＰンは含んでい
なかった。

５’　、、、ＴＡＡ’Ｉ’ＴＡＴＣ）ＧＡＡＴＴＣ、、
，３’ｐＡＯＸＩ　　　ＥｃｏＲＩ Ａ（ＩＸ１プロモーター（１）ＡＯＸｌ　）は、酵素合
成の停止によシ、炭素源異化代Ｗ産吻抑制に対して応答
性會有する。加えて、ＡＯプロモーターは炭素源欠除に
対しても応答ａを有する。メタノールを基にした生育に
よｆｉ、ＡＯＸ１プロモーターか誘導される。更に、評
細な研究によシ、Ｅｌｌｉｓ　。

Ｂｒｕｓｔ　、　Ｋｏｕｔｚ　、　Ｗａｔｅｒｓ　、　
Ｈａｒｐｏｌｄ及びＧｉ　ｎｇｅｒａｓら、　Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ　、　ｍｙ　、　１９８５　。

ｐ、　１１１１−１１２１に記載されたと同様に、本発
明で用いるＡＯＸ１プローモー断片は、染色体でのＡＯ
Ｘ１プロモーターと同様にして、調節されて・いること
が明らかになった。本実施例で記載した如くしてＦ／ｌ
製され単離されたクローンのそれぞれは、ＡＯｘ１プロ
モーター目芽と同様に、異化代謝産物抑制、炭素源欠除
、及びメタノール誘導に対して応答性を示した。

ＡＯターミネータ−について ＡＯターミネータ−として用いる５ｔｕＩ−Ｈｉｎｄｌ
ＩＩフラグメントは、ＡＯＸＩ　ｍＲＮＡ転写のポリア
デニル化のための鋳型を提供する配列を含んでいる。こ
れらの配列は次の配列を含んでいる。

ＴＡＴＡＧＴＡＴＡＧＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＧＴＣ−ポ
リアデニル化５ｔｕＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、ポリペ
プチドコード領域に対してプラスミドの６′末端部に配
置せしめた時、該断片によｐ、ＲＮｋの転写の終結が促
される。ＡＯＸＩターミネーション配列は、プラスミド
ｐＰＧ３．２から単離され、回収することができる。

プラスミドｐＰＧ３．２は、ｐＢＲ３２２に基いたプラ
スミドであ、ｉＤ、ＡＯＸ１ターミネーション配列を有
している。このプラスミドは、Ｅ、Ｃ０１１宿主に導入
芒れ、これは、ｔｈｅ　Ｎｏｒｔｈｅｒｈ　Ｒｅｇｉｏ
ｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ　ｏｆ　ｔｈｅ
　Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ
　ｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ｉｎ　Ｐｅｏｒｉａ　
、　ｌ１ｉｎｏｉｓに奇計され、受孔番号ＮＲＲＬ　Ｂ
−１５９９９か付与されている。

実施例１ 本実施例で対象とするプラスミドの調製工程會、第５図
にまとめて示した。

ｐＢＳＡＧ５及びｐＢ８ＡＧ５Ｉの構築１、　　ｐＣＦ
Ｌ２の構築 その６′末端におりるＡＴＧのＴｏを欠いたＡＯＸ１プ
ロモーターを含むベクターｐＡＯＰ２　ｋ　ＨｉｎｃＩ
Ｉで切断した。プロモーターを含むＤＮＡ　ｌ！ｆＴ片
を単離しあらかじめＨｉｎｄＩＩＩで切断しクレノー断
片で平滑末端としたｐＢＲ３２２に連結した。この反応
によシベクター１）ＣＦＬ２が創製された。

２、　　ｐＢｓＡＯＰ２の構築 ｐＢＲ３２２のＰｖｕ　Ｉ　Ｉ部位をＢａｔＩ　Ｉ部位
で直換したｐＢＲ３２２−ＢｇｔＩＩ　ｆ、ＥｃｏＲＩ
及びＣｔａＩで消化した。

得られる線状シラスミＰを、ｐＣＦＬ２から得られるＡ
ＯＸ１會宮むＣｔａＩ／ＥｃｏＲＩ断片と連結反応によ
多結合させた。得られるベクターを１）ＢＳＡＯＰ２と
命名した。

３、　　ｐＢＳＡＧ２２の構築 ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位に挿入されたＨＢｓＡｇ
遺伝子を含むプラスミドｐＨＢｓ−５（Ｖａｌｅｎｚｕ
ｒｌａら。

Ｎａｔｕｒｅ　２９８　、３４７−３５０　（１９８２
）　）ｆ、（、ｔａＩで消化した。ｈｌａｔ３１エンド
ヌクレアーゼによシ、得られる線状プラスミドの両側の
約６０　ｂＰを除いた。得られたＤＮＡ断片をＢａｍ　
ＨＩで消化し、クレノー断片で平滑末端とした。ＩＪ　
ｆ−ション後、約２００の形質転換体ｆＮｃｏｌで切断
した。得られる線状プラスミドを単離し褥連結した。Ｅ
、　ｃｏ’ｌｉを形質転換後、全プラスミドの約１０％
（ｐＢｓＡ（）１と命名）は、新たに作られたＮｃｏＩ
部位を有していた。ｐＢＳＡＧｌ　ｆ　ＮｃｏＩで消化
し、クレノー断片で平滑末端にした後、ｉｉａｍＨＩで
消化した。このプラスミド断片を、あらかじめＥｃ　ｏ
　ＲＸで消化し、クレノー断片で平滑末端にしＢａｍＨ
Ｉで消化したｐＢｓＡＯＰ２と連結せしめた。得られる
ベクターをｐＢｓＡ（）２２と命名した。

４、　　ｐＢｓＡ（）４　、　ｐＢＳＡＧ５　、　ｐＢ
ＳＡＧ５１の構築３　’−ＡＯＸ１転写終結断片を待つ
プラスミドｐＡＯＴ−１（ｐＰＧ３．２　（受託番号Ｎ
ＲＲＬ　Ｂ−１５９９９が付与された宿主Ｅ、　Ｃ０１
ｉから入手できる）の１．６ｋｂＰの５ａｔＩ−Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ断片ｆ、　５ａｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ切断ｐＢ
Ｒ３２２Δｌ１ｅｃｏＲＩ　（すなわち、ＥｃｏＲＩ部
位が破壊されたｐＢＲ３２２：第７図参照）に連結する
ことにより誘導されるｐＢＲ３２２に基いたプラスミド
）　ｆ　ＸｂａＩ及びＰｓｔＩで切断した。ターミネー
タ−を含む断片を、あらかじめＸｂａＩ及びＰｓｔＩで
切断したＰＢＳＡＧ２２に連結し、ｐＸＰ−１を得た。

ｐＢＳＡＧ２２　’ｅ：　ＤｒａＩで消化し、次いで５
ｔｕＩ　’）ンカー全付加して、最後に５ｔｕＩ及びＥ
ｃｏＲＩで消化した。ＨＢｓＡｇ　ｈ　ｍ遺伝子を単離
し、あらかじめ５ｔｕＩ及びＥｃｏＦｔＩで切断したｐ
ｘｐ−１に連結せしめてｐＢＳＡＧ４　ｔ″得た。ｐ　
８ＳＡＧ４からのＣｔａ工断片を含むＨＢｓ　Ａｇを、
ｐＹＪ３３　（第８図参照）の非反後Ｃ２ａＩ部位に連
結して、ｐＢＳＡＧＡ及びｐＢｓＡ０５Ｉ　’に得た。

プラスミドｐＢＳＡＧ５工の制限酵素地図は、第１１図
で示される。プラスミドｐＢ８ＡＧ５及びｐＢＳＡＧ５
Ｉは、５’−ＡＯＸｌ　／ＨＢｓＡｇ／　３’−ＡＯＸ
１発埃カセットを含むＣ１ａＩフラグメントの配位のみ
が異なる。ｐＢＳＡＧ５では、５　’−ＡＯＸ１フラグ
メントがＰｉｃｈｉａ　ＨＩＳ４１１伝子に隣接してお
シ、一方３’−ＡＯＸ１フ？グメントは、自律重複１ｉ
！喪累ＰＡＲＳ２に隣接している。プラスミドｐＢＳＡ
Ｇ５が導入された宿主Ｅ、Ｃ０１ｉは、ｔｈｅ　Ｎｏｒ
−ｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　
Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅ
ｓ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕ
ｒｅに寄託されている。Ｅ、ｃｏｌｉ　ＭＣ１０（５１
−ｐＢＳＡＧ５株は、受託番号ＮＲＲＬ　Ｂ−１８０２
８が付与されている。

実施例バ Ｐｉｃｈｉａ染色体において、−級アルコールオキシダ
ーゼ遺伝子（ＡＯＸＩ　）かＨＢｓＡｇ遺伝子で置換さ
れた宿主Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓのｖ＠製にラ
イて、本実施例で記述する。

宿主Ｐ、ｐａｓｔｏｒｉｓ　ＨＢｓＡｇ発現Ａｏｘ　１
−変異株を調製するため、プラスミドｐＢＳＡＧＩ　５
Ｉを第９−１１図で示した方法によシ構築した。第１の
工程では、ＡＯＸＩ　ｆロモーター−ＬａｃＺ遺伝子発
現ベクターｐｓＡＯＨ５及び下記する方法によシ調製さ
れ第１３図にしたＡＯＸ１プロモーター−ＨＢｓＡｇ発
現ベクター　ｐＴＨＢ８３　’ｋ、ＨｉｎｄＩＩＩで消
化した。ｐＴＨＢｓ３を調製するため、プラスミドｐＡ
ＯＴ−１（第７図参照）ｉ８ｔｕＩで切断し、ｇｃｏＰ
−Ｉリンカ−に連結し、次いでＰＳｔＩで消化した。３
’−ＡＯ刈断片を宮むＥｃｏＲＩ−ＲｓｔＩ断片を単離
した。５’−ＡＯＸＩ配列を富むベクターｐＡＯＰ３’
ｔ、ＥｃｏＲＩ及び８ｓｔＩで切断し、得られる５’−
ＡＯＸＩ断片を、あらかじめＥｃｏＲＩ及び８ｓｔＩで
切断したＥ、　ｃｏｌｉ−８，ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシ
ャトルベクターｐ８ＥＹＩＤ１　（Ｄｏｕｇｌａｓら、
（１９８４）Ｐｒｏｃ、　ｈａｔｌ　Ａｃａｄ、　８ｃ
ｉ、　ＵＳＡ　、　８１　、３９８３−３９８７）に連
結した。ｐＡＯＰ３及びｐ８ＥＹ１０１断片の連結によ
シ、プラスミドｐＴＡＯ２０が得られた。

！ラスミドｐＴＡＯ２０は、Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
　、バクテリアでの選択のため、それぞれＵＲＡ３　、
アンピシリン遺伝子を持ってお夛、また８、ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅでの被設Ωための２μサークル（ｃｉｒｃｌ
ｅ　）、及び５ｌ−ＡＸＯ１配列を有している。

プラスミドｐＴＡ０２０　ｋ、ＰｓｔＩで部分切断した
。

得られる軸状化ベクターを単離し、ＥｃｏＲＩで切断し
た。最も大きな断片（２μｃｉｒｃｌｅ配列、ＵＲＡ遺
伝子及び５　’−ＡＯＸＩ断片を含む）を、ｐＡＯＴ−
１から得られる３　’−ＡＯｘ１断片に連結した。

ｐＨＢ５−５のＨＢｓＡｇ　ｋ含むＥｃｏＲＩ断片を、
ｇｃｏＲＩで消化して単離し、あらかじめＫｃｏＲＩで
消化しバクテリアアルカリフォスファターゼで処理した
１）ＴＨＢＳ　１に連結した。得られるベクターを１）
ＴＨＢＳ２と命名し、これは、３’−ＡＯＸ１配列と５
’−ＡＯＸ１配列の間に挿入されたＨＢｓＡｇ遺伝子を
有していた。

プラスミドｐＹＪ３０　（宿主Ｅ、ｃｏｌｉ　ＮＲＲＬ
　Ｂ−１５８９０から入手し得る）をＥｃｏＲＩで切断
し、クレノー断片で平滑末端にし次いでＰＳｔＩで切断
した。Ｐ。

ｐａｓｔｏｒｉｓのＨ工Ｓ　４／ＰＡＲＳ１を含む断片
を単離し、ベクターｐＴＨＢｓ２　（両側がＡＯＸＩ配
列に接しｆｔ−ＨＢｓＡｇ遺伝子を含む）からのＰｓｔ
Ｉ−８ｓｔＩ断片と連結せしめた。これにより、ベクタ
ーｐＴＨＢｓ３を得た。

ｐＴＨＢ８３　ｆ　ＨｉｎｄｌＩＩで消化して得られる
１、４ｋｂＰ断片（ＨＢｓＡｇ遺伝子、　ＡＯＸｌ　タ
ーミネーション配列及びＡＯＸ１プロモーター配列の部
分を含む）を回収し、ｐ８ＡＯＨ５から得られる７、７
　ｋｂＰ断片（Ｐｉｃｈｉａ　ＨＩＳ４遺伝子、　ＡＯ
Ｘｌｒ　Ｅｅ１モーター配列の大部分及びｐＢＲ３２２
からの配列を含む〕に挿入した。修復されたＡＯＸＩプ
ロモーター配列を宮む９、Ｉ　ｋｂＰ組換えプラスミド
ｐＹＭ３９　ｋ　、次いで単離した。

第２の工程として、プラスミドｐＰＧ３．２　（ＮＲＲ
ＬＢ−１５９９９の宿主Ｅ、　ｃｏｌｉから入手し・得
る）　ｆ　ＰｖｕＩＩで消化し、ＡＯｘ１遺伝子の６′
末端部（３’ＡＯＸ１遺伝子）の配列を含む１．５１ｃ
ｂＰ断片を、ｐＹＭ３９の単一のＮｒｕＩ部位へ挿入し
た。ＰｖｕＩＩＩＥｔｒ片が、ＡＯＸ１遺伝子の３’！
端部に最も近い配列が、ベクターのＨＩＳ４遺伝子の部
分に向けて配位するように、起振された、１０．６ｋｂ
Ｐの組換えプラスミドｐＹＭエ６を単離した。プラスミ
ドル…工６は、宿主ＰｉｅｈｉａからＡＯ刈辿伝子を除
くのに必要なすべての接木、及びＡＯＸｌ　７°ロモー
ター支配下でのＨＢｓＡｇの発現に必要なすべての要素
を含んでいるが、ｐＢＳＡＧ５の整理されたＨＢｓＡｇ
遺伝子断片を含んでい々い。

そこで、最後の構築工程として、目的とするＨＢｓＡｇ
遺伝子’ｉ　ＡＯＸ１遺伝子欠損ベクターに貴結合する
ことを行なった。このために、ｐＹＭＩ６とｐＢＳＡＧ
５Ｉ　（ＨＢｓＡｇ　’ｔｔｍカセットを含むＣｔａＩ
断片が逆方向である以外はｐＢｓＡ（）５と同じプラス
ミド）をＰｓｔＩ及び８ｐｈＩで消化した。整理された
（　ｔ、ｒｉｍｍｅｄ　）　ＨＢｓＡｇ遺伝子発税カセ
シト及びＰｉｃｈｉａ　ＨＩＳ４遺伝子を含むｐＢＳＡ
Ｇ５Ｉからの６．６ｋｂＰの断片を、ＡＯＸ１配列の６
１末端部及びｐＢＲ６２２０犬部分を含むｐＹＭＩ　６
からの４．６　ｋｂＰ断片へ押入しＸ　　’Ｉ　Ｏ−９
ｋｂＰのプラスミドｐＢＳＡＧＩ５工ｉ得た。１）ＢＳ
ＡＧＩ５Ｉ　＊　４人し７ＣＥ−ｃｏｌｉ　ｋ　ｔｈｅ
　Ｎ０ｒ−ｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｉｎ　Ｐｅｏｒｉａ　。

■１ｌｉｎｏｉｓ　Ｋ　を此し、受比査号ＮＲＲＬ　Ｂ
−１８０２１か付与された。

Ｐ、ｐａｓｔｏｒｉｓ　ｈｉｓ４変異株Ｇ３１１５　（
ＮＲＲＬ　Ｙ　−１５８５１）を形質転換させるため、
ｐＢＳＡＧＩ５Ｉを、最初ＢａｔＩ　Ｉで消化し、１つ
の終結点においてＡＯＸ１遺伝子の５′末端部分（５’
ＡＯＸ１遺伝子〕からの０．８５　ｋｂＰ　Ｉ：Ｄ配列
及び他の終結点においてＡＯＸＩ遺伝子の６′末端部分
からの１．１ｋｂＰの配列を宮む７．２ｋｂＰの線状ベ
クターが得られた（第１２図９゜ＢａｔＩＩ切断ｐＢ８
ＡＧＩ　５Ｉ約２μ、＆　ｋ　Ｇ５１１５へ尋人し、ヒ
スチジン原栄養株によシ選択した。約５　Ｘ　１０３個
のＨｉｓ＋コロニーが得うれた。

ｐＢＳＡＧＩ　５Ｉが、ＡＯＸＩ染色体遺伝子座に線状
分子として挿入され、ＡＯＸ１遺伝子が除かれて形質転
換か起った。それ故、目的とする線状に挿入されｆｃＨ
ｉｓ“形質転換体は、メタノールに基づくゆつくシとし
た生育によって同定することかできる（　Ｐ、ｐａ８ｔ
ＯｒｉＳは、諏２級のよりｉいアルコールオキシダーゼ
遺伝子ＡＯＸ２　ｅ持っておシ、これによって、第１級
アルコールオキシダーゼ遺伝子を欠失した株が、ゆつく
シとメタノールに暴いて生育するのに十分なアルコール
オキシダーゼが産生される）。

メタノールでよく生育できないＨｉｓ＋形質転換体を同
定する方法は、選択号大中に固定されたＨｉ　ｓ　”　
ｌ＃ｊＪ　Ｊｔ２ｉ１　ｋ　、先ず回収することである
。回収工程は、寒天を滅菌水２０凝を含む５０紅チユー
ブ・に移し、Ｂｒｉｎｋｍａｎホモジナイで−を用いて
６０秒間低速度で粉砕することによって行なう。得られ
る混合ｖｌをガーゼに通すことによって濾過し、跨天全
滅劇水３Ｑｍｉで洗うことによって、寒天破片を細胞か
ら分離する。酵母細胞を次いで光学濃１Ａ６ｏｏが肌１
になるまで希釈し、４にセットしたプランソンソニファ
イヤーを用いて１０秒間超音阪処理して＃Ｉ胞のかｆｃ
まり全壊し、滅菌水で１００倍に希釈した。得られる希
釈液の１０μを及び１００μｔ１（取り、アミノ酸を官
有しない０．６７％酵母窒素源及び０．１％グルコース
を含む球入プレート上に広けた。３０℃で６日間インキ
ュベーション後、プレート上に決われたコロニーについ
て、アミノ酸會言有しない０．６７％酵母窒素源及び次
の炭素源、すなわち１）炭素源なし２）０．５％メタノ
ール３）２％グルコースをそれぞれ含む寒天プレート上
にレプリカプレートすることによって、メタノールでの
生育有「力について分析した。２係グルコースで生育し
たコロニーのうち、６２％はメタノールではよく生育で
きなかった。

ｐＢＳＡＧＩ　５Ｉ配列が、第１２図に示したように挿
入されていることを確認するために、メタノールを有効
に利用できないＰ、ｐａＳｔＯｒｉ８株の１つから全Ｄ
ＮＡｔｌ−抽出し、制限酵素で消化し、次いですずンプ
ロット法によｆ）、３２ｐ−ラベル化プローブとハイ・
プリダイズさせた。すずンプロット法により、ＡｏＸｌ
−株Ｇ３１１５　（ｐＢＳＡＧＩ５Ｉ　）及びＡｏＸ１
＋株Ｇ５１１５から１７）　ＤＮＡ　？、ＡＯＸＩ遺伝
子及びＮＲＲＬ　Ｂ−１ｂ８６Ｂとしてｔｈｅ　Ｎｏｒ
ｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃ
ｅｎｔｅｒ　１ｎＰｅｏｒｉａ　、　１ｌｌｉｏｎｉｓ
に寄肚された宿主Ｅ、ｃＯ１ｉから人手し得るｐＢＲ３
２２からの配列より概成されるラベル化ｐＰＧ４　、　
［］プラスミドとハイブリダイズさせた。ＡＯＸｌ　Ｋ
＝コードする２、３　ｋｂＰ断片が、ｏｓ１１５ＤＮＡ
　’ｉ含むレーン（１ａｎｅ　）に見られた。しかしな
がら、Ｇ５１１５　（ｐＢＳＡＧＩ５Ｉ　）　ＤＮＡを
含むレーンには２．３　ｋｂＰ断片は見られずまた新し
い断片もなかった。この結果から、Ｇ５１１５　（ｐＢ
ｓＡ（）Ｉ５Ｉ　）株からはＡＯＸ、１遺伝子が除去さ
れていることが証明される。

実施例■ ＨＢ６Ａｇコードベクターで形質転換されたＰｉｃｈｉ
ａ酔母の生育 １、　ファーメンタ−でのＧ５１１５　（ｐＢｓＡ（）
５　）の生育 １０％接釉９Ｊを、振とりフラスコの酵母窒素源（ＹＮ
Ｂ　）及び２％グルコース中で６０℃にて一晩生育せし
ぬた。次いで接種物を、ファーメンタ−中の滅菌基礎塩
（ｐＨ４に調整されたンに加えた。

グルコース栄養分を希釈速度０．０５−０．１　ｈ−’
で加えた。細胞ａｉが定常状態になり、ファーメンタ−
中のグルコースＩｌ［が１００　ｐｐｍより小さくなっ
た時に、炭素栄養源をメタノールあるいは５０％グルコ
ース−５０％メタノール混合物に換えることによって、
ＨＢｓＡｇの産生が妨導された。

２、　ファーメンタ−でのＧ５１１５　（ｐＢＳＡＧＩ
！：ＩＩ　）（ＡＯＸｌ−）の生育 溶解性ＨＢＳＡｇオースリア（Ａｕ５ｒｉａ　）　ｆ＆
性（３−４％の俗解性蛋白）の最適発机は、ＡＯＸＩ−
株全１グリセロール次いでメタノール含有栄養分で、バ
ッチ式で生育せしめることによって達成される。

接Ｔｈ、　Ｔｈ　？ｒ、ＹＮＢ及びグリセロールで生育
せしめる。

基礎塩とグリセロール（１％及び４％グリセロールを用
いた）及びビオチンを７アーメンター中で圧熱滅菌する
。冷却後、ＰＨを６．５と６の間に調整し、わずかの塩
（２，５紅／１．）を、接種前に加える。グリセロール
全便い尽す前あるいは後に、１００％メタノールを用い
てスタートすることができる。メタノールｆ＃度が２％
では、ＨＢｓＡｇの蓄積Ｆｉ阻害され丁、２００時間続
く。しかしながら、ファーメンタ−中のメタノール製置
が５％では、ＨＢＳＡｇ粒子の蓄積はストップする。

栄養分の塩ｒＩｋ度を高めることによって、よシ高濃度
に細胞を生育せしめることができる。メタノールで生育
せしめる場合には、亜鉛濃度を筒めることが、細胞濃度
を高める上で特にに要である。

生育が亜鉛で制限されない場合に、よシ高いオースリア
活性が得られる。しかしながら他の蛋白も高くなるので
、俗解性蛋白中でのオースリア活性は全体として低くな
る。

３、ｏｓ１１５　（ｐＢＳＡ（）５　）及び（）８１１
５　（ｐＢＳＡＧＩ５Ｉ）の細胞培養物の振とりフラス
コ中での生育形質転換コロニーを分取し、ＳＤプレート
上に塗シ付けた。次いで、２５０ＷＬＬ振とりフラスコ
中の５％グルコースを含有するＹＮＢブロース（１×Ｙ
ＮＢ及び５μ９７　ｍのビオチン）５０ｖ中に接種し、
３０℃で１分間２５０回転で、−晩振とうした。翌朝の
０Ｄ６００は、２と３の間であった。１０００Ｄ６００
　Ｍ７Ｌ位の細胞（約１０−細胞）を取り、ＩＥＣ遠心
分離機で、室温で２０００　Ｘｇで７分間遠心した。細
胞ペレットを２を振と９フラスコ中の２％グリセロール
を含有するＹＮＶブロース５００廐に懸濁した（　０Ｄ
６００　”＝　０．２　）。培養物ヲ、０Ｄ６００か２
乃至６になるまで、エアーシエイカーによシロ０°Ｃで
２５　Ｏｒｐｍでインキュベートした。

Ａｏｘｌ−宿主の場合には、培養物から５０００Ｄａｏ
。

を取シ、工ＥＣで２０００　Ｘｇで７分間遠心した。

細胞ペレットを０．５％メタノール全含冶スるＹＮＢブ
ロース５００縮に懸濁した（１０ロ０Ｄ６００　）。

ＡＯＸｌ−宿主の場合には、１７００Ｄ６００　ｋ　取
’）、同様の条件で遠心し、０．５％メタノールを含有
するＹＮＢブロース５００紅に懸濁した（　０−３０Ｄ
ａｏｏ　）。

両者の培養物を、２を振とりフラスコ中で、３０℃２５
　Ｏｒｐｍで振とうした。ＯＤｌ’ｌＯＯが２以上にな
った時にはいつでも、培養物を、同じ生育培地で２倍に
希釈した。１０００Ｄｓｏｎのサンプルを定期的に取シ
、２０００Ｘｇで７分間遠心した。得られる細胞を一７
０’Ｃで１−２週間保存した。

実施例■ 以下のすべての実験は０．４℃で実施した。凍結した細
胞ペレットを齢解し、氷冷した５Ｊ俗化緩倫液２駄で２
回洗浄した。細胞（１０００Ｄ６００単位）をデイスポ
ーサブルガラスチューブ（１３Ｘ１００酩）に移した。

可溶化緩衝液０．６５廐及び酸で洗浄したガラスピーズ
０．５　ｇ（直径０−４５１１１）を細胞ペレットに加
えた。この懸濁液を１分間に最大４（ロ）転でポルチッ
クシスミキサーにて振とうし、それぞれの回転ごとに１
分間の間隔をおいた。全細胞スラリーを取り、ガラスピ
ーズを可溶化緩衝液Ｄ−３５ｍｂで洗浄した。洗浄液と
細胞スラリーとを一緒にし、エツペンドルフ（Ｅｐｐｅ
ｎｄｏｒｆ　）チューブに移した。抽出物音エツベンド
ルフ遠心分離機で１５分間遠心した。上溝（浴解部；０
．７廐）をペレットから取った。ペレットからＨＢｓ　
Ａｇ蛋白するために、２×襄縮ＳＤＳ　−ｆｆポルーデ
イング緩衝液０．７肚全ペレツトに加え、混合物をポル
テックスミキサーで攪拌し、１５分間ボイルした。混合
物を１５分間遠心し、次いで上溝（不浴部）を取った。

溶解部及び不浴部の一部について、ＴＣＡ沈澱法及びロ
ーリ−法を用いて蛋白ｔＡｔを分析した。溶解部及び不
浴部は、３−１５Ｉｎ９／紅の蛋白＃度を有していた。

ここでは、モノマーのａ８ｉ蛋白ＨＢｓＡｇ、あるいは
’ｌ　２ｎｍ粒子の蛋白複合体を、ＨＢＳＡｇ蛋白をコ
ードする配列を含むベクターで形質転換されたＰｉｃｈ
ｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓの培養物から抽出する方法を記
載する。

Ｐ’、ｐａｓ％ｏｒｉｓの培養ｖｌＪ全、１　ｍＬ当ｂ
ｉＤ−１ｏ。

０Ｄ６００単位の細胞濃度１で生育せしめた。１０００
ＤＩ’ｌＯＯ単位の一部ｔ　１３　Ｘ　１００　ｎｍの
ボロシリケート培養チューブに移し、２０容振の可溶化
緩衝液で２回洗浄した。

細胞はペレット化し、次いでこのペレット化細胞（ＩＥ
Ｃ遠心分離機〕に、酸で洗浄したガラスピーズ（０−５
ｍｘ　）　０．５　＆次いで可溶化緩衝液０．６５凝を
加えた。可溶化緩衝液は、コントロールとして０．５　
Ｍ　ＮａＣｔ及び０．１％トリトンｘ−ｉｏｎ（ｗｔ／
ｖｏ’１．　　）　　、　６るいは０．１％トリ　トン
ｘ−１０口の存在下もしくは非存在下に６Ｍヨウ化カリ
ウムまたはカリウムイソシアネートを含んでいた。全て
の浴液ｆ　、１　［］　ｍＭ！Ｊン酸ナトリウムでＰ）
１７．５に緩衝化した。混合物をポルテックスミキサー
を用いて４分間、１分間ごとに最大スピードで激しく攪
拌した。各間隔の間に、混合物を１分間以上氷で冷却し
た。細胞が完了した後、細胞溶液を取シ、ガラスピーズ
全可溶化緩衝ｇ　ｏ−ｓ　ｓ　ｍｚで洗浄し、２つのｔ
ｅｒ液全−緒にして、１３０００Ｘｇで１５分間遠心し
た。上溝を取り、免疫活性ＨＢｓＡｇ粒子（オースリア
分析）及びトリクロロ酢酸沈澱蛋白（ローリ−）の分析
全行なった。５回の実歇の結果を表１に示した。

ＮａＣ１ｆ用いた条件に比べて、ＫＩあるいはＫＳＣＮ
を用いたいずれの条件も、ＨＢｓＡｇ粒子の値が少さい
（Ａ欄）。またＫＩあるいはＫＳＣＮによって、全蛋白
の浴出が抑制され、それによって、ＨＢＳＡｇ粒子の比
活性が２−５位に増加する（Ｃ欄）ことが明らかである
。

３．２２ｎｍ粒子の分析（ＡＵ８ＲＩＡＴＭＩＩキット
）浴解部をオースリア（Ａｕ５ｒｉａ　）希釈緩衝液で
１ｏ　ｏ　ｏ　−１ｏ、ｏ　ｏ　［）倍に希釈し、２５
−１００μｔについて、以下のようにして分析した。

１、　標準白＊’を作製するため、コントロールｔ０．
１　ｎｇ乃至Ｊ　ｎｇを含む全１２００μノのそれぞれ
の希釈［ｋ反応皿の個々のウェル中に入れた（４個の陽
性コントロールとともに〕。

分析すべきサンプルについては、希釈した溶解部ケ反応
皿の各々のウェルに入れた。

２．１個のビーズを、希釈溶解部あるいはコントロール
を富むウェルに注意深く加えた。他の方法として、ビー
ズを、コントロールあるいは希釈溶解部を加える前に加
えてもよい。

３、　カバーシールを反応皿にかけ、そっとたたいて、
気泡を除いた。

４、反応ｉｔ次いで４５℃で２時間インキユペートシた
。

５、　カバーシート１除き、捨てた。液体を吸い出し、
それぞれのビーズを蒸留水あるいは非イオン水４−６μ
で２回洗浄した。

６、　１＆５１−抗）Ｈ３ｓ抗体２００μｔをビーズを
含むそれぞれのウェルに入れた。

７、　　ｗＴたにカバーシールをかけ、そっとたたいて
、気泡を除いた。

８、反応皿を、次いで４５℃で１時間インキュベートし
た。

９　カバーシール奮ｓシ除き捨てた。液体を吸い出し、
それぞれのビーズを上記５と同様にして洗浄した。

１０、ビーズを次いですぐに、：ｉｊｉＭな同定用カウ
ントチューブに移した。

ガンマ−シンチレーションカウンターＫ　！　ル６１１
１！ １１、カウント速度全１分間測定した。

１２、サンプルについて、最後に洗浄してから２４時間
以内にカウントした。

２２ｎｍ粒子の良友を、上記１で作製した標準曲線を用
いて計算した。

４、モノマー分析（ウェスタン分析） 蛋白１解部おるいは不浴部）２５μｙと等容量（通常２
−５μｔ）を、Ｈ，Ｏにとシ１０μｔとした。２×濃縮
デルローデイング緩衝液（１００ｍＭ　ＤＴＴ／ＩＸ　
ｖｉ衝液中）１０μｔ’ｉ１（加え、サンプルを１５分
間ボイルした。ボイルしたサンプルを１２％８Ｄ８アク
リルアミドグル（Ｌａｅｍｍｌｉ　）上に論、いた。を
気泳動後、蛋白をニトロセルロース紙上に移した（　Ｔ
ｏｗｂｉｎ　Ｃ）　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７６　、４３５０−４３５４　（１
９７９））。

ＨＢｓＡｇ會、ＨＢｓＡｇ抗血清（血漿から訪専された
ＨＢｓＡｇに対する）及び１２５ニーラベル化蛋白Ａを
用いて検出Ｌ７’ｒ、ニトロセルロース紙をコダックＸ
ＡＲ−フィルムに一晩、−７０℃でさらした。ニトロセ
ルロース紙上の放射活性バンドを、ガンマカウンターで
カウントすることによって、モノマーの定ｔを行なった
。Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによって産生された組換え
ＨＢｓＡｇ（１００−５００ｎｇ　／レーン）をスタン
ダードとして用いた。

実施例司 Ｐｉｃｈｉａ　ｐ＆５ｔｏｒｉ８でのＨＢｓＡｇの発埃
レベルいくつかの形質転換Ｐ、ｐａｓｔｏｒｉｓ株によ
るＨＢｓＡｇの良生全１実施例ｖ１で述べた分析法によ
シ、実施例ｖ１の１の部分で述べた可俗化プロトコール
を用いて分析した。得られた結果は表■に１とめて示し
た。

上記した結果によシ、筒レベルのＨＢｓＡｇが、Ｐｉｃ
ｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓからの一部アルコールオキシ
ダーゼ遺伝子（ＡＯＸｌ　）の調節領域のコントロール
の基で、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて肱生
されることが鉦明される。

【図面の簡単な説明】

２１４１１Ｊｌ’ｆ、、Ｐｉｃｈｉａジヒドロキシアセ
トンシンターゼ遺伝子（ＤＡＳ　）の調節遺伝子領域の
制限酵素地図を示す。 第２図は、Ｐｉｃｈｉａ−級アルコールオキシダーゼ遺
伝子（ＡＯＸＩ　）の調節遺伝子領域の制限酵素地図を
示す。 第６図は、Ｐｉｃｈｉａ　ｐ４０遺伝子の調節遺伝子領
域の制限＃素地図を示す。　　　。 第４図は、プラスミドｐＡＯＰ２の制限酵素地図を示す
。 第５図は、プラスミドｐＢ８ＡＧ５汲ひｐＢ８Ａ（）５
Ｉの桐築法會示す。 第６図は、プラスミドｐＨＢｓ　−５の制限酵素地図を
示す。 第７図は、プラスミドｐＡＯＴ−１の制限酵素地図を示
す。 第８図は、プラスミドｐＹＪ３３の制限酵素地図を示す
。 第９図は、プラスミドｐｓＡＯＨ５及びｐＴＨＢｓ３か
らプラスミドｐＹＭ３９の構築法を示す。 第１０図は、プラスミドｐＹＭ３９及びｐｐｏ３．２か
らプラスミドｐＹＭＩ６の構築法を示す。 第１１図は、プラスミドｐＹＭ１６人ひｐＢ８ＡＧ５Ｉ
から！ラスミドｐＢ８ＡＧＩ　５Ｉの構築法を示す。 第１２図は、プラスミドｐＢ８ＡＧＩ５Ｉの一部の、Ｐ
ｉｃｈｉａ染色体の一部アルコールオキシダーゼ（ＡＯ
Ｘｌ　）遺伝子への挿入を示したものである。 第１３図は、プラスミドｐＴＨＢｓ３の構築法を示す。 図面に用いた略号は、以下に示す意味を表わす。 Ａｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　Ａｓｕ工ＩＢ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　ＢａｍＨＩＢ２　　　　　　　　　
　　　　ＢｇＩＩＩＢｃ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｉ
＋、　　Ｌ　ＩＣＣ］ａＩ Ｈ２ＨｉｎｃＩＩ Ｈ３）ＩｉｎｄＩＩ工 Ｋ　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｋｐｎ　Ｉ　ｌ
Ｎｄ４　　　　　　　　　　　　　　　　　ＮｄｅＩＮ
ｒ　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＮｒｕＩＰｓ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＰｓｔＩＰｖ　
Ｉ　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｐｖｕ　ＩＰｖ
２　　　　　　　　　　　　　　　　　ＰｖｕＩ工ＲＩ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＥｃｏＲＩＲ５
ＥｃｏＲＶ Ｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｓａ１■ｐＳ
ｐｈｌ Ｓｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　　５ｓｔＩＳ
　ｔ　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｓ　ｔｕ　
ＩＸｂ　　　　　　　　　　　　　　　　ＸｂａＩｘｈ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＸｈｏＩ図面に
おいて、ＤＮＡ断片の組換えに用いた制限＃素部位であ
って、連結反応の際に破壊された部位は、破壊された部
位の略号上かっこでくくることによって示した。

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. （１）調節遺伝子領域及びポリペプチドコード遺伝子領
   域を含むＤＮＡ断片であつて、 （ａ）該調節遺伝子領域は、ポリペプチドコード遺伝子
   領域の５′末端に位置した時にメッセンジャーＲＮＡの
   転写を支配することができ、以下の（ｉ）−（ｉｉｉ）
   の少なくとも１つの条件に応答性を有する調節遺伝子領
   域であり、 （ｉ）培養基にメタノールが存在し、当該ＤＮＡ断片を
   保持する宿主生物が該メタノールと接触する条件、 （ｉｉ）培養基にメタノール以外の非異化代謝産物抑制
   炭素源が存在し、当該ＤＮＡ断片を保持する宿主生物が
   該炭素源と接触する条件、 （ｉｉｉ）培養基に炭素源の欠除の状態が生じ、当該Ｄ
   ＮＡ断片を保持する宿主生物が、異化代謝産物抑制炭素
   源及びエネルギー源を基に生育後、炭素源の欠除の状態
   と接触する条件； （ｂ）ポリペプチドコード遺伝子領域が、Ｂ型肝炎ウィ
   ルスの表面抗原またはその部分をコードするポリペチド
   コード遺伝子領域である、ことを特徴とするＤＮＡ断片
   。
2. （２）調節遺伝子領域が、第２図の制限酵素地図で示さ
   れるものである特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ断片
   。
3. （３）ポリペプチドコード遺伝子領域の下流ＤＮＡの３
   ′末端配列が、該ポリペプチドコード遺伝子領域によつ
   てコードされるメッセンジャーＲＮＡのポリアデニル化
   及び転写終結を支配できるものである特許請求の範囲第
   １項又は第２項記載のＤＮＡ断片。
4. （４）ＤＮＡ断片が、更に、バクテリアプラスミドＤＮ
   Ａ、バクテリオフアージＤＮＡ、酵母プラスミドＤＮＡ
   、酵母染色体ＤＮＡ、あるいはそれらの２つ又はそれ以
   上から誘導される１つ又はそれ以上のＤＮＡ配列を含む
   特許請求の範囲第１項から第３項のいずれか１項記載の
   ＤＮＡ断片。
5. （５）酵母染色体ＤＮＡが、自律的複製ＤＮＡ配列及び
   マーカー遺伝子である特許請求の範囲第４項記載のＤＮ
   Ａ断片。
6. （６）自律的複製ＤＮＡ配列が、ＰＡＲＳ１又はＰＡＲ
   Ｓ２である特許請求の範囲第５項記載のＤＮＡ断片。
7. （７）ＤＮＡ断片が、更に、 １つの（第１の）挿入ＤＮＡ断片、 選択マーカー遺伝子、 及び他の１つの（第２の）挿入ＤＮＡ断片、が連続して
   配列されたＤＮＡを含み；該第１及び第２の挿入ＤＮＡ
   断片はそれぞれ少なくともその長さが約２００ヌクレオ
   チドであつて、Ｐｉｃｈｉａ属のゲノムＤＮＡの部分と
   相同のヌクレオチド配列を有し；当該ＤＮＡ断片と選択
   マーカー遺伝子は、第１の挿入ＤＮＡ断片の３′末端と
   第２の挿入ＤＮＡ断片の５′末端の間に位置し；そして
   第１と第２の挿入ＤＮＡ断片は、お互いにＰｉｃｈｉａ
   のゲノム中と同様に配位している特許請求の範囲第１項
   から第６項のいずれか１項記載のＤＮＡ断片。
8. （８）ポリペプチドコード遺伝子領域が、下記に示す約
   ７００ｂＰ断片あるいはそのサブユニット、またはそれ
   らの変異体あるいは機能的等価物である特許請求の範囲
   第１項から第７項のいずれか１項記載のＤＮＡ断片。 【遺伝子配列があります】
9. （９）特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ断片、バクテ
   リアプラスミドＤＮＡ、酵母選択マーカー及び酵母自律
   的複製配列からなることを特徴とするプラスミド。
10. （１０）プラスミドがｐＢＳＡＧ５である特許請求の範
    囲第９項記載のプラスミド。
11. （１１）プラスミドがｐＢＳＡＧ５Ｉである特許請求の
    範囲第９項記載のプラスミド。
12. （１２）プラスミドがｐＢＳＡＧＩ５Ｉである特許請求
    の範囲第９項記載のプラスミド。
13. （１３）プラスミドｐＢＳＡＧ５、ｐＢＳＡＧ５Ｉ、あ
    るいはｐＢＳＡＧＩ５Ｉで形質転換されたＰｉｃｈｉａ
    属株の培養物。
14. （１４）特許請求の範囲第７項又は第８項記載のＤＮＡ
    断片で形質転換されたＰｉｃｈｉａ属株の培養物。
15. （１５）本質的に純粋な形態である特許請求の範囲第１
    ３項又は第１４項記載の培養物。
16. （１６）（ａ）特許請求の範囲第７項又は第８項記載の
    ＤＮＡ断片、あるいは特許請求の範囲第９項から第１２
    項のいずれか１項記載のプラスミドで、形質転換された
    酵母株を、メタノール、非異化代謝産物抑制炭素源、あ
    るいはそれらの混合物、または少なくとも１つの異化代
    謝産物抑制炭素及びエネルギー源を含む栄養培地中で培
    養し、 （ｂ）栄養培地が異化代謝産物抑制炭素及びエネルギー
    源を含む場合には、（ａ）で得られるものを更に炭素源
    の欠除の状態にさらす、ことを特徴とするＢ型肝炎ウィ
    ルスの表面抗原の製造法。
17. （１７）Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原を単離し精製する
    特許請求の範囲第１６項記載の製造法。
18. （１８）第４図に示されるプラスミドｐＡＯＰ２であつ
    て、Ｐｉｃｈｉａ　ＡＯＸ１調節遺伝子領域の支配下に
    ある、外来蛋白産生用の発現ベクターの構築に有用なプ
    ラスミド。
19. （１９）以下の実施例Ｖ、VIまたはVIIに示すのと実質
    的に同様の、Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原の製造法。
20. （２０）特許請求の範囲第１６、１７又は１９項記載の
    方法により製造されたＢ型肝炎ウィルスの表面抗原。