KR100237953B1 - 돌연변이 aox2 프로모터, 이 프로모터를 함유한 미생물, 이 미생물의 제조방법 및 이 미생물을 사용한 이종단백질의 제조방법 - Google Patents

돌연변이 aox2 프로모터, 이 프로모터를 함유한 미생물, 이 미생물의 제조방법 및 이 미생물을 사용한 이종단백질의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 목적은 이종 단백질의 고수준 생성용 신규 프로모터 및 이 프로모터의 제조방법을 제공하는데 있다.
이에, 돌연변이 AOX2 프로모터를 천연 AOX2 프로모터로부터 염기 서열 결실, 염기 치환 또는 삽입으로 유도한다. 이러한 돌연변이 AOX2 프로모터의 조절하에 AOX2 유전자를 갖는 미생물 균주를 AOX1 유전자에 의해 암호화된 AOX를 생성할 수 없으나 천연 AOX2 프로모터의 조절하에 AOX2 유전자를 갖는 균주를 메탄올-함유 배지중에서 배양하여 수득할 수 있다. 프로모터로부터 하부에 삽입된 목적하는 이종 단백질 유전자를 갖는 돌연변이 균주를 배양하여 이종 단백질을 생산할 수 있다.
또한, 돌연변이 AOX2 프로모터를 갖는 플라스미드를 제공한다. 이러한 플라스미드의 삽입에 의해 수득된 형질전환체를 사용하여 이종 단백질을 생산할 수 있다.

Description

돌연변이 AOX2 프로모터, 이 프로모터를 함유한 미생물, 이 미생물의 제조방법 및 이 미생물을 사용한 이종단백질의 제조방법
제1도는 PC4130에 대한 작제 도식 및 GCP101을 수득하는 방법을 도시한 것이다.
제2도는 AOX2 유전자 부근의 제한 효소 지도를 도식화한 것이다.
제3도는 각각 제한 효소 지도를 사용하여 AOX2 프로모터가 클로닝된 플라스미드 pMM030 및 pMM034를 도식화한 것이다.
제4도는 각각 제한 효소 지도를 사용하여 AOX2 구조유전자가 클로닝된 플라스미드 pMM031 및 pMM035를 도식화한 것이다.
제5도는 AOX2 프로모터 서열에서 형질전환을 야기시키기 위한 통합 벡터인 pYI066 및 pYI068의 작제를 도시한 것이다.
제6도는 돌연변이 AOX2 프로모터를 갖는 각 균주를 수득하기 위한 방법을 나타낸 것이다.
제7도는 pPG001의 작제를 도시한 것이다.
제8도는 AOX2 프로모터의 조절하에 HSA을 발현시키는 플라스미드 pMM041 및 pMM042의 작제를 도시한 것이다.
제9도는 본원에 기술되는 실시예 7의 공정을 도시한 것이다.
본 발명은 돌연변이 AOX2 프로모터, 이 프로모터를 포함하는 미생물, 이 미생물을 제조하는 방법 및 이 미생물을 사용하여 이종 단백질(heterologous protein)을 생산하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 돌연변이 AOX2 프로모터를 포함하는 플라스미드, 상기 플라스미드를 포함하는 형질전환체 및 상기 형질전환체를 사용하여 이종 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
메탄올을 이용하는 효모는 탄소 및 에너지 공급원으로서 메탄올을 이용한다. 메탄올 이용 경로는 메탄올의 포름알데하이드로의 산화로 시작된다. 이러한 산화 단계는 효소 알콜 옥시다제(AOX, EC 1.1.3.13)에 의해 촉매된다. AOX는 글루코즈-함유 배지중에서는저 수준으로 발현되는반면, 메탄올-함유 배지중에서는 세포내 가용화 단백질의 30%를 차지한다.
메탄올을 이용하는 효모인, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)는 2개의 AOX 유전자(AOX1 유전자 및 AOX2 유전자)를 갖는다.
AOX1 프로모터와 AOX2 프로모터는 활성이 현저히 상이하다. 피키아 파스토리스에서 AOX 활성은 주로 AOX1 위치에서의 발현에 기인한다[참조：Molecular and Cellular Biology. 9. 1316(1989)]. 이종 유전자가 AOX1 위치에서 치환된 피키아 파스토리스 균주는 메탄올-함유 배지에서 느리게 성장하므로 긴 배양기간을 필요로 하게 되는데, 이는 메탄올 이용이 단지 AOX2 활성에 근거하여 이루어지기 때문이다.
AOX를 암호화하는 2개의 AOX 유전자중에서, AOX1 유전자의 조절 영역인 AOX1 프로모터는 고 활성을 가지며, 메탄올을 이용하는 효모에서 이종 단백질을 고 수율로 발현시키기위해 사용될 수 있다. 그러나, AOX2 프로모터는 활성이 약하므로, 이종 단백질을 발현시키는데에 적합하지 않다. 최근에, 상기 AOX 유전자의 조절 영역을 이용하여 이종 단백질을 생산하기 위한 연구가 수행되었다[참조:EP-A-344459(JP-A-2-104290)(본원에 사용되는 용어 “JP-A”는 미심사 공개 일본국 특허원을 의미한다)； EP-A-343388(JP-A-2-242694)； GB-A-2217332(JP-A-2-303497)].
천연 AOX2 프로모터는 미합중국 특허 제5,032,516호에 기술되어 있다.
일단 이종 단백질을 암호화하는 유전자가 치환에 의해 숙주의 AOX1 유전자 영역으로 삽입되면, 메탄올 이용은 단지 AOX2 활성에만 의존해야 한다. 메탄올-함유 배지중에서 이러한 돌연변이체의 성장속도는 야생형 숙주의 성장속도보다 열등하며, 결국 불리하게도 연장된 배양기간을 사용해야할 필요가 있다.
본 발명의 목적은 AOX1 유전자 활성이 결여된 기타 효모 균과는 대조적으로 메탄올-함유 배지중에서 양호하게 성장할 수 있고 이종 단백질을 발현시킬 수 있는 효모 균주 및 이러한 균주를 수득하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 이종 단백질을 고도로 발현시키기 위한 신규한 프로모터 및 이러한 프로모터를 수득하는 방법을 제공하는 것이다.
추가의 목적은 상기 프로모터를 함유하는 플라스미드를 포함함으로써 이종 단백질 생산 시스템을 갖춘 형질전환체를 제공하는 것이다.
상기 목적은 (1) 야생형 AOX2 프로모터의 염기 서열내 부분적 결실 또는 치환, 또는 신규한 염기 서열의 첨가에 의한, 야생형 AOX2 프로모터로부터 기원하는 돌연변이 AOX2 프로모터； (2) 상기 (1)에서 언급된 돌연변이 AOX2 프로모터의 조절하에 AOX 유전자를 염색체상에 함유하는 미생물 균주； (3) AOX2 유전자가 야생형 AOX2 프로모터의 조절하에 있는 균주를 메탄올-함유 배지중에서 배양함으로써 야생형 AOX2 프로모터내에 돌연변이를 야기시킴을 포함하여 상기 (2)에서 언급된 균주를 수득하는 방법； (4) 상기 (2)에서 언급된 균주를 배양시킴을 포함하여 이종 단백질을 생산하는 방법; (5) 상기 (1)에서 언급된 돌연변이 AOX2 프로모터를 함유하는 플라스미드； (6) 상기 (5)에서 언급된 플라스미드의 도입에 의해 수득된 형질전환체； (7) 상기 (6)에서 언급된 형질전환체를 배양함을 포함하여 이종 단백질을 생산하는 방법을 제공함으로써 달성될 수 있다.
제1도는 PC4130에 대한 작제 도식 및 GCP101을 수득하는 방법을 설명한 것이다. 제1도에서, “Prom”은 프로모터를 의미하고, “t”는 터미네이터를 의미하며, “폴리 A”는 폴리 A 영역을 의미한다.
제2도는 AOX2 유전자 부근의 제한 효소 지도를 도식화한 것이다. 괄호안의 수는 각각 Xba I 부위(거리 0)로부터의 거리(x 100 염기)를 나타낸다.
제3도는 각각 제한 효소 지도를 사용하여 AOX2 프로모터가 클로닝된 플라스미드 pMM030 및 pMM034를 도시한 것이다. 괄호안의 수는 각각 EcoRI 부위(거리 0)로부터의 거리(x 100 염기)를 나타낸다.
제4도는 각각 제한 효소 지도를 사용하여 AOX2 구조 유전자가 클로닝된 플라스미드 pMM031 및 pMM035를 도시한 것이다. 괄호안의 수는 각각 EcoRI 부위(거리 0)로부터의 거리(x 100 염기)를 나타낸다.
제5도는 AOX2 프로모터 서열내에 형질전환을 야기시키기 위한 통합 벡터 pYI066 및 pYI068의 작제를 설명하고 있다. 제5도에서, “BAP”는 세균 알칼리성 포스파타제를 의미하고, “AOX2 prom”은 AOX2 프로모터를 의미한다.
제6도는 돌연변이 AOX2 프로모터를 갖는 각 균주를 수득하는 위한 방법을 보여준다.
제7도는 pPG001의 작제를 설명하고 있다. 제7도에서, “p”는 프로모터를 의미하고, “t”는 터미네이터를 의미한다.
제8도는 AOX2 프로모터의 조절하에 HSA를 발현시키는 플라스미드 pMM041 및 pMM042의 작제를 설명하고 있다.
제9도는 실시예 7의 공정을 설명하고 있다. 제9도에서, “■”는 프로브(0.6kb Kpn I 단편)를 의미하고, “Pr”은 AOX2 프로모터를 의미하며, “↓”는 Bgl II 분해 부위를 의미한다.
(1) 돌연변이 AOX2 프로모터
본 발명의 돌연변이 AOX2 프로모터는 천연, 즉 야생형 AOX2 프로모터의 염기 서열내의 부분적 결실 또는 치환, 또는 신규한 염기 서열의 첨가에 의해, 천연, 즉 야생형 AOX2 프로모터로부터 기원한다.
a. 야생형 AOX2 프로모터의 염기 서열내의 부분적 결실
결실 부위는 야생형 AOX2 프로모터 영역내에 있는 한 중요하지 않다. 예를 들어, 결실 부위는 서열 동정 번호： 1에서 나타낸 바와 같이 야생형 AOX2 프로모터를 함유하는 염기 서열중 730번 염기 내지 1528번 염기 사이에 존재할 수 있다. 결실은 하나 이상의 염기를 수반할 수 있으며, 하나 이상의 위치에서 일어날 수 있다. 특별한 예로서, 서열 동정 번호: 1의 서열중 749번 염기 (C)부터 1187번 염기 (T)까지의 439개 염기쌍이 결실되어 있는, 서열 동정 번호： 2로 구체적으로 나타낸 프로모터가 언급될 수 있다.
b. 야생형 AOX2 프로모터의 염기 서열의 부분적 치환
치환 부위는 야생형 AOX2 프로모터 영역내에 있는한 중요하지 않다. 예를 들어, 치환 부위는 서열 동정 번호：1로 나타낸 AOX2 프로모터 함유 염기 서열중 730번 염기와 1528번 염기 사이에 존재할 수 있다. 치환은 하나 이상의 염기를 수반할 수 있으며, 하나 이상의 위치에서 일어날 수 있다. 특별한 예로서, 서열 동정 번호： 1로 나타낸 염기 서열중 1274번 염기(T) 부위가 (C)로 치환된 서열 동정 번호： 3으로 구체적으로 나타낸 프로모터가 언급될 수 있다.
c. 야생형 AOX2 프로모터에 새로운 염기 서열의 첨가
첨가 부위는 야생형 AOX2 프로모터 영역내에 있는 한 중요하지 않다. 예를 들어, 첨가 부위는 서열 동정 번호: 1로 나타낸 야생형 AOX2 프로모터-함유 염기 서열중 730번 염기와 1528번 염기 사이에 존재할 수 있다. 첨가는 하나 이상의 염기를 수반할 수 있으며, 하나 이상의 위치에서 일어날 수 있다. 특별한 예로서, 서열 동정 번호: 1로 나타낸 염기 서열중 1314번 염기(A)와 1315번 염기(C) 사이에 서열 동정 번호: 7로 나타낸 추가의 서열을 갖는 서열 동정 번호: 4로 구체적으로 나타낸 프로모터가 언급될 수 있다.
각각 서열 동정 번호 : 2, 3 및 4로 나타낸 상기 언급된 염기 서열에서, 예를 들어 1번 염기로부터 730번 염기까지의 영역은 편의상 야생형과 동일하게 제공된다. 그러나, 1번 염기 내지 730번 염기의 영역은 상기와 같이 나타낸 것으로 제한 되지 않고, 적당한 위치에서의 결실, 치환 및/또는 삽입을 포함할 수 있음이 명백하다.
야생형 AOX 프로모터의 염기 서열에서 결실, 치환 또는 첨가는 부위-지시된 결실[참조: Nucl. Acids Res., 11, 164(1983)], 부위-지시된 돌연변이유발 및 제한 효소 처리와 병행하여 합성 유전자의 사용과 같은 일반적으로 사용되는 유전공학 기술을 이용하여 수행될 수 있다.
(2) 돌연변이 AOX2 프로모터를 염색체상에 함유하는 미생물 균주
본 발명의 미생물 균주는 그들의 염색체상에 상기 (1)에서 언급된 돌연변이 AOX2 프로모터의 조절하에 AOX 유전자를 포함한다.
더욱 특히, 상기 균주는 AOX1 유전자-암호화된 AOX를 생성하지 않으면서, 염색체내에 상기 (1)에서 언급된 돌연변이 AOX2 프로모터의 조절하에 있는 AOX 유전자를 포함한다. 더욱 구체적으로, 균주는 염색체상에 AOX1 프로모터 및 상기 (1)에서 언급된 돌연변이 AOX2 프로모터를 가지므로 이종 단백질 유전자는 AOX1 프로모터의 조절하에 있게 되고, AOX 유전자는 돌연변이 AOX2 프로모터의 조절하에 있게 된다.
이와 같은 미생물 균주로는 균주 GCP101 및 SHG4105-4가 언급될 수 있다.
(3) 염색체상에 돌연변이 AOX2 프로모터를 포함하는 미생물 균주를 수득하는 방법
1) 출발 미생물 균주
본 발명의 실시에서 사용되는 출발 미생물 균주는 염색체사에 야생형 AOX2 프로모터의 조절하에 있는 AOX2 유전자를 포함한다. 따라서, 균주는 AOX1 프로모터 조절하의 AOX1 유전자 및 AOX2 프로모터 조절하의 AOX2 유전자와 함께 염색체상에 AOX1 프로모터 및 AOX2프로모터를 포함한다.
이러한 미생물 균주는, 예를 들어 피키아 파스토리스(야생형)이며, 특별한 예로서 균주 GTS115(NRRL 기탁 번호 Y-15851)[참조: Gene, 59, 115-125(1987)]가 언급될 수 있다.
2) 이종 단백질 유전자의 도입
이종 단백질 유전자를 상기 1)에 언급된 출발 균주에 도입하여 AOX1 유전자 영역에서 이종 단백질 유전자와의 치환을 야기시킨다.
이종 단백질로서는 여러가지 중에서 사람 혈청 알부민(HSA), B형 간염 바이러스 항원, 유로키나제 및 인터페론이 언급될 수 있다.
EP-A-344459(JP-A-2-104290)에 기술되어 있는 바와 같이, AOX1 유전자의 5’ 와 3’ 상동 영역 사이에 이종 단백질 유전자 전사 단위 및 마커 등을 갖는 선형의 부위-특이적 통합 벡터가 AOX1 유전자를 치환시키기 위해 사용된다(참조: 제1도). 출발 균주의 형질전환은 그 자체 공지된 방법으로 수행된다.
이러한 균주의 특정 예로는 PC4130 및 PC4105가 언급될 수 있다.
이종 단백질 유전자를, AOX1 유전자 영역으로 삽입하거나, AOX1 유전자에 의한 AOX 생성이 경감되도록 AOX1 유전자를 부분적 변형(예를 들어, 결실, 치환 또는 첨가)시킨 후 그러한 상태에서 돌연변이시켜 이종 단백질 유전자를 도입시킨다.
3) 형질전환체의 획득
상기 2)에서 언급된 균주(AOX1 유전자에 의한 AOX1 생성이 더 이상 일어나지 않는 형질전환체)를 메탄올-함유 배지중에서 배양하여 AOX2 프로모터 영역에서 돌연변이를 유발시킨다.
메탄올 농도는, 예를 들어 약 1 내지 5%이다. 배지는 천연 배지이거나 인공 배지일 수 있다. 천연 배지로서는, 예를 들어 YP 배지(1% 효모 추출물 + 2% 폴리펩톤)가 언급될 수 있다. 배양은 일반적으로 15 내지 43 ℃(적합하게는 약 30 ℃)에서 약 20 내지 120시간 동안, 필요한 경우 통기 및/또는 교반하면서 수행한다. 배양이 완결된 후, 배양물의 일부 또는 전부를 취하여 새로이 제조한 메탄올-함유 배지로 옮기고, 배양을 계속한다. 계대배양의 경우, 배양물의 일부를 취하여 희석하고, 희석액을 영양이 불량한 메탄올-함유 평판, 예를 들어 2% MeOH-YNB w/o a.a. 평판(아미노산 없는 0.7% 효모 질소 염기, 2% 메탄올 및 1.5% 아가 분말)상에 도말하고, 이어서 30 ℃에서 배양한다. 형질전환체는 약 3 내지 14일 배양한 후에 생성된 콜로니로부터 수득할 수 있다.
4) 돌연변이 AOX2 프로모터의 회수
돌연변이 AOX2 프로모터는 적당한 유전 공학 기술을 이용하여 AOX2 프로모터 영역으로부터 클로닝에 의해 상기 2)에 언급된 형질전환체로부터 회수할 수 있다.
회수된 프로모터의 염기 서열은 그 자체 공지된 기술에 의해 분석할 수 있다.
(4) 상기 (2)에 언급된 미생무 균주를 이용하여 이종 단백질을 생산하는 방법
상기 (2)에 언급된 균주(형질전환체)는 숙주 세포를 위한 그 자체 공지된 배지에서 배양된다. 배지는 바람직하게는 메탄올을 함유해야 한다. 메탄올 농도는, 예를 들어 약 0.01 내지 5%이다. 배지는 천연 배지 또는 인공 배지일 수 있다. 천연 배지에는 여러 가지 중에서 YNB 배지(0.7% 효모 질소 염기) 및 YP 배지(1% 효모 추출물 + 2% 폴리펩톤)가 포함된다.
배양은 일반적으로 15 내지 43℃(바람직하게는 약 30℃)에서 약 20 내지 360시간 동안, 필요한 경우 통기 및/또는 교반하면서 수행한다.
배양 후, 배양 상등액을 회수하고, 이종 단백질을 그 자체 공지된 방법, 예를 들어 친화성 크로마토그래피 또는 겔 여과 분획법에 의해 배양 상등액으로부터 정제할 수 있다.
(5) 플라스미드
본 발명의 플라스미드는 상기 (1)에서 언급된 돌연변이 AOX2 프로모터를 포함한다.
본 발명의 플라스미드는 시그날 펩타이드 유전자, 구조 단백질 유전자, 터미네이터, 동종 영역, 마커 유전자, 숙주에서 복제할 수 있는 자가 복제 서열 등을 함유할 수 있다.
시그날 펩타이드 유전자로서 이용할 수 있는 것은 사람 혈청 알부민 프레프로(prepro) 펩타이드 유전자 또는 이의 변형된 유전자[참조: EP-319641 (JP-A-2-167095)], 효모 인버타제 시그날 펩타이드 유전자, 효모 α-인자 시그날 펩타이드 유전자 및 인공적으로 합성된 리더 서열[참조: EP-329127 (JP-A-1-240191)]이다.
자가 복제 서열의 예는 피키아 파스토리스 염색체 DNA로부터 분리된 PARS1 및 PARS2이다[참조: 미합중국 특허 제4,837,148호].
구조 유전자로서는 여러 가지 중에서 이종 단백질 (예: 사람 혈청 알부민, 프로유로키나제, 조직 플라스미노겐 활성화제, B형 간염 표면 항원, 다양한 인터페론 등) 유전자, AOX1 유전자 및 AOX2 유전자가 언급될 수 있다.
터미네이터의 예로서는 AOX1 터미네이터 및 AOX2 터미네이터가 언급될 수 있다.
동종 영역에는 여러 가지 중에서 HIS4, URA3, LEU2 및 ARG4가 포함된다.
마커 유전자로서는, 예를 들어 항생제 내성 유전자 및 영양요구성 돌연변이-상보성 유전자가 사용될 수 있다. 항생제로서는 여러 가지 중에서 사이클로헥스이미드, G-418, 클로람페니콜, 블레오마이신 및하이그로마이신이 언급될 수 있다. 영양요구성 돌연변이-상보성 유전자에는 여러 가지 중에서 HIS4, URA3, LEU2 및 ARG4가 포함된다.
전사 단위에는 5’에서 3’ 방향으로 순서대로 작동적으로 연결되는 적어도 돌연변이 AOX2 프로모터, 시그날 펩타이드 유전자, 구조 단백질 유전자 및 터미네이터가 포함된다.
본 발명의 플라스미드는 일반적으로 허용되는 유전 공학 기술을 이용하여 제조될 수 있다.
(6) 형질전환체
본 발명의 형질전환체는 도입되는 상기 (5)에서 언급된 플라스미드를 함유한다.
효모는 본 발명의 실시에서 숙주로서 바람직하다. 피키아 파스토리스가 더욱 바람직하다. 특별한 예로서, 균주 GTS115(NRRL 기탁번호 Y-15851)가 언급될 수 있다.
숙주(효모)세포는 그 자체 공지된 방법, 예를 들어 인산칼슘 침전 방법, 폴리에틸렌 옥사이드를 이용한 원형질 융합 방법 또는 일렉트로포레이션(electroporation)에 의해 형질전환시킬 수 있다. 그 다음에 목적 형질전환체가 선별된다.
플라스미드는 염색체중 삽입체의 형태, 재조합에 의해 염색체중에 통합된 형태 또는 플라스미드 형태로 숙제 세포에서 존재할 수 있다.
숙주에 도입된 외래 유전자의 복제수는 1 이상일 수 있다.
하나의 동일한 균주는 본 발명의 플라스미드와 함께 또다른 프로모터의 조절하에 있는 이종 유전자의 발현을 위한 또 다른 플라스미드를 함유할 수 있다.
(7) 상기 (6)에 언급된 형질전환체를 이용하여 이종 단백질을 생산하는 방법
이종 단백질은 상기 (6)에서 언급된 바와 같이 수득된 형질전환체를 배양하여 상기 (2)에서 언급된 것과 동일한 방법으로 생산될 수 있다.
또한, 하기 공정예 및 시험예가 본 발명을 추가로 설명하고 있다. 그러나, 이들은 결코 본 발명의 영역을 제한하지 않는다.
본 발명의 실시에서 사용된기술, 반응 공정 및 분석 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 달리 지시되지 않는 한, 모든 효소는 시판용인 것을 사용하며, 예를 들어, 다카라 스조(Takara Shuzo)로부터 구입할 수 있다.
달리 특정화되지 않는 한, 효소 반응을 위해 사용되는 완충액 및 반응조건은 효소 공급업자에 의해 추천된 것이다.
효모 균주 피키아 파스토리스 GTS115, PC4130 및 PC4105, 및 플라스미드 pPGP1 및 pPGS1은 본 발명자들로부터 수득된 것이다.
플라스미드, 플라그 하이브리드화 및 전기영동을 사용한 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)의 형질전환은 문헌에 기술된 바와 같이 수행한다[참조: “Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982].
[실시예 1]
[GCP101의 수득(참조: 제1도)]
EP-A-344459(JP-A-2-104290)에 기술된 방법에 의해 피키아 파스토리스 GTS115(his4)의 AOX1 유전자 영역을, AOX1 프로모터의 조절하에 HSA를 발현시키는 전사 단위를 갖는 플라스미드 pPGP1를 NotI 분해시켜 생성된 단편으로 치환하여 균주 PC4130을 수득한다. 이 균주는 AOX1-구조 유전자가 결여되어 있으므로 탄소원으로서 메탄올을 함유하는 배지에서 효모의 성장 속도는 느리다(Mut-균주).
PC4130을 3㎖의 YPD 배지(1% 효모 추출물, 2% 박토-펩톤 및 2% 글루코즈)에 접종한다. 24시간의 배양 후, 배양된 세포를 초기 광학 밀도가 540㎚(OD540)에서 1이 되도록 50㎖의 2% MeOH-YP 배지(1% 효모 추출물, 2% 박토-펩톤 및 2% 메탄올)에 접종한다. 30℃에서 3일간 배양한 후, 배양물을 초기 OD540값이 1이 되도록 50㎖의 2% MeOH-YP 배지에 접종한다. 동일한 계대배양 과정을 3일 간격으로 반복한다. 각 계대배양에서, 세포 현탁액은 멸균수를 사용하여, 2% MeOH-YNB w/o a.a. 평판(아미노산 없는 0.7% 효모 질소 염기, 2% 메탄올 및 1.5% 아가)상에 도말하기위해 107세포수/평판의 농도로 희석하고, 이어서 30℃에서 5일 동안 배양한 후 콜로니의 존재 또는 부재 여부를 후속 검사한다. 12일의 계대배양 후에 수득된 세포로 도말한 2% MeOH-YNB w/o a.a. 평판은 20개의 콜로니를 생산했다(이러한 종류의 평판에서는 Mut-균주는 성장하기 힘든 반면, Mut+균주는 증식된다). 따라서, 상기 평판에서의 콜로니형성은 메탄올의 이용 능력이 증가된 Mut+돌연변이체가 수득되었음을 나타낸다. 수득된 콜로니중 하나를 멸균수로 적당하게 희석하고, 희석액을 분리된 단일 콜로니의 형성을 위해 2% MeOH-YNB w/o a.a. 평판상에 도말한다. 이들 중 하나를 GCP101로 지명한다.
다양한 배지상에서의 성장 속도에 대해 PC4130과 GCP101를 비교한다. YNB w/o a.a. 평판(아미노산이 없는 0.7% 효모 질소 염기, 2% 글루코즈 및 1.5% 아가분말) 상에서 4℃에서 저장된 1루프의 세포를 각 시험관중의 3㎖의 YPD 배지에 접종하고, 30℃에서 24시간 동안 배양한다. 그 다음에 세포를 초기 OD540값이 0.1인 각 50㎖의 배지를 함유하는 플라스크에 접종하고, 30℃에서 배양한다. 배양 상등액중 세포증식 정도 및 사람 혈청 알부민의 농도를 24시간 간격으로 측정한다(표 1). 사람 혈청 알부민 농도는 RPHA 방법[참조: 유럽 특허 제 122620호]에 의해 측정한다. 사용된 배지는 YPD 배지, 2% MeOH-YP 배지(1% 효모 추출물, 2% 박토-펩톤 및 2% 메탄올) 및 4% MeOH-YP 배지(1% 효모 추출물, 2% 박토-펩톤 및 4% 메탄올)이다.
탄소원으로서 글루코즈를 함유하는 배지에서는 두 균주사이에 현저한 차이점이 관찰되지 않은 반면, 탄소원으로서 메탄올을 함유하는 배지에서는 GCP101가 PC4130와 비교하여 증가된 성장을 나타낸다(Mut+로 형질전환). HSA 생성에 대해서는 GCP101과 PC4130 사에서 거의 차이가 없다.
[표 1]
[실시예 2]
[AOX2 유전자의 클로닝]
AOX2 유전자 및 이 유전자의 인접 부위의 서열 및 제한 효소 지도는 Cregg등[참조: Mol. Cell. Biol., 9. 1316-1323(1989)] 및 Koutz 등[참조: Yeast, 5, 167-177(1989)]에 의해 보고되어 있다. 따라서, 이들 보고를 참조로 하여 AOX2를 클로닝하는 계획을 세운다. AOX2 유전자 및 이 유전자의 인접 부위의 제한 효소 지도는 제2도에 나타나 있다.
우선, 염색체 DNA를 Cameron 등[참조:Nucleic Acids Res., 4. 1429(1977)]의 방법에 의해 균주 PC4130 및 GCP101 모두로부터 추출하여 정제한다. 각 염색체 DNA를 Xba I 및 Pst I 으로 완전히 분해하여 AOX2 프로모터 영역, AOX2 구조 유전자 및 AOX2 터미네이터를 완전히 포함하는 단편을 수득한다. 분해물을 에탄올 침전 및 원심분리로 수집하고, 건조시켜 멸균수중에 용해시킨다. EcoRI 메틸라제(Takara Shuzo로부터 구입)를 가하고, 용액을 배양한다. 반응 혼합물을 TE-포화된 페놀-클로로포름으로 추출한 후 클로로포름으로 추출하고, 수성층을 에탄올 침전시킨다. 침전물을 원심분리로 수집하고, 건조시켜 멸균수중에 용해시킨다.
말단을 DNA 평활화 키트(DNA blunting kit)(Takara Shuzo로부터 구입)를 이용하여 평활말단으로 만들고, EcoRI 링커인 d(pG-G-A-A-T-T-C-C)(TakaraShuzo로부터 구입)를 DNA 연결 키트(DNA ligation kit)(Takara Shuzo로부터 구입)를 사용하여 평활말단에 연결시킨다. 다시, 에탄올로 침전시키고, 침전물을 원심분리로 회수하고, 건조시켜 멸균수중에 용해시킨다. EcoRI을 가하고, 37℃에서 1시간 동안 배양시킨다. 1% 아가로스 겔 상에서 전기영동을 수행하고, 4 내지 5kb에 상응하는 겔 영역을 잘라낸다.
이어서, DNA를 회수하기 위해 겔 영역을 전기 용출하고 GENE CLEANII(BI0101)을 이용하여 정제하고, 회수된 DNA를 멸균수중에 용해시키고, λgt 10암(arm)(ProtocloneTMSystem; Promega로부터 구입)에 연결시키고, 시험관내에서 Gigapack GOLD3(Stratagene으로부터 구입)을 이용하여 팩키징을 수행한다. 생성 혼합물을 A600값이 2로 조정된 이.콜라이 C600 및 C600hfl 균주에 노출시킨다. 각 균주의 세포를 라이브러리를 형성시키기 위해 NZY 평판(1% NZ 아민, 0.5% 염화나트륨, 0.5% 효모 추출물, 0.02% 황산 마그네슘 및 1.5% 아가 분말)상에 접종한 다음 역가 검정한다. 재조합 파아지는 이.콜라이 C600hfl 세포상으로 흡착되며, 이 세포를 NZY 평판상에 접종하여 각 평판당 약 500개의 플라그를 수득한다.
PC4130 및 GC101 균주 각각으로부터 유도된 형질전환체를 위해 4개의 나일론막(Colony/Plaque ScreenTM, NEN)을 이용한다. 상기 세포를 상기 막으로 옮기고 변성시킨 후, 중화 및 고정화 처리를 한다. 사용한 프로브는 피키아 파스토리스 IFO1013-기원한 AOX1 구조 유전자의 전반부에 상응하는 EcoRV-Bgl II 단편으로서, 랜덤 프라이머 표지 키트(Takara Shuzo 제조원)를 사용하여32P로 표지하여 제조한다. 예비 하이브리드화를 1% BSA, 1mM EDTA, 0.5M NaH2PO4(pH 7.2) 및 7% SDS를 함유하는 용액내에서 5분 동안 65℃에서 수행한다. 하이브리드화를 1% BSA, 1mM EDTA, 0.5M NaH2PO4(pH 7.2) 및 7% SDS를 함유하는32P-프로브 용액내에서 밤새 65℃에서 수행한다. 세척을 위해, 상기 세포를 0.5M NaH2PO4(pH 7.2) 내에서 10분 동안 실온에서 배양한 다음, 0.5% BSA, 1mM EDTA, 40mM NaH2PO4(pH 7.2) 및 5% SDS를 함유하는 용액내에서 30분 동안 37℃에서 배양한다. 후자의 배양을 총 3회 반복한다. 필터를 공기건조시키고, X-선 노출 카세트내 X선 필름과 -80℃에서 16시간 동안 접촉시켜 방사선 자동사진을 찍는다.
각 균주로부터, 2개의 양성 콜로니를 수득하였다. 각 균주에 대한 한 클론으로 파아지 증식을 수행하여 파아지 DNA를 추출한다. 상기와 같이 수득한 DNA를 Eco RI으로 분리하고, 원하는 단편(1.5kb와 2.9kb)의 형성을 아가로스 겔 전기영동으로 확인한다. pUC19(Bethesda Research Laboratories 제조원)을 Eco RI으로 분해하고, 알칼리성 포스파타제로 처리하고, 수득된 단편을 회수하여 파아지 DNA의 Eco RI 분해물에 연결시킨다.
이 결합 혼합물을 이용하여 이.콜라이 HB101을 형질전환시킨다. 상기 세포를 40㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 L 평판(수중에 트리스 염기 0.62g, 폴리펩톤 10g, 효모 추출물 5g 및 염화나트륨 5g을 용해시키고, 물을 가하여 1ℓ를 만든 후, 한천 분말 15g을 첨가하고, 이 혼합물을 오토클레이브(autoclave)한 뒤 냉각시키고 암피실린을 첨가한 다음 플라스틱 접시에 동일량을 분주하고, 응고시켜 제조된 것)상에 접종하고, 37℃에서 밤새 배양한다.
생성된 콜로니 각각을, 미니프렙(miniprep)하고, 플라스미드를 추출한 후 Eco RI으로 분해하여 스크리닝한다. 결과적으로 pUC19내에 각각 삽입된 1.5kb와 2.9kb 단편을 가진 클론을 PC4130 및 GCP101 균주 모두에서 수득하였다. 상기 클론을 40㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 슈퍼 브로쓰(super broth) 내에서 밤새 37℃에서 진탕배양시키고[슈퍼 브로쓰는 수중에 12g의 박토트립톤, 24g의 효모 추출물 및 5㎖의 글리세롤을 용해시킨 후 물을 첨가하여 900㎖로 만들고, 이 용액(용액 A)을 오토클레이브한 다음 상기 용액 A와 용액 B(수중에 3.81g의 인산이수소칼륨과 12.5g의 인산수소이칼륨을 용해시키고 물을 첨가하여 100㎖를 만듬으로써 제조됨)를 9:1의 용량비(volume/volume ratio)로 혼합하여 제조됨]. 상기 클론의 플라스미드DNA를 알칼리성-SDS 법으로 다량 추출하여 정제한다.
PC4130-기원한 AOX2 프로모터 영역 및 AOX2 구조 유전자를 함유하는 플라스미드 각각을 pMM030 및 pMM031로 명명하였고, 반면 GCP101-기원한 AOX2 프로모터 영역 및 AOX2 구조 유전자를 함유하는 플라스미드 각각을 pMM034 및 pMM035로 명명하였다(참조: 제3도 및 제4도). 이들 플라스미드를 다양한 제한 효소로 분해하여 생성된 단편들의 크기는 이미 보고된 패턴과 일치하였다.
[실시예 3]
[AOX2 프로모터 영역의 염기 서열의 결정]
pMM30 및 pMM034를 EcoRI으로 분해시켜 각각 1.5kb 단편을 수거하고, DNA 평활화 킷트(Takara Shuzo 제조원)를 사용하여 평활말단으로 만든다. 별도로, pUC19을 XbaI으로 분해시키고, 멍 빈 뉴클레아제(mung bean nuclease)(Takara Shuzo 제조원)로 처리한 후, 알칼리성 포스파타제로 처리된 단편에 연결한다. 플라스미드 DNA를 상응하는 형질전환체로부터 제조한다. 상기 공정의 결과 PC4130-기원한 AOX2 프로모터 영역 DNA와 GCP101-기원한 AOX2 프로모터 영역 DNA가 pUC19의 Xba I 부위내에 아클로닝된다.
상기 플라스미드 각각으로부터, 삽입체 크기가 150 내지 300bp로서 상이한 5 또는 6개의 결실 돌연변이 클론을 킬로 서열 분석용 결실 키트(Takara Shuzo 제조원)를 사용하여 제조한다. 상기 결실 돌연변이체는 M13 디데옥시 서열 분석 키트(Takara Shuzo)를 사용하여 서열을 결정하였다. 결과적으로, ATG로부터 존재하는 PC4130-기원한 AOX2 프로모터 영역의 1.5kb 길이의 염기 서열 및 GCP101-기원한 AOX2 프로모터 영역의 1.5kb 길이의 염기 서열을 완전히 결정하였다.
상기 두 균주로부터 기원한 서열을 비교한 결과 PC4130-기원한 AOX2 구조 유전자에서 개시코돈 ATG[서열동정번호: 1에서 1528번 뉴클레오타이드 다음의 1529번 내지 1531번 뉴클레오타이드(도시되지 않았음)]으로부터의 255bp 상부의 뉴클레오타이드(즉. 서열동정번호: 1에서 1274번 뉴클레오타이드)가 T인 한편, GCP101-기원한 클론에서 상응하는 뉴클레오타이드(서열동정 번호: 3에서 1274번 뉴클레오타이드)가 C로서 하나의 염기차가 있는 것으로 나타났다.
[실시예 4]
[GCP101-기원한 AOX2 프로모터와 PC4130-기원한 AOX2 프로모터와의 상호치환[비교; 유럽 특허원 제 127304호(일본국 특허원 제 60-41488호)]]
효모-기원한 인버타제(SUC2) 유전자를 pMM030 및 pMM034의 SpeI 부위에 삽입시켜 AOX2 프로모터의 교환을 위한 플라스미드를 작제한다. 즉, pmM030 및 pMM034 각각을 SpeI으로 분해시키고, 알카리성 포스파타제로 처리한 후 4.2kb 단편을 회수한다. SUC2 유전자를 클로닝시켜 pUC19로부터 기원한 플라스미드 pYI056을 EcoRI 및 SalI으로 분해시키고, DNA 평활화 키트(Takara Shuzo 제조원)를 사용하여 단편을 평활말단으로 만든 다음, 여기에 SpeI 링커 d(pG-A-C-T-A-G-T-C)(NEB)를 DNA 연결 키트(Takara Shuzo 제조원)를 사용하여 연결시킨다. 그런 다음, SpeI으로 분해시키고 2.9kb 단편을 회수한 후, pMM030-또는 pMM034-기원한 단편에 연결시킨다. 이에 따라, PC4130-기원한 AOX2 프로모터로부터 상부 영역에 SUC2를 함유하는 플라스미드 pYI066 및 GCP101-기원한 AOX2 프로모터로부터 상부 영역에 SUC2를 함유하는 플라스미드 pYI068를 작제하였다(참조: 제5도).
이 두 개의 플라스미드를 사용하여 숙주 균주 PC4130과 GCP101을 형질전환시킨다. 각 플라스미드를 EcoRI으로 분해시켜 4.4kb 단편을 수득한다. AOX2 프로모터 영역과 동종인 영역이 SUC2의 양쪽에 존재하기 때문에, 상기 단편을 피키아 파스토리스내로 도입시켰을 때 AOX2 유전자 프로모터 영역에서 동종 재조합이 일어나 양 균주로부터 기원하는 AOX2 프로모터의 상호교환이 이루어진다.
문헌[참조: Cregg et al.. Mol. Cell. Biol., 5. 3376-3385 (1985)]의 방법을 참조하여 피키아 파스토리스를 형질전환시킨다. 따라서, PC4130과 GCP101을 5㎖의 YPD 배지중에서 30℃로 밤새 배양한 다음 접종(0.01%)하는데 사용한다. 16 내지 20시간 배양한 후 A600이 1에서 5로 증가할 때 각 배양물을 50㎖ 코닝 튜브에 옮겨 원심분리한다. 수득된 세포를 20㎖의 멸균수중에 현탁시키고, 다시 원심분리 한다. 이에 따라 수득된 세포를 10㎖의 SED 완충액(1M 솔비톨, 25mM EDTA 및 50mM 디티오트레이톨)중에 현탁시킨 다음 원심분리하고, 1M 솔비톨 용액으로 2회 세척한다.
이어서, 이들을 10㎖의 자이몰라이아제 용액(자이몰라이아제 100T를 SED 완충액중에 50㎍/㎖의 농도로 용해시켜 제조됨)중에 현탁시키고, 30℃에서 30분 동안 배양한다. 10% SDS를 1/10 용량으로 첨가했을때의 세포 파괴 가능성을 현미경으로 관찰하여 확인한다. 세포를 원심분리하여 수거하고, 1M 솔비톨 용액을 2 분획으로 세척한 후 CaS 완충액(1M 솔비톨과 10mM 염화칼슘)중에 현탁시킨 다음, 원심분리한다. 회수한 세포를 1㎖의 CaS 완충액중에 현탁시키고, 100㎕의 생성된 스페로플라스트(spheroplast) 현탁액을 폴리프로필렌 튜브로 옮긴다.
pYI066과 pYI068을 EcoRI으로 분해시켜 수득된 4.4kb DNA 단편 각각 10㎍을 상기 튜브에 가한 다음, 이 혼합물을 실온에서 20분 동안 정치시킨다. 그런 다음, 1㎖의 PEG 용액(20% 폴리에틸렌 글리콜 3350,10mM 염화칼슘 및 10mM 트리스 염기, pH 7.4)을 가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 15분 동안 정치시킨다. 세포를 원심분리하여 수거하고, 150㎕의 SOS 용액(1M 솔비톨, 10mM 염화칼슘 및 0.3 x YPD)중에 현탁시키고, 실온에서 30분 동안 정치시킨다. 850㎕의 1M 솔비톨을 첨가한후, 상부 아가의 10㎖ 분획(1M 솔비톨, 아미노산이 없는 1.35% 효모 질소 염기, 400㎍/ℓ 바이오틴, 2% 글루코즈 및 1% 아가)에 10, 100 및 500㎕의 수득된 스페로 플라스트 현탁액 각각을 가하고 교반시킨 다음, 각 현탁액을 밑평판(이의 조성은 상부 아가와 동일하며 디쉬상에서 고화된 것)상에 도말한다.
배양을 30℃에서 4일 동안 수행한다. 상부 아가층이 진균으로 덮여지면 각각을 멸균 드럭 스푼으로 긁어내고 3G1 유리 필터를 통해 여과하여 아가를 제거한다. 적당량의 각 진균 세포-함유 여과물을 희석시키고, MSu 평판(아미노산이 없는 0.7% 효모 질소 염기, 400㎍/l 바이오틴, 0.5% 사카로즈 및 1% 아가 분말)상에 접종시킨다. 생성된 단일 콜로니중 하나를 택하여 멸균수중에 현탁시키고, 재차 접종하는데 사용한다.
비교적 큰 단일 콜로니를 2% MeOH-YNB w/o a.a. 평판상에 접종시키고, 5일 경과한 후 증식(Mut+) 또는 무증식(Mut-균주)에 관하여 판정한다. 표 2에서 알 수 있는 바와 같이, PC4130(Mut-균주)에 pYI068(돌연변이형 AOX2 프로모터)을 도입시킴으로써 기원한 형질전환체중의 20%가 상기 종류의 평판상에서 성장한다. 반면, GCP101(Mut+균주)에 pYI066(천연형 AOX2 프로모터)을 도입시킴으로써 기원한 형질전환체중의 6%가 상기 종류의 평판상에서 성장할 수 없었다.
따라서, 천연 AOX2 프로모터 대신에 돌연변이 AOX2 프로모터로 교환시켰을 때 프로모터 활성이 증가되었고, 결국 Mut-균주로부터 Mut+균주로의 전환이 유도되었다.
[표 2]
[실시예 5]
[다른 Mut+형질전환체내의 AOX2 프로모터에서의 돌연변이 위치에 대한 조사]
HSA를 생산하는 피키아 파스토리스 PC4105 균주는 상술한 방법에 따라 AOX1 영역을 HSA 발현 플라스미드 pPGS1으로 치환시킴에 의해 피키아 파스토리스 GTS115 균주로부터 기원한 균주이다. pPGS1과 실시예 1의 pPGP1 사이의 차이는 단지 pPGP1에서 HSA의 3’에 존재하는 폴리-A 영역이 pPGS1에는 존재하지 않는다는 점이다.
PC4105 균주의 경우, 실시예 1과 동일한 계대배양 실험을 7개의 독립 플라스크를 이용하여 수행한다. 결과로서, 모든 7개 플라스크에서 메탄올-함유 배지에서 개선된 증식을 보여주는 균주(Mut+균주)가 수득되었다. 플라스크로부터 분리된 단일 콜로니 각각을 SHG4105-4, SHG4105-8, SHG4105-9, SHG4105-10, SHG4105-11, SHG4105-16 및 SHG4105-18로 명명하였다(참조: 제6도).
문헌[Cameron et al., Nucleic Acids Res., 4, 1429(1977)]의 방법에 따라 7개 균주 및 PC4105로부터 염색체 DNA를 추출하고 정제한다. 실시예 2에서 수득된 2개의 균주 PC4130 및 GCP101 모두로부터의 염색체 DNA와 함께, 상기 DNA를 PCR 방법으로 AOX2 프로모터 영역 DNA 증폭에 적용시킨다(즉, 프라이머를 우선 합성한다. 실시예 3에서 결정된 염기 서열(서열동정 번호: 1)을 기준으로 하여, AOX2 유전자의 ATG로부터 상부로 143개 내지 160개 염기, 즉 서열동정번호: 1에서 염기 번호 1369번 내지 1386번 및 이에 연결된 EcoRI 부위에 상응하는 상보적 스트랜드 (counter strand)서열을 3’쪽에 대한 프라이머(서열동정번호: 5)로서 사용하고, 상기 ATG로부터의 상부로 786개 염기 내지 803개 염기, 즉 서열동정번호: 1에서 염기 번호 726 내지 733 및 이에 연결된 BamHI 부위에 상응하는 주요 스트랜드 서열을 5’쪽에 대한 프라이머(서열동정번호: 6)로서 사용한다. 상기 두 서열은 Applied Biosystems 모델 381A(DNA 합성기)를 사용하여 포스포아미다이트 방법으로 합성한다.
각각 주형으로서 사용되는 상기의 10개의 염색체 DNA에 대해, 상기 2개의 프라이머와 Takara Shuzo의 GeneAmpTM키트에 부착된 설명서에 기술된 절차를 사용하여 PCR을 수행한다. 이 반응(PCR)을 위해 Perkin Elmer-Cetus 모드 PJ 2000 DNA열 순환 장치를 사용하여, 94℃에서 1분간 DNA 스트랜드의 열 변성, 37℃에서 2분간의 프라이머와의 어닐링 및 72℃에서의 2분간의 폴리머라제-촉매된 쇄 연장을 포함한 주기를 35회 반복한다. 아가로즈 겔 전기영동한 후, 약 650bp 크기의 DNA를 회수하고, SUPRECTM-01(Takara Shuzo 제조원)를 사용하여 정제한다.
SHG4105-16의 경우, 약 250bp 크기의 DNA를 증폭시킴으로써 DNA를 회수하고 정제한다. 별도로, pUC19를 EcoRI 및 BamHI으로 분해시키고, 2.7kb 단편을 회수하여 알칼린 포스파타제로 처리한다. 그런 다음, 이 단편을 각각의 증폭된 DNA에 연결시키고, 연결 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 컴피턴트 세포 균주 DH5(Toyobo 제조원)를 형질전환시킨 후 수득된 형질전환체 중에서 예상된 플라스미드를 포함하는 형질전환체 균주를 선별한다. 플라스미드 DNA를 알카리-SDS 방법으로 제조한다. 이에 따라 제조된 10개 플라스미드의 DNA를 M13 디데옥시 서열 분석 키트(Takara Shuzo 제조원)를 사용하여 EcoRI 부위로부터의 약 200개 염기에 대하셔 서열 분석한다.
SHG4105-16의 경우,증폭된 완전한 염기 서열을 결정하였다. PC4130과 PC4105는 앞서 보고[참조: Koutz et al., Teast, 5, 167-177(1989)]된 서열 동정번호: 1과 동일한 염기 서열을 제공한다. GCP101의 경우, 실시예 3에서 밝혀진 바와 같이 ATG로부터 상부로 255bp에서 T가 C로 돌연변이되었음이 확인된다(서열 동정 번호:3). SHG4105-4, SHG4105-9, SHG4105-10, SHG4105-11 및 SHG4105-18의 경우, 서열 동정 번호: 3의 프로모터 서열과 함께 GCP101과 동일한 돌연변이를 보여준다. SHG4105-8의 경우, ATG로부터 255bp 상부 뉴클레오타이드 T는 변하지 않은 상태이지만, ATG로부터의 약 215bp 내지 약 234bp 상부 부위에 있는 GGAGA 서열 사이에서 서열 동정 번호:7에 도시된 19개-염기 반복 서열이 삽입되어 있는 것으로 밝혀졌다[1314번 염기(A)와 1315번 염기(C) 사이에서 서열 동정 번호: 1에 서열 동정 번호: 7이 첨가되어 생성된 서열 동정 번호 4에 도시된 프로모터 서열을 제공한다]. SHG4105-16의 경우, ATG로부터 255bp 상부의 T는 유지되어 있으나, ATG로부터 342bp 내지 780bp 상부의 439bp 영역[서열 동정 번호: 1에서 749번 염기(C) 내지 1187번 염기(T)]이 결실된 것으로 밝혀졌다(서열 동정 번호: 2).
[실시예 6]
[GCP101-기원한 AOX2 프로모터의 활성]
GCP101-기원한 AOX2 프로모터 또는 PC4130-기원한 AOX2 프로모터의 조절하에 HSA의 발현을 위한 벡터를 이의 프로모터 활성을 확인하기 위하여 작제한다.
즉, pPGP1을 Not I으로 분해시키고, DNA 평활화 키트(Takara Shuzo 제조원)를 사용하여 평활말단으로 만든다. 여기에 EcoRI 링커 d(pG-G-A-A-T-T-C-C)(Takara Shuzo 제조원)를 연결시킨다. Sph I으로 완전히 분해시키고 EcoRI으로 부분 분해시킨 후, 6.5kb 단편을 회수하고 정제한다. pUC19를 EcoRI 및 Sph I으로 분해하고, 분해물을 알칼린 포스파타제로 처리한다. 상기 6.5kb 단편에 벡터 혼합물을 연결시켜 pUC19-기원한 플라스미드 pPG001을 수득한다. 이 플라스미드는 AOXI 프로모터의 조절하에 HSA를 발현시키며 선별 마커로서 HIS4를 갖는다(참조: 제 7도).
pPG001을 EcoRI으로 부분 분해시키고, DNA 평활화 키트(Takara Shuzo 제조원)를 사용하여 평활말단으로 만든다. 별도로, Applied Biosystems 모델 381A DNA 합성기를 사용한 포스포아미다이트 방법으로 서열 GGGATCCC를 갖는 BamHI 링커를 합성한다. 이 링커를 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제(Takara Shuzo 제조원)로 인산화시키고, 상기의 평활말단화된 단편과 연결시킨다. AsuII 및 BamHI으로 분해시킨 후, 7.1kb 단편을 정제한다. 별도로, pPGP1을 HindIII으로 분해시키고, DNA 평활화 키트(Takara Shuzo 제조원)를 사용하여 평활말단으로 만든다. 여기에 BamHI 링커 d(pG-G-G-A-T-C-C-C)를 연결시키고 AsuII 및 BamHI으로 분해시킨 후, 1.9kb 단편을 정제한다. 이 단편을 상기 7.1kb 단편에 연결시켜 플라스미드 pPG002를 수득한다.
pMM030 및 pMM034를 각각 EaeI으로 분해시키고, 1.5kb 단편을 회수한 다음 멍 빈 뉴클레아제(Takara Shuzo 제조원)로 처리하여 평활말단으로 만든다. 서열 CTTCGAAG를 갖는 AsuII 링커를 Applied Biosystems 모델 381A DNA 합성기를 이용한 포스포아미다이트 방법으로 합성하고, T4 폴리뉴클레오타이드 키나제(Takara Shuzo 제조원)를 사용하여 인산화시켜 상기의 각 평활말단 단편에 연결시킨다. EcoRI 및 AsuII로 분해시킨 후, 1.5kb AOX2 프로모터 영역 단편을 회수한다.
별도로, AOX1 프로모터의 조절하에 HSA를 발현시키고 HIS4 영역을 갖는 플라스미드 pPG002를 EcoRI 및 AsuII로 분해시킨 다음, AOX1 프로모터 영역이 없는 8.1kb 단편을 알칼린 포스파타제로 처리하여 회수한다. 이 단편을 1.5kb AOX2 프로모터 영역 단편에 연결한다. 즉, PC4130-기원한 (천연) AOX2 프로모터의 조절하에 HSA를 발현시키는 플라스미드 pMM041 및 GCP101-기원한 (돌연변이) AOX2 프로모터의 조절하에 HSA를 발현시키는 플라스미드 pMM042를 작제한다 (참조 : 제8도).
pPG002, pMM041 및 pMM042를 각각 효소 StuI으로 분해시켜 선형으로 만들고 (이들 플라스미드는 HIS4 영역의 단일 분해 부위에서 분해된다) GTS115내로 도입시킨다. 이에 따라, 그 플라스미드들은 동종 재조합의 결과로서 GTS115 내로 his4 영역에 통합된다. 실시예 5와 동일한 방법으로 피키아 파스토리스를 형질전환시킨다.
사용된 평판은 히스티딘-요구성이기 때문에, 형질전환후 형성된 모든 콜로니는 형질전환체 콜로니로 여겨진다. 3G1 유리 필터를 통해 여과하여 아가를 제거하고, 각 여과물의 일부를 YPD 배지내에 접종시킨다. 30℃에서 밤새 배양한 후, 배양 브로쓰를 여러 배지(50㎖)에 분배하여 0.1의 초기 A540을 얻는다. 각 배양 브로쓰로부터 24시간 간격으로 샘플을 위하고, RPHA 방법(유럽 특허 제 122620호)을 이용하여 배양 상등물중의 사람 혈청 알부민 농도에 대해 검정한다.
PC4130-기원한 AOX2 프로모터에 의한 사람 혈청 알부민-생성 활성은 낮은 반면에, GCP101-기원한 AOX2 프로모터는 사람 혈청 알부민 생성-유도 활성에 있어서 AOX1 프로모터와 비교될 만하다. 이의 결과는 표 3에 제시한다.
[표 3]
[실시예 7]
[돌연변이 AOX2 프로모터를 사용한 HSA 생성주 제조]
pMM042를 StuI으로 분해시키고, 실시예 6에서와 같이 GTS115 균주에 도입시킨다. GTS115 균주의 his4 영역과의 동종 재조합을 통해 통합시키면, 몇몇 경우 형질전환 공정으로부터 둘 이상의 카피물이 통합되는 결과를 얻을 수 있다. 형질 전환후 형성된 각 콜로니를, 3G1 유리 필터를 통한 여과로 아가를 제거하여 수거하고, 여과물을 멸균수로 희석시켜 100개 세포/평판의 농도를 얻은 다음 희석물을 YNB W/O a.a. 평판(아미노산이 없는 0.7% 효모 질소 염기, 2% 글루코즈 및 1.5% 아가 분말)상에 도말한다. 30℃에서 3일간 배양하여 단일 콜로니를 형성시킨다.
이에 따라 수득된 10개 콜로니 각각으로부터 실시예 2와 동일한 방법으로 염색체 DNA를 추출한다. 프로브로서 피키아-유도된 염색체 HIS4 영역을 사용하여 써던 분석[참조: Southern. E. M., J. Mol. Biol., 98, 503(1975)]을 수행하고, 통합된 pMM042 카피물의 수를 측정한다. 즉, 5㎍의 각 염색체 DNA를 Bg1II로 분해시키고, 아가로즈 겔 전기영동시킨다. 겔을 0.2N HC1로 30분 동안 처리하고, 알칼린 변성 용액(0.2N NaOH와 0.6M NaCl)에 옮긴 다음, 반응 30분후 중화 용액[0.2M 트리스(pH 7.4), 0.6M NaCl]에 옮긴다. 중화 처리(30분)를 2회 수행한다. 통상의 방법으로 Hybond-N(Amersham 공급원)에 블롯팅을 수행한다.
피키아 파스토리스 HIS의 KpnI 단편(0.6kb)를 프로브로서 사용하기 위해 표지한다. 프로브 제조, 하이브리드화 및 세정을 DNA 표지 및 DIG-ELISA용 검출 키트(Boehringer Mannheim-Yamanouchi 제조원) 및 이에 부착된 설명서를 이용하여 수행한다. GTS 115의 경우, 제9(a)도에 나타나 있는 바와 같이 2.7kb HIS4 영역을 갖기 때문에 2.7kb 밴드로 나타나야 한다. GTS115의 his4 영역내로 pMM042의 1개 카피물을 통합시킨 결과 7.8kb 밴드 및 4.5kb 밴드가 나타날 수 있다. 동일한 방법으로 pMM042의 2개의 카피물을 통합시킨 결과 7.8kb 및 4.5kb 이외에 또 다른 9.6kb 밴드가 나타난다. 3개의 카피물을 통합시킨 결과는 7.8kb 및 4.5kb 밴드 뿐만 아니라 9.6kb 밴드가 이중 밀도로 나타난다. 4개의 카피물을 통합시킨 결과는 동일한 분자량 밴드가 삼중 밀도로 나타난다.
pMM042는 his4 영역에서 GTS115내로 삽입된 것으로 밝혀졌다. pMM042 카피물 수가 1 내지 4개로 변화하는 균주를 수득하였다. 이들 가운데, 한 개 카피물의 통합으로 수득된 균주중 하나를 UHG42-15로 명명하였고, 2개 카피물의 통합으로 수득한 균주중 하나를 UHG42-3으로 명명하였으며, 3개 카피물의 통합으로 수득한 균주중 하나를 UHG42-12로 명명하였다[참조: 제9(b)도 내지 (d)도].
클론으로 분리시킨 후, UHG42-15, UHG42-3 및 UHG42-12를 HSA 생산성에 대해 평가한다. 이들을 YPD 배지에 접종하고, 30℃에서 밤새 배양한다. 각 배양 브로쓰를 50㎖의 2% MeOH-YP 배지에 접종하여 초기 OD540가 1이 되도록 한다. 배양 브로쓰 샘플을 24시간 간격으로 취하고, 각 배양 상등물중의 사람 혈청 알부민의 농도를 RPHA 방법(참조: 유럽 특허 제122620호)으로 측정한다.
표 4에 수록된 바와 같이, UHG42-15는 80㎎/ℓ의 최대 HSA 생산성을, UHG42-3은 100㎎/ℓ의 최대 HSA 생산성을, UHG42-12는 160㎎/ℓ의 최대 HSA 생산성을 제공하였다. 생산성이 높은 균주를 클로닝시켜 수득하였으며, 생산성은 카피물의 수가 증가함에 따라 커진다. 다시 말해서, GCP101-기원한(돌연변이) AOX2 프로모터를 사용하여 HSA 발현을 유발시키는 플라스미드 pMM042를 이용하여 HSA의 생산성이 높은 균주를 수득할 수 있었다.
[표 4]
본 발명에 따라 수득된 돌연변이 AOX2 프로모터는 천연(야생형) 프로모터와 비교하여 현저히 증가된 프로모터 활성을 갖는다. 이러한 돌연변이 프로모터를 사용함으로써, 이종 단백질을 다량으로 발현시킬 수 있다. 그러므로, 본 발명의 프로모터는 유전공학 분야에서 신규의 발현 시스템으로서의 중요성을 갖는다.
본원에 기재된 모든 문헌은 참조문헌으로 도입된다.
본 발명은 이의 특정 실시예를 참고로 하여 상세히 설명되고는 있지만, 당업자에게는 누구나 본 발명의 취지 및 영역을 벗어나지 않고서 여러 가지 변화 및 변형을 수행할 수 있음이 자명할 것이다.
서열목록.
서열동정번호 : 1
서열길이 : 1528
서열유형 : 핵산
본쇄형 : 이본쇄
서열형태 : 선형
분자형 : 다른 핵산. 플라스미드 DNA
특징 :
명명/주요점 : 프로모터
동정방법 : E
서열 기술 :
서열동정번호 : 2
서열길이 : 1089
서열유형 : 핵산
본쇄형 : 이본쇄
서열형태 : 선형
분자형 : 다른 핵산. 플라스미드 DNA
특징 :
명명/주요점 : 프로모터
동정방법 : E
서열기술 :
서열동정번호 : 3
서열길이 : 1528
서열유형 : 핵산
본쇄형 : 이본쇄
서열형태 : 선형
분자형 : 다른 핵산. 플라스미드 DNA
특징 : 명명/주요점 : 프로모터
동정방법 : E
서열기술 :
서열동정번호 : 4
서열길이 : 1547
서열유형 : 핵산
본쇄형 : 이본쇄
서열형태 : 선형
분자형 : 다른 핵산. 플라스미드 DNA
특징 :
명명/주요점 : 프로모터
동정방법 : E
서열기술 :
서열동정번호 : 5
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서열유형 : 핵산
본쇄형 : 일본쇄
서열형태 : 선형
분자형 : 다른 핵산. 합성 DNA
특징 :
명명/주요점 : 프라이머 결합
동정방법 : E
서열기술 :
서열동정번호 : 6
서열길이 : 26
서열유형 : 핵산
본쇄형 : 일본쇄
서열형태 : 선형
분자형 : 다른 핵산. 합성 DNA
특징 :
명명/주요점 : 프라이머 결합
동정방법 : E
서열기술 :
서열동정번호 : 7
서열길이 : 19
서열유형 : 핵산
본쇄형 : 이본쇄
서열형태 : 선형
분자형 : 다른 핵산. 추가 DNA
특징 :
명명/주요점 : 삽입 서열
동정방법 : E
서열기술 :

Claims (11)

  1. 서열 동정 번호 : 1의 천연의 AOX2 프로모터로 이루어지고, i) 서열 동정 번호 : 1의 749번 내지 1187번 염기를 결실하고 있는 돌연변이; ii) 서열 동정 번호 : 1의 1274번 염기(T)가 염기(C)로 치환된 돌연변이 또는 iii) 서열 동정 번호 : 1의 1314번 및 1315번 염기 사이에 서열 동정 번호 : 7의 서열이 삽입된 돌연변이 중 하나 이상을 포함하는 돌연변이 AOX2 프로모터.
  2. 제1항에 따른 돌연변이 AOX2 프로모터를 포함하는 플라스미드.
  3. 제2항에 있어서, 돌연변이 AOX2 프로모터에 작동적으로 연결된 이종 단백질에 대한 유전자를 포함하는 발현 플라스미드인 플라스미드.
  4. 제3항에 있어서, 이종 단백질에 대한 유전자가 사람 혈청 알부민(HSA)에 대한 유전자인 플라스미드.
  5. 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 효모 세포내에 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 플라스미드를 포함하는 형질전환된 피키아파스토리스 효모 숙주.
  6. 제1항에 따른 돌연변이 AOX2 프로모터에 작동적으로 연결된 이종 단백질에 대한 유전자가 포함된 발현 플라스미드를 포함하는 제5항에 따른 형질전환 숙주를 배양함을 포함하여 이종 단백질을 생산하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 메탄올의 존재하에서 야생형 효모의 성장 속도와 비교하여 효모의 성장 속도를 증가시키는 프로모터.
  8. 제1항에 있어서, 서열 동정 번호 : 2, 서열 동정 번호 : 3 및 서열 동정 번호 : 4 중에서 선택된 서열을 갖는 프로모터.
  9. 염색체상에 제1항에 따른 돌연변이 AOX2 프로모터의 조절하에 있는 AOX2 유전자를 갖는 피키아 파스토리스 효모 균주.
  10. 염색체상에 서열 동정 번호 : 1의 천연 AOX2 프로모터의 조절하에 있는 AOX2 유전자를 갖는 피키아 파스토리스 효모 균주를 메탄올-함유 배지내에서 배양한 후, 배양된 피키아 파스토리스 효모 균주를 분리함을 포함하여, 염색체상에 제1항에 따른 돌연변이 AOX2 프로모터만의 조절하에 발현되는 AOX2 유전자를 갖는 피키아 파스토리스 효모 균주를 수득하는 방법.
  11. 프로모터에 작동적으로 연결된 이종 단백질에 대한 유전자가 포함된 발현 플라스미드를 포함하는 제9항에 따른 피키아 파스토리스 균주를 배양함을 포함하여, 이종 단백질을 생산하는 방법.
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