CN1308452C - 一种含有改组乙醇氧化酶启动子的毕赤酵母植酸酶表达系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含有改组乙醇氧化酶启动子的毕赤酵母植酸酶表达系统，该表达系统中采用经过DNA改组突变和筛选得到的AOXI启动子，能够利用葡萄糖作为碳源，在简便的发酵条件获得酸性植酸酶的高效表达，从整体上降低生产成本。

Description

一种含有改组乙醇氧化酶启动子的毕赤酵母植酸酶表达系统

技术领域

本发明涉及甲醇酵母表达系统，具体涉及含有改组乙醇氧化酶启动子的毕赤酵母植酸酶表达系统。

背景技术

酵母作为一类外源基因的表达系统具有很多优点，酵母属于单细胞生物又具有真核生物的细胞结构，因而即保留了细菌易于操作和生长快速的特点，又具有糖基化、脂肪酰化、蛋白质磷酸化等翻译后修饰功能。大部分重组蛋白的表达以酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)为宿主表达系统。然而酿酒酵母表达蛋白通常存在产量低，自我复制表达型载体在细胞传代中不稳定，外源蛋白过糖基化作用等局限性。

甲醇酵母是上世纪七十年代初期在研究利用甲醇为单一碳源和能量来源产生单细胞蛋白的过程中被发现的。甲醇酵母分为四类：毕赤酵母属(pichia)、汉逊酵母属(hansenula)、念珠菌属(candida)和球拟酵母属(torulopsis)。其中以毕赤酵母属(pichia.pastoris)的遗传背景以及生理特征研究得较为透彻。甲醇酵母是一种甲基营养型酵母，在缺乏葡萄糖、甘油等抑制性碳源时，能利用甲醇作为唯一碳源。它含有乙醇氧化酶基因，其强的启动子受到甲醇的严格调控，可以用来驱动外源蛋白的高效表达。

近年来，甲醇酵母系统由于其在蛋白表达方面所具有的优点而得到广泛的应用。甲醇酵母系统是一种真核表达系统，可以对表达的蛋白进行加工折叠和翻译后修饰；具有很高的表达量，已经达到了14.8g/L；节省成本，只需要简单的培养基；可以高密度发酵；背景杂蛋白少，表达产物容易纯化。

毕氏酵母(Pichia pastoris)系统是近年来发展很快的一个真核表达系统，许多有活性的蛋白质已经在毕氏酵母系统中大量表达。毕氏酵母表达系统是真核表达系统，可以对表达的蛋白质进行加工折叠和修饰，还具有发酵方法成熟、发酵密度高、培养简单廉价、外源蛋白质既可以胞内积累又可分泌；表达产量高、背景蛋白质少易于表达产物纯化等优点。

DNA改组是在与基因相关的DNA片段群体中，由于大量的随机相互参入而导致的重组或突变。20世纪80年代，Leder提出DNA改组(DNA shuffling)概念，期望能通过发现一个新的遗传系统增加基因DNA甚至RNA的改变。Stemmer建立了DNA改组的成熟技术，之后该技术发展迅速，利用该技术可以大大提高基因功能和改变基因的编码和结构，突变后的基因在序列、结构、功能上均显著区别于原来基因。短短二十年间，利用该技术在已成功地对许多功能基因进行了改造，取得了一系列研究成果，例如，获得了提高32000倍的β-内酰胺酶(β-lactamase)及荧光强度超过野生型45倍的绿色荧光蛋白(GFP)。通过DNA改组方法，Crameri等得到了高抗砷酸盐(arsenate)的菌株；Matsumura等成功对GUS基因进行突变，获得了在用戊二醛或甲醛固定植物材料中，GUS活性稳定的β-葡萄糖苷酸酶。

目前可用于甲醇酵母表达的启动子有很多，其中大多数来源于甲醇酵母本身，如AOX1、AOX2、DAS、P40、GAP、FLD等。不同的启动子根据其在天然转录的蛋白在酵母中的作用不同而强弱不同。其中乙醇氧化酶启动子(AOX1)是使用最多、表达效率最高的一个启动子。在乙醇氧化酶启动子被分离、克隆，并建立了转化方法后，毕氏酵母已被发展成为一种高效的外源蛋白表达宿主。近年来，许多蛋白质在毕氏酵母中实现了高效表达，达到了克级水平，部分达到了十几克的高表达；但仍然有多种的蛋白质表达量相对较低。提高毕氏酵母外源蛋白质的表达量是降低工业化生产成本的关键。在菌株、培养条件、发酵等逐渐成熟的情况下，构建高表达的载体是提高外源基因表达量的一个关键因素。

乙醇氧化酶启动子(AOX1)控制着乙醇氧化酶的表达机制，而乙醇氧化酶可催化甲醇的代谢反应。由于AOX1表达系统中需要使用甲醇，鉴于甲醇对细胞的毒性和甘油对甲醇诱导的弱抑制等因素，在发酵过程中必须先经过1-2天的甘油生长阶段，再通过补加甘油和其它成分，以及通过控制溶解氧含量和发酵环境的PH使细胞生长到合适的密度，最后才逐渐补加甲醇进行诱导表达。发酵过程中必须使细胞处于一段“饥饿期”，消耗发酵环境中的甘油。整个发酵周期需要10天左右，发酵过程较难控制。而且发酵过程中大量使用甘油。

葡萄糖的成本远远小于甘油，用葡萄糖替代甘油作为碳源，可以节约发酵成本。但由于葡萄糖是表达的阻遏物，当AOX启动子用葡萄糖进行甲醇酵母发酵时，用甲醇诱导效果较低，因此必须去除发酵液中痕量的葡萄糖，才能够获得好的诱导表达效果，因而目前一般难以实现用葡萄糖作为碳源。寻找和发掘新的更好的甲醇酵母启动子具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含有改组乙醇氧化酶启动子的毕赤酵母植酸酶表达系统，该表达系统中采用经过DNA改组突变和筛选得到的AOX1启动子，能够利用葡萄糖作为碳源，在简便的发酵条件获得外源蛋白的高效表达，从整体上降低生产成本。

本发明所提供的植酸酶表达系统包括：(1)含有改组乙醇氧化酶启动子的甲醇酵母表达载体pYPX99质粒；(2)宿主毕赤酵母[Pichia pastoris(His-Mut+)]。

本发明毕赤酵母植酸酶表达系统的构建方法由下列步骤组成：

1、乙醇氧化酶启动子(AOX1)突变体库的构建；

本步骤通过DNA突变过程，包括AOX1启动子DNA片段的扩增，AOX1启动子DNA片段PCR产物用DNA酶降解得到小片段，小片段进行无引物的PCR扩增以及取无引物PCR产物为模板进行引物PCR扩增四步，获得AOX1启动子DNA片段的突变体库。

(1)AOX1启动子DNA片段的扩增：

根据基因库Z46233(查阅网址： http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)公布的乙醇氧化酶启动子核苷酸序列(见图1)，合成两个寡核苷酸引物。以含有AOX1启动子的质粒pPIC9为模板，扩增得到长度为940bp左右的AOX1启动子DNA片段。

(2)回收DNA，回收的AOX1启动子DNA片段用DNA酶进行降解，形成弥散的片段，通过透析袋回收30-50bp的小片段。

(3)回收产物进行无引物PCR扩增，形成200-400bp的弥散条带。

(4)取无引物扩增产物为模板，加入引物进行PCR扩增，其扩增产物即为AOX1启动子DNA片段的突变体库。

2、含AOX1启动子DNA片段的突变体库的甲醇酵母表达载体pYPX99质粒的构建：

本步骤是将回收的AOX1启动子DNA片段的突变体库经过BglII和HindIII双酶切后，植入含有报告基因酸性植酸酶的甲醇酵母表达载体pPIC9中，构建形成pYPX99质粒，其构建策略见图7。该质粒可以通过检测酸性植酸酶的活性筛选所需要的改组AOX1启动子。

3、阳性酵母菌的筛选：

本步骤是将含有报告基因酸性植酸酶及突变的AOX1启动子库的表达载体pYPX99质粒转入宿主菌毕氏酵母[Pichia pastoris(His-Mut+)]，在以葡萄糖为碳源的培养基中培养，筛选得到良好表达酸性植酸酶的阳性酵母菌。

(1)将构建好的含有报告基因酸性植酸酶的及突变的AOX1启动子库的表达载体pYPX99质粒通过电击转化大肠杆菌菌株DH5α，转化物涂布在含有氨苄青霉素的2YT培养基上，37℃培养过夜，进行建库，获得大于10⁸个转化子。

(2)将库进行质粒抽提，后电泳鉴定。

(3)用限制性内切酶BglII对抽提质粒进行酶切，酶切产物电击转化毕氏酵母菌株[Pichia pastoris(His-Mut+)]，将转化子在含有葡萄糖为碳源的培养基中培养，离心去除培养基中的葡萄糖成分，进行表达筛选，获得良好表达酸性植酸酶的阳性菌株。

本发明所构建的改组AOX1启动子的测序与分析：

利用PCR方法，从筛选得到的毕赤酵母阳性菌株中扩增AOX1启动子，构建入克隆载体PMD18-T。经过DNA序列测定，得到全长的核苷酸序列。分析发现与原始的AOX1启动子核苷酸序列相比，核苷酸改动了48个，同源性为94.9％。

本发明所构建的改组AOX1启动子的核苷酸序列见图2。

附图说明

图1为基因库Z46233公布的乙醇氧化酶启动子核苷酸序列。

图2为改组后的乙醇氧化酶启动子核苷酸序列。

图3为引物核苷酸序列。

图4为PCR扩增AOX1启动子DNA产物琼脂糖电泳鉴定图谱，其中左列为DNA长度标记，右列为PCR扩增AOX1启动子DNA产物电泳条带，该条带大小为938bp。

图5为用DNA酶对PCR扩增AOX1启动子DNA产物进行降解的结果丙烯酰胺电泳鉴定图谱，其中左列为降解产物电泳条带，右列为DNA长度标记。

图6为降解产物的无引物扩增结果的琼脂糖电泳鉴定图谱，其中左列为DNA长度标记，右列为无引物扩增产物电泳条带。

图7为有引物PCR扩增得到的AOX1启动子DNA片段的突变体库的琼脂糖电泳鉴定图谱，其中左列为DNA长度标记，右列为AOX1启动子DNA片段的突变体库的电泳条带。

图8为pYPX99质粒构建策略图。

图9为毕赤酵母表达酸性植酸酶活性试验结果图，其中1表示用甘油进行发酵的含有常规AOX1启动子的毕赤酵母，2表示用葡萄糖进行发酵的含有改组AOX1启动子的毕赤酵母。

有益效果：

1、本发明提供的含有改组乙醇氧化酶启动子的毕赤酵母植酸酶表达系统对酸性植酸酶有高效表达性。

2、本发明表达系统采用经过DNA改组突变和筛选得到的AOX1启动子，能够利用葡萄糖替代甘油作为碳源，节约了发酵成本，缩短发酵周期，从整体上降低生产成本。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。

下述实施例中，所用的试验材料及其来源包括：

质粒pPIC9、大肠杆菌菌株DH5α：购自Invitrogen公司；

毕氏酵母菌株[Pichia pastoris(His-Mut+)]购自美国种质保藏中心(ATCC)；

ABI PRIAM Big-Dye Terminator DNA测序试剂盒：购自美国应用系统公司；

质粒PMD18-T、限制性内切酶XhoI和NotI；BglII和HindIII酶、Taq聚合酶、脱氧核糖核酸酶(DNase I)、连接酶、dNTP、10×PCRbuffer：购自宝生物工程大连有限公司。

下述实施例中常规的基因操作参照有关文献，其中引物PAGE纯化、透吸袋回收DNA、DNA测序、质粒碱法抽提方法参照分子克隆文献Sambrook J，Frets E F，Mannsdes T et al.In：Molecular Cloning.2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.植酸酶酶活的测定参照van der Heeft.Phytase activity，vanadate manual method.Gist-brocades methodNr，1995，61696(41)，2832)；酵母DNA抽提参照Adams，A.，Gottschling，D.E.，Kaiser，C.A.andStearns，T.(1998)Methods in yeast genetics：A Cold Spring Harbor laboratory course manual.Cold Spring Harbor laboratory press。

实施例1  PCR扩增AOX1启动子DNA片段

(一)试验方法：

1、寡核苷酸引物的合成

1)根据基因库Z46233(查阅网址： http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)公布的乙醇氧化酶启动子核苷酸序列，设计两个寡核苷酸引物，分别编号为A1、A2。为了便于克隆和构建，在引物的5’端分别加上了BglII和HindIII酶切位点序列。所设计的引物序列具体见图3：

2)引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

3)参照分子克隆文献方法进行PAGE纯化。

2.PCR扩增反应：

引物：A 15’aagatctctgaaaaataacagttattatt 3’

      A 25’aaagcctatctctcaagttgtcgtt 3’

pPIC9质粒模板：1μl；A1：10.2ng；A2：0.2ng；10×PCR buffer：5μl；dNTP(2.5mmol/L)：4μl；Taq聚合酶：2U；加ddH₂O至终体积为50μl。

反应程序为94℃10min预变性，94℃变性30s，72℃复性和延伸2min，共30循环。

采用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，用透吸袋法回收得到938bp的基因片段。

3、DNA序列的测定：

采用双脱氧核苷酸终止法，用ABI PRIAM Big-Dye Terminator DNA测序试剂盒，在ABI377型DNA自动化荧光测序仪上进行双链DNA序列的测定。

(二)试验结果：

1、采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的结果见图4。

2、AOX1启动子测序结果：用PCR法扩增得到AOX1启动子的DNA序列与基因库Z46233公布的序列比较，结果完全一致。

实施例2  乙醇氧化酶启动子(AOX1)突变体库的构建：

(一)试验方法：

1、AOX1启动子DNA片段的DNase I降解及回收

1)DNase I降解：

用100μl DNase I缓冲液溶解实施例1所回收的AOX1启动子DNA片段，加入0.1UDNase I，25℃处理15min后70℃处理10min(失活DNA酶)。采用10％丙烯酰胺凝胶电泳鉴定降解产物。本步骤中，DNase I缓冲液的组成为：50mmol/L Tris-Cl pH7.4+1mmol/L MgCl₂

2)降解产物回收：

用透吸袋法回收得到10～50bp的小片段。用10μl 10×无引物PCR缓冲液(50mmol/LKCl+10mmol/LTris-Cl pH9.0+1％Triton)溶解沉淀。

2、降解产物的无引物PCR扩增：

反应体系：

降解小片段DNA模板：5μl；dNTPs(2.5mmol/L)：4μl；MgCl₂(2.5mmol/L)：4.5μl；Ex-Taq聚合酶：2U；加ddH₂O至终体积为50μl。

反应程序为：94℃30s，40℃30s，72℃30s，共45个循环。

采用2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，用透吸袋法回收DNA。

3、无引物PCR扩增产物的引物PCR扩增：

无引物PCR扩增产物模板：5μl；A1：10.2ng；A2 0.2ng；10×PCR buffer：5μl；dNTPs(2.5mmol/L)：4μl；Pyrobest-Taq聚合酶：2U；加ddH₂O至终体积为50μl。

反应程序为：94℃30s，70℃30s，72℃1min，共35个循环。

1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收DNA。

(二)试验结果：

1、采用丙烯酰胺凝胶电泳鉴定降解产物的结果见图5。从图5可以看出，AOX1启动子DNA片段经DNase I降解后，形成长度为30-50bp的弥散小片段。

2、采用琼脂糖凝胶电泳检测降解产物的无引物PCR扩增结果见图6。从图6可以看出，降解产物经无引物PCR扩增后，形成长度为200-400bp的弥散片段。

3、用琼脂糖凝胶电泳检测引物PCR扩增结果见图7。从图7可以看出，无引物扩增产物经过引物PCR扩增后，得到长度为938bp的片段。此片段即为AOX1启动子的突变体库。

实施例3  含AOX1启动子DNA片段的突变体库的甲醇酵母表达载体pYPX99M质粒及突变体库转化子的构建

1、pYPX99质粒的构建

按Sambrook分子生物学基本操作(Sambrook J，Frets E F，Mannsdes T et al.In：Molecular Cloning.2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.)，先通过XhoI和NotI将将甲醇酵母表达载体pPIC9酶切，用T4DNA连接酶连接将酸性植酸酶基因AF542235(查阅网址： http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)连接进去，在AOX1启动子的突变体库DNA片段和甲醇酵母表达载体pPIC9质粒分别用BglII和HindIII酶切，透吸袋法回收酶切产物，其中回收AOX1启动子的突变体库DNA片段酶切产物长度为938bp，pPIC9酶切产物长度为9kb左右，用T4DNA连接酶连接，所得到的连接产物即为含AOX1启动子DNA片段的突变体库的甲醇酵母表达载体pYPX99质粒。其质粒构建策略图见图8。

2、突变体库转化子的构建

将构建好的pYPX99质粒通过电击转化大肠杆菌菌株DH5α，转化物涂布在含有氨苄青霉素的2YT培养基上，37℃培养过夜，待长出克隆后，刮取全部的克隆进行质粒碱法抽提获得含改组突变的AOX1启动子，以酸性植酸酶为报告基因的突变体库转化子，本步骤中得到的转化子数量多达10⁸个。

实施例4  阳性酵母菌的筛选

1、宿主酵母的预处理：

将活化的毕赤酵母置于500mL YPD培养基(配方：20g/L蛋白胨、10g/L酵母提取物、20g/L葡糖糖)中30℃培养18小时，至A值达到1.7，5000r/min离心10分钟收集菌体，先后用0℃预冷的500mL、250mL无菌水洗菌体，离心10分钟，去上清液，用20mL0℃预冷的1mol/L山梨醇悬浮菌体。5000r/min离心10分钟离心后菌体再用0.5mL0℃预冷的山梨醇悬浮，用于电击备用。

2、转化子培育：

大量抽提酵母表达质粒，BglII酶切回收小片段，取2μg线性化片段加入50μL感受态细胞，冰浴5min，用Bio-Red GenePulser电击仪电击，参数为2.5kV，25μF。电击结束后，立即加入1.0mL 0℃预冷的1.0mol/L山梨醇，取200μL涂布于固体选择培养基平板上，30℃培养直至转化子出现。培养基的组成为：186g/L山梨醇、20g/L葡萄糖、13.4g/L酵母氮源基础培养基(YNB)、0.05g/L谷氨酸、0.05g/L甲硫氨酸、0.05g/L赖氨酸、0.05g/L亮氨酸、0.05g/L异亮氨酸、20g/L琼脂糖。

3、阳性酵母菌的筛选：(在本步骤中如何体现甲醇诱导发酵？

将大量的转化子接种到以葡萄糖为碳源的培养基(13.4g/LYNB、0.4mg/L生物素、200g/L葡萄糖)中进行生长，30℃，200rpm，经过2天培养至OD600达到2.0左右。通过5000r/min离心10分钟离心收集菌体，在去除葡萄糖的培养基(13.4g/L YNB、0.4mg/L生物素)中进行2天30℃，200rpm，培养表达。经过对108个转化子植酸酶酶活的测定，从中得到一株酸性植酸酶表达最好的阳性菌株，编号为ps-1，其酶活在试管中达到150FTU/mL。将阳性菌株ps-1接种200ml YPD培养基YPD(蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，葡糖糖20g/L)，30℃，200rpm，经过2天培养至OD600达到2.0左右，转入B.Braun 5L发酵罐中进行高密度发酵，以YPD培养重组酵母，利用氨水控制pH值为5.5，发酵过程中含氧量控制在20％，培养过程中补加40％葡萄糖溶液，培养140h，测定酸性植酸酶的表达量为3900U/mL。

实施例5  毕赤酵母的酸性植酸酶表达试验

(一)试验方法

1、试验组：

对照组：含有原始AOX1启动子的毕赤酵母

本发明试验组：实施例4筛选得到的阳性菌株ps-1

2、操作步骤：

1)对照组菌株的构建：通过XhoI和NotI将购得的含有原始AOX1启动子的毕赤酵母表达载体pPIC9酶切，用T4DNA连接酶连接将酸性植酸酶基因AF542235(查阅网址：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)连接进去构建完成含有原始原始AOX1启动子和酸性磷酸酶报告基因的表达载体pPIC9。

2)将构建好的pPIC9质粒通过电击转化大肠杆菌菌株DH5α，转化物涂布在含有氨苄青霉素的2YT培养基上，37℃培养过夜，待长出克隆后，刮取菌落，通过碱法抽提质粒，参照实施例4的步骤1-2的方法获得含有原始AOX1启动子的毕赤酵母转化子。

3)对照组菌株的发酵与表达：对照组的培养条件是先将转化子接种到以甘油为碳源的培养基(13.4g/L YNB、0.4mg/L生物素、200g/L甘油)中进行生长，30℃，200rpm，经过2天培养至OD600达到2.0左右，转入B.Braun 5L发酵罐中进行高密度发酵，以以甘油为碳源的培养基(13.4g/L YNB、0.4mg/L生物素、200g/L甘油)培养重组酵母，利用氨水控制pH值为5.5，发酵过程中含氧量控制在20％，培养90h，甘油耗尽，再加入0.5％甲醇，30℃诱导培养，诱导时间为60小时，总的发酵时间为140小时。对照组的酸性植酸酶表达量为5600U/mL。

试验组的发酵与表达同实施例4。

(二)试验结果

酸性植酸酶的表达结果见图9。如图9所示，对照组的酸性植酸酶表达量为5600U/mL；本发明试验组的酸性植酸酶的表达量为3900U/mL，利用前期用葡萄糖进行菌体生长，后期通过去除培养基中的葡萄糖成分进行诱导表达的方式，本发明提供的毕赤酵母阳性菌株对酸性植酸酶的表达量为常规方法的69.6％。可见，本发明提供的含有改组乙醇氧化酶启动子的毕赤酵母植酸酶表达系统能够利用葡萄糖替代甘油作为碳源，节约了发酵成本，缩短发酵周期，而对酸性植酸酶有良好的表达性。

实施例6  改组AOX1启动子的测序与分析

1)酵母DNA抽提：通过酵母DNA抽提方法(参照Adams，A.，Gottschling，D.E.，Kaiser，C.A.and Stearns，T.(1998)Methods in yeast genetics：A Cold Spring Harbor laboratory course manual.Cold Spring Harbor laboratory press.)获得含有改组AOX1启动子的阳性菌株的DNA。

2)克隆入PMD-18载体：

将抽提得到的改组AOX1启动子基因片段10μl，PMD-18载体1μl，T4DNA连接酶1μl，buffer 3μl，无菌水15μl混合后存放于4℃冰箱过夜。

通过化学法转化大肠杆菌DH5a(参照分子克隆文献：Sambrook J，Frets E F，MannsdesT et al.In：Molecular Cloning.2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.)。

3)碱法抽提质粒，通过BglII和HindIII酶切鉴定，得到载体为2.8kb左右，片段为950bp左右的正确克隆。测序结果见图2。

比较图1和图2可见，本发明提供的改组AOX1启动子核苷酸序列与原始AOX1启动子相比，具有94.9％的同源性，改动的核苷酸达48个。

                            序列表

<110>上海永业农科生物工程有限公司

<120>一种含有改组乙醇氧化酶启动子的毕赤酵母植酸酶表达系统

<130>ZP041084

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>938

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(938)

<223>双链DNA分子，启动子作用，通过DNA改组而来，含有A、T、G、C四种常规碱基

<400>1

ctgaagaata atagttaata ttcgagatgt aacatccaca gacgaaaggt tgaatgaaac  60

ctttttgcca tacgacatcc acacgtccat tctcacaaat aagtgccaaa cgcaactgga  120

ggggatacgc tagcagcaga cctttgcaaa cgcaggacct ccactcctct tctgctcaac  180

acccactttt gccgtcgaaa aaccagccca gttattgggc ttgattggag ttcgctcgtt  240

ccaattcctt ctattaagct actaacatta tgactttatt agcctgtcta tcctggctcc  300

cctggcgagg ttcatgtttg tatatttccg aatgcaacaa gctccgcatt agacccgaac  360

atcactccag gtgagggctt tctgagtgtg gggtcaaata gtctcatgtt ccccaaatgg  420

tccaaaactg acagtttaca cgctgtcttg caacctaata tgtcaaaagc gtgatctcat  480

acaagatgaa ctaagtttgg ttcgttgaaa tgccaacggc cagttggtca ataagaaact  540

tccaaaagtc gccataccgt atgtcttgtt tgatattgat tgacgaatga tcaggaataa  600

tctcattaat gcttagcgca gtctctctag cgcttctgaa ccccggtgca cctgtgccga  660

aacgcaaatg gcgaaacacc cgctttttgc atgattatgc attagctcca cattgtatgc  720

ttccaagatt ctggtgggaa tactcgtgat agcctaacgt tcatgatcat aatttaactg  780

ttctaacccc tacttgacag caatatataa acataaggaa gctgccctgt cttaaacctt  840

tttttttatc atctttatta gcttactttc ataattgaga ctggttccaa ttgacaagct  900

tttgatttta acgacactta acgacaactt gagaagat                          938

Claims (5)

1、一种含有核苷酸改动48个的改组乙醇氧化酶启动子的毕赤酵母植酸酶表达系统，其特征在于包括：(1)含有改组乙醇氧化酶启动子的甲醇酵母表达载体pYPX99M质粒；(2)宿主毕赤酵母Pichia pastoris。

2、根据权利要求1所述的含有改组乙醇氧化酶启动子的毕赤酵母植酸酶表达系统，其特征在于改组乙醇氧化酶启动子的核苷酸序列与原始乙醇氧化酶启动子相比，具有94.9％的同源性，改动的核苷酸达48个，改组启动子具有如下序列：

ctgaagaataatagttaatattcgagatgtaacatccacagacgaaaggttgaatgaaacctttttgccat

acgacatccacacgtccattctcacaaataagtgccaaacgcaactggaggggatacgctagcagca

gacctttgcaaacgcaggacctccactcctcttctgctcaacacccacttttgccgtcgaaaaaccagc

ccagttattgggcttgattggagttcgctcgttccaattccttctattaagctactaacattatgactttatta

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3、一种甲醇酵母表达载体pYPX99M质粒，其特征在于含有酸性磷酸酶报告基因和核苷酸改动48个的乙醇氧化酶启动子DNA片段。

4、一种毕赤酵母菌株，其特征在于含有权利要求2所述的改组乙醇氧化酶启动子。

5、权利要求1所述的毕赤酵母植酸酶表达系统的构建方法，由下列步骤组成：

(1)、乙醇氧化酶启动子AOX突变体库的构建：通过DNA突变过程，包括AOX1启动子DNA片段的扩增，AOX1启动子PCR产物用DNA酶降解得到30-50bp的小片段，小片段进行无引物的PCR扩增得到200-400bp的片段以及取无引物PCR产物为模板进行引物PCR扩增，获得AOX1启动子DNA片段的突变体库；

(2)、含AOX1启动子DNA片段的突变体库的甲醇酵母表达载体pYPX99M质粒的构建：将回收的AOX1启动子的突变体库经过BglII和HindIII双酶切后，植入含有报告基因酸性植酸酶的甲醇酵母表达载体pPIC9中，构建形成pYPX99质粒；

(3)、阳性酵母菌的筛选：将构建好的含有报告基因酸性植酸酶的及突变的AOX1启动子库的表达载体pYPX99质粒通过电击转化大肠杆菌菌株DH5α，转化物涂布在含有氨苄青霉素的2YT培养基上，37℃培养过夜，进行建库，获得大于10⁸个大肠杆菌转化子，然后将库进行质粒抽提、用限制性内切酶BglII对抽提的质粒进行酶切，酶切产物电击转化毕氏酵母菌株Pichia pastoris，将毕氏酵母转化子在含有葡萄糖为碳源的培养基中培养，离心去除培养基中的葡萄糖成分，进行表达筛选，获得良好表达酸性植酸酶的阳性菌株。

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