CN1793375A - 重组人神经生长因子的酵母表达系统及制备重组人神经生长因子的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新的表达人神经生长因子的酵母表达系统，其具有表达产率高；产物具天然结构和生物活性，无需变性和复性；培养基简单、价廉；热源性物质减少；产率显著提高，生产成本大幅度降低等优点。本发明还提供了利用该表达系统制备人神经生长因子的方法。

Description

重组人神经生长因子的酵母表达系统及制备重组人神经生长因子的方法

技术领域

本发明涉及新的表达人神经生长因子(hNGF)的重组载体及其酵母表达宿主。

本发明还涉及利用该酵母表达系统的制备重组人神经生长因子的方法。

背景技术

人神经生长因子(human nerve growth factor，简称hNGF)是人体中一种对正常神经细胞有营养作用，对损伤神经修复机能有调节作用的生物活性因子，它可维持交感神经和感觉神经的生存，促进神经细胞的分化，决定轴突的伸展方向。对促进大脑的发育，神经系统的生长，损伤神经的再生和功能恢复具有决定性作用。

hNGF可应用于糖尿病性周围神经病变、老年痴呆病、帕金森氏病、面神经炎，以及神经损伤(包括脊髓损伤、高位截瘫、断指再植、脑损伤，周围神经损伤等中枢及外围神经系统的损伤)等神经系统疾病，是目前唯一可应用于临床的神经系统蛋白质因子。rhNGF在人体中含量甚微，天然来源几乎不可能。因此，用基因工程的方法生产重组人神经生长因子(rhNGF)是唯一的选择。

利用基因工程技术，以微生物为载体，生产外源蛋白具有广阔的应用前景。到目前为止，已发展了多种蛋白表达系统。大肠杆菌表达系统是研究得最清楚的一套原核表达系统，人们对它的遗传背景和生化特性了解得很透彻，而且大肠杆菌因其具有容易操作，生长迅速，营养需求简单等优点，得到了广泛的应用。但是这一系统本身也存在着若干缺陷：①缺少真核生物的蛋白翻译后修饰和加工，如剪切、糖基化、形成二硫键等；②表达的蛋白多以包涵体形式存在，需要经过复杂的复性才能恢复构象和活性；③背景杂蛋白很多，纯化较麻烦；④表达量一般不是很高。为了克服大肠杆菌表达系统的缺点，从二十世纪80年代开始，人们发展了酵母细胞表达系统。

酵母作为一种最简单的单细胞真核生物，兼有原核生物和真核生物的某些优点。酵母表达系统的优点：酵母是一种单细胞低等真核生物，培养条件普通，生长繁殖速度迅速，能够耐受较高的流体静压，用于表达基因工程产品时，可以大规模生产，有效降低了生产成本。酵母表达外源基因具有一定的翻译后加工能力，收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，性质较原核表达的蛋白质更加稳定，特别适合于稳定表达真核生物基因和制备有功能的表达蛋白质。酵母表达系统具有外分泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外，因此很容易纯化。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是最早用于表达外源蛋白的酵母菌。它具有繁殖速度快，能高密度发酵，可以进行蛋白翻译后的修饰、加工等优点。自1981年Hitzemom等用酿酒酵母表达人干扰素获得成功后(HitzemomR A，Hagie F E，et al，Nature，1981，293：717～722)，酿酒酵母还表达了多种原核和真核蛋白。但此系统也有其局限性，如缺乏强有力的启动子；分泌效率差；表达菌株不够稳定；表达质粒易于丢失；糖基化程度高；核心多糖末端存在α-1，3糖苷键，从而使得蛋白具有高度的抗原性，不适宜作治疗制剂等等。为了解决这些问题，人们发展了甲醇酵母表达系统。

甲醇酵母是一种甲醇营养型酵母，在缺乏抑制性碳源如葡萄糖、甘油时，能利用甲醇作为唯一碳源，它是在酿酒酵母的基础上发展起来的一种新型表达宿主。包括Pichia、Hansenula、Torulopsis、Candida等，其中以Pichiapastoris(巴氏毕氏酵母)为宿主建立的外源基因表达系统，近年来得到迅速发展和广泛应用。作为真核表达系统，甲醇酵母具有许多其他蛋白表达系统所不具有的优点，如具有强有力的乙醇氧化酶基因(AOX1)启动子，可严格调控外源蛋白的表达；可对表达的蛋白进行翻译后的加工和修饰，即二硫键的形成、脂肪的酰化、蛋白磷酸化、折叠、信号序列加工、N-糖基化、O-糖基化，从而使表达出的蛋白具有生物活性；在蛋白质诱导表达的过程中虽然以甲醇作为唯一的碳源，但不存在象细菌、动物细胞培养中的内毒残留问题；营养要求低，生长快，培养基廉价，便于工业化生产；可高密度发酵培养，蛋白产量高；表达量高；糖基化程度低；甲醇酵母自身分泌的蛋白少，表达产物较易分离纯化。

中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary Cell，CHO)是用于真核生物基因表达较为成功的宿主细胞。与其它表达系统相比，它具有许多优点：①准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近天然蛋白分子；②表达产物胞外分泌，便于分离纯化；③具有重组基因的高效扩增和表达能力；④贴壁生长，有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可进行悬浮培养或在无血清培养基中达到高密度，培养体积能达到1000L以上；⑤CHO细胞属于成纤维细胞，很少分泌内源蛋白，利于外源蛋白的分离纯化。根据CHO细胞表达系统的特点，已有越来越多的药用蛋白在其中获得了高效表达，部分药物已投放市场，如EPO、G-CSF等。但是，利用该表达系统进行蛋白表达时也存在着许多缺陷，如构建的重组CHO细胞生产效率低，表达产物浓度低；某些糖基化表达产物不稳定，不易纯化；重组CHO细胞上游构建与下游分离纯化易脱节，纯化较麻烦；表达周期长；重组细胞培养费用昂贵等等。因此，目前利用CHO细胞表达外源基因的技术尚不能满足生物药品的开发和生产的要求。

人神经生长因子，在国内外已经研究多年，国内基本上是从人血白细胞中直接提取DNA，进行克隆和表达。鉴于NGF具有广阔的临床应用前景，因而受到医学界与企业界的重视。在异源蛋白的表达中，大肠杆菌因其具有容易操作，生长迅速，营养需求简单等优点，已成功地表达了多种外源蛋白，但是，由于hNGF分子包含3对二硫键，若用大肠杆菌进行表达(白艳艳，杨吉成，等，苏州大学学报，2004，24(4)：466-468；刘东海，张更荣，等，中国病理生理杂志，2002，18(5)：486-489)，存在肽键不能有效折叠及二硫键容易错配等因素，而且，纯化时需经过变性和复性步骤，复性率很低。中国专利申请00111220.1公开了一种用二硫键异构酶PDI促进变性的重组人神经生长因子(rhNGF)正确折叠并提高其复性率的新型方法。在rhNGF的复性体系中加入一定比例的PDI，可以使rhNGF中错误配对的二硫键打开并形成正确的二硫键，从而提高复性率，降低异构体比例，提高rhNGF产率。然而，纯化仍然困难，成本居高不下，其产量和应用受到限制。虽然目前国内外对利用CHO细胞表达人神经生长因子进行了研究(付玲，于婷，等，军事医学科学院院刊，2003，27(4)：319-320；白艳艳，杨吉成，等，中国免疫学杂志，2003，19(5)：343-346)，但是由于CHO细胞表达系统存在的诸多缺陷而受到限制。巴氏毕氏酵母表达系统由于其独特的优越性而受到广泛的应用，已经表达了许多外源蛋白，而且，也有文献已经报道了人神经生长因子β亚基的基因在P.pastoris中的表达(范乔，刘宏迪，等，科学通报，1999，44(6)：637-642)。尽管其使用了甲醇营养型酵母GS115作为宿主细胞，但其所使用的质粒表达载体为pHIL-S1，该载体为外泌型表达载体，乙醇氧化酶AOX1启动子调控目的基因的表达，磷酸酶PH01信号肽基因位于目的基因的N端，并含有PHO1切割位点(如图1所示)。为使阅读框架一致，在hNGF编码序列N端加上二个碱基AA插入pHIL-S1的XhoI位点，构建了表达载体pSNGF。将该表达载体转入GS115构建的酵母转化子表达的目的蛋白占细胞总蛋白的14.4％，但未报道具体的rhNGF的表达量。

研究证明NGF虽然为一种糖蛋白，其功能同其N端糖基有关，但其糖基仅作为识别信息存在，许多基因工程产品证明不含糖基的亚基有较高的活性，因此提高表达的目的蛋白的生物学活性，并且同时使得筛选方法简单、易操作，筛选效果明显是设计NGF的引物序列和表达载体需要考虑的重要因素。

发明内容

本发明的目的在于本发明提供了新的含有重组人神经生长因子的表达载体及其转化的酵母表达系统(也称为表达宿主)。

本发明的另一个目的在于提供利用本发明的表达系统制备重组人神经生长因子的方法。

根据本发明的一方面，含有重组人神经生长因子的质粒表达载体pPKLNGF具有如图1所示结构，是将合成的hNGF基因序列插入pPIC9KL质粒中构建而成。其中pPIC9KL质粒是通过将商购的质粒pPIC9K经改造后而成，其具有单一的XhoI酶切位点，在hNGF基因的插入后，可表达出高活性的蛋白。

根据本发明的另一方面，提供含有本发明质粒载体的酵母表达宿主，将本发明构建的表达载体pPKLNGF转化酵母宿主即可获得本发明的表达hNGF的酵母表达系统，由酵母细胞中表达的优点不仅因为可以分泌hNGF，而且还因为它在实际上是呈准确折迭形式的并具有高度活性的。酵母宿主可以从巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、汉森酵母(H.Polymorpha)、假丝酵母(Candida)和球拟酵母(Torulopsi)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)等中选择，最优选的酵母宿主为巴斯德毕赤酵母，常用的毕赤酵母宿主菌有：GS115、KM71、KM71H、SMD1168和SMD1168H等等，其中优选毕赤酵母GS115。

根据本发明的再一方面，提供制备重组人神经细胞生长因子的方法，包括下述步骤：

1)将编码人神经生长因子的基因可操作地连接于表达载体pPIC9KL，构建表达人神经生长因子的重组表达载体；

2)用所述重组表达载体转化酵母宿主，构建表达人神经生长因子的酵母表达系统；

3)培养所述酵母表达系统，获得重组人神经生长因子。

其中，所述步骤1)包含下述步骤：

1.1)采用pPIC9KL质粒构建含单一XhoI酶切位点的质粒pPIC9KL；

1.2)将编码人神经生长因子的基因可操作地连接于表达载体，构建含有hNGF的重组表达载体pPKLNGF。

在上述方法步骤1.1)中，构建含单一XhoI酶切位点的质粒的步骤包括：

1.1.1)将质粒pPIC9K用Xho I酶酶切，经klenow酶补平后，用T₄DNAligase连接，转入大肠杆菌DH5α；

1.1.2)培养并收集菌体，提取质粒，测序，选择非polylinker 5’端的XhoI酶酶切位点切开并补平的质粒，获得pPIC9KL质粒。

在上述方法步骤1.2)中，含有hNGF的重组表达载体pPKLNGF的制备步骤包括：

1.2.1)以下述合成的核苷酸序列为引物：

引物1：5′CTCGAG AAA AGA TCT TCT TCT CAC CCA ATC 3′

引物2：3′CGCCGGCG AAT AGT AGA CTG TCG GAA AGA 5′

以正常人血白细胞基因组DNA为模板，分别进行PCR扩增；

1.2.2)从获得的PCR产物中回收合成的rhNGF DNA片断，插入载体pPIC9KL，获得含有hNGF的重组表达载体pPKLNGF。

本发明构建的含有hNGF的质粒表达载体通过对现有质粒的改造，获得的质粒pPIC9KL，其不仅具有α因子信号肽，而且经改造后其AOXI 3’端(即polylinker5’端)的XhoI位点就成为单酶切位点，使得rhNGF基因可以从此位点插入质粒载体，保证了阅读框架正确，酵母α因子信号肽切割后的第一个氨基酸即为rhNGF的第一个氨基酸ATG，从而酵母表达分泌的rhNGF是完整的，而且与天然hNGF N端氨基酸序列一致的蛋白质产品。

本发明针对酵母表达系统设计构建表达载体，制备出了表达hNGF的酵母表达系统，在酵母表达系统中不仅可以高效表达酵母表达质粒上的外源基因并将表达的外源蛋白hNGF分泌至细胞壁外的培养基中，而且表达产物具有天然蛋白结构和天然活性。酵母培养体系经济、简便，高密度发酵可得100克/升干重酵母，可提高产率，降低生产成本，比较适合于大规模工业化生产。

本发明选用的甲醇酵母表达体系以醇氧化酶为启动子，通过同源双交换使外源基因稳定地整合于酵母染色体，有效地避免了外源基因丢失。甲醇酵母不但能使表达产物糖基化，避免酿酒酵母的超糖基化作用，更重要的是它可将表达产物分泌于胞外，而且自身蛋白的分泌却很少，非常有利于下游的纯化设备。甲醇酵母能大量分泌异源蛋白。在甲醇酵母中，质粒也能发生高频整合，用一系列方法可增加拷贝数，提高产量。

本发明提供了一种用酵母分泌表达具天然蛋白结构和生物活性的rhNGF的新的表达系统。它与其它表达体系，如大肠杆菌表达体系和真核细胞表达体系相比具有以下优点：

①表达产率高；

②产物具天然结构和生物活性，无需变性和复性；

③培养基简单、价廉；

④热源性物质减少；

⑤产率显著提高，生产成本大幅度降低。

上述优势使本发明具有明显的技术创新性与工艺先进性，更适合于工业化生产重组人神经生长因子。按照本发明的表达系统和方法可以制备得到纯度大于99％，生物比活性高于10⁵U/mg蛋白的重组hNGF。

对比实验表明，酵母表达系统表达的rhNGF目的蛋白占细胞总蛋白的28.7％，纯度达98％以上，生物学活性高于1×10⁵U/mg，而现有的大肠杆菌表达系统表达的rhNGF，其纯度只能达到95％，生物学活性只有2×10⁴U/mg。现有的采用质粒表达载体pHIL-S1和GS115的酵母表达系统，其表达的目的蛋白占细胞总蛋白的14.4％。因此，本发明的表达系统能明显提供hNGF的表达量和表达蛋白的生物学活性。

为了更好地理解本发明的本质，下面结合附图，通过对本发明较佳实施方式的描述，详细说明但不限制本发明。

附图的简要说明

图1为本发明构建的表达质粒pPKLNGF的结构图；

图2为本发明获得的rhNGF的cDNA序列测定结果及对应的氨基酸序列；

图3为本发明获得的rhNGF的SDS-PAGE电泳图，其中，Marker为分子量标记，泳道1为酵母分泌上清，泳道2为纯化后的rhNGF；

图4为本发明获得的纯化的rhNGF免疫印迹鉴定结果，其中，泳道1为纯化的rhNGF，泳道2为阳性对照(重组人β-NGF，购自R&D)。

发明的具体实施方式

本发明所用的试验材料如无特别说明均为市售购买产品，各种试剂和培养基的成分和配制方法可以参见常规实验手册中的描述。

【实施例1】重组人神经生长因子毕赤酵母表达系统(pPKLNGF)的构建与表达

毕赤酵母(Pichia pastoris)是一种甲醇酵母，同动植物系统相比，它具有操作简单的优点；和原核生物大肠杆菌等不一样，毕赤酵母能对要表达的蛋白质进行正确折叠因而具备天然生物活性；此外，这种甲醇酵母能够实现高密度发酵，而且其转化子能够非常稳定地表达外源蛋白质，更适应工业化生产。因此本发明中选择毕赤酵母作为rhNGF的表达宿主菌。

1.hNGF基因的PCR扩增

1.1人血白细胞基因组DNA的提取

方法按常规提取方法进行：用右旋柠檬酸处理新鲜血液后，离心沉淀白细胞。将白细胞悬浮在抽提缓冲液中，37℃保温1h。加蛋白酶K水解蛋白质，酚抽提，乙醇沉淀。提取的DNA溶于TE(pH8.0)，-20℃保存。

1.2引物设计合成及PCR反应

为了获得hNGF的cDNA，本发明人采用全基因合成的方法进行克隆。序列设计参考文献报道的hNGF的基因序列(Ullrich A，Gray A，Berman C，et al，Nature，1983，Vol.303，821-825)。本发明人设计的5′和3′端序列分别含有酶切位点Xho I及酵母α因子信号肽切割位点AAA AgA，3′端序列含有酶切位点Not I及终止密码TGA TAA，以适应酵母表达载体pPIC9KL，及保持阅读框架正确。

设计5′和3′端序列分别如下：

引物1：5′ CTCGAG AAA AGA TCT TCT TCT CAC CCA ATC 3′

          Xho I

引物2：3′ CGCCGGCG AAT AGT AGA CTG TCG GAA AGA 5′

          Not I

取上述提取的正常人血白细胞基因组DNA为模板，以引物1、引物2分别进行PCR扩增，扩增条件为：94℃变性50sec，55℃退火60sec，72℃延伸90sec，共进行35个循环。PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳回收。回收合成的rhNGFDNA片断，插入载体pPIC9KL。

2.表达质粒pPKLNGF的构建

酵母表达质粒选用上述pPIC9KL。

pPIC9KL是从质粒pPIC9K突变衍生而来。pPIC9K原为Invitrogen公司产品(Cat.No.VI75-20)。pPIC9K质粒原在AOX13’端及3’AOX1基因处各有一个Xho I位点，无法用Xho I位点插入。

将质粒pPIC9K用Xho I酶酶切，经klenow酶补平后，该位点由

5′CTCGAG 3′    5′-C--G-3′

3′GAGCTC 5′变为3′-G--C-5′

用T₄DNA ligase连接，转入大肠杆菌DH5α。这样切割补平后可能得到四种产物：两个相同的Xho I同时切开补平；两个相同的Xho I同时都没有切开；两个酶切位点各只切开一个补平。用含100μg/mL AMP的LB液体培养基，37℃条件下振荡培养至OD₆₀₀约0.5，离心收集菌体，提取质粒，测序，选择非polylinker 5’端的Xho I酶酶切位点切开并补平的质粒(polylinker 5’端的XhoI酶酶切位点未切开)为pPIC9KL质粒。这样AOXI 3’端(即polylinker 5’端)的XhoI位点就成为单酶切位点，使得rhNGF基因可以从此位点插入质粒载体，保证了阅读框架正确，酵母α因子信号肽切割后的第一个氨基酸即为rhNGF的第一个氨基酸ATG，从而酵母表达分泌的rhNGF是完整的，而且与天然hNGF N端氨基酸序列一致的蛋白质产品。我们改造质粒pPIC9K后得到的质粒，具有单一的Xho I酶切位点，我们将其命名为pPIC9KL。

质粒结构图见图1。

所用巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统，它由野生型石油酵母Y11430突变而来，常用的3株宿主菌是GS115、KM71和MC100-23。GS115和KM71是Y11430的组氨醇脱氢酶基因(histidinol dehydrogenase gene，his4)缺失突变体，不能合成His4，因此质粒载体需携带his4，转染后的阳性重组子可以用his4缺陷(his4)平板进行筛选，GS115的启动子为PAOX1，在含甲醇的培养基中可以快速生长。本发明中优选毕赤酵母GS115。

构建好的巴斯德毕赤酵母表达载体被相应的内切酶消化变成线状，用电穿孔法将线性化载体转化到宿主菌中。线性化的位置不同使载体有两种方式与宿主菌染色体整合。当消化载体产生的DNA片段与5′AOX1和3′AOX1两端同源时，线性化载体DNA可以直接替代基因组AOX1，即发生了单位点置换，产生Muts表型的阳性重组菌株；当酶切位点发生在AOX1的5′端或HIS4标记内时，线性化载体DNA将在基因组的同源位点发生整合，Mut表型由宿主菌决定。巴斯德毕赤酵母具有翻译后修饰功能，如信号肽加工、蛋白质折叠、二硫键形成和糖基化作用等，其糖基化位点与其他哺乳动物细胞相同，为Asn-X-Ser/Thr，生成的糖链较短，一般只有8～14个甘露糖残基，核心寡聚糖链上无末端α-1，3糖苷键，抗原性较低，特别适合于生产医药用重组蛋白质。

3.cDNA序列测定

分别用pPIC9K的测序引物5’AOXI Pichia和3’AOXI Pichia sequencingprimer(购自Invitrigen公司)进行正、反向测序。将上述测序图谱用计算机读序并整合正、反向测序结果，得到rhNGF cDNA序列并翻译成对应氨基酸(图2)。测序结果与文献报道(Ullrich A，Gray A，Berman C，et al，Nature，1983，Vol.303，821-825)的rhNGF的cDNA碱基和氨基酸序列一致。表明本发明人克隆得到的rhNGF cDNA是正确的。构建的表达质粒pPKLNGF的全序列为：rhNGF cDNA序列+pPIC9KL质粒序列，pPIC9KL质粒序列与pPIC9K质粒序列相比，除了非polylinker 5’端的Xho I酶酶切位点由5′CTCGAG 3′(pPIC9K)变为5′-C--G-3′(pPIC9KL)外，其它序列一致(见Invitrogen公司产品目录pPIC9K标准序列)。

4.酵母转化

宿主菌优选毕赤酵母GS115。GS115(购自Invitrogen公司)的基因型为：his4 mut⁺。

感受态细胞的制作方法如下：用GS115单菌落接种5mL YPD (YeastExtract 1％，Peptone 2％，Dextrose 2％)液体培养基，30℃过夜培养，取1mL转接到200mL YPD培养基中继续培养，当其OD₆₀₀达到1.5左右时，停止培养，离心(5000rpm)收集菌体，然后分别用去离子水和1mol/L山梨糖醇(D-Sorbitol，Sigma)各洗涤2次，最后加入1mL预冷的1mol/L山梨糖醇，按每管100μL分装成备用的毕赤酵母感受态细胞，保存于-70℃。

酵母转化采用电穿孔的方法。电穿孔操作方法如下：用Sal I酶切质粒pPKLNGF，再将线性化的酵母表达载体质粒转入GS115感受态细胞。取线性DNA 0.3μg与100μL感受态细胞混合后，注入预冷的0.2cm电击杯(Bio-Rad)中，轻敲电击杯，使混合物落入电击杯底部，在电击仪(Bio-Rad)上设定电压为1.5kV，电容为25μF，电阻为400Ω，进行电穿孔操作。电穿孔后，立即加入0.9mL预冷的1mol/L山梨糖醇于电击杯中，混匀后从中吸出200μL，立即涂布MDS转化培养基(1.34％YNB，(4×10^-5)％Biotin，1％ Dextrose，1mol/LD-Sorbitol)，然后倒置平板于30℃，培养2天后转化子开始出现。

5.酵母转化子的筛选

含AOX1-hNGF基因和His4(组氨酸脱氨酶基因)序列的片段通过同源重组插入或置换整合到酵母基因组中His4基因上。由于表达载体含有卡那霉素抗性基因，它能使酵母细胞对G418产生抗性。对G418抗性程度基本取决于卡那霉素抗性基因整合到酵母基因组中的数目。因此通过不同浓度的G418筛选来获得多拷贝转化子。转化子涂板MD培养基上，30℃培养3天后，将MD培养基上生长的转化子用牙签刮下，用无菌水稀释到每毫升10⁵个细胞，再取200μl涂布于不同浓度的G418-MD平板，G418浓度分别为1.0、2.0、4.0mg/mL。培养48h筛选出多拷贝转化子。结果在4mg/mL G418的MD平板上筛选到3个多拷贝转化子。

PCR验证及多拷贝数估计：挑取多拷贝转化子单菌落，提取转化子的基因组DNA，分别以5’AOXI Pichia和3’AOXI Pichia sequencing primer为引物进行PCR扩增。PCR扩增产物琼脂糖电泳检查，3个多拷贝转化子均产生1.1kb的DNA条带，即均为阳性。上述操作参照Invitrogen公司multicopyexpression kit manual说明书进行。将上述转化子用摇瓶表达，获得rhNGF酵母工程菌，命名为PKLN-2。

6.rhNGF酵母工程菌(PKLN-2)的检定和表达

6.1甲醇利用表型分析

对酵母工程菌PKLN-2克隆进行甲醇利用表型分析。经MM和MD培养基生长比较，确定酵母工程菌pPKLN-2的甲醇利用表型为Mut⁺。

6.2抗生素抗性特征

未转化的宿主菌GS115在YPD培养基上生长，在G418-YPD培养基上(4mg/mL G418)不生长。

转化后的工程菌PKLN-2在YPD培养基上和G418-YPD培养基上都生长良好。

上述结果表明酵母工程菌PKLN-2具有卡那霉素(G418)的抗性。

6.3工程菌的表达与表达产物分析

PKLN-2菌落接种10ml酵母完全培养基(1.18％KH₂PO₄，0.3％K₂HPO₄·3H₂O，1％甘油，1.34％YNB，4×10^-7生物素)，于28℃振荡培养8h，然后加入90mL新鲜培养基。再振荡培养20h。加入甲醇进行48h诱导，培养液离心后，取上清进行SDS-PAGE分析，并检测上清中NGF的生物活性。PKLN-2的分泌表达量约为每毫升培养上清分泌表达160μg，SDS-PAGE电泳谱带扫描分析表达的hNGF占细胞总蛋白量的28.7％。经纯化后其纯度可达到98％以上。用8～9d龄的鸡胚背根神经节测定其生物学活性，结果表明它具有明显的促进DRG突起生长的作用，通过计算其生物学活性高于1×10⁵U/mg。电泳和生物活性结果均表明rhNGF被毕赤酵母分泌到培养液中，并且具有天然生物活性。

SDS-PAGE电泳图见图3。

经疏水层析柱和CM-Sepharose层析柱纯化，即得纯化的rhNGF，纯化的rhNGF做免疫印迹鉴定，结果与抗NGF抗体呈阳性反应，免疫印迹鉴定结果见图4。

使用酵母工程菌PKLN-2，在上述培养条件下，所分泌表达的目的蛋白纯化产物N端序列测定表明符合所设计的rhNGF的N端氨基酸序列，即信号肽切割正确。

根据以上检定结果，表明：工程菌PKLN-2是rhNGF的酵母表达工程菌，由此而建立的表达纯化工艺是可行的。

【实施例2】重组人神经生长因子毕赤酵母表达系统(pPIC9K-NGF)的构建与表达

1.hNGF基因的PCR扩增

1.1人血白细胞基因组DNA的提取

制备方法同实施例一。

1.2引物设计合成及PCR反应

参考文献报道的hNGF的基因序列(Ullrich A，GrayA，Berman C，et al，Nature，1983，Vol.303，821-825)，设计合成了一对引物，以便于克隆表达，在其两端分别引入了EcoR I和Not I酶切位点，引物如下：

引物1：5′ GAATTC TTA TCT CAC AGC CTT CCT GCT 3′

          EcoR I

引物2：3′ CGCCGGCG AAT AGT AGA CTG TCG GAA AGA 5′

          Not I

取上述提取的正常人血白细胞基因组DNA为模板，以引物1、引物2分别进行PCR扩增，扩增条件为：94℃变性50sec，55℃退火60sec，72℃延伸90sec，共进行35个循环。PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳回收。

2.重组质粒pPIC-NGF的构建

将上述PCR扩增片段克隆到pGEM-T easy载体上(Promega公司，实验过程按Promega说明书)，采用氯化钙法转化转化大肠杆菌JM109，得到重组质粒，命名为pT-NGF。将质粒pT-NGF和酵母表达质粒pPIC9K分别用EcoR I和Not I双酶酶切后，回收片段，在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组表达质粒，命名为pPIC-NGF。

3.毕赤酵母转化

本实施例中宿主菌优选毕赤酵母GS115(购自Invitrogen公司)。

感受态细胞的制备：制备方法同实施例一。

毕赤酵母电转化：酵母表达质粒pPIC-NGF用Sac I酶切后，电转化毕赤酵母GS115，电转化方法同实施例一。

4.酵母转化子的筛选

将上述构建的酵母转化子，按实施例一的方法筛选阳性转化子。结果在4mg/mL G418的MD平板上筛选到6个多拷贝转化子。

PCR验证及多拷贝数估计同实施例一。将上述转化子用摇瓶表达，选取表达水平较高的5号转化菌作为rhNGF酵母工程菌，命名为PPIC-5。

5.rhNGF酵母工程菌(PPIC-5)的检定和表达

5.1甲醇利用表型分析

实验方法同实施例一，结果表明酵母工程菌PPIC-5的甲醇利用表型为Mut⁺。

5.2抗生素抗性特征

实验方法同实施例一，结果表明酵母工程菌PPIC-5具有Kanamycine(G418)的抗性。

5.3工程菌的表达与表达产物分析

实验方法同实施例一。

取发酵上清进行SDS-PAGE分析，可以看见一条明显的表达带，分子量为28kD，在完全解聚的诱导表达菌株样品中有一明显条带对应着14kD，这同NGF单体的分子量相当。经电泳扫描分析，hNGF占细胞外泌总蛋白量的12.6％，Western blotting检测表明具有免疫活性。使用构建的工程菌PPIC-5表达rhNGF，经疏水层析柱和CM-Sepharose层析柱纯化后，即得纯化的rhNGF，经分析，rhNGF的纯度可达95％。纯化的rhNGF做生物活性分析，其活性约为7×10⁴U/mg。电泳和生物活性结果均表明rhNGF被毕赤酵母分泌到培养液中，并且具有天然生物活性。

根据以上检定结果，表明：工程菌PPIC-5是rhNGF的酵母表达工程菌，由此而建立的表达纯化工艺也是可行的。但是，采用质粒pPIC9KL与pPIC9K进行表达的rhNGF相比较，质粒pPIC9KL表达具有明显的优势：改造后的质粒pPIC9KL具有单一的Xho I酶切位点，保证了酵母表达分泌的rhNGF是完整的，而且与天然hNGF N端氨基酸序列一致；而pPIC9K质粒具有两个XhoI位点，插入hNGF cDNA后酵母表达分泌的rhNGF比天然的hNGF多出或者减少几个氨基酸，分泌的hNGF生物活性和纯度均要低。(即用酵母表达系统pPIC9K表达处理的hNGF的氨基酸序列与天然的NGF序列不一致。)由于实施例一引入了酵母α因子信号肽切割位点AAA AgA，因此，具有更稳定、更高效的外泌表达。采用载体pPIC9KL所表达的rhNGF核心寡聚糖链上无末端α-1，3甘露糖，抗原性较低，对活性基本无负面影响，特别适合于医药生产用重组蛋白。因此，本发明优选构建的工程菌PKLN-2来表达重组人神经生长因子。

【实施例3】重组人神经生长因子毕赤酵母(PKLN-2)的发酵、纯化制备

本实施例优选实施例一中构建的酵母工程菌PKLN-2进行rhNGF的发酵表达。

1、菌种活化

取冻存甘油菌株，划YPD平板，28℃温育活化48h。

2、一级种子培养

取50mL BMG摇瓶培养基，接入YPD平板活化的菌落，28℃、250rpm振荡培养24h，至菌液OD₆₀₀为11左右。

3、二级种子培养

取新鲜BMG培养基(体积为上罐基础料体积的10％)，按1～2％向二级种子液中接入一级种子液，接种前向种子液中加入10×YNB和500×Biotin，28℃、250rpm振荡培养24h，至菌液OD₆₀₀为20左右。

4、高密度发酵表达

发酵过程中，温度设定为28℃，溶解氧量(DO)控制在30％以上，pH在培养期间设定为5.2，在准备诱导之前2～3h逐渐降低pH至5.0，并使诱导过程中的pH维持在5.0左右。

补加甘油的前提应该是罐内甘油消耗完全(表现为DO急速上升至70～80％)，此时通过调节甘油速度来控制DO，使其维持在30％以上。补加甘油的最佳时间一般为发酵培养18～20h。

当甘油流加完毕，罐内碳源消耗完全，DO快速上升，即可开始诱导表达。先用手动补加少量甲醇，待这部分甲醇被消耗完毕，酵母菌已适应甲醇作为营养碳源后，开始从低速度流加甲醇。诱导过程中通过调节甲醇的流加速度，维持DO在30％以上。最佳诱导时间为48～72h。

5、上清液分离

发酵结束，于4℃条件下经5,000rpm离心30min，取上清，弃沉淀菌体，保留上清液。

6、超滤浓缩

离心后的发酵上清液经5,000MWCO超滤膜超滤浓缩至发酵液体积的1/5，加入3倍体积pH为4.5的20mmol/L醋酸缓冲液，继续超滤浓缩，重复上述操作3次。然后取浓缩液于4℃条件下经10,000rpm离心20min除去沉淀，取上清液，置于4℃保存备用或直接用于下一步纯化。

7、疏水层析

疏水层析纯化的条件为：填料为Sepharose C4；环境温度为4℃；缓冲液为浓度1.0mol/L(NH₄)₂SO₄/20mmol/L醋酸缓冲液(pH4.5)；洗脱液分别为0.5～0.2M(NH₄)₂SO₄/20mmol/L醋酸缓冲液(pH4.5)、20mmol/L醋酸缓冲液(pH4.5)。

8、离子交换

离子交换纯化的条件为：填料为CM Sepharose F.F.；环境温度为4℃；缓冲液为20mmol/L醋酸缓冲液(pH4.5)；洗脱液分别为0.1～0.15mol/L NaCl/20mmol/L醋酸缓冲液(pH4.5)、0.3～0.5mol/L NaCl/20mmol/L醋酸缓冲液(pH4.5)。

9、脱盐

收集离子交换纯化洗脱样品，以20mmol/L醋酸-醋酸钠(pH4.5)为缓冲液，过G-25凝胶，收集紫外吸收峰，即得到纯度＞98％，生物比活性高于10⁵U/mg的hNGF纯品。

通过实验表明，酵母表达系统可以用于表达重组人神经生长因子。

对比实验发现，用毕赤酵母表达系统pPIC9KL-NGF表达的rhNGF占细胞总蛋白量的28.7％，纯化后，其纯度达98％以上，生物学活性高于1×105U/mg，而用pPIC9K-NGF表达系统表达的rhNGF占细胞总蛋白量的12.6％，纯化后，其纯度只能达到95％，生物学活性也只有7×10⁴U/mg。因此，毕赤酵母表达系统pPIC9KL-NGF具有明显的优越性。

以上实施例均能得到正确高效表达rhNGF的工程菌株，获得高生物学活性的rhNGF。巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)，表达载体质粒pPIC9KL、宿主菌GS115作为最优选择。

以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。

Claims (10)

1、一种表达人神经生长因子的表达载体，将合成的编码人神经生长因子的基因插入表达质粒pPIC9KL构建，其具有图1所示的结构。

2、权利要求1所述的表达载体，其特征在于所述表达质粒pPIC9KL通过下述方法构建：

1)将质粒pPIC9K用Xho I酶酶切，经klenow酶补平后，用T₄ DNA ligase连接，转入大肠杆菌DH5α；

2)培养并收集菌体，提取质粒，测序，选择非polylinker 5’端的Xho I酶酶切位点切开并补平的质粒，获得pPIC9KL质粒。

3、一种表达人神经生长因子的表达系统，其含有由权利要求1所述的表达载体。

4、权利要求2所述的表达系统，其特征在于所述表达系统由所述表达载体转化酵母宿主构建而成。

5、权利要求3所述的表达系统，其特征在于所述酵母宿主为巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)。

6、一种采用权利要求1所述的表达载体制备重组入神经生长因子方法，包括下述步骤：

1)将编码人神经生长因子的基因可操作地连接于表达载体pPIC9KL，构建表达人神经生长因子的重组表达载体；

2)用所述重组表达载体转化酵母宿主，构建表达人神经生长因子的酵母表达系统；

3)培养所述酵母表达系统，获得重组人神经生长因子。

7、权利要求6所述的方法，其中所述步骤1)中包含下述步骤：

1.1)采用pPIC9K质粒构建含单一XhoI酶切位点的质粒pPIC9KL；

1.2)将编码人神经生长因子的基因可操作地连接于表达载体，构建含有hNGF的重组表达载体pPKLNGF。

8、权利要求7所述的方法，其中在上述方法步骤1.1)中，构建含单一XhoI酶切位点的质粒的步骤包括：

1.1.1)将质粒pPIC9K用Xho I酶酶切，经klenow酶补平后，用T₄ DNAligase连接，转入大肠杆菌DH5α；

1.1.2)培养并收集菌体，提取质粒，测序，选择非polylinker 5’端的XhoI酶酶切位点切开并补平的质粒，获得pPIC9KL质粒。

9、权利要求7所述的方法，其中在步骤1.2)中，含有hNGF的重组表达载体pPKLNGF的制备步骤包括：

1.2.1)以下述合成的核苷酸序列为引物：

引物1：5′CTCGAG AAA AGA TCT TCT TCT CAC CCA ATC 3′

引物2：3′CGCCGGCG AAT AGT AGA CTG TCG GAA AGA 5′

以正常人血白细胞基因组DNA为模板，分别进行PCR扩增；

1.2.2)从获得的PCR产物中回收合成的rhNGF DNA片断，插入载体pPIC9KL，获得含有hNGF的重组表达载体pPKLNGF。

10、权利要求6所述的方法，其中进一步包含将获得的重组人神经生长因子纯化的步骤。

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