CN103060249A

CN103060249A - 大肠埃希氏菌及由其高效分泌表达人表皮生长因子的方法

Info

Publication number: CN103060249A
Application number: CN2012101896050A
Authority: CN
Inventors: 杨圣勇; 朱冬发; 李仁宝; 张辉; 王莉; 韩文琦; 董国秀; 吕岳寅
Original assignee: SHANGHAI APELOA PHARMACEUTICAL RESEARCH Co Ltd; APELOA KANGYU PHARMACEUTICAL Co Ltd
Current assignee: Apeloa Pharmaceutical Co ltd; Shanghai Puluochuangzhi Pharmaceutical Technology Co ltd; ZHEJIANG APELOA KANGYU PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2012-06-06
Filing date: 2012-06-06
Publication date: 2013-04-24
Anticipated expiration: 2032-06-06
Also published as: CN103060249B

Abstract

本发明涉及利用基因工程的方法构建表达菌株，公开了一种大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）BTE-9，于2012年4月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO.6014。还提供了该菌株高效分泌表达人表皮生长因子的方法。本发明在发酵表达过程中不使用诱导剂，避免了使用诱导剂带来的菌体生理状态改变和质粒丢失，而且降低了生产成本，避免了有毒类诱导剂对目标产物的污染，且表达量高。

Description

大肠埃希氏菌及由其高效分泌表达人表皮生长因子的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及利用基因工程的方法构建表达菌株，发酵生产人表皮生长因子（hEGF），更具体地说是涉及一种大肠埃希氏菌及由其高效分泌表达人表皮生长因子的方法。

背景技术

人表皮生长因子（Human epidermal growth factor，简称 hEGF）又名尿抑胃素，hEGF见于人正常生理状态下的几乎所有体液中，如尿、乳液、血液、唾液、泪液、胃液、骨髓液等中都含有EGF，一般认为肾内尿液、乳液中含量较多(Orsinib B,et al.Clin Biochem,1991,24:135-137)。Cohen S (Cohen S,et al. Proc.Natl.Acad.Sci, USA, 1975,72:1317-1321) 和Gregorg H (Gregorg H,et al.Nature,1975,257:325-327)于1975年都在尿液中分离得到 hEGF，其一级结构也于同年阐明，hEGF成熟肽由53个氨基酸组成，分子量为6.2 KD，等电点约为pH 4.6-4.7，分子内有三对二硫键，以维持其蛋白构型和生物活性。

hEGF是一种重要的生长因子,也是最早发现并用于临床的生长因子之一，临床试验表明 hEGF 可促使外胚层细胞和毛细血管生长，促进烧伤、创伤及外科伤口的愈合，加速移植表皮和移植角膜的生长，因此对创伤性皮肤、角膜移植和外伤性皮肤溃疡等治疗有重要作用(Huang BR,Basic Clin Med,1991,11:87-91)。另外 hEGF还广泛应用于高端化妆品（王丽明,山东科学,2006,4: 71-73）。

现在报道的 hEGF 有三种生产的方法：化学合成的方法，1988年 March D（March D,et al.American Pepetide Symposium ,1988, 10:202-203）首先完成了 hEGF 的全合成，但由于 hEGF 分子内的二硫键及很多活性位点的存在，致使合成产物的纯度、产率及活性都无法满足工业化的生产要求；再有从生物来源中提取(美国专利 19840619708)，主要从尿液中分离提取，但天然来源原料hEGF浓度很低，致使分离提纯效率低成本高，很难规模化生产；基因工程技术构建表达菌株，发酵生产hEGF是现在规模化生产的主要方法。

已经报道很多发酵生产 hEGF的技术和方法，包括使用大肠杆菌、芽孢杆菌（Wang GL,et al.Yi Chuan Xue Bao,2003,30(2):267-271）、酵母（Clements JM,et al. Gene,1991,106(2):267-271 ）、藻类细胞（戴激,等，植物学报,2001,43(12):1260-1261）、动物细胞（Mroczkowshi B.Methods Enzymol,1991,198:175-177）植物组织细胞（WO patent:WO9821348）等作为宿主发酵表达 rhEGF。现在生产中主要还是利用原核细胞进行表达生产，大肠杆菌以其生长速度快，遗传背景清晰，易于改造，工艺简单，已经有大规模的发酵医用蛋白的经验，使之成为外源表达 rhEGF 的首选宿主菌。非组成型表达方式的大肠杆菌在生长表达过程中一般分两个阶段，菌体的生长阶段和诱导表达阶段，诱导阶段的诱导表达方式有多种，有些诱导启动子启动表达需要添加相应诱导剂如乳糖、IPTG、阿拉伯糖等，加入诱导剂后往往会造成菌体生理状态变化、裂解或者诱导过快造成表达量剧增对细胞产生毒害，而且有些诱导剂（如IPTG）本身具有毒性，在很多国家医药生产中禁止使用；有的诱导方式不需要添加诱导剂而使用营养限制型的启动子，如碱性磷酸酯酶启动子，色氨酸启动子等，但这类启动子都对培养基要求比较苛刻，而且诱导物质本身也是营养成分致使发酵不易控制，增加了发酵成本。大肠杆菌同样具有细胞内表达和分泌（分泌至周质）表达方式，分泌表达方式所表达的多肽结构均一性强、活性高、利于纯化、且成本低，因此成为现在生产rhEGF的主要表达方式。但利用大肠杆菌分泌表达也有相对胞内表达的缺点，如表达量较低。Grossman TH 报道了(Grossman TH,et al. GENE,USA, 1998,209:95-103)在复合培养基中用乳糖启动子控制的大肠杆菌 pET 表达系统可以在没有专门诱导剂诱导情况下表达， cAMP在启动表达中起到关键作用，而且以此种方式表达的宿主菌质粒保存率优于诱导表达的方式；魏东芝等人(Fu XY,et al.Chem Technol Biotechnol,2006, 81: 1866- 1871)研究了大肠杆菌 pET 表达系统在不需要专门诱导时酵母抽提物对其表达 Trx–hPTH 的影响，发现在复杂培养基中不同来源和不同浓度的酵母抽提物对大肠杆菌表达影响很大，高浓度的酵母抽提物有利于表达。

发明内容

鉴于以上原因发明人设计并得到了一个大肠杆菌高效分泌表达 hEGF 的方法。本发明公开了一种大肠杆菌不需要专门诱导高效分泌表达重组人表皮生长因子（rhEGF）的方法。大肠埃希氏菌(E. coli)通常称为大肠杆菌。

具体说来，发明人提供如下的技术方案：

一种大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BTE-9，于2012年4月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO.6014。

上述的大肠埃希氏菌BTE-9，其特征包括：质粒pTEGF9，此质粒带有T7lac启动子序列、碱性磷酸酯酶信号肽基因、大肠杆菌偏好性密码子的hEGF基因、卡那霉素抗性基因，宿主菌为E.coli BL21（DE3）[基因型:F-,ompT,hsdS（rBB-mB-）,gal,dcm(DE3)]。

本发明还提供了上述的大肠埃希氏菌BTE-9高效分泌表达人表皮生长因子的方法，包括：

（1）大肠埃希氏菌BTE-9菌株的构建及高表达菌株的筛选，

（2）摇瓶发酵培养大肠埃希氏菌BTE-9表达人表皮生长因子，

（3）产物纯化。

作为优选方案，根据本发明所述的大肠埃希氏菌BTE-9高效分泌表达人表皮生长因子的方法，其中，所述的步骤（1）大肠埃希氏菌BTE-9菌株的构建及高表达菌株的筛选为：

（1.1）构建表达质粒 pTEGF9 ，

（1.2）将质粒pTEGF9用CaCl₂转化方法转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞并涂布含有卡那霉素的LB平板，培养，电泳分析发酵液中hEGF含量，筛选出高表达的菌株命名为E.coli BL21（DE3）/pTEGF9，即大肠埃希氏菌BTE-9。

作为优选方案，根据本发明所述的大肠埃希氏菌BTE-9高效分泌表达人表皮生长因子的方法，其中，所述的步骤（2）中：摇瓶培养基以100 mL计含如下成分：多聚蛋白胨 1 g、酵母抽提物 0.8 g、葡萄糖 0.8 g、磷酸二氢钾 0.08 g、磷酸氢二钾 0.2 g、硫酸铵 0.2 g、无水硫酸镁 0.05 g、甘氨酸 0.1g、饱和酚红 200μl。

本发明还提供了另外一种上述的大肠埃希氏菌BTE-9高效分泌表达人表皮生长因子的方法，包括：

（1）大肠埃希氏菌BTE-9菌株的构建及高表达菌株的筛选，

（2）发酵罐发酵培养大肠埃希氏菌BTE-9表达人表皮生长因子，

（3）产物纯化。

第二种方案中，作为优选方案，根据本发明所述的大肠埃希氏菌BTE-9高效分泌表达人表皮生长因子的方法，其中，所述的步骤（1）大肠埃希氏菌BTE-9菌株的构建及高表达菌株的筛选为：

（1.1）构建表达质粒 pTEGF9 ，

第二种方案中，作为优选方案，根据本发明所述的大肠埃希氏菌BTE-9高效分泌表达人表皮生长因子的方法，其中，所述的步骤（2）中：发酵培养基配方为（w/v）：多聚蛋白胨2%、酵母抽提物1.6%、葡萄糖1%、硫酸铵0.5%、无水磷酸氢二钾0.41%、无水磷酸二氢钾0.16%、氯化钠0.12%、无水硫酸镁0.19%、甘氨酸0.2%。

第二种方案中，作为优选方案，根据本发明所述的大肠埃希氏菌BTE-9高效分泌表达人表皮生长因子的方法，其中，所述的发酵罐发酵培养条件为：

种子制备：取冻存管里菌以1/500（v/v）比例接种于有含有30μg/ml卡那霉素的LB培养中，220 rpm，37℃，培养至菌体浓度OD600为2.0，

发酵控制：种子1%（v/v）接种入发酵罐，发酵罐内培养基含30 μg/ml的卡那霉素，维持pH为6.5-7.0，当溶氧下降后又上升时（约8个小时）开始流加25%葡萄糖溶液，流加速度以恒定溶氧确定，溶氧维持在20-30%，同时恒流速加入0.2%甘氨酸（甘氨酸质量\发酵液体积）直至发酵16-17个小时结束。

本发明大肠埃希氏菌BTE-9高效分泌表达人表皮生长因子的方法包括：扩增磷酸酯酶信号肽和hEGF基因串联的DNA片段，克隆入质粒pET30a，得到表达质粒pTEGF9，转化大肠杆菌BL21(DE3)，筛选得到高产菌株E.coli BL21（DE3）/pTEGF9（即大肠埃希氏菌BTE-9），优化摇瓶培养和发酵培养方法，并进行产物鉴定。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明的特点是，首先，在发酵表达过程中不使用诱导剂，避免了使用诱导剂（如 IPTG）带来的菌体生理状态改变和质粒丢失，而且降低了生产成本，避免了有毒类诱导剂对目标产物的污染，其次，表达量高，使用优化的培养基和培养方法使摇瓶中分泌表达 rhEGF可达 140 mg/L，发酵罐中达到 190 mg/L，所表达的 rhEGF 与天然 hEGF 有相同的结构和细胞生物活性。

本发明中的菌株在发酵培养过程中不经过专门诱导就可以高效分泌表达rhEGF，简化了发酵操作，提高了分泌表达效率，此种表达方式还可用来表达其它活性多肽。

附图说明

图 1 是本发明表达载体 pTEGF9 结构图，

图 2 是本发明摇瓶发酵液 HPLC 分析结果，

图 3 是本发明已纯化 rhEGF的 HPLC 分析结果，

图 4 是本发明已纯化 rhEGF的 SDS-PAGE 分析结果，

其中1为标准品 hEGF加入DTT；2为纯化的rhEGF 加入DTT；

3为标准品 hEGF；4为纯化的rhEGF；5为Marker，

图 5 是本发明rhEGF N端分析图谱，

图 6 是本发明摇瓶培养 E.coli BL21（DE3）/pTEGF9 中 rhEGF 的表达量和生物量变化，

图 7 是本发明发酵罐发酵E.coli BL21（DE3）/pTEGF9中生物量，rhEGF表达量，残糖含量随时间的变化，

图 8 是本发明已纯化 rhEGF 的细胞生物活性测定。

具体实施方式

下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

主要原料、试剂和设备说明：质粒 pET30a，E.coli BL21(DE3) 均购自NOVAGEN公司，质粒pE-5为上海普洛康裕药物研究院生物一室保存，高效液相色谱仪购自安捷伦公司。

本发明的大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BTE-9，2011年6月从上海市浦东新区南汇工业园园中路1399号上海普洛康裕药物研究院有限公司实验室培养获得，于2012年4月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学微生物研究所，保藏号为：CGMCC NO.6014。

实施例1表达质粒 pTEGF9 的构建及鉴定

常规分子实验操作方法参考《分子克隆实验指南》(科学出版社第三版)。以 EGF-1（5’-AAACATATGAAACAAAGCACTATTGCACTG-3’，下划线部分为引入的酶切位点）和 EGF-2（5’-AAAGGATCCTTATTAACGCAGTTCCCACC-3’）为引物，质粒pE-5为模板扩增带有磷酸酯酶信号肽的 hEGF基因片段，所扩增基因片段利用 BamHI 和 NdeI 双酶切，酶切产物经纯化后与 BamHI和NdeI双酶切的质粒pET30a相连接，并电击转化入E.coli TOP10感受态细胞中，涂布于含有30 μg/ml卡那霉素的LB平板上，过夜培养，挑取菌落以EGF-2和EGF-3（5’-TACCATCGACACCACCACGC-3’）为引物进行菌落PCR，用琼脂糖凝胶电泳验证，验证正确的质粒经过DNA测序，正确质粒命名为pTEGF9(图1)。

实施例2表达菌株的构建、高表达菌株的筛选及质粒稳定性检测

2.1表达菌株的构建、高表达菌株的筛选

将质粒pTEGF9用CaCl₂转化方法转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞并涂布含有30 μg/ml卡那霉素的LB平板，37℃培养过夜，挑取阳性克隆100个分别接种到10 mL 含有30 μg/ml卡那霉素的液体LB培养基中，37℃，220 rpm，培养36小时，取培养液0.5 mL，离心取上清，放入真空旋转蒸发仪上进行浓缩，浓缩定容至50μl。使用Tricine-SDS-PAGE 方法进行电泳（此胶共三层，从上到下依次为5%的积层胶，10%的夹层胶和15%的分离胶）电泳结束后用高灵敏考马斯亮蓝染色方法染色并脱色，扫描拍照并用QuantityOne 进行灰度分析，筛选出高表达的菌株命名为E.coli BL21（DE3）/pTEGF9，即大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BTE-9，于2012年4月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏号为：CGMCC NO.6014。

2.2 质粒传代稳定性检测

将高产菌种E.coli BL21（DE3）/pTEGF9以1/1000（v/v）比例接种于含有30 μg/ml卡那霉素的液体 LB培养基中，37℃，220 rpm，培养过夜，重复上述操作10次，每次得到的菌液稀释10⁵倍涂布于没有抗性的LB平板上，37℃过夜培养，分别挑取100个平板上的菌落，划线到含有30 μg/ml卡那霉素的LB平板上，37℃过夜培养，并计数每块平板上长出的菌落数，既可以得到各代的质粒保存率。

Figure 2012101896050100002DEST_PATH_IMAGE001

。

从结果可以看出，在传代10次后，该菌株质粒保存率为100%。

实施例3摇瓶培养大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BTE-9（即E.coli BL21（DE3）/pTEGF9）表达rhEGF

摇瓶培养：

通过单因素分析、均匀实验设计的方法优化培养基配方及培养方式。使用含50 mL培养基的250 mL摇瓶培养，每50 mL培养基中所含成分为：

多聚蛋白胨 0.5 g 酵母抽提物 0.4 g

葡萄糖 0.4 g 磷酸二氢钾 0.04 g

磷酸氢二钾 0.1 g 硫酸铵 0.1 g

无水硫酸镁 0.025 g 甘氨酸 0.05 g

饱和酚红 100μl 卡那霉素 30μg/mL

冻存菌种1%（v/v）比例接种于摇瓶培养基，培养温度为37℃，转速为220 rpm，连续培养35个小时，期间调节pH为7.0。

培养过程中每隔5小时取样检测生物量及hEGF含量。生物量通过检测 600nm 的光吸收值（OD600）的方法，rhEGF分泌表达量采用HPLC检测分析方法。

HPLC分析方法：

仪器：Agilent 1100 HPLC仪

操作温度：25 ℃

分析柱：C18色谱柱（15×3.6 mm I.D.)

溶液A： 0.1% TFA

溶液B： 0.1% TFA 90%乙腈

梯度：0%-100% B，30分钟

进样量：10μl

检测波长：280 nm

流速：0.8 mL/min

配制标准 hEGF 溶液 10μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、120μg/mL、160μg/mL、200μg/mL，将不同浓度的标准hEGF溶液各取10μl进行 HPLC 分析，得出色谱峰的积分面积，根据 hEGF浓度与hEGF 色谱峰积分面积之间的关系作出标准曲线。将摇瓶培养液高速离心去除菌体，上清液使用 0.2μm的滤膜过滤，取 10μL进行 HPLC 分析（图2）得出 hEGF 峰面积，并根据标准曲线计算出培养液中 rhEGF含量。

在此培养基中培养大肠埃希氏菌BTE-9，达到稳定期时菌体浓度OD600约为8.0，稳定期内大量表达rhEGF，培养35-36小时表达量达140μg/mL。（图6）

实施例4发酵罐发酵培养

根据摇瓶培养实验设计发酵培养基，通过发酵罐发酵进行优化和确定培养基：

培养基成分	配比%（w/v）	培养基成分	配比%（w/v）
				多聚蛋白胨	2	无水磷酸二氢钾	0. 16
酵母粉	1.6	氯化钠	0.12
				葡萄糖	1	硫酸镁	0.19
硫酸铵	0.5	甘氨酸	0.2
				无水磷酸氢二钾	0. 41

种子制备：

取冻存管里的菌，以1/500（v/v）比例接入100 mL 含有30 μg/ml卡那霉素的液体LB培养基中，装瓶量为1/5，220 rpm，37℃，培养至菌体浓度OD600为2.0。

发酵操作：

已经制备好的100 mL种子接种到装有10 L培养基（含有30 μg/ml卡那霉素）的20 L发酵罐内，发酵温度37℃，转速500 rpm，维持罐内pH为6.5-7.0，通气量为1 m³/h，当溶氧下降后又上升时（约8个小时）开始流加25%（w/v）葡萄糖，流加速度以恒溶氧确定，溶氧维持在20-30%；同时恒流速加入0.2%甘氨酸（甘氨酸质量/发酵液体积）直至发酵16-17个小时结束。发酵过程中通过恒定溶氧补料，还原糖含量维持在1mg/mL，最终表达量在190μg/mL。（图7）

实施例5 rhEGF纯化及鉴定

5.1 rhEGF纯化

疏水层析：发酵液离心去除菌体，上清液加入硫酸铵至终浓度为0.5 M,上样Phenyl-Sepharose 6 high performance疏水层析柱，依次用缓冲液A（0.5 mol/L 硫酸铵）冲洗、缓冲液B（0.02 mol/L pH7.0磷酸盐缓) 洗脱，收集活性峰。

凝胶层析：疏水层析收集液上样Superdex 30层析柱，用0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.0）洗脱，收集活性峰。

离子交换层析：凝胶层析收集液用0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.0）稀释至电导率不大于5 mS/cm，上Q-Sepharose high performance阴离子交换层析柱。用0.01 M pH5醋酸钠的缓冲液冲洗直至紫外吸收走平，用0.01 M pH4醋酸钠缓冲液洗脱收集活性峰。

5.2 SDS-PAGE分析

纯化后rhEGF经Tricine-SDS-PAGE电泳（图4）拍照并使用QuantityOne分析，目的条带单一，且分子量大小与标准品一致。

5.3 HPLC分析

纯化后rhEGF经HPLC分析，与标准品出峰位置相同，且通过峰面积积分分析，纯度达96%（图3）。

5.4 N端氨基酸序列分析

委托上海基康生物技术有限公司进行Edman降解法分析N端氨基酸序列，共测定了N端10个氨基酸，测出其N端序列为Asn-Ser-Asp-Ser-Glu-Cys-Pro-Leu-Ser-His（图5），与天然hEGF的N端氨基酸序列一致。

5.5 细胞生物活性测定

MTT法检测细胞活性：收集对数期Balb/c 3T3细胞，重悬于完全培养液中（DMEM添加10％FBS），计数，调整细胞浓度为5×10⁵/mL，接种于96孔板上，每孔100 mL，37℃ 5％ CO₂培养24小时；吸去上清，加入检测培养液培养100 mL/孔，37℃ 5％ CO₂培养24小时；用检测培养液将rhEGF样品及标准品稀释至一系列稀释度，吸去96孔板上清，加入100 mL/孔已稀释好的样品，每个稀释度做2个重复，置37 ℃ 5％ CO₂培养箱培养48小时。换液一次，并追加同样浓度的待测rhEGF，继续培养24小时；加入MTT溶液10 mL/孔，37℃ 5％ CO₂培养4小时，吸去上清，加入DMSO 100 mL/孔，震荡5-10分钟混匀，570 nm比色，用origin8.0 计算其ED50，应用rhEGF生物活性参照标准品为标准，依上述方法同时确定rhEGF参照标准品的ED50以及样品的ED50，换算得rhEGF样品的生物学活性。

供试品生物学活性（IU/mL）=Pr×(Ds×Es)/(Dr×Er)

其中 Pr为参考标准品生物学活性，Ds为供试品预稀释倍数，Es为供试品相当于参考标准品半效量的稀释倍数，Dr为参考标准品预稀释倍数，Er为参考标准品半效量的稀释倍数。

经纯化的rhEGF样品所测得的生物活性为1.13×10⁶ IU/mg，与天然hEGF活性（1.00×10⁶ IU/mg）相当（图8）。

上述优选实施例只是用于说明和解释本发明的内容，并不构成对本发明内容的限制。尽管发明人已经对本发明做了较为详细地列举，但是，本领域的技术人员根据发明内容部分和实施例所揭示的内容，能对所描述的具体实施例做各种各样的修改或/和补充或采用类似的方式来替代是显然的，并能实现本发明的技术效果，因此，此处不再一一赘述。本发明中出现的术语用于对本发明技术方案的阐述和理解，并不构成对本发明的限制。

Claims

1. 一种大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BTE-9，于2012年4月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO.6014。

2.如权利要求1所述的大肠埃希氏菌BTE-9，其特征在于包括：质粒pTEGF9带有T7lac启动子序列、碱性磷酸酯酶信号肽基因、大肠杆菌偏好性密码子的hEGF基因、卡那霉素抗性基因，宿主菌为E.coli BL21（DE3）[基因型:F-,ompT,hsdS（rBB-mB-）,gal,dcm(DE3)]。

3.一种由权利要求1所述的大肠埃希氏菌BTE-9高效分泌表达人表皮生长因子的方法，其特征在于，所述的方法包括：

（1）大肠埃希氏菌BTE-9菌株的构建及高表达菌株的筛选，

（2）摇瓶发酵培养大肠埃希氏菌BTE-9表达人表皮生长因子，

（3）产物纯化。

4.如权利要求2所述的大肠埃希氏菌BTE-9高效分泌表达人表皮生长因子的方法，其特征在于，所述的步骤（1）大肠埃希氏菌BTE-9菌株的构建及高表达菌株的筛选为：

（1.1）构建表达质粒 pTEGF9 ，

（1.2）将质粒pTEGF9用CaCl₂转化方法转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞并涂布含有卡那霉素的LB平板，培养，电泳分离培养液，筛选出高表达的菌株命名为E.coli BL21（DE3）/pTEGF9，即大肠埃希氏菌BTE-9。

5.如权利要求2所述的大肠埃希氏菌BTE-9高效分泌表达人表皮生长因子的方法，其特征在于，所述的步骤（2）中：摇瓶培养基以100 mL计含如下成分：多聚蛋白胨 1 g、酵母抽提物 0.8 g、葡萄糖 0.8 g、磷酸二氢钾 0.08 g、磷酸氢二钾 0.2 g、硫酸铵 0.2 g、无水硫酸镁 0.05 g、甘氨酸 0.1g、饱和酚红 200μl。

6. 一种由权利要求1所述的大肠埃希氏菌BTE-9高效分泌表达人表皮生长因子的方法，其特征在于，所述的方法包括：

（1）大肠埃希氏菌BTE-9菌株的构建及高表达菌株的筛选，

（3）产物纯化。

7. 如权利要求6所述的大肠埃希氏菌BTE-9高效分泌表达人表皮生长因子的方法，其特征在于，所述的步骤（1）大肠埃希氏菌BTE-9菌株的构建及高表达菌株的筛选为：

（1.1）构建表达质粒 pTEGF9 ，

8. 如权利要求6所述的大肠埃希氏菌BTE-9高效分泌表达人表皮生长因子的方法，其特征在于，所述的步骤（2）中：发酵培养基配方为（w/v）：多聚蛋白胨2%、酵母抽提物1.6%、葡萄糖1%、硫酸铵0.5%、无水磷酸氢二钾0.41%、无水磷酸二氢钾0.16%、氯化钠0.12%、无水硫酸镁0.19%、甘氨酸0.2%。

9. 如权利要求6所述的大肠埃希氏菌BTE-9高效分泌表达人表皮生长因子的方法，其特征在于，所述的发酵罐发酵培养条件为：

发酵控制：种子1% （v/v）接种入发酵罐，发酵罐内培养基含30 μg/ml的卡那霉素，维持pH为6.5-7.0，当溶氧下降后又上升时开始流加25%葡萄糖溶液，流加速度以恒定溶氧确定，溶氧维持在20-30%，同时恒流速加入0.2%甘氨酸直至发酵16-17个小时结束。