CN110408558A - 一种纳豆激酶的生产菌株及其生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种纳豆激酶的生产菌株及其生产方法。具体地，本发明涉及一种可生产纳豆激酶的新菌种，纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtils natto)ST‑1086，其以CGMCC No.17895保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明还涉及应用本发明的新菌株CGMCC No.17895生产纳豆激酶产品的方法，所得纳豆激酶产品可以用作溶解血栓的药品。本发明还涉及本发明的纳豆激酶产品用于制备用于溶解血栓的组合物的用途以及用于治疗血栓的方法。

Description

一种纳豆激酶的生产菌株及其生产方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域。具体地，本发明涉及一种纳豆激酶的生 产菌株及纳豆激酶产品的生产方法。

背景技术

纳豆激酶为国际上公认的用于人类心脑血管疾病的预防、保健和治疗 的最重要的活性分子之一，为纳豆枯草芽孢杆菌发酵所产生的微量活性物 质。多年来，已广泛应用于食品、膳食补充剂和国内的保健品市场。纳豆 激酶膳食补充剂原料国际国内市场需求量巨大。

目前国际范围内纳豆激酶主要产地有日本、美国和中国台湾。日本产 的纳豆激酶由纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)发酵纳豆中提取，活 性为10000-22000FU/g，相当于67000-147400IU/g。在日本，主要有四个 厂家生产纳豆激酶：纳百恩、生物科技、大和及本田下属一个子公司。生 产纳豆激酶最早、产量最大的是生物科技公司，占据了中国台湾和日本的 大部分市场。大和公司生产的纳豆激酶粉末，在日本也占据一定的市场份 额。这两家的纳豆激酶原料自用不对外销售。生物科技公司以及大和公司 使用的技术老、产品功效单一、缺少粘物质的保护、容易失活、稳定性差， 但成本低廉。本田下属子公司基本同生物科技，拥有纳豆激酶专利。日本 纳百恩公司是生产纳豆激酶后起之秀，纳豆激酶产品的活性达到22000 FU/g，相当于147400IU/g，但价格昂贵。中国台湾产纳豆激酶的技术来源 于日本。美国产纳豆激酶由曲霉菌发酵物提取，产品中不含纳豆菌和维生 素K2等粘物质，可称为“溶栓酶”。

文献报道，利用纳豆枯草芽孢杆菌进行液态发酵，纳豆激酶的产量为 3232IU/ml(相当于482.4FU/ml)(参见熊强等人，纳豆激酶液态发酵条件 的研究，生物加工过程，2012年，第10卷第4期，第26-29页)。

在中国，纳豆产业正处于快速发展阶段，新鲜纳豆以及以纳豆提取粉 为主要原料的复合饮料、糖果、饼干及保健食品等纳豆系列食品成为一大 消费热点。但是，由于纳豆激酶不稳定，纯化过程易变性，目前获得纳豆 激酶纯品非常困难，目前国内外尚未有纳豆激酶纯品或其制剂销售，也未 有纳豆激酶的药品。因此，本发明旨在提供一种生产、纯化纳豆激酶的方 法，解决纳豆激酶开发成药品的关键技术难题。

发明内容

为了克服现有技术的不足和满足市场需求，本发明的目的在于提供一 种可以产生纳豆激酶的新菌种。

本发明人经过多年大量深入细致地研究，从市售新鲜纳豆中分离纳豆 枯草芽孢杆菌菌株，以其作为出发菌株，诱变出一种新的纳豆枯草芽孢杆 菌(Bacillus subtilisnatto)ST1086，该诱变菌株以CGMCC No.17895保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区 北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2019年6月 5日。本发明人从市售新鲜纳豆中分离菌株，得到产纳豆激酶的菌种ST102。以ST102菌株作为出发菌株，进行紫外诱变，紫外诱变50代后得到形态 变异株ST1086，纳豆激酶产量提高11倍。以上形态变异以及纳豆激酶的 产量经数代传代培养较稳定。

本发明提供的新菌株CGMCC No.17895具有以下微生物学特性：革 兰氏阳性菌，芽孢中间生，芽孢大小0.6～0.8μm×1.0～1.5μm，菌体宽1μm， 长2-3μm。在LB琼脂培养基上，菌落表面饱满、褶皱、白，凸起，能拉 丝，菌落直径0.3-0.5cm，无色素，菌体培养10小时出现芽孢。

在本发明的一个方面，提供了应用本发明的新菌株CGMCC No.17895 生产纳豆激酶产品的方法，包括在培养基中培养本发明的菌株CGMCC No. 17895以在所述培养基中产生纳豆激酶。培养可以在本领域常规或已知的 装置和条件下进行，例如可以使用摇瓶在本领域常规或已知的转速下进 行；也可以在常规的发酵罐中进行，例如5L发酵罐、5T发酵罐。

在一些实施方案中，培养基包含碳源物质和氮源物质，且所述碳源物 质与所述氮源物质的比为10:1～1:2。在一些实施方案中，碳源物质选自葡 萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖和甘油中的一种或多种，氮源物质选自酵母粉、 蛋白胨、黄豆粉和鹰嘴豆粉中的一种或多种。

在又一些实施方案中，培养基还包含促进微生物的生长和提高纳豆激 酶的产率的有机物、无机物、或有机物和无机物的混合物。在一些实施方 案中，有机物为丝氨酸、甘氨酸、和丙氨酸中的一种或多种，无机物为镁 盐或钠盐。优选地，无机物为硫酸镁、氯化镁、氯化钠。

在另一些实施方案中，培养在35-45℃，优选37-40℃进行。在一些实 施方案中，培养持续10-48小时，优选12-24小时。

根据一些实施方案，所述方法包括在发酵过程中补加碳源物质或氮源 物质，或碳源物质和氮源物质的混合物。在一些实施方案中，所述方法还 包括以下步骤：(1)固液分离，以分离菌体和上清液；(2)用超滤膜分离， 得到纳豆激酶浓缩液，所述超滤膜的分子量范围优选在1000～50000D之 间，更优选在10000～30000D之间；(3)用1mmol/L NaCl溶液洗涤，使 所述纳豆激酶浓缩液的电导率≤300μs/cm，优选≤200μs/cm，更优选≤100 μs/cm；以及(4)干燥，所述干燥优选为喷雾干燥、冷冻干燥、真空干燥。 在一些实施方案中，固液分离使用本领域常规或已知的固液分离方法进 行，诸如陶瓷膜分离或离心。在一些实施方案中，在干燥步骤中加入保护 剂，所述保护剂优选为大豆蛋白粉、胶原蛋白粉、膳食纤维、微晶纤维素、 玉米淀粉或者其组合物，更优选为5-25％的大豆蛋白粉和2.5-12.5％膳食纤维。

根据一些实施方案，通过本发明的方法得到的纳豆激酶产品的活性为 6.5万-75万FU/g，相当于43.6万IU/g-502.5万IU/g。

在另一个方面，本发明还提供了由本发明的新菌株CGMCC No.17895 发酵培养的培养液制备纳豆激酶产品的方法。在一些实施方案中，所述方 法包括以下步骤：

(1)固液分离，所述固液分离使用本领域常规或已知的固液分离方 法进行，诸如陶瓷膜分离、离心，以分离菌体和发酵上清液；

(2)用超滤膜分离，得到纳豆激酶浓缩液，所述超滤膜的分子量范 围优选在1000～50000D之间，更优选在10000～30000D之间；

(3)用等渗盐溶液洗涤，使所述纳豆激酶浓缩液的电导率≤300 μs/cm，优选≤200μs/cm，更优选≤100μs/cm；以及

(4)干燥，所述干燥优选为喷雾干燥、冷冻干燥、真空干燥。

在一些实施方案中，在干燥过程中加入本领域常规的或者已知的保护 剂，例如大豆蛋白粉、胶原蛋白粉、膳食纤维、微晶纤维素、玉米淀粉或 者其组合物，优选5-25％的大豆蛋白粉和2.5-12.5％膳食纤维。

采用本发明的菌种CGMCC No.17895及本发明的发酵方法，周期短 16-24小时，产量高达12000IU/ml(相当于1791.0FU/ml)，最终纳豆激酶 产品活性在6.5万～75万FU/g，且在制剂工艺过程更加稳定。

具体实施方式

下面将通过实施例对本发明做进一步描述，这些描述并不是对本发明 内容做进一步限定。本领域的技术人员应理解，对本发明技术特征所做的 等同替换，或相应改进，仍属于本发明的保护范围之内。

在本发明中，纳豆激酶活性通过以下方法测定。

纳豆激酶活性的测定方法(一)

试液

1.PBS(phosphate buffer saline，磷酸缓冲盐溶液)缓冲液：

0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.5)：称取磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O) 3.58g，加双蒸水使溶解并稀释至1000mL为I液；取磷酸二氢钠 (NaH₂PO₄·2H₂O)0.78g，加双蒸水使溶解并稀释至500mL为II液；取I 液约84mL，II液约16mL，将二者混合至pH值为7.5。

将0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.5)与0.9％氯化钠溶液(1:17)混合， 得到PBS缓冲液。

2.1.5％琼脂糖溶液：取琼脂糖1.5g，加PBS缓冲溶液100mL，加热 溶解，50℃水浴保温。

3.纤维蛋白原溶液：取纤维蛋白原适量，加PBS缓冲溶液制成每1mL 中含1.5mg的可凝蛋白溶液。

4.凝血酶溶液：取凝血酶，加0.9％氯化钠溶液制成每1mL中含1BP 单位的溶液。

5.尿激酶标准品溶液的制备：

5.1尿激酶标准溶液(1000IU/mL)：取尿激酶一瓶，按标示效价加入 PBS缓冲溶液溶解，即为1000IU/mL尿激酶标准溶液。

5.2尿激酶工作标准溶液的配制，如下：

表1：

制备平板

取于50℃水浴5min的纤维蛋白原溶液39mL，置烧杯中，边搅拌边加 入50℃琼脂糖溶液39mL、凝血酶溶液3.0mL，立即混匀，快速全部倒入14cm的培养皿中，室温水平放置1小时，用直径为3mm的不锈钢小管(打 孔器)，在纤维蛋白平板上打若干个孔。

测定

精密量取不同浓度的尿激酶标准品溶液各10μL，分别点在同一琼脂糖 纤维蛋白平板中，加盖，置37℃恒温箱中反应18小时。取出测量溶圈直 径。计算溶圈面积，以溶圈面积对数为横坐标，浓度对数为纵坐标作回归 曲线，得出相应的回归方程。

根据预先估算的纳豆激酶活性，精密称取纳豆激酶样品于容量瓶中， 用适量PBS缓冲溶液溶解，超声15分钟后定容至刻度，使最终点样浓度 在200～400IU/mL。精密量取纳豆激酶样品溶液10μL，点在琼脂糖纤维蛋 白平板中，加盖，于37℃恒温箱中反应18小时。取出后测量溶圈直径， 计算溶圈面积，将样品溶圈面积代入回归方程，计算样品溶液的纳豆激酶 活性。

纳豆激酶活性的计算：

X＝C×V/M

其中：X：样品纳豆激酶活性，IU/g；

C：通过回归方程计算的上样样品液中纳豆激酶活性，IU/mL；

V：样品稀释总体积，mL；

M：样品质量，g。

纳豆激酶活性的测定方法(二)

以FU计的纳豆激酶活性定义为：

依据日本食品研究实验室之纳豆激酶活性分析方法(第104022640号) 分析纳豆激酶活性。

酶反应组

(1)取试管加入1.4mL PBS缓冲液及0.4mL 0.72％纤维蛋白原溶液， 混合均匀，于37±0.3℃水浴中反应5min。

(2)在上述试管中再加入0.1mL 20U/mL凝血酶溶液，并充分混合 均匀，于37±0.3℃水浴中反应10min。

(3)在步骤(2)的溶液准确反应第10分钟时，准确加入0.1mL测 试样品溶液，混合均匀，于37±0.3℃水浴中进行酶反应60分钟，并于30min 和50min时各摇匀一次。

(4)在步骤(2)的溶液准确反应至第60min时加入2mL 0.2M三氯 乙酸溶液终止酶反应，于37±0.3℃水浴中反应20min。

阴性对照管

(1)与酶反应组的步骤(1)和(2)相同，至准确反应第10分钟时， 首先加入2mL0.2M三氯乙酸溶液。

(2)接着加入0.1mL测试样品溶液，并充分混匀，于37±0.3℃水浴 中反应20min。

(3)反应终止后，将试管以12000rpm离心10min。

(4)将上清液转移到干净的试管中，为阴性对照管。以阴性对照管 为空白，于275nm处测定酶反应组的吸光值(OD，Optical Density)，并 记录。

纳豆激酶的活性以下列方式计算:

其中：X：样品纳豆激酶活性，FU/g或FU/mL；

Ar：酶反应组OD值；

Ac：阴性对照组OD值；

Ar-Ac：数值必须介于0.050～0.080之间；

60：表示反应时间(min)；

0.1：表示样品体积(mL)。

实施例1：从市售纳豆中分离产纳豆激酶的纳豆枯草芽孢杆菌

将纳豆(购自日本生物科技公司)用无菌水溶解、稀释后涂抹在固体 LB培养基平板上，于37℃恒温培养24小时，平板表面长出白色菌落， 用接种针挑取有拉丝现象。把白色菌落转移到LB斜面培养基上，于37℃ 培养24小时，用接种环接种于发酵培养基(100ml三角瓶装量20ml，培 养基配方：葡萄糖2％，蔗糖2％，黄豆粉3％，硫酸镁0.01％，氯化钠0.5％，丝氨酸0.08％)，37℃，270rpm振摇20小时，离心取上清，用琼脂糖纤维 蛋白平板法测定纳豆激酶含量，挑选溶圈直径较大的菌株，最终鉴定出产 纳豆激酶的纳豆枯草芽孢杆菌。

实施例2：产纳豆激酶的菌种诱变

以实施例1所得的纳豆枯草芽孢杆菌为出发菌株，进行紫外诱变：紫 外波长200-300nm，照射距离15-30cm，照射时间20s，经过50代诱变 得变异株ST-1086。该变异株ST-1086具有以下微生物学特性：革兰氏阳 性菌，芽孢中间生，芽孢大小0.6～0.8μm×1.0～1.5μm，菌宽1μm，长2-3 μm。在LB琼脂培养基上，菌落表面饱满、褶皱、白，凸起，能拉丝，直径0.3-0.5cm，无色素，菌体培养10小时出现芽孢。该变异株ST-1086保 藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳 区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2019年6 月5日，保藏号为：CGMCC No.17895。

实施例3：种子制备

将出发菌株和实施例2所得的CGMCC No.17895菌株分别接种至装 有20ml种子培养基(见表1)，于37-40℃，150-300rpm振摇培养箱培养 3-16小时，即得种子培养液。

表2：种子培养基：

成分	含量％
		葡萄糖	1.0
胰蛋白胨	1.0
		酵母提取物	0.5
NaCl	1.0
		纯水	补足至体积100ml
pH	7.0

实施例4：5L罐发酵

将实施例3所得种子培养液按照接种量占发酵培养基量的20％接种至 基础培养基(见表2)中，40℃培养，培养30分钟后开始流加补入补料培 养基(见表3)，每半小时加入补料培养基200ml，持续到10.5小时，共 补入2L补料培养基。培养过程pH值自然，溶解氧浓度控制在30％以上。 发酵周期17小时。纤维蛋白平板法测定纳豆激酶含量。

表3：基础培养基

成分	含量％
		黄豆粉	0.5
蔗糖	0.9
		葡萄糖	0.1
硫酸镁	0.05
		氯化钠	0.5
丝氨酸	0.01
		氢氧化钠	0.003
纯水	补足至体积100ml

表4：补料培养基

出发菌株用本方法得纳豆激酶产量为800IU/ml(相当于119.4FU/ml)， 将所得发酵液用陶瓷膜进行固液分离，所得透析液用10000D分子量的超 滤膜进行浓缩，浓缩液纳豆激酶活性为7000IU/ml(相当于1044.8FU/ml)， 纳豆激酶浓缩液加入15％大豆蛋白粉和5％膳食纤维(购自法国罗盖特公 司，小麦来源的水溶性膳食纤维)溶解后进行喷雾干燥。得到活性为1500 FU/g(相当于10050IU/g)的纳豆粉。

本发明的CGMCC No.17895菌株的纳豆激酶产量为7500IU/ml(相当 于1119.4FU/ml)，将所得发酵液用陶瓷膜进行固液分离，所得透析液用 10000D分子量的超滤膜进行浓缩，浓缩液纳豆激酶活性为150000IU/ml (相当于22388.1FU/ml)。所得纳豆激酶浓缩液加入12％的大豆蛋白粉和6％ 膳食纤维进行喷雾干燥。得活性为58000FU/g(相当于390000IU/g)的纳豆 粉。

实施例5

与实施例4不同之处在于，补料培养基中含有0.16％丝氨酸。本发明 的CGMCCNo.17895菌株的纳豆激酶发酵产量12000IU/ml(相当于 1791.0F U/ml)。

实施例6

与实施例4不同之处在于，补料培养基中含有0.16％甘氨酸。本发明 的CGMCCNo.17895菌株的纳豆激酶发酵产量9000IU/ml(相当于1343.3 FU/ml)。

实施例7

与实施例4不同之处在于，补料培养基中含有0.16％丙氨酸。本发明 的CGMCCNo.17895菌株的纳豆激酶发酵产量10000IU/ml(相当于 1492.5FU/ml)。

实施例8

与实施例4不同之处在于，补料培养基中含有0.16％丝氨酸和0.16％ 甘氨酸。本发明的CGMCC No.17895菌株的纳豆激酶发酵产量10500 IU/ml(相当于1567.2FU/ml)。

实施例9

与实施例4不同之处在于，补料培养基中含有0.16％丝氨酸和0.16％ 丙氨酸。本发明的CGMCC No.17895菌株的纳豆激酶发酵产量11000 IU/ml(相当于1641.8FU/ml)。

实施例10

与实施例4不同之处在于，补料培养基中含有0.16％甘氨酸和0.16％ 丙氨酸。本发明的CGMCC No.17895菌株的纳豆激酶发酵产量9500IU/ml (相当于1417.9FU/ml)。

实施例11

与实施例4不同之处在于，补料培养基中含有0.16％丝氨酸、0.16％ 甘氨酸和0.16％丙氨酸。本发明的CGMCC No.17895菌株的纳豆激酶发酵 产量10300IU/ml(相当于1537.3FU/ml)。

实施例12

取实施例4中CGMCC No.17895的发酵液，经孔径为0.1μm的陶瓷 膜进行固液分离，除去菌体，培养基等固体颗粒，得到含纳豆激酶的液体； 所得的含纳豆激酶的液体用截留分子量为10000D的超滤膜过滤、浓缩得 到纳豆激酶浓缩液；所得纳豆激酶浓缩液用30％饱和度的硫酸铵除杂，再 用70％饱和度的硫酸铵沉淀纳豆激酶，去除部分色素及多糖，得到纳豆激 酶沉淀；将纳豆激酶浓缩液沉淀用sephadex G25填料进行脱盐，用磷酸缓 冲液进行洗脱，上样量20％CV(柱体积)，流速40cm/h，收集脱盐的纳 豆激酶液；脱盐后的纳豆激酶液，用SP sepharose FF填料(购自GE)进行纯 化，上样量80～120mg/ml，流速120cm/h，得到去除色素多糖部分杂蛋白 的纳豆激酶液；取去除色素多糖的浓缩液，用分子筛填料superdex75进行 柱层析，去除剩余的杂蛋白条带，上样量5％CV，流速20cm/h,收集得到 含纳豆激酶单一条带的收集液；将单一条带的纳豆激酶的收集液用冻干机 进行冷冻干燥，得到700万FU/g(相当于4690万IU/g)的纳豆激酶纯品粉 末。

表5：

	活性浓度IU/ml(g)	回收率％
			发酵液	7500	100％
浓缩液	1.5×10<sup>5</sup>	95％
			30％硫酸铵盐析	1.4×10<sup>5</sup>	93％
70％硫酸铵盐析	2.0×10<sup>5</sup>	90％
			Sephadex G25柱层析	1.4×10<sup>5</sup>	81％
SP sepharose FF	3.1×10<sup>5</sup>	50％
			Superdex 75	5.2×10<sup>5</sup>	42％
冻干粉	4.7×10<sup>7</sup>	38％

实施例13

本实施例目的是CGMCC No.17895菌株的纳豆激酶按文献纯化方法 进行纯化，考察纯化过程中纳豆激酶活性的变化情况。

取实施例4中CGMCC No.17895的发酵液，经孔径为0.1μm的陶瓷 膜进行固液分离，除去菌体，培养基等固体颗粒，得到含纳豆激酶的液体； 所得纳豆激酶液体用截留分子量为10000D的超滤膜过滤、浓缩得到纳豆 激酶浓缩液7000IU/ml，浓缩液经过30％硫酸铵沉淀，再经过60％硫酸铵 沉淀，去除部分色素及多糖，得到纳豆激酶沉淀。沉淀用2M硫酸铵溶液 溶解成5％的溶液，用Phenyl Sepharose疏水柱层析，上样量20～60mg/ml， 流速60cm/h，用2M～0M的硫酸铵溶液线性梯度洗脱，洗脱20倍柱体积， 流速100cm/h，分步收集洗脱液，用SDS-PAGE检测洗脱液中纳豆激酶纯 度，得到了95％纯度的纳豆激酶纯品，层析流出液直接进行冷冻干燥，得 到500万FU/g(3350万IU/g)的纳豆激酶纯品粉末。

表6：

实施例14

与实施例12不同之处在于，取实施例4中出发菌株的发酵液，得到 600万FU/g(相当于4020万IU/g)的纳豆激酶纯品粉末。

表7：

	活性浓度IU/ml(g)	回收率％
			发酵液	8.0×10<sup>2</sup>	100％
浓缩液	1.1×10<sup>4</sup>	95％
			30％硫酸铵盐析	1.4×10<sup>4</sup>	93％
70％硫酸铵盐析	2.0×10<sup>4</sup>	90％
			Sephadex G25柱层析	1.4×10<sup>4</sup>	83％
SP sepharose FF	2.9×10<sup>4</sup>	49％
			Superdex 75	4.6×10<sup>4</sup>	35％
冻干粉	4.0×10<sup>7</sup>	32％

从实施例12、实施例13的结果可以看出，与现有技术方法相比，本 发明的纯化方法能显著提高纳豆激酶纯品的活性浓度。

从实施例12、实施例14的结果可以看出，与出发菌株相比，本发明 的CGMCCNo.17895菌株能够得到纳豆激酶活性浓度更高的纯品。

实施例15

与实施例5不同之处在于，将用本发明的CGMCC No.17895菌株发 酵所得的发酵液用10000D超滤膜浓缩后用0.1mmol/L NaCl溶液进行洗 涤，直到电导率为300μs/cm。电导率用电导计进行测量。所得纳豆激酶浓 缩液活性为30万IU/ml(相当于4.5万FU/ml)。浓缩液加入5％微晶纤维素 和5％的膳食纤维进行喷雾干燥。喷雾干燥条件：进风温度200℃，出风温 度45℃，风机速度70R/min，进料速度45L/h，干燥收率为45％。所得纳 豆粉活性为10.1万FU/g(67.8万IU/g)。

实施例16

与实施例5不同之处在于，将用本发明的CGMCC No.17895菌株发 酵所得的发酵液用10000D超滤膜浓缩后用0.1mmol/L NaCl溶液进行洗 涤，直到电导率为300μs/cm。电导率用电导计进行测量。所得纳豆激酶浓 缩液活性为30万IU/ml(相当于4.5万FU/ml)。浓缩液加入5％大豆蛋白粉 和5％的膳食纤维进行喷雾干燥，干燥收率为80％。所得纳豆粉活性为18 万FU/g(相当于120.6万IU/g)。大豆蛋白粉作为蛋白保护剂，能提高纳豆 激酶的稳定性；微晶纤维素只是赋形剂，提高浓缩液的固含量，有利喷雾 干燥工艺。

实施例17

与实施例5不同之处在于，将用本发明的CGMCC No.17895菌株发 酵所得的发酵液用10000D超滤膜浓缩后用0.1mmol/L NaCl溶液进行洗 涤，直到电导率为200μs/cm。所得纳豆激酶浓缩液活性为30万IU/ml(相 当于4.5万FU/ml)。浓缩液加入15％大豆蛋白粉和7.5％的膳食纤维进行喷 雾干燥，干燥收率为90％。所得纳豆粉活性为12.9万FU/g(86.1万IU/g)。

实施例18

与实施例5不同之处在于，将用本发明的CGMCC No.17895菌株发 酵所得的发酵液用10000D超滤膜浓缩后用0.1mmol/L NaCl溶液进行洗 涤，直到电导率为100μs/cm。所得纳豆激酶浓缩液活性为30万IU/ml(相 当于4.5万FU/ml)。浓缩液加入15％大豆蛋白粉和7.5％的膳食纤维和5％ 微晶纤维素进行喷雾干燥，干燥收率为98％。所得纳豆粉活性为12.4万 FU/g(相当于83.2万IU/g)。

实施例19

与实施例5不同之处在于，将用本发明的CGMCC No.17895菌株发 酵所得的发酵液用10000D超滤膜浓缩后用纯化水进行洗涤，直到电导率 为300μs/cm。所得纳豆激酶浓缩液活性为25万IU/ml(3.7万FU/ml)。浓 缩液5％大豆蛋白粉和5％的膳食纤维进行喷雾干燥，干燥收率为80％。所 得纳豆粉活性为16.4万FU/g(110万IU/g)。

实施例20

与实施例5不同之处在于，将用本发明的CGMCC No.17895菌株发 酵所得的发酵液用10000D超滤膜浓缩后用纯化水进行洗涤，直到电导率 为200μs/cm。所得纳豆激酶浓缩液活性为24万IU/ml(3.6万FU/ml)。浓 缩液加入15％大豆蛋白粉和7.5％的膳食纤维进行喷雾干燥，干燥收率为 90％。所得纳豆粉活性为10.8万FU/g(72.4万IU/g)。

实施例21

与实施例5不同之处在于，将用本发明的CGMCC No.17895菌株发 酵所得的发酵液用10000D超滤膜浓缩后用纯化水进行洗涤，直到电导率 为100μs/cm。所得纳豆激酶浓缩液活性为23万IU/ml(3.4万FU/ml)。浓 缩液加入15％大豆蛋白粉和7.5％的膳食纤维和5％微晶纤维素进行喷雾干 燥，干燥收率为98％。所得纳豆粉活性为9.7万FU/g(64.7万IU/g)。

实施例22

与实施例5不同之处在于，将用本发明的CGMCC No.17895菌株发 酵所得的发酵液用10000D超滤膜浓缩后用纯化水进行洗涤，直到电导率 为100μs/cm。所得纳豆激酶浓缩液活性为23万IU/ml(3.4万FU/ml)。浓 缩液进行喷雾干燥，干燥收率为50％。所得纳豆粉活性为21万FU/g(142 万IU/g)。

实施例23

采用实施例22、实施例15、实施例16、实施例17、实施例18所得 的纳豆粉，分别进行压片，考察不同的辅料对制剂工艺过程的稳定性。压 片工艺：纳豆粉加入30％鱼胶原蛋白、10％麦芽糊精、10％乳糖、30％微 晶纤维素，原、辅料分别过80目筛—混合—制粒—压片，测定纳豆激酶 压片前后的活性。结果如下表：

表8：

Claims (17)

1.一种纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtils natto)菌株，所述纳豆枯草芽孢杆菌菌株以CGMCC No.17895保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.一种生产纳豆激酶产品的方法，所述方法包括在培养基中培养根据权利要求1所述的纳豆枯草芽孢杆菌菌株以在所述培养基中产生纳豆激酶。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述培养基包含碳源物质和氮源物质，且所述碳源物质与所述氮源物质的比为10:1～1:2。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述碳源物质选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖和甘油中的一种或多种。

5.根据权利要求3和4中任一项所述的方法，其中所述氮源物质选自酵母粉、蛋白胨、黄豆粉和鹰嘴豆粉中的一种或多种。

6.根据权利要求2-5中任一项所述的方法，其中所述培养基还包含促进微生物的生长和提高纳豆激酶的产率的有机物、无机物、或有机物和无机物的混合物。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述有机物为丝氨酸、甘氨酸、和丙氨酸中的一种或多种。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述无机物为镁盐或钠盐，所述无机物优选为硫酸镁、氯化镁、氯化钠。

9.根据权利要求2-8中任一项所述的方法，其中培养在35-45℃，优选37-40℃进行。

10.根据权利要求2-9中任一项所述的方法，其中培养持续10-48小时，优选12-24小时。

11.根据权利要求2-10种任一项所述的方法，所述方法包括在发酵过程中补加碳源物质或氮源物质，或碳源物质和氮源物质的混合物。

12.根据权利要求2-11中任一项所述的方法，所述方法还包括以下步骤：

(1)固液分离，以分离菌体和上清液；

(2)用超滤膜分离，得到纳豆激酶浓缩液，所述超滤膜的分子量范围优选在1000～50000D之间，更优选在10000～30000D之间；

(3)用1mmol/L的等渗NaCl溶液洗涤，使所述纳豆激酶浓缩液的电导率≤300μs/cm，优选≤200μs/cm，更优选≤100μs/cm；

(4)干燥，所述干燥优选为喷雾干燥、冷冻干燥、真空干燥。

13.根据权利要求12所述的方法，其中固液分离使用陶瓷膜分离或离心进行。

14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述干燥步骤中加入保护剂，所述保护剂优选为大豆蛋白粉、胶原蛋白粉、膳食纤维、微晶纤维素、玉米淀粉或者其组合物，更优选为5-25％的大豆蛋白粉和2.5-12.5％膳食纤维。

15.一种纳豆激酶产品，所述纳豆激酶产品通过根据权利要求2-14中任一项所述的方法获得。

16.根据权利要求15所述的纳豆激酶产品，其中所述纳豆激酶产品的活性为6.5万-75万FU/g，相当于43.6万IU/g-502.5万IU/g。

17.如权利要求15或16所述的纳豆激酶产品在制备用于溶解血栓的药物中的用途。