CN110358712B - 一种乳酸菌组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种乳酸菌组合物，由嗜热链球菌inm25‑ST、德氏乳杆菌保加利亚亚种inm25‑LB及促进因子组成，该组合物用于提高清酒乳杆菌LZ217在发酵时的叶酸代谢能力；优点为：生产性能良好、稳定，能够投入工厂大批量生产。同时所得发酵产品具备良好的口感、质地和风味，保质期内乳清析出少，后酸化弱，活性叶酸含量高。

Description

一种乳酸菌组合物及其应用
技术领域
本发明涉及一种乳酸菌组合物及其应用。
背景技术
酸奶是一种传统发酵乳制品，具有丰富的营养和良好的益生保健价值，加上淳厚丝滑的口感，且易于消化吸收，深受人们的喜爱，近年来，随着我们人民消费水平的提高和健康理念的流行，酸奶产品每年以25％的速度在增长。酸奶发酵剂是酸奶生产中的关键要素，其品质好坏直接影响产品的感官质量和风味口感。
对于工业生产菌株而言，产香(乙醛、双乙酰等风味物质)、产粘(胞外多糖多聚物等)、抗后酸化等生产性能优良菌株的选育以及优良性能菌株的组合是酸奶发酵剂产业化的关键之一，近些年发酵乳产品普遍存在的问题是，工业化生产的酸乳产品质地稀薄，粘度低，保水能力差，在运输和储存过程中极易产生乳清大量析出的现象，严重影响产品品质，因此市面大部分乳制品采用添加琼脂、果胶或羟丙基二淀粉磷酸酯等增稠剂成分来提高酸乳品质。然而增稠剂的使用不仅会影响酸乳的风味也有悖于消费者对安全、无添加产品的追求。对生产者和消费者而言，迫切希望能使用性能优良的发酵剂菌株生产安全绿色的纯天然酸乳。
目前已有专利号：CN201510311918.2一种高产叶酸的乳酸菌菌株制作豆浆发酵乳的制作方法，清酒乳杆菌LZ217具有叶酸代谢能力，由于益生菌发酵的豆奶发酵乳具有豆的特殊风味，大部分人群不太接受，但是在牛乳中发酵时，叶酸产量很低，限制了它的应用。清酒乳杆菌LZ217存在发酵豆奶口味不佳问题以及牛乳中发酵时叶酸产量较低的问题。现有生产菌株产香、产粘、抗后酸化等生产性能不佳。
发明内容
本发明针对以上问题，提供一种乳酸菌组合物。
发明目的通过以下方案实现：一种乳酸菌组合物，由嗜热链球菌 inm25-ST、德氏乳杆菌保加利亚亚种inm25-LB及促进因子组成，该组合物用于提高清酒乳杆菌LZ217在发酵时的叶酸代谢能力。
进一步的，嗜热链球菌，菌株名称为inm25-ST，菌株的保藏编号为 CGMCCNo.15446，保藏日期为：2018年03月12日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
进一步的，德氏乳杆菌保加利亚亚种，菌株名称为inm25-LB，菌株的保藏编号为CGMCC No.15445，保藏日期为：2018年03月12日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
进一步的，嗜热链球菌inm25-ST和德氏乳杆菌保加利亚亚种 inm25-LB的菌数含量比为1000:1～1:1。
进一步的，德氏乳杆菌保加利亚亚种inm25-LB与嗜热链球菌 inm25-ST中添加了促进因子酵母萃取物，其添加量为0.001～10％(w/w)。
一种乳酸菌组合物的应用，该组合物接种应用于发酵乳中与清酒乳杆菌LZ217的菌数的比例关系是100：1～1:1。
本发明所提供的嗜热链球菌inm25-ST(Streptococcus thermophilus inm25-ST)的16S rDNA全序列为SEQ ID No.1所示。
本发明所提供的德氏乳杆菌保加利亚亚种inm25-LB(Lactobacillusdelbrueckii subsp.Bulgaricus inm25-LB)的16S rDNA全序列为SEQ ID No.2所示。
本发明的优点生产性能优良，实用性强；通过产粘好、产香快菌株的复配使用，发酵获得的酸奶气味上更为浓郁，质地黏软丝滑，后酸化弱。在运输和储存过程中乳清析出少，能较好地应用于实际生产；促使清酒乳杆菌LZ217的叶酸代谢能力更强；与清酒乳杆菌LZ217单菌发酵乳相比，本组合物配合清酒乳杆菌LZ217使用的发酵乳，在相同条件下使叶酸含量提高1.2倍以上。
附图说明
图1为嗜热链球菌inm25-ST的菌落形态图。
图2为嗜热链球菌inm25-ST革兰氏染色的菌体形态图。
图3为嗜热链球菌inm25-ST的16S rDNA的电泳鉴定图。
图4为德氏乳杆菌保加利亚亚种inm25-LB菌落涂片图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明：
下述实施实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1一种乳酸菌组合物，由嗜热链球菌inm25-ST、德氏乳杆菌保加利亚亚种inm25-LB及促进因子组成，该组合物用于提高清酒乳杆菌 LZ217在发酵时的叶酸代谢能力。
一种乳酸菌组合物，德氏乳杆菌保加利亚亚种，菌株名为inm25-LB，菌株的保藏编号为CGMCC No.15445，保藏日期为：2018年03月12日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明所提供的德氏乳杆菌保加利亚亚种inm25-LB序列所示。
gagtttgatc ctggctcatg acgatcgctg gcggcgtgcc taatacatgc aagtcgagcgagctgaattc aaagattcct tcggggtgat ttgttggatg ctagcggcgg atgggtgagt aacacgtgggcaatctgccc taaagactgg gataccactt ggaaacaggt gctaataccg gataacaaca tgaatcgcatgattcaagtt tgaaaggcgg cgtaagctgt cactttagga tgagcccgcg gcgcattagc tagttggtggggtaaaggcc taccaaggca atgatgcgta gccgagttga gagactgatc ggccacattg ggactgagacacggcccaaa ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccacaatgga cgcaagtctg atggagcaacgccgcgtgag tgaagaaggt tttcggatcg taaagctctg ttgttggtga agaaggatag aggcagtaactggtctttat ttgacggtaa tcaaccagaa agtcacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgtaggtggcaag cgttgtccgg atttattggg cgtaaagcga gcgcaggcgg aatgataagt ctgatgtgaaagcccacggc tcaaccgtgg aactgcatcg gaaactgtca ttcttgagtg cagaagagga gagtggaattccatgtgtag cggtggaatg cgtagatata tggaagaaca ccagtggcga aggcggctct ctggtctgcaactgacgctg aggctcgaaa gcatgggtag cgaacaggat tagataccct ggtagtccat gccgtaaacgatgagcgcta ggtgttgggg actttccagt cctcagtgcc gcagcaaacg cattaagcgc tccgcctggggagtacgacc gcaaggttga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggtttaattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctgtgctac acctagagat aggtggttcccttcggggac gcagagacag gtggtgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcccgcaacgagc gcaacccttg tctttagttg ccatcattaa gttgggcact ctaaagagac tgccggtgacaaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaag tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctacaatgggcagta caacgagaag cgaacccgcg agggtaagcg gatctcttaa agctgttctc agttcggactgcaggctgca actcgcctgc acgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat cagcacgccg cggtgaatacgttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatggaa gtctgcaatg cccaaagtcg gtgggataacctttatagga gtcagccgcc taaggcaggg cagatgactg gggtgaagtc gtaacaaggt agccgt
一种乳酸菌组合物，嗜热链球菌，菌株名为inm25-ST，菌株的保藏编号为CGMCCNo.15446，保藏日期为：2018年03月12日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明所提供的嗜热链球菌inm25-ST序列所示。
cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtagaac gctgaagagaggagcttgct cttcttggat gagttgcgaa cgggtgagta acgcgtaggt aacctgcctt gtagcgggggataactattg gaaacgatag ctaataccgc ataacaatgg atgacacatg tcatttattt gaaaggggcaattgttccac tacaagatgg acctgcgttg tattagctag taggtgaggt aatggctcac ctaggcgacgatacatagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggaggcagcagtagg gaatcttcgg caatgggggc aaccctgacc gagcaacgcc gcgtgagtga agaaggttttcggatcgtaa agctctgttg taagtcaaga acgggtgtga gagtggaaag ttcacactgt gacggtagcttaccagaaag ggacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtcccgagcg ttgtccggatttattgggcg taaagcgagc gcaggcggtt tgataagtct gaagttaaag gctgtggctc aaccatagttcgctttggaa actgtcaaac ttgagtgcag aaggggagag tggaattcca tgtgtagcgg tgaaatgcgtagatatatgg aggaacaccg gtggcgaaag cggctctctg gtctgtaact gacgctgagg ctcgaaagcgtggggagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg agtgctaggt gttggatcctttccgggatt cagtgccgca gctaacgcat taagcactcc gcctggggag tacgaccgca aggttgaaactcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaaccttaccaggtc ttgacatccc gatgctattt ctagagatag aaagttactt cggtacatcg gtgacaggtggtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccctattgttagttgcca tcattcagtt gggcactcta gcgagactgc cggtaataaa ccggaggaag gtggggatgacgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gttggtacaa cgagttgcgagtcggtgacg gcgagctaat ctcttaaagc caatctcagt tcggattgta ggctgcaact cgcctacatgaagtcggaat cgctagtaat cgcggatcag cacgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccgcccgtcacac cacgagagtt tgtaacaccc gaagtcggtg aggtaacctt ttggagccag ccgcctaaggtgggacagat gattggggtg aagtcgtaac aaggtaagcc gt
一种乳酸菌组合物，清酒乳杆菌菌株名为LZ217，菌株的保藏编号为:CGMCCNO.10259，保藏日期为：2014年12月29日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。专利号为：201510258884.5。
一种乳酸菌组合物，嗜热链球菌inm25-ST和德氏乳杆菌保加利亚亚种inm25-LB的菌数含量比为1000:1～1:1。
一种乳酸菌组合物，该组合物接种应用于发酵乳中与清酒乳杆菌 LZ217的菌数的比例关系是100：1～1:1。
一种乳酸菌组合物，德氏乳杆菌保加利亚亚种inm25-LB与嗜热链球菌inm25-ST中添加了促进因子酵母萃取物，其添加量为0.001～10％ (w/w)。促进因子酵母萃取物为酵母抽提物，如安琪酵母，乐斯福，且不限于以上两种。
一种乳酸菌组合物的应用，该组合物接种应用于发酵乳中与清酒乳杆菌LZ217的菌数的比例关系是100：1～1:1。
下表为本组合物与清酒乳杆菌菌株发酵后同先有发酵乳数据杜对比。
Figure RE-GDA0002167883680000051
注：叶酸含量检测方法为：GB5009.211-2014
实施例2嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种的菌株筛选方法
优良产粘、产香嗜热链球菌的筛选
以单菌株发酵乳质地、粘度、模拟运输后的乳清析出情况、产风味情况为衡量指标，从200余株嗜热链球菌中优选4株，作为为备选嗜热链球菌菌株。
优良后酸化性能德氏乳杆菌保加利亚亚种的筛选
以单菌株发酵乳的低温(4℃7d)酸度变化、发酵终点(80oT)时间为衡量指标，从100余株德氏乳杆菌保加利亚亚种中优选4株，作为为备选德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株。
促进清酒乳杆菌lz217生长及叶酸代谢的组合物的筛选
以优选的4株嗜热链球菌菌株和优选的4株德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株为研究对象，从中选择一株球菌和一株杆菌，形成多个(4*4＝16)的双菌株组合(杆菌：球菌比例固定为1：10)与清酒乳杆菌LZ217共同接种(嗜热链球菌菌株与清酒乳杆菌LZ217的比例固定在10：1，发酵剂的接种量固定为106cfu/mL。即每毫升原料乳接种106cfu上述酸奶发酵乳酸菌组合)制备发酵乳，测定发酵乳中叶酸含量，优选出最佳组合物，即为德氏乳杆菌保加利亚亚种inm25-LB和嗜热链球菌inm25-ST。
实施例3乳酸菌组合物的制备
1、发酵乳酸菌菌株培养与计数
将甘油管保藏的嗜热链球菌inm25-ST和德氏乳杆菌保加利亚亚种 inm25-LB分别经2～3次活化培养后，嗜热链球菌菌株inm25-ST接入M17 液体培养基，42℃培养16h，德氏乳杆菌保加利亚亚种inm25-LB接入MRS 液体培养基，42℃培养20h，无菌条件下，3000rpm、6min离心沉淀菌体，去除上清液，收集菌体。分别计算菌数含量。
2、菌株组合物制备
根据菌数含量，将嗜热链球菌inm25-ST和德氏乳杆菌保加利亚亚种 inm25-LB按1000：1～1：1菌数含量混合。形成多组分发酵剂培养物。
3、添加促进代谢因子
德氏乳杆菌保加利亚亚种inm25-LB、嗜热链球菌inm25-ST混合物中添加了酵母萃取物，其添加量为0.001～10％(w/w)。
实施例4乳酸菌组合物制备发酵乳
1、发酵乳酸菌菌株培养与计数
将甘油管保藏的嗜热链球菌inm25-ST和德氏乳杆菌保加利亚亚种 inm25-LB分别经2～3次活化培养后，嗜热链球菌菌株inm25-ST接入M17 液体培养基，42℃培养16h，德氏乳杆菌保加利亚亚种inm25-LB接入MRS 液体培养基，42℃培养20h，无菌条件下，3000rpm、6min离心沉淀菌体，去除上清液，收集菌体。分别计算菌数含量。
2、菌株组合物制备
根据菌数含量，将嗜热链球菌inm25-ST和德氏乳杆菌保加利亚亚种 inm25-LB按1000：1～1：1菌数含量混合。形成多组分发酵剂培养物。
3、添加促进代谢因子
德氏乳杆菌保加利亚亚种inm25-LB、嗜热链球菌inm25-ST混合物中添加了酵母萃取物，其添加量为0.001～10％(w/w)。
清酒乳杆菌LZ217的菌株培养物制备
将甘油管保藏的清酒乳杆菌LZ217分别经2～3次活化培养后，清酒乳杆菌LZ217接入MRS液体培养基，37℃培养20h，无菌条件下，3000rpm、 6min离心沉淀菌体，去除上清液，收集菌体。分别计算菌数含量。
发酵乳的制备
根据菌数含量，向嗜热链球菌inm25-ST、德氏乳杆菌保加利亚亚种 inm25-LB及酵母萃取物组成的混合物里添加清酒乳杆菌LZ217，嗜热链球菌菌株与清酒乳杆菌LZ217的比例为100：1～1：1，即为发酵剂,向灭菌原料乳中添加以上方法制备的发酵剂，接种量为104～108cfu/mL。即每毫升原料乳接种104～108cfu上述发酵剂。在43度发酵4-8h后，即为发酵乳产品。
实施例5德氏乳杆菌保加利亚亚种inm25-LB的筛选
1.1样品来源
样品采自于四川阿坝藏族自治区红原县、诺尔盖县等地藏族牧民的传统牦牛奶发酵酸乳，样品未添加商业发酵剂，牧民沿袭传统发酵方式转接牦牛奶发酵而成。
1.2菌株的分离纯化
以无菌操作称取25g样品，放入装有225ml无菌生理盐水的锥形瓶中 (瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)，充分震荡摇匀，用无菌生理盐水进行十倍梯度稀释，选取适宜稀释度的样品稀释液，涂布于MRS固体培养基上，置于37℃培养48h。培养结束后，从琼脂培养基中选择生长有50-150 个单菌落的平板，挑取具有粘性的菌落，在MRS琼脂平板上多次划线纯化，直至整个平板上的菌落形态一致，挑取单菌落到MRS液体培养基增菌培养。得到的菌株均在含40％甘油的MRS液体培养基中于-80℃冷冻保存。
2.德氏乳杆菌保加利亚亚种inm25-LB的鉴定
2.1菌落特征
德氏乳杆菌保加利亚亚种inm25-LB在MRS琼脂培养基培养48h后，呈现圆形，直径在0.1-0.2mm之间，白色，边缘整齐的湿润菌落。
2.2显微镜下形态
德氏乳杆菌保加利亚亚种inm25-LB菌落涂片：革兰氏染色呈阳性，不生芽，杆状，见图4。
2.3 16S rDNA鉴定
用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取目标菌株基因组DNA，将提取的乳酸菌基因组DNA作为PCR扩增的模板，采用细菌通用引物27F和 1492R进行16S rDNA的PCR实验，PCR反应扩增结束后，取PCR产物进行琼脂糖凝胶检测拍照，扩增片段长度为1.5kb左右。将PCR产物送至生工生物工程(上海)有限公司进行测序，结果如SEQ ID NO.1所示，在NCBI 网站上进行BLAST序列比对，结果显示该序列与德氏乳杆菌保加利亚亚种的16S rDNA序列同源性超过99％。
将菌株inm25-LB的序列比对结果和生理生化结果相结合，确定筛选的乳酸菌inm25-LB为德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)。
一种乳酸菌组合物，M17固体培养基：大豆胨5.0g/L，蛋白胨2.5g/L，酪蛋白胨2.5g/L，酵母浸粉2.5g/L，牛肉浸粉5.0g/L，乳糖5.0g/L，抗坏血酸钠0.5g/L，β-甘油磷酸钠19.0g/L，硫酸镁0.25g/L，琼脂 12.75g/L，调节pH至7.2±0.2.
一种乳酸菌组合物，灭菌脱脂牛乳；脱脂乳粉以12％(w/v)比例溶于蒸馏水中，55℃加热平衡，115℃保持10min灭菌。
样品1为嗜热链球菌AB0603。
样品3为嗜热链球菌AB2302。
一种乳酸菌组合物，乳酸菌高产胞外多糖，其胞外多糖产量为： 476.3-644.0mg/L。
一种乳酸菌组合物，胞外多糖从所述嗜热链球菌(Streptococcus thermophilusinm25-ST)发酵的高含胞外多糖的脱脂酸乳中提取得到。
一种乳酸菌组合物，脱脂酸乳按照如下步骤的方法制备得到：将嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus inm25-ST)按2-5％(v/v)比例接种到11-13％(w/v)的灭菌脱脂乳中发酵4.5-5.5h，培养温度为37-43℃。
一种乳酸菌组合物，乳酸菌筛选自四川阿坝藏族自治州地区的传统牦牛发酵乳。
一种胞外多糖，将inm25-ST发酵的脱脂酸乳通过等电点法除酪蛋白，酶解后，用三氯乙酸沉淀离心，取上清液用乙醇沉淀，将所述沉淀溶解于超纯水后再用超纯水透析，即得。
一种乳酸菌组合物，实验测得本菌株inm25-ST发酵所得的酸乳酸度为72-78°T，酸乳黏度为7500-8500mPa﹒s，凝乳时间为4.5-5.5h，酸乳持水力为50-65％，冷藏期7天后酸度增加了3.5-5°T。
一种乳酸菌组合物的制备方法，所述嗜热链球菌(Streptococcus thermophilusinm25-ST)在M17液体培养基中提前活化培养。
一种乳酸菌组合物，从M17培养基中挑取具有拉丝倾向的乳酸菌菌落，纯化培养，然后接种于灭菌脱脂牛奶进行发酵，选取发酵乳质地粘稠，拉丝明显的乳酸菌。
一种乳酸菌组合物，嗜热链球菌inm25-ST或嗜热链球菌inm25-ST发酵剂，按2-5％(v/v)比例接种到11-13％(w/v)的灭菌脱脂乳中发酵 4.5-5.5h，发酵温度为37-43℃，所述发酵乳具有高含胞外多糖，质地粘稠，低脂，风味丰富的特点，适用于糖尿病患者、肥胖患者。
实施例6嗜热链球菌inm25-ST的筛选及鉴定：
1.嗜热链球菌inm25-ST的筛选
1.1样品来源
样品采自于四川阿坝藏族自治区红原县、诺尔盖县等地藏族牧民的传统牦牛奶发酵酸乳，共采集26份样品，采样点远离公路和城镇，取样点距离在10公里以上，样品未添加商业发酵剂，牧民沿袭传统发酵方式转接牦牛奶发酵而成。
1.2菌株的分离纯化
以无菌操作称取25g样品，放入装有225ml无菌生理盐水的锥形瓶中 (瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)，充分震荡摇匀，用无菌生理盐水进行十倍梯度稀释，选取适宜稀释度的样品稀释液，涂布于M17固体培养基上，置于43℃培养48h。培养结束后，从琼脂培养基中选择生长有50-150 个单菌落的平板，挑取具有粘性的菌落，在M17琼脂平板上多次划线纯化，直至整个平板上的菌落形态一致，挑取单菌落到M17液体培养基增菌培养。得到的菌株均在含40％甘油的M17液体培养基中于-80℃冷冻保存。
2.嗜热链球菌inm25-ST的鉴定
2.1菌落特征
嗜热链球菌inm25-ST在M17琼脂培养基培养48h后，呈现圆形，直径在0.1-0.2mm之间，白色，边缘整齐的湿润菌落，见图1。
2.2显微镜下形态
嗜热链球菌inm25-ST菌落涂片：革兰氏染色呈阳性，不生芽，球形，成对或成链状，见图2。
2.3 16S rDNA鉴定
用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取目标菌株基因组DNA，将提取的乳酸菌基因组DNA作为PCR扩增的模板，采用细菌通用引物27F和 1492R进行16S rDNA的PCR实验，PCR反应扩增结束后，取PCR产物进行琼脂糖凝胶检测拍照，扩增片段长度为1.5kb左右，见图3。将PCR产物送至生工生物工程(上海)有限公司进行测序，结果如SEQ ID NO.1所示，在NCBI网站上进行BLAST序列比对，结果显示该序列与嗜热链球菌的16S rDNA序列同源性超过99％。
将菌株inm25-ST的序列比对结果和生理生化结果相结合，确定筛选的乳酸菌inm25-ST为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)。
实施例7嗜热链球菌inm25-ST制备脱脂酸乳
1.脱脂酸乳的制备
将保藏于-80℃的40％(v/v)冷冻甘油管中的乳酸菌，按2％(v/v) 比例接种到M17液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，制备种子液。将活化后的种子液继续按2％(v/v)比例接种于12％(w/v)的灭菌脱脂乳中，43℃静置培养，以滴定酸度>70°T为发酵终点，置于4℃冷藏 24h，得到不需要添加增稠剂的酸乳。
2.酸乳理化指标测定
2.1酸乳发酵时间的测定
将活化后的菌株种子液按2％(v/v)比例接种于12％(w/v)的灭菌脱脂乳中，43℃静置培养，以滴定酸度>70°T为发酵终点，记录发酵时间，三次平行实验，取平均值。
实验测得嗜热链球菌inm25-ST凝乳时间为280-320min。
2.2酸乳滴定酸度的测定
根据GB 5009.239-2016，称取10g(精确到0.001g)已混匀的试样，置于150ml锥形瓶中，加20ml新煮沸冷却至室温的水，混匀，加入2.0ml 酚酞试剂指示液，混匀后用氢氧化钠标准溶液滴定，边滴边转动烧瓶，直到颜色与参比溶液颜色相似，且5s内不消退，整个滴定过程应在45s内完成，滴定过程中，向锥形瓶中吹氮气，防止溶液吸收空气中的二氧化碳，记录消耗的氢氧化钠标准溶液毫升数(V1)，代入下式(1)进行计算。
Figure RE-GDA0002167883680000111
式中：
X1——样品的酸度，单位为度(°T)[以100g样品所消耗的0.1mol/L 氢氧化钠的毫升数计，单位为毫升每100克(ml/100g)]；
c1——氢氧化钠标准溶液的摩尔浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；
V1——滴定时所消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单位为毫升(ml)；
V0——空白实验所消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单位为毫升(ml)；
100——100g样品；
m1——样品的质量，单位克(g)；
0.1——酸度理论定义氢氧化钠的摩尔浓度，单位为摩尔每升 (mol/L)。
以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算数平均值表示，结果保留三位有效数字。
实验测得嗜热链球菌inm25-ST发酵酸乳的终点酸度为75～80°T。
2.3酸乳粘度的测定
采用流变仪(博勒飞公司DV2T型)，在4℃下测试粘度，转子型号为 64，分别在50r/min的速度下测定三次，选取第20s的数据为测量值，每个样品做三个平行试样，结果取算数平均值。
实验测得嗜热链球菌inm25-ST发酵酸乳的粘度为7754mPa﹒s。
2.4酸乳脱水收缩敏感性的测定
取20g样品置于一个装有定量滤纸的漏斗中，室温条件下静置过滤 2h，收集滤液，并按式(3)计算持水率。
Figure RE-GDA0002167883680000121
式中
W1——收集的滤液的质量，单位克(g)；
W2——样品的质量，单位克(g)。
以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算数平均值表示，结果保留三位有效数字。
实验测得嗜热链球菌inm25-ST发酵酸乳的持水力为55-60％。
2.5感官评定
由8位食品专业师生进行感官评价：(1)色泽评定：将适量酸乳放入烧杯中，在日光灯下观察其色泽。(2)滋味和气味评定：打开封盖后马上闻气味，然后用温水漱口，再品尝滋味。(3)组织状态评定：将酸乳倾斜倒在光滑的黑瓷板上，略微倾斜转动，仔细观察组织状态。感官评价总分100分，其中色泽10分，滋味和气味40分，组织状态50分。评分标准见表1。
表1感官评价评分标准
Figure RE-GDA0002167883680000122
Figure RE-GDA0002167883680000131
实验测得嗜热链球菌inm25-ST发酵酸乳的理化指标测定结果见表2。
表2菌株发酵理化指标测定结果
Figure RE-GDA0002167883680000132
2.6酸乳后酸化的测定
将活化后的菌株按2％(v/v)比例接种于12％(w/v)的灭菌脱脂乳中， 43℃静置培养，发酵完成后放入4℃冷藏，测定冷藏1d、3d、5d、7d时的滴定酸度。实验测得嗜热链球菌inm25-ST发酵酸乳的后酸化结果见表3。
表3保质期内酸度测定结果
Figure RE-GDA0002167883680000133
Figure RE-GDA0002167883680000141
实施例8嗜热链球菌inm25-ST的胞外多糖的制备
脱脂酸乳的制备
见“1.脱脂酸乳的制备”部分的记载。
胞外多糖的提取
等电点法除酪蛋白：取发酵乳样品50g,用饱和氢氧化钠调样液pH至 8.0,4000g/min，离心20min，上清液用HCl溶液调pH至4.6,4000g/min，离心20min，取上清液；
酶解：调节pH至7.5，加入1/10体积的胰酶液(浓度为3g/L，现配现用)，40℃水浴，酶解2.5h后，4000g/min，离心30min，取上清液；
三氯乙酸法除蛋白：加入80％(w/v)的三氯乙酸溶液至终浓度为10％，使蛋白质变性，4℃沉淀1h后，12000g/min，离心40min，收集上清液；
乙醇沉淀：加入4倍体积预冷的无水乙醇，4℃沉淀过夜，12000g/min，离心40min，收集沉淀，重溶于超纯水中；
透析：装入透析袋(截留分子量14000Da)，4℃超纯水透析48h，每 8h换水；冷冻干燥48h。
3.粗多糖纯度鉴定
采用紫外-可见光谱法分析粗多糖纯度。
称取提取出的粗多糖0.5mg，溶于5ml超纯水中，制成0.1mg/mL的多糖溶液，用紫外可见光谱仪于190-350nm波段进行紫外扫描。如果在 260nm、280nm处有紫外特征吸收峰，则表明样品纯度不高；反之，则可以认为样品基本不含核酸和蛋白质，保证了一定的纯度。
实验测得嗜热链球菌inm25-ST在260nm、280nm波长处没有紫外特征吸收峰。
4.多糖含量测定
采用苯酚-浓硫酸法测定胞外多糖含量，用葡萄糖做标准曲线。取适量分析纯葡萄糖置于鼓风干燥箱中80℃干燥2h，冷却后精确称取4mg葡萄糖于100mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，配制成葡萄糖标准溶液 (40ug/ml)。准确吸取葡萄糖标准溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、 1.00、1.20、1.40、1.60、1.80ml，及样品备用液0.2ml，置于具塞刻度试管中，再加入6％(v/v)苯酚溶液1ml,混匀后静置2min，迅速加入5mL 浓硫酸，混匀静置10min后30℃水浴加热15min，取出，置于冷水中冷却，以空白溶液为对照，测定490nm波长处的吸光度，每组做3个平行。以葡萄糖含量(mg/L)为横坐标，吸光度值(A490)为纵坐标绘制标准曲线。
将发酵乳样品中提取的多糖溶解于5ml水中，按上述方法测得胞外多糖含量测定结果见下表4，实验测得嗜热链球菌inm25-ST胞外多糖产量为 476.3-644.0mg/L。
表4苯酚-硫酸法测定胞外多糖含量结果
样品编号 胞外多糖mg/L
1 68.8-101.8
inm25-ST 476.3-644.0
3 12-36.3
表5为现有专利中嗜热链球菌产胞外多糖的含量，相比可知，本专利嗜热链球菌inm25-ST是产胞外多糖的优势菌株。
表5现有专利嗜热链球菌产胞外多糖的比较
Figure RE-GDA0002167883680000151
Figure RE-GDA0002167883680000161
虽然本发明已通过参考优选的实施例进行了描述，但是，本领域普通技术人员应当了解，可以不限于上述实施例的描述，在权利要求书的范围内，可作出形式和细节上的各种变化。
Figure RE-GDA0002167883680000162
Figure RE-GDA0002167883680000171
Figure RE-GDA0002167883680000181
序列表
<110> 浙江一鸣食品股份有限公司
<120> 一种乳酸菌组合物及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1502
<212> DNA
<213> 嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)
<400> 1
cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtagaac gctgaagaga 60
ggagcttgct cttcttggat gagttgcgaa cgggtgagta acgcgtaggt aacctgcctt 120
gtagcggggg ataactattg gaaacgatag ctaataccgc ataacaatgg atgacacatg 180
tcatttattt gaaaggggca attgttccac tacaagatgg acctgcgttg tattagctag 240
taggtgaggt aatggctcac ctaggcgacg atacatagcc gacctgagag ggtgatcggc 300
cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcgg 360
caatgggggc aaccctgacc gagcaacgcc gcgtgagtga agaaggtttt cggatcgtaa 420
agctctgttg taagtcaaga acgggtgtga gagtggaaag ttcacactgt gacggtagct 480
taccagaaag ggacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtcccgagcg 540
ttgtccggat ttattgggcg taaagcgagc gcaggcggtt tgataagtct gaagttaaag 600
gctgtggctc aaccatagtt cgctttggaa actgtcaaac ttgagtgcag aaggggagag 660
tggaattcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatatgg aggaacaccg gtggcgaaag 720
cggctctctg gtctgtaact gacgctgagg ctcgaaagcg tggggagcga acaggattag 780
ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg agtgctaggt gttggatcct ttccgggatt 840
cagtgccgca gctaacgcat taagcactcc gcctggggag tacgaccgca aggttgaaac 900
tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac 960
gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatccc gatgctattt ctagagatag aaagttactt 1020
cggtacatcg gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt 1080
taagtcccgc aacgagcgca acccctattg ttagttgcca tcattcagtt gggcactcta 1140
gcgagactgc cggtaataaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct 1200
tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gttggtacaa cgagttgcga gtcggtgacg 1260
gcgagctaat ctcttaaagc caatctcagt tcggattgta ggctgcaact cgcctacatg 1320
aagtcggaat cgctagtaat cgcggatcag cacgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt 1380
gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt tgtaacaccc gaagtcggtg aggtaacctt 1440
ttggagccag ccgcctaagg tgggacagat gattggggtg aagtcgtaac aaggtaagcc 1500
gt 1502
<210> 2
<211> 1526
<212> DNA
<213> 德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)
<400> 2
gagtttgatc ctggctcatg acgatcgctg gcggcgtgcc taatacatgc aagtcgagcg 60
agctgaattc aaagattcct tcggggtgat ttgttggatg ctagcggcgg atgggtgagt 120
aacacgtggg caatctgccc taaagactgg gataccactt ggaaacaggt gctaataccg 180
gataacaaca tgaatcgcat gattcaagtt tgaaaggcgg cgtaagctgt cactttagga 240
tgagcccgcg gcgcattagc tagttggtgg ggtaaaggcc taccaaggca atgatgcgta 300
gccgagttga gagactgatc ggccacattg ggactgagac acggcccaaa ctcctacggg 360
aggcagcagt agggaatctt ccacaatgga cgcaagtctg atggagcaac gccgcgtgag 420
tgaagaaggt tttcggatcg taaagctctg ttgttggtga agaaggatag aggcagtaac 480
tggtctttat ttgacggtaa tcaaccagaa agtcacggct aactacgtgc cagcagccgc 540
ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg atttattggg cgtaaagcga gcgcaggcgg 600
aatgataagt ctgatgtgaa agcccacggc tcaaccgtgg aactgcatcg gaaactgtca 660
ttcttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccatgtgtag cggtggaatg cgtagatata 720
tggaagaaca ccagtggcga aggcggctct ctggtctgca actgacgctg aggctcgaaa 780
gcatgggtag cgaacaggat tagataccct ggtagtccat gccgtaaacg atgagcgcta 840
ggtgttgggg actttccagt cctcagtgcc gcagcaaacg cattaagcgc tccgcctggg 900
gagtacgacc gcaaggttga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag 960
catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctgtgctac 1020
acctagagat aggtggttcc cttcggggac gcagagacag gtggtgcatg gctgtcgtca 1080
gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg tctttagttg 1140
ccatcattaa gttgggcact ctaaagagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga 1200
tgacgtcaag tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atgggcagta 1260
caacgagaag cgaacccgcg agggtaagcg gatctcttaa agctgttctc agttcggact 1320
gcaggctgca actcgcctgc acgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat cagcacgccg 1380
cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatggaa gtctgcaatg 1440
cccaaagtcg gtgggataac ctttatagga gtcagccgcc taaggcaggg cagatgactg 1500
gggtgaagtc gtaacaaggt agccgt 1526

Claims (4)

1.一种乳酸菌组合物，其特征在于：由嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus）及酵母抽提物组成，该组合物用于提高清酒乳杆菌（Lactobacillus sakei）在发酵时的叶酸代谢能力;
嗜热链球菌，菌株名称为inm25-ST，菌株的保藏编号为CGMCC No.15446，保藏日期为：2018年03月12日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号;
德氏乳杆菌保加利亚亚种，菌株名称为inm25-LB，菌株的保藏编号为CGMCC No.15445，保藏日期为：2018年03月12日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号;
清酒乳杆菌，菌株名称为LZ217，菌株的保藏编号为CGMCC No. 10259，保藏日期为：2015年03月12日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.根据权利要求1所述的一种乳酸菌组合物，其特征在于：嗜热链球菌inm25-ST和德氏乳杆菌保加利亚亚种inm25-LB的菌数含量比为1000:1～1:1。
3.根据权利要求1所述的一种乳酸菌组合物，其特征在于：德氏乳杆菌保加利亚亚种inm25-LB与嗜热链球菌inm25-ST中添加了酵母抽提物，其添加量为0.001～10%（w/w）。
4.一种根据权利要求1所述的乳酸菌组合物的应用，其特征在于：该组合物用于提高清酒乳杆菌LZ217的叶酸代谢能力。
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