CN105339487A - 富含维生素发酵物的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的原理提供用于自然地使饮料富含多种维生素的新的组合物和方法。所述方法包括发酵饮料(例如水果果汁)，在单一步骤中使用能生产至少四种维生素(例如维生素B12、维生素K、叶酸、和生物素)的微生物。

Description

富含维生素发酵物的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年10月17日提交的美国临时申请61/715,137的权益，该临时申请的全文引入本申请作为参考。
技术领域
本发明的原理总体上涉及饮料发酵技术领域。特别是，本发明的原理提供组合物和方法用于在饮料中自然地生产维生素，从而改善营养价值。
背景技术
维生素对于正常生长和发育以及对于细胞、组织、和器官的健康维持是必须的。毫不奇怪，维生素缺乏与许多生理失调相关。通常使用膳食补充剂以保证每天获得充足量的这些必需营养素。希望有新的改良的饮料配方以满足变化的市场需求。特别是，对于具有自然衍生的替代营养特性(例如，增加的维生素含量)的饮料有相当大的市场需求。因此，开发具有令人满意的营养特性和风味形廓的新的饮料配方对于饮料工业来说代表着持续的挑战。
发明内容
发明概述
在一个方面，本发明的原理提供了一种发酵饮料组合物。在一个实施方案中，相对于未发酵的等同饮料，所述发酵饮料包括增加的维生素B12、维生素K、叶酸、和生物素。在另一个实施方案中，无外源的维生素B12、维生素K、叶酸、或生物素被添加到所述发酵饮料中。
在某些实施方案中，所述发酵饮料包括从约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约15倍、至约20倍推荐每日摄入量(RDI)的维生素B12、维生素K、叶酸、和生物素。在一些实施方案中，所述维生素的任何组合可以按照任何上述量增加。当与未发酵的对应饮料相比时，至少这4种维生素中的每种都能增加到可检测的量。
在另一个实施方案中，所述发酵饮料是水果果汁。在某些实施方案中，所述水果果汁是选自由葡萄柚、樱桃、大黄(rhubarb)、香蕉、西番莲果(passionfruit)、荔枝、葡萄、苹果、橙子、芒果、李子(plum)、西梅(prune)、蔓越橘、菠萝、桃、梨、杏、蓝莓、木莓(raspberry)、草莓、黑莓、越橘(huckleberry)、波森莓(boysenberry)、桑葚(mulberry)、鹅莓(gooseberry)、草原果(prairieberry)、接骨木果(elderberry)、罗干梅(loganberry)、露莓(dewberry)、石榴、木瓜、柠檬、青柠(lime)、橘子、西番莲果(passionfruit)、猕猴桃、柿子、红醋栗、柑橘(quince)、和番石榴，或其组合组成的组中的至少一种。应理解还可以包括额外的或替代的水果果汁。
在一个实施方案中，所述发酵饮料包括从约1％、约2％、约3％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、或约80％重量的水果果汁。
在一些实施方案中，所述发酵饮料选自由蔬菜汁、大豆、麦芽、牛奶、谷物、咖啡、或糖/水混合物组成的组。
在某些实施方案中，所述发酵饮料包括非营养性甜味剂。在一些实施方案中，所述非营养性甜味剂包括选自由甜叶菊提取物、甜菊苷、阿斯巴甜、糖精、和三氯蔗糖组成的组中的至少一种。在一个实施方案中，所述非营养性甜味剂是莱鲍迪苷A(RebA)。在另一个实施方案中，所述发酵饮料包括营养性甜味剂。在一些实施方案中，所述营养性甜味剂包括选自由蔗糖、果糖、和葡萄糖组成的组中的至少一种。在某些实施方案中，所述发酵饮料包括添加剂，所述添加剂选自由盐、食品级酸、着色剂、防腐剂、抗坏血酸、能量促进剂、和维生素组成的组。
在另一个方面，本发明的原理提供了一种生产发酵饮料的方法。在一个实施方案中，相对于未发酵的等同饮料，所述方法增加维生素B12、维生素K、叶酸、和生物素。在一些实施方案中，所述方法包括用能够生产维生素的微生物发酵饮料。在一个实施方案中，所述微生物生产维生素B12、维生素K、叶酸、和生物素。当与未发酵的等同饮料相比时，所述方法导致发酵饮料具有增加的维生素B12、维生素K、叶酸、和生物素。在另一个实施方案中，无外源的维生素B12、维生素K、叶酸、和生物素被添加。
在某些实施方案中，所述方法包括增加所述维生素B12、维生素K、叶酸、和生物素的含量从约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约15倍、至约20倍推荐每日摄入量(RDI)。所述维生素能按照相对于彼此相似或不同的量增加。当与未发酵的对应饮料相比时，至少这4种维生素中的每种都能增加到可检测的量。在一个实施方案中，维生素B12增加1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约15倍、至约20倍推荐每日摄入量(RDI)，维生素K增加1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约15倍、至约20倍推荐每日摄入量(RDI)，叶酸增加1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约15倍、至约20倍推荐每日摄入量(RDI)，以及生物素增加1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约15倍、至约20倍推荐每日摄入量(RDI)，或其组合。
在一个实施方案中，所述方法包括用细菌发酵饮料的步骤。在一些实施方案中，所述方法包括用来自丙酸杆菌属(Propionibacterium)的细菌生产发酵饮料。在另一个实施方案中，所述方法包括用细菌费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichii)生产发酵饮料。在一个实施方案中本公开提供了乳酸菌菌株，所述乳酸菌菌株选自由费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichii)CHCC15460菌株和其衍生的突变体组成的组，所述费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichii)CHCC15460菌株保藏于德国微生物菌种保藏中心，登录号为DSM26457。
在特别的实施方案中，所述方法包括从饮料中去除微生物的步骤。在某些实施方案中，所述方法包括发酵后从饮料中去除微生物的步骤。
在另一个实施方案中，所述方法包括生产含水果果汁的发酵饮料。在某些实施方案中，所述方法包括生产含水果果汁的发酵饮料，所述水果果汁选自葡萄柚、樱桃、大黄、香蕉、西番莲果、荔枝、葡萄、苹果、橙子、芒果、李子、西梅、蔓越橘、菠萝、桃、梨、杏、蓝莓、木莓、草莓、黑莓、越橘、波森莓、桑葚、鹅莓、草原果、接骨木果、罗干梅、露莓、石榴、木瓜、柠檬、青柠、橘子、西番莲果、猕猴桃、柿子、红醋栗、柑橘、和番石榴，或其组合中的至少一种。
在一个实施方案中，所述方法包括生产含从约1％、约2％、约3％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、或约80％重量水果果汁的发酵饮料。
在一些实施方案中，所述方法包括生产含蔬菜汁、大豆、麦芽、牛奶、谷物、咖啡、或糖/水混合物中的至少一种的发酵饮料。
在某些实施方案中，所述方法包括添加非营养性甜味剂。在一些实施方案中，所述方法包括添加非营养性甜味剂，所述非营养性甜味剂选自由甜叶菊提取物、甜菊苷、阿斯巴甜、糖精、和三氯蔗糖组成的组。在一个实施方案中，所述方法包括添加非营养性甜味剂莱鲍迪苷A(RebA)。在本发明的另一些实施方案中，所述方法包括添加营养性甜味剂。在一些实施方案中，所述方法包括添加非营养性甜味剂，所述非营养性甜味剂选自由蔗糖、果糖、和葡萄糖组成的组。在某些实施方案中，所述方法包括添加添加剂，所述添加剂选自由盐、食品级酸、着色剂、防腐剂、抗坏血酸、能量促进剂、和维生素组成的组。
在另一个方面，本发明的原理提供一种发酵饮料，相对于未发酵的等同饮料，所述发酵饮料是通过包括增加维生素B12、维生素K、叶酸、和生物素步骤的方法制备的。在一些实施方案中，本发明的原理提供一种发酵饮料，所述发酵饮料是通过包括用能生产维生素B12、维生素K、叶酸、和生物素的微生物发酵饮料的步骤的方法制备的。在特别的实施方案中，本发明的原理提供一种发酵饮料，所述发酵饮料是通过包括增加饮料的维生素B12、维生素K、叶酸、和生物素含量的步骤的方法制备的，所述饮料不添加外源维生素B12、维生素K、叶酸、和生物素。
在额外的方面，本发明的原理提供了一种原发酵果汁。在一个实施方案中，相对于未发酵的等同果汁，所述原发酵果汁包括增加的维生素B12、维生素K、叶酸、和生物素。在另一个实施方案中，所述原发酵果汁包括能生产增加的维生素B12、维生素K、叶酸、和生物素的微生物。在某些实施方案中，所述原发酵果汁包括至少1倍推荐每日摄入量(RDI)的维生素B12、维生素K、叶酸、和生物素。在某些实施方案中，所述原发酵果汁包括无外源的维生素B12、维生素K、叶酸、或生物素被添加。
参考以下说明书和权利要求书，本发明原理的这些和其它特征、方面以及优点将会被更好地理解。
发明详述
本发明的原理至少部分基于以下出人意料的发现：用生产维生素的微生物发酵饮料能自然地，并显著地增加维生素的浓度。结果使饮料大大地富含了维生素并显示出很少的风味变化且至少部分地维持了甜味和口感。相应地，与未发酵的等同饮料相比，本发明的原理提供了具有至少增加的维生素B12、维生素K、叶酸、和生物素含量的发酵饮料组合物。
如本文所使用的，“发酵饮料”总体上是由含糖溶液或分散液衍生的或生产的溶液或分散液，所述糖作为基质被微生物利用。这种发酵饮料的典型实例可以是水果果汁。在替代的实施方案中，所述发酵饮料选自葡萄柚果汁、樱桃果汁、大黄果汁、香蕉果汁、西番莲果果汁、荔枝果汁、葡萄果汁、苹果果汁、橙子果汁、芒果果汁、李子果汁、西梅果汁、蔓越橘果汁、菠萝果汁、桃果汁、梨果汁、杏果汁、蓝莓果汁、木莓果汁、草莓果汁、黑莓果汁、越橘果汁、波森莓果汁、桑葚果汁、鹅莓果汁、草原果果汁、接骨木果果汁、罗干梅果汁、露莓果汁、石榴果汁、木瓜果汁、柠檬果汁、青柠果汁、橘子果汁、西番莲果果汁、猕猴桃果汁、柿子果汁、红醋栗果汁、柑橘果汁、和番石榴果汁，或其组合。
如本领域技术人员所理解的，在本文公开的饮料中水是基本成分，典型地是主要液体部分，其余的成分在其中溶解、乳化、悬浮或分散。本领域技术人员会理解，为了方便，在某些情况下，通过参考添加到饮料产品配方中的成分的原始形式，本文描述了一些成分。这种原始形式可以与最终饮料产品中发现的所述成分的形式不同。例如，橙子汁总体上是通过从新鲜水果中提取，通过干燥和随后干燥果汁的再造，或通过浓缩该果汁并随后向该浓缩物中添加水来制备的。待发酵的饮料，例如，可以是新鲜的，可以是含果肉的饮料，或可以是已经通过离心或过滤从中去除果肉的饮料。
如本文所使用的，“维生素”是指正常生长和营养所必需的且在饮食中需要限量的任何一组有机化合物。术语“维生素”不包括膳食矿物质，必需脂肪酸，或必需氨基酸。因为维生素是按照它们的生物活性来分类的，而不是按照它们的结构，每种“维生素”是上位描述语并且是指所有显示与特别的维生素有关的生物活性的许多化合物。上位描述语“维生素B12”包括，例如，化合物氰钴维生素、羟钴胺素、腺苷钴胺素、或甲基钴胺素。上位描述语“维生素K”包括2-甲基-1,4-萘醌衍生物，例如，叶绿醌或甲基萘醌。上位描述语“叶酸”(也称为维生素B9)包括大量叶酸衍生物，这些叶酸衍生物差别在于它们的氧化状态，例如，蝶酰基-L-谷氨酸、蝶酰基-L-谷氨酸盐、或蝶酸单麸胺酸。如本文所使用的，“生物素”(CAS登录号58-85-5，也称为维生素H、bioepiderm、和辅酶R)是指上位描述语维生素B7，并且是由四氢咪唑酮环(tetrahydroimidizalonering)与四氢噻吩环稠合而组成。
如本文所使用的，“增加的维生素”是指与相同体积的标准饮料(例如，未发酵饮料，比如根据所述方法发酵前所述起始材料)相比，饮料中维生素增加。在一些实施方案中，所述发酵饮料包括从约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约15倍、至约20倍推荐每日摄入量(RDI)的维生素。所述维生素能按照相对于彼此相似或不同的量增加。当与未发酵的对应饮料相比时，至少这4种维生素中的每种都能增加到可检测的量。
在一个实施方案中，维生素B12增加1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约15倍、或至约20倍推荐每日摄入量(RDI)，维生素K增加1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约15倍、或至约20倍推荐每日摄入量(RDI)，叶酸增加1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约15倍、或至约20倍推荐每日摄入量(RDI)，以及生物素增加1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约15倍、或至约20倍推荐每日摄入量(RDI)，或其组合。
如本文所使用的，“未发酵的等同饮料”是饮料的一个版本或未根据本发明的原理进行发酵处理的饮料。
如本文所使用的，“推荐每日摄入量”(RDI)是指经国家研究委员会食品和营养委员会(theFoodandNutritionBoardoftheNationalResearchCouncil)充分考虑的营养素每日摄入水平以满足在美国每个年龄阶段和性别群体中97-98％健康人群的需要。
如本文所使用的，“发酵”是通过微生物分解有机物质生产更简单的有机化合物。发酵总体上是在显著的厌氧条件下发生的，无意将术语限定为严格的厌氧条件，因为发酵在有氧气存在的情况下也发生。
与维生素有关的“外源的”是指添加到组合物中的维生素。维生素可以单独地、选择性地、和/或人工地补加到组合物中。与维生素有关的“内源的”是指在食品和饮料中自然地发生的维生素。
如本文所使用的，“非营养性甜味剂”是在典型用量下不提供显著热含量，即给予每8盎司份饮料少于5卡路里热量以达到糖的10白利糖度的等效甜味的甜味剂。在各种实施方案中，所述发酵饮料组合物进一步包括非营养性甜味剂，所述非营养性甜味剂选自由甜叶菊提取物、甜菊苷、阿斯巴甜、糖精、和三氯蔗糖组成的组。在一个实施方案中，所述发酵饮料组合物包括非营养性甜味剂莱鲍迪苷A(RebA)。
如本文所使用的，“营养性甜味剂”是在典型用量下提供显著热含量，即给予每8盎司份饮料大于5卡路里热量以达到糖的10白利糖度的等效甜味的甜味剂。在各种实施方案中，所述发酵饮料组合物进一步包括营养性甜味剂，所述营养性甜味剂选自蔗糖、果糖、葡萄糖、和高果糖谷物糖浆。
如本文所使用的，白利糖度(°Bx)是水溶液的糖含量。一白利糖度是100克溶液中1克蔗糖，并且代表所述溶液的强度，如重量百分比(％w/w)。
应理解饮料和其它饮料产品可以有任何的众多不同的特定配方或组成。一般地，饮料典型地包含至少水、酸化剂、和风味剂。根据本发明原理的饮料产品包括饮料，即，即饮配方，饮料浓缩物等。适合用在至少实施方案中的果汁包括，例如，水果果汁、蔬菜果汁、和浆果汁。在利用果汁的饮料中，所述果汁可以以下述水平使用，例如，所述饮料的从约0.2％、约0.5％、约1％、约2％、约3％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约50％、约60％、约70％、至约80％重量。
相应地，本发明的原理提供一种发酵饮料，与未发酵的等同饮料相比，所述饮料具有至少增加的维生素B12、维生素K、叶酸、和生物素。也能提供通过添加甜味剂来修饰其味道形廓的饮料。各种饮料，例如水果果汁，含有有限量的维生素，从而使其成为希望维持健康饮食的消费者的次优选的选择。
制备本发明的发酵饮料组合物，可使用标准的发酵方法。饮料发酵的实施例可以在美国专利号4210720、美国专利号4,544,633、美国专利号4,867,992；美国专利号7,427,397、美国公开号20050180963、美国公开号20090269438；EP0089720、EP0166238、EP1625794、EP1625795、国际公开号WO2004001022、和国际公开号WO2012/036575中找到，它们中的每件申请明确地被引入本申请作为参考。因为发酵微生物的增殖能利用有氧条件，充分的氧气可以供增殖容器中的微生物使用。在发酵饮料配方中可以适当地利用搅拌和/或再循环以便连续地引入空气或氧气。发酵微生物也能在厌氧条件下生长，所述厌氧条件是使用已知的方法例如，鼓入氮气，使氧气从生长环境耗尽。同样地，本发明的原理提供生产发酵饮料的方法，与未发酵的等同饮料相比，所述方法包含用微生物(例如，细菌，能生产维生素的)孵育饮料来生产具有至少增加的维生素B12、维生素K、叶酸、和生物素的发酵饮料。
可使用能生产维生素的至少一种微生物。通过发酵生产的具有单一维生素的富集物是本领域公知的。然而，为了解决使用多种生物体和多种发酵步骤的问题，本发明的原理利用产维生素的微生物自然地增加饮料中维生素含量，至少四种维生素的含量，通过使用单一微生物的单一发酵步骤。
根据本发明的原理有许多已知的产维生素的微生物得到了应用，它们大部分是细菌，例如，但不限于，丙酸杆菌属(Propionibacterium)、乳酸菌属(Lactobacillus)、和乳球菌属(Lactococcus)。在一个实施方案中，生产维生素的生物体是费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichii)。在一个实施方案中，所述菌株是费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichii)CH15460或其突变体。所述菌株保藏于德国微生物菌种保藏中心，登录号为DSM26457。
在本文中，术语“突变体”应理解为衍生的菌株，或通过例如基因工程、辐射和/或化学处理从本发明的菌株(或母菌株)衍生的菌株。所述突变体也可以是自然发生的突变体。优选地，所述突变体是功能上等同的突变体，例如，具有与母菌株基本上相同或改良特性(例如，关于生产维生素，如B12、维生素K、叶酸和生物素)的突变体。这种突变体是本发明的一部分。尤其地，术语“突变体”是指自然发生的突变体或本发明的菌株经过任何常规使用的突变处理而获得的菌株，所述突变处理包括用化学突变剂处理，例如甲基磺酸乙酯(EMS)或N-甲基-N'-硝基-N-硝基胍(NTG)、或紫外线。突变体可以经过几种突变处理(单一处理应理解为一个突变步骤后跟着是筛选/选择步骤)，但目前优选地，实施不多于20、或不多于10、或不多于5种处理(或筛选/选择步骤)。在目前优选的突变体中，相比于母菌株，细菌基因组中少于1％、少于0.1％、少于0.01％、少于0.001％或甚至少于0.0001％的核苷酸被其它核苷酸替代，或缺失。
如本领域常规的，当微生物，例如，但不限于，细菌费氏丙酸杆菌(P.freudenreichii)被加到培养基(例如，未发酵的饮料，如水果果汁)中时，就会完成发酵，借此微生物将碳源转变成乙醇和其它分子。如本文所描述的，培养基中维生素B12和叶酸的生产是在有氧条件下研究的，例如，分别在Hugenschmidt等和Sybesma等中所讨论的，它们引入本申请作为参考。
能生产维生素的细菌典型地生长和发酵的pH范围为约3.0至7.0。发酵可以自发地进行，或可以通过接种之前发酵的培养物开始，在这种情况下，如本领域已知的，未发酵的饮料可以被接种成群的细菌，且可包括，例如，约106至约107cfu/ml果汁。进行孵育时通气以促进细菌群的生长。发酵温度通常从20℃至40℃，发酵处理的持续时间可以是，例如从几小时延长至大于1或2或3或4或5或6或7或8或更多天，以至于几周。
因此，随着发酵，本发明的原理提供发酵饮料组合物，所述发酵饮料组合物具有增加的维生素含量，至少维生素B12、维生素K、叶酸、和生物素的含量，这样提供了营养上改善的饮料还维持甜味。例如，能提供维生素B12、维生素K、叶酸、和生物素含量大于1倍推荐每日摄入量(RDI)的水果果汁。在替代的实施方案中，本发明的原理能用于生产发酵饮料，所述发酵饮料自然地富集至少维生素B12、维生素K、叶酸、生物素的浓度，且在一些实施方案中富集1、2、3、4、5、6、7、8、9、或更多其它的维生素。在一些实施方案中，本发明的原理能用于在下述产品中提供增加的维生素含量：碳酸或非碳酸软饮料、泉水饮料、冷冻的即饮饮料、咖啡饮料、茶饮料、乳饮料、粉状的软饮料、和液体浓缩物、调味的水、增强的水、水果果汁和水果果汁风味的饮料、运动饮料、和含酒精的产品。如本领域技术人员所理解的，任何的这些饮料可以是根据本文方法待发酵的起始材料，或是发酵饮料可被添加到其中的饮料。
在一个实施方案中，所述发酵饮料组合物是“原发酵饮料”。如本文所使用的，“原”意思是未加工的或未纯化过的。本文所公开的所述饮料产品的自然的实施方案是自然的，它们不含任何人工的或合成的东西。所以，如本文所使用的，根据下面的指南定义了“自然的”饮料组合物：为了自然的成分原材料存在或起源于自然。涉及发酵和酶的生物合成可以利用，但用化学试剂的合成不使用。人工色素、防腐剂、和风味剂不被认为是自然的成分。
跟随着发酵可以使用一种或多种发酵后处理步骤，例如巴氏杀菌、过滤、离心分离、或均质化。例如，常使用的几种巴氏杀菌方法(参见，例如，美国专利号4,830,862和4,925,686，引入本申请作为参考)。一个普通的方法是通过紧邻板式换热器的管子传递果汁，这样所述果汁不会直接接触加热表面来加热。另一个方法是使用热的巴氏杀菌的果汁预热进入的未巴氏杀菌的果汁。所述预热的果汁进一步用蒸汽或热水加热到所述巴氏杀菌温度。典型地，达到温度185至201.2°F(85-94℃)约30秒可充分减少微生物数量并制备用于灌装的果汁。可选地，典型地发酵饮料中至少约20％的微生物通过使用一个或多个分离器被去除。用于从所述发酵饮料中去除含微生物的残渣的分离器的实施例包括沉淀分离器、滗析器、离心机、水力旋流器、筛、滤器、膜和压力。相应地，在一个实施方案中，所述方法包括去除能生产维生素的微生物的后处理步骤。在一些实施方案中，所述微生物可以在发酵期间从发酵反应中去除，而在另一些实施方案中，所述微生物是在发酵完成后被去除。
成分可以通过某些特定的技术被处理或被纯化，所述技术包括至少：物理处理、发酵、和酶解。适当的处理和纯化技术包括至少：吸收、吸附、凝聚、离心分离、截断、烹饪(烘烤、油炸(flying)、煮沸、烧烤)、冷却、切断、色谱分析、涂层、结晶、消化、干燥(喷雾、冷冻干燥、真空)、蒸发、蒸馏、电泳、乳化、封装、提取、挤压、过滤、发酵、研磨、灌输、浸渍(maceration)、微生物法(凝乳酶、酶)、混合、剥皮、浸透(percolation)、冷藏/冷冻、压榨、浸泡(steeping)、洗涤、加热、混合、离子交换、冻干、渗透(osmose)、沉淀、盐析、升华、超声波处理、浓缩、絮凝、均质化、再造、酶解(使用自然界中发现的酶)。加工助剂(当前定义为用作制造助剂以增强食品组分的吸引力或利用的物质，包括澄清剂、催化剂、絮凝剂、助滤剂、和结晶抑制剂等(参见21CFR§170.3(o)(24))是附带的添加剂且如果适当的去除可以使用。
非营养性甜味剂，也叫做人工甜味剂，或高强度甜味剂，是展现数倍于蔗糖的甜味的试剂。高强度甜味剂的实施例包括糖精、甜蜜素(cyclamate)、阿斯巴甜、莫那甜(monatin)、阿力甜、乙酰氨基磺酸钾、三氯蔗糖、索马甜(thaumatin)、甜菊苷、甘草甜素(glycerrhizin)、三氯蔗糖、和纽甜。所以，饮料，例如水果果汁、运动饮料、和软饮料，是用非营养性甜味剂增甜的，所述非营养性甜味剂在饮料的源成分中不是自然地存在的，因而总体上被认为是许多消费者不欢迎的。相比之下，营养性甜味剂总体上是指自然地发生的物质。营养性甜味剂的实施例包括葡萄糖、果糖、麦芽糖、半乳糖、麦芽糖糊精、海藻糖、果寡糖(fructo-oligosaccharides)、和丙糖。由于在饮料中非营养性甜味剂的流行和普及，已经描述了几种工艺用于修饰含有这些非营养性甜味剂的饮料的味道形廓。
如本文所使用的，“添加剂”意思是食品添加剂，或添加到食品中以保护风味或增强其味道和外观的物质。在某些实施方案中，所述发酵饮料组合物进一步包括添加剂，所述添加剂选自由盐、食品级酸、着色剂、防腐剂、抗坏血酸、能量促进剂、和维生素组成的组。进一步地，将其它成分添加到特别的饮料实施方案的配方中，包括风味剂、电解质、加味剂(tastents)、掩蔽剂、风味增强剂、碳酸化物、或咖啡因，总体上将是一种选择。
一旦做了，所述发酵饮料得到了自身作为饮料的应用，或可以与一种或多种其它饮料混合。二氧化碳可以被用于向本文公开的某些实施方案的饮料提供气泡。为了给饮料充入二氧化碳，本领域已知的任何技术和充入二氧化碳的设备都可以利用。根据本发明的原理，可乐饮料(典型地展现了深褐色的颜色，该颜色来源于热处理碳水化合物导致的焦糖着色)也能得益于增加的维生素含量的方法。
本文描述的定义和方法用于更好地限定本公开，并且指导本领域技术人员实施本公开。除非另有说明，相关领域技术人员应根据常规用法来理解术语。
在一些实施方案中，用于描述和要求保护本公开的某些实施方案的表示成分、特性(例如分子量)、反应条件等的数量的数字应被理解为在一些情况下通过术语“约”来修饰。在一些实施方案中，术语“约”用来表明数值包括为确定该数值所采用的设备或方法的均数的标准偏差。在一些实施方案中，在本书面说明书和所附权利要求书中提出的数值参数是近似值，这些近似值能依赖特别实施方案所追求获得的希望的特性而变化。在一些实施方案中，所述数值参数应根据所报道的有效数字的数目并通过应用普通的舍入技术来建立。尽管提出本公开的一些实施方案的宽的范围的数值范围和参数是近似值，但在具体实施例中提出的数值是尽可能精确地报道的。本公开的一些实施方案中出现的数值可包含某些误差，这些误差必然地起因于在其各自的试验测量中存在的标准差。本文中数值范围的详述仅仅是想要充当单独提及每个落入该范围的独立值的速记法。除非本文另有说明，如同本文单独详述的一样，每个单独值被引入本说明书。
在一些实施方案中，术语“一个”和“一种”和“所述”和在描述特定的实施方案的语境中(尤其在以下权利要求书中的某些语境中)使用的相似参考可以解释为涵盖单数和复数两种，除非另外特别指出。在一些实施方案中，如本文所使用的(包括权利要求书)术语“或”是用来意指“和/或”，除非明确地说明仅涉及替代物或所述替代物时互相排斥的。
术语“包含”、“具有”和“包括”是开放式的连接动词。这些动词中的一个或多个的任何形式或时态，例如“包含(comprises)”，“包含(comprising)”，“具有(has)”，“具有(having)”，“包括(includes)”和“包括(including)”，也是开放式的。例如，“包含”、“具有”或“包括”一个或多个步骤的任何方法不限于仅拥有那一个或多个步骤，并且可涵盖其它未列出的步骤。相似地，“包含”、“具有”或“包括”一个或多个特征的任何组合物或设备不限于仅拥有那一个或多个特征，并且可涵盖其它未列出的特征。
本文所描述的所有方法可以以任何适合的顺序进行，除非本文另有说明或另外与语境显然矛盾。任何和所有实施例，或关于本文某些实施方案提供的示例性语言(如“例如(suchas)”)的使用仅仅想要更好地说明本公开，并不对所要求保护的本公开的范围构成限制。在说明书中语言不应被解释为表明任何未要求保护的元素，这是实践本公开所必要的。
本文公开的本公开的替代的元素或实施方案的分组不应被解释为限制。每个组成员都可以单独地或与该组的其他成员或本文存在的其它元素的任何组合来提及和要求保护。由于方便或可专利性的原因，一个组的一个或多个成员可以被包括在一个组中或从其中删除。
已经详细描述了本公开，将显然的是，在不背离所附权利要求书中所限定的本公开的范围下，修饰、变化、和等同实施方案是可行的。此外，应理解，本公开中的所有实施例是作为非限制性实施例提供的。
具体实施方式
提供以下非限制性实施例进一步说明本公开。本领域技术人员应理解，在实施例中公开的以下技术代表了发明人已经发现在实践本公开中良好运作的途径，并因此可被视为构成用于其实践的模式实施例。然而，根据本公开，本领域技术人员应理解，在所公开的具体实施方案中可以进行许多变化并且仍获得相像或相似的结果而不背离本公开的精神和范围。
实施例1
菌株
用于富含维生素发酵的培养物是费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichii)CH15460。该菌株选自科汉森培养物保藏获得的8个其它丙酸杆菌(Propionibacterium)。所述菌株保藏于德国微生物菌种保藏中心，登录号为DSM26457。在本文公开的方法中所述菌株的突变体也得到了应用。
果汁发酵
最初的水果果汁发酵是通过接种含有1％或10％(v/v)的费氏丙酸杆菌培养物的水果果汁完成的，如本领域所已知的，费氏丙酸杆菌培养物在丰富培养基(MRS培养基)上生长。该培养物首先被离心，并且在各自的果汁中重悬以避免将丰富培养基接入所述果汁发酵。果汁发酵在30℃孵育5-8天，并且定期地收集样品用于维生素分析。分析前，这些样品在80℃加热10min以终止丙酸杆菌(Propionibacterium)的进一步生长，并且分析前于4℃储存。所有水果果汁都是市售的100％巴氏杀菌的果汁。
维生素分析
维生素B12、叶酸和生物素的含量是由德国柏林SGSInstitutFresenius的商业实验室使用特定的微生物检测法测定。维生素K2是通过GC-MS来分析。
实施例2
在橙子汁中评估费氏丙酸杆菌(P.freudenreichii)(菌株CHCC15460和菌株PA)发酵获得的维生素B12产量(表1)。细菌起始培养物接种后5-8天，分析发酵的橙子汁样品的维生素含量、pH、和风味形廓。样品经有氧地培养或厌氧地培养。有氧培养物被注入补加的氧气或通过摇动低体积的培养物使其暴露在外界条件下。厌氧培养物被注入氮气或在满瓶且不摇动的条件下生长。发酵后样品显示显著增加的维生素B12含量且风味和pH几乎没有变化。进一步地，有氧生长的样品没有显示显著增加的维生素产量。
实施例3
在香蕉汁中评估费氏丙酸杆菌(P.freudenreichii)(菌株CHCC15460和菌株PA)发酵获得的维生素B12产量(表2)。正常体积(1％v/v)或大量体积(10％v/v)的细菌起始培养物接种后5-8天，分析发酵的香蕉汁样品的维生素含量、pH、和风味形廓。样品经有氧地培养或厌氧地培养。有氧培养物被注入补加的氧气或通过摇动低体积的培养物使其暴露在外界条件下。厌氧培养物被注入氮气或在满瓶且不摇动的条件下生长。菌株CHCC15460比菌株PA生产显著更多的维生素B12，并且风味或pH几乎没有变化。菌株CHCC15460对有氧发酵或无氧发酵显示了不同的反应，并且当大量体积的起始培养物用于样品发酵时，在维生素B12产量方面有2-5倍增加。相比之下，菌株PA总体上生产较低量的维生素B12，并且引起pH的轻微降低。进一步地，当发酵样品经有氧培养时，菌株PA显示显著增加的维生素B12产量。然而，不像菌株CHCC15460，用大量接种量的菌株PA起始培养物发酵样品显示不希望的风味形廓的变化。
实施例4
在番茄汁中评估费氏丙酸杆菌(P.freudenreichii)(菌株CHCC15460和菌株PA)发酵获得的维生素B12产量(表3)。细菌起始培养物接种后5-8天，分析发酵的番茄汁样品的维生素含量、pH、和风味形廓。样品经有氧地培养或厌氧地培养。有氧培养物被注入补加的氧气或通过摇动低体积的培养物使其暴露在外界条件下。厌氧培养物被注入氮气或在满瓶且不摇动的条件下生长。菌株CHCC15460比菌株PA生产显著更多的维生素B12，并且风味几乎没有变化，仅pH轻微增加。相比之下，菌株PA总体上生产显著较低量的维生素B12，并且引起pH的轻微降低。进一步地，当发酵样品在有氧气的条件下培养时，菌株CHCC15460生产更多的维生素B12，而菌株PA在同样的条件下生产较少的维生素。最终，菌株PA发酵的样品形成甜的令人喜欢的风味。
实施例5
在不同水果果汁中评估费氏丙酸杆菌(P.freudenreichii)(菌株CHCC15460)发酵获得的维生素产量(表4)。细菌起始培养物接种后5-8天，分析发酵的水果果汁样品的维生素含量和pH。在发酵罐中培养橙子汁、香蕉汁、和番茄汁的副样(其中表明的)。其中计算的，所有样品显示显著水平的维生素B12、维生素B6、维生素K2、和生物素。此外，所有样品显示pH没有变化，或轻微增加。
实施例6
在不同水果果汁中评估费氏丙酸杆菌(P.freudenreichii)(菌株CHCC15460)发酵获得的维生素产量(表5)。细菌起始培养物接种后5-8天，分析发酵的水果果汁样品的维生素含量和pH。其中计算的，所有样品显示显著水平的维生素B12、维生素K2、和生物素。并且，所有样品显示pH轻中度的变化。最终，当接种较低体积的起始培养物时，芒果和橙子汁样品都显示降低的维生素含量，而当接种较高体积的起始培养物时，红甜菜汁显示降低的维生素K2水平。
实施例7
在橙子汁和芒果汁中评估费氏丙酸杆菌(P.freudenreichii)(菌株CHCC15460)发酵获得的维生素产量(表6)。细菌起始培养物接种后3、5和6天，分析发酵的水果果汁样品的维生素含量。接种后仅3天后，所有样品显示显著增加的维生素B12含量。在后来的时间点，两种果汁显示维生素B12的含量几乎没有变化。发酵后，芒果汁样品显示维生素B6的含量没有变化，而检测到维生素K、叶酸、和生物素显著增加。相比之下，随着发酵橙子汁显示维生素K水平没有变化。
保藏和专家解决方案
菌株费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichii)CHCC15460于2012年10月4日保藏于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)，德国布伦瑞克，Inhoffenstr.7B，D-38124，登录号为DSM26457。
所述保藏是根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约进行的。
申请人请求被保藏的微生物样品应该仅对申请人批准的专家是可使用的。
参考文献
以下参考文献特别地引入本申请作为参考，他们对本申请中提出的那些提供示例性的程序上的或其它详细补充。
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Sybesma等，MetabolicEngineering，6：109-115，2004。

Claims (31)

1.一种发酵饮料组合物，相对于未发酵的等同饮料，所述发酵饮料组合物包含增加的维生素B12、维生素K、叶酸、和生物素，其中无外源的维生素B12、维生素K、叶酸、或生物素被添加。
2.权利要求1的组合物，其中所述发酵饮料包含从约1倍至约20倍推荐每日摄入量的维生素B12、维生素K、叶酸、和生物素。
3.权利要求1的组合物，其中所述发酵饮料是水果果汁。
4.权利要求3的组合物，其中所述水果果汁是选自由葡萄柚、樱桃、大黄、香蕉、西番莲果、荔枝、葡萄、苹果、橙子、芒果、李子、西梅、蔓越橘、菠萝、桃、梨、杏、蓝莓、木莓、草莓、黑莓、越橘、波森莓、桑葚、鹅莓、草原果、接骨木果、罗干梅、露莓、石榴、木瓜、柠檬、青柠、橘子、西番莲果、猕猴桃、柿子、红醋栗、柑橘、和番石榴，或其组合组成的组中的水果的果汁。
5.权利要求1的组合物，其中所述发酵饮料包含从约1％至约80％重量的水果果汁。
6.权利要求1的组合物，其中所述发酵饮料选自由蔬菜汁、大豆、麦芽、牛奶、谷物、咖啡、或糖/水混合物组成的组。
7.权利要求1的组合物，包含非营养性甜味剂。
8.权利要求7的组合物，其中所述非营养性甜味剂选自由甜叶菊提取物、甜菊苷、阿斯巴甜、糖精、和三氯蔗糖组成的组。
9.权利要求1的组合物，包含营养性甜味剂。
10.权利要求9的组合物，其中所述营养性甜味剂选自由蔗糖、果糖、和葡萄糖组成的组。
11.权利要求1的组合物，包含添加剂，所述添加剂选自由盐、食品级酸、着色剂、防腐剂、抗坏血酸、能量促进剂、和维生素组成的组。
12.一种生产相对于未发酵的等同饮料包含增加的维生素B12、维生素K、叶酸、和生物素的发酵饮料的方法，所述方法包含用能生产维生素B12、维生素K、叶酸、和生物素的微生物发酵饮料，其中无外源的维生素B12、维生素K、叶酸、或生物素被添加。
13.权利要求12的方法，其中所述发酵饮料包含从约1倍至约20倍推荐每日摄入量的维生素B12、维生素K、叶酸、和生物素。
14.权利要求12的方法，其中所述微生物是细菌。
15.权利要求14的方法，其中所述细菌来自丙酸杆菌属(Propionibacterium)。
16.权利要求15的方法，其中所述细菌是费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichii)。
17.权利要求12的方法，进一步包含从所述饮料中去除所述微生物的步骤。
18.权利要求12的方法，其中所述发酵饮料是水果果汁。
19.权利要求18的方法，其中所述水果果汁是选自由葡萄柚、樱桃、大黄、香蕉、西番莲果、荔枝、葡萄、苹果、橙子、芒果、李子、西梅、蔓越橘、菠萝、桃、梨、杏、蓝莓、木莓、草莓、黑莓、越橘、波森莓、桑葚、鹅莓、草原果、接骨木果、罗干梅、露莓、石榴、木瓜、柠檬、青柠、橘子、西番莲果、猕猴桃、柿子、红醋栗、柑橘、和番石榴，或其组合组成的组中的水果的果汁。
20.权利要求12的方法，其中所述发酵饮料包含从约1％至约80％重量的水果果汁。
21.权利要求12的方法，其中所述发酵饮料选自由蔬菜汁、大豆、麦芽、牛奶、谷物、咖啡、或糖/水混合物组成的组。
22.权利要求12的方法，包含添加非营养性甜味剂的步骤。
23.权利要求22的方法，其中所述非营养性甜味剂选自由甜叶菊提取物、甜菊苷、阿斯巴甜、糖精、和三氯蔗糖组成的组。
24.权利要求12的方法，包含添加营养性甜味剂的步骤。
25.权利要求24的方法，其中所述营养性甜味剂选自由蔗糖、果糖、和葡萄糖组成的组。
26.权利要求12的方法，进一步包含添加添加剂的步骤，所述添加剂选自由盐、食品级酸、着色剂、防腐剂、抗坏血酸、能量促进剂、和维生素组成的组。
27.通过权利要求12的方法制备的组合物。
28.一种原发酵果汁，相对于未发酵的等同果汁，其中所述原发酵果汁包含增加的维生素B12、维生素K、叶酸、和生物素，其中所述发酵果汁进一步包含能够生产维生素B12、维生素K、叶酸、和生物素的微生物。
29.权利要求28的原发酵果汁，包含至少1倍推荐每日摄入量的增加的维生素B12、维生素K、叶酸、和生物素，其中无外源的维生素B12、维生素K、叶酸、或生物素被添加。
30.权利要求16的方法，其中所述细菌选自由费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichii)CHCC15460菌株和其衍生的突变体组成的组，所述费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichii)CHCC15460菌株保藏于德国微生物菌种保藏中心，登录号为DSM26457。
31.一种乳酸菌菌株，所述乳酸菌菌株选自由费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichii)CHCC15460菌株和其衍生的突变体组成的组，所述费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichii)CHCC15460菌株保藏于德国微生物菌种保藏中心，登录号为DSM26457。
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