CN107988106B - 一种酸奶发酵剂、其制备方法及应用 - Google Patents

一种酸奶发酵剂、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种酸奶发酵剂，由保加利亚乳杆菌JMCC0018、嗜热链球菌JMCC0019以活菌数配比为1：100‑10000组成。本发明以具有良好发酵特性的益生菌组合而成，用来发酵牛奶制作酸奶，以满足消费者的风味需求。本发明还公开了所述酸奶发酵剂的制备方法及应用、酸奶的制备方法。本发明的发酵剂将保加利亚乳杆菌JMCC0018、嗜热链球菌JMCC0019进行复配，用作发酵剂制备酸奶，发酵速度快，所制备的酸奶香气好、后酸弱。

Description

一种酸奶发酵剂、其制备方法及应用
技术领域
本发明属于乳制品发酵技术领域，涉及一种发酵剂，具体地说是一种酸奶发酵剂、其制备方法及应用。
背景技术
目前，西方发达国家对酸奶发酵剂的研究和应用在处于世界领先地位，同时也拥有先进的规模化生产能力。如仅丹麦的Hansen公司，就提供全世界所需近50%的乳品发酵剂。国内对冻干发酵剂的研究起步较晚，在20世纪90年代才开始进行，使得我国冻干发酵剂菌种资源不足，发酵剂制备技术不完善，工业化生产能力不高，进一步造成现阶段我国所使用的酸奶发酵剂大多为进口的发酵剂，导致酸奶生产成本过高。
随着我国经济的发展和人们生活水平的提高，消费者对乳酸菌的需求日益扩大，尤其对酸奶的需求量逐年增加。因此，从我国传统发酵乳中进行乳酸菌菌株的筛选，探索我国长期食用的发酵乳是否具有与国外类似功能的益生菌菌株，针对我国目前居民饮食结构改变带来的问题，进行菌株的分离、筛选具有重要意义，以开发具有自主知识产权的酸奶发酵剂，来提高我国酸奶发酵剂的国际竞争力和我国酸奶制造商的核心竞争力。
发明内容
本发明的目的，是要提供一种酸奶发酵剂、其制备方法及应用，以具有良好发酵特性的益生菌组合而成，用来发酵牛奶制作酸奶，以满足消费者的风味需求。
本发明为实现上述目的，所采用的技术方案如下：
一种酸奶发酵剂，由德氏乳杆菌保加利亚亚种JMCC0018、嗜热链球菌JMCC0019以活菌数配比为1：100-10000组成。
本发明还提供了上述酸奶发酵剂的制备方法，按照以下步骤顺序进行：
（1）菌株活化
德氏乳杆菌保加利亚亚种JMCC0018、嗜热链球菌JMCC0019分别按照以下顺序进行的步骤进行活化：
1）菌株接种至液体MRS培养基，37℃培养48h，为第一代；
2）取第一代1mL，加入9mL脱脂奶中，培养16h，作为第二代；
3）取第二代1mL，加入9mL脱脂奶中，培养16h，作为第三代，得活化后菌种；
（2）菌粉制备
德氏乳杆菌保加利亚亚种JMCC0018、嗜热链球菌JMCC0019每一种菌粉分别按照以下顺序进行的步骤来制备：
1）将活化后菌种放入发37℃发酵罐内进行发酵，发酵10小时；
2）发酵液4℃低温冷却1h后，通过管式离心机进行低温（4℃）菌体分离，并加入冻干保护剂进行乳化，得到乳化液；
3）将乳化液放入真空冷冻干燥机内冻干，温度控制在—40～—35℃，通过金属探针检测水分活度至水活度＜0.2进行质量控制（常规作法），得到冻干菌体；
4）将冻干菌体放入粉碎机内进行粉碎，粉碎后的产品过40目筛，最终制得单菌株菌粉，其中菌株活菌数≥2×1010cfu/g；
（3）复配
取各自分别制备好的德氏乳杆菌保加利亚亚种JMCC0018、嗜热链球菌JMCC0019两种菌粉，按照活菌数量比1：100-10000进行复配，得酸奶发酵剂。
本发明也提供了上述酸奶发酵剂的一种应用，它用于通过发酵步骤，用牛奶或复原乳制备酸奶。
一种酸奶的制备方法，包括依次进行的基料调配、均质杀菌、发酵、破乳步骤。
作为限定：
①所述基料调配步骤是：
将主料牛乳/复原奶打入混料罐中，加入辅料，搅拌至辅料完全溶解;控温存放，得基料；
②所述均质步骤是：将基料输入均质机中进行均质，均质二级压力4.8～5.1 MPa、一级压力17.2～17.8 MPa；均质温度58～62℃；
③所述杀菌步骤是：在93～98℃温度下杀菌时间300～310s；
④所述发酵步骤是：将杀菌后的料液降温至40～42℃，输入发酵罐；以与牛奶/复原乳的比例为1000kg：10g，取发酵剂加入发酵罐，混合、活化，搅拌30～40min,关闭搅拌;40～42℃保温发酵，自关闭搅拌时刻起3h时开始测酸，当所测滴定酸度达到68～72°T，将发酵罐温度提高至55℃，保持5 min后破乳，搅拌20～30 min，降至室温即成，其中，测酸频次为每隔20min测酸一次，直至滴定酸度达到68～72°T。
作为进一步的限定，所述基料调配步骤中的控温存放，是控制温度在0～15℃，存放0～1h，于均质杀菌前15 min开启搅拌15min；存放时间达1h但不能进入均质机中进行均质时，需控制温度在0～10℃，继续存放0～1h，并于均质杀菌前15 min开启搅拌15min。
本发明中：
（Ⅰ）德氏乳杆菌保加利亚亚种JMCC0018（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）是从西藏传统发酵乳中分离筛选出来的，该菌菌株已于2017年7月14日保存于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，保藏号为CGMCC NO. 14425。经对菌株进行分子生物学鉴定，通过DNA提取、PCR扩增，16SrDNA测序，NCBI网站blast最终确定为德氏乳杆菌保加利亚亚种。
其16Sr DNA序列结果如下：
GACTCCTATAAAGGTTATCCCACCGACTTTGGGCATTGCAGACTTCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCGTGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAGTCCGAACTGAGAACAGCTTTAAGAGATCCGCTTACCCTCGCGGGTTCGCTTCTCGTTGTACTGCCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCTTTAGAGTGCCCAACTTAATGATGGCAACTAAAGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCACCACCTGTCTCTGCGTCCCCGAAGGGAACCACCTATCTCTAGGTGTAGCACAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGCGCTTAATGCGTTTGCTGCGGCACTGAGGACCGGAAAGTCCCCAACACCTAGCGCTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTGCAGACCAGAGAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTCCACCGCTACACATGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGAATGACAGTTTCCGATGCAGTTCCACGGTTGAGCCGTGGGCTTTCACATCAGACTTATCATTCCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGACTTTCTGGTTGATTACCGTCAAATAAAGACCAGTTACTGCCTCTATCCTTCTTCACCAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTGCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATCAGTCTCTCAACTCGGCTACGCATCATTGCCTTGGTAGGCCTTTACCCCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGCTCATCCTAAAGTGACAGCTTACGCCGCCTTTCAAACTTGAATCATGCGATTCATGTTGTTATCCGGTATTAGCACCTGTTTCCAAGTGGTATCCCAGTCTTTAGGGCAGATTGCCCACGTGTTACTCACCCATCCGCCGCTAGCGTCCAACAAATCATCCCGAAGGAAT
其Phes基因测序结果如下：
CACCTGCTGCGGAGCCTCACTTCACCAGTTCAAGCCCGGACCATGGAAAAGCATGACTTCATAAAGGGGACCTCAAGATGATCTCCCCAGGCAAGGTTTACACAATAGACGATGACGACGCCACCCAGTCCCACCAGTTCATGCAGATGGAAGGGCTGGTTGTCAGCAAGAACATCTCCTTGAGTGACCTTAAGGGGACCTTGGAACTGGTGGCCAAACACGAATTCGGCCAGGACCGGGAAACCCGCTTGCGGCCAAGCTACTTCCCATTTACTGAACCATCACTTGAAATGGACTTTTCTTGCTTTGAATGCGGCGGCAAGGGCTGCTCGATCTGCAAGAACACCGGCTGGATCGAAGTTCTGGGTGCCGGGATCGTTCACCCGAATGTTTTGTCTGCCGCCGGCATTGACCCAAACGTCTACTCTGGTT
JMCC0018的分离纯化方法，按照以下步骤顺序进行：
①样品采集
取25mL西藏拉萨市夺底乡牧民家中自制传统的发酵乳制品，加入到250mL生理盐水中，充分混匀，得到样品；
②样品的富集
取样品2mL，加入到100mL的LC液体培养基中，35℃培养72h，得到培养液；
③菌株分离
取培养液1mL，用0.9%（重量与体积的百分比）无菌的生理盐水稀释100000倍，分别为梯度稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍，得到菌悬液；
取MRS琼脂培养基（MRS培养基具有以下组成：10g酪蛋白胨；10g牛肉膏；5g酵母膏；20g葡萄糖；5g乙酸钠；2g柠檬酸二胺；1g吐温-80；K2HPO4：2g；0.2g MgSO4·7H2O；0.05gMnSO4·7H2O；15g琼脂；1000mL蒸馏水；该培养基调节pH6.8±0.1），融化后，倒入培养皿，待其冷却、完全凝固后，吸取0.1mL菌悬液涂布到培养基上；
置35℃环境下厌氧培养72h（H2：CO2：N2=5：10：85），观察菌落生长情况；
待平板出现典型菌落后，根据标准嗜热链球菌的菌落特征以及参考相关文献图片，挑选出相应的菌落，进行下一步的菌株纯化；
④菌株的纯化
挑取选中的单菌落，将菌落培养物划线接种到MRS琼脂培养基上，35℃有氧环境培养72h；然后，再将培养皿上长出的单菌落，继续划线接种到MRS琼脂培养基上，35℃有氧环境培养72h；连续培养三次；
⑤将纯培养物置于无菌的20%甘油中在-70℃保存，同时接种MRS琼脂培养基试管斜面用于临时保存。
德氏乳杆菌保加利亚亚种JMCC0018细菌学特征如下：
A1．基本特征如表1所示：
表1. 德氏乳杆菌保加利亚亚种JMCC0018基本特征
Figure RE-71190DEST_PATH_IMAGE001
由表1可见，德氏乳杆菌保加利亚亚种JMCC0018为革兰氏阳性、杆状、无芽孢、接触酶和氧化酶试验的阴性菌株。
A2．糖发酵特性实验
将上述分离纯化菌株挑取单菌落进行平板划线，37℃培养48h，分别挑取一接种环菌株接入糖发酵管中，37℃培养48h，观察颜色变化。具体结果见下表。
表2. 德氏乳杆菌保加利亚亚种JMCC0018的鉴定结果
Figure RE-3374DEST_PATH_IMAGE002
注：“+”表示发酵利用；“-”表示不发酵利用。
（Ⅱ）嗜热链球菌JMCC0019（Streptococcus thermophiles）
嗜热链球菌JMCC0019（Streptococcus thermophiles），是从西藏拉萨市夺底乡牧民家中自制传统发酵乳中分离筛选出来的，该菌菌株已于2017年7月14日保存于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，保藏号为CGMCC NO.14426。将菌株进行分子生物学鉴定，通过DNA提取、PCR扩增，16SrDNA测序，NCBI网站blast最终确定为嗜热链球菌。
嗜热链球菌JMCC0019的16SrDNA测序结果如下：
GTGGCTCAAAGGTTCCTCACCGACTTCGGGTGTTAAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGATTGGCTTTAAGAGATTAGCTCGCCGTCACCGACTCGCAACTCGTTGTACCAACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTATTACCGGCAGTCTCGCTAGAGTGCCCAACTGAATGATGGCAACTAACAATAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACCGATGTACCGAAGTAACTTTCTATCTCTAGAAATAGCATCGGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCGGCACTGAATCCCGGAAAGGATCCAACACCTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGCCGCTTTCGCCACCGGTGTTCCTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTCTCCCCTTCTGCACTCAAGTTTGACAGTTTCCAAAGCGAACTATGGTTGAGCCACAGCCTTTAACTTCAGACTTATCAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTCGGGACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTGGTAAGCTACCGTCACAGTGTGAACTTTCCACTCTCACACCCGTTCTTGACTTACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCGGTCAGGGTTGCCCCCATTGCCGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTATGTATCGTCGCCTAGGTGAGCCATTACCTCACCTACTAGCTAATACAACGCAGGTCCATCTTGTAGTGGAGCAATTGCCCCTTTCAAATAAATGACATGTGTCATCCATTGTTATGCGGTATTAGCTATCGTTTCCAATAGTTATCCCCCGCTACAAGGCAGGTTACCTACGCGTTACTCACCCGTTCGCAACTCATCCAAGAAGAGCAAGCTCCTCTCTTCAGCGTCTACTGCAG
嗜热链球菌JMCC0019的Phes基因测序结果如下：
TCGCAACTCTACAAGTCCTGTCCAAGCTCGTACACTTGATAAACATGATTTTTCTAAAGGTCCTCTTAAGATGATCTCACCAGGACGTGTTTTCCGTCGTGATACCGATGATGCGACTCACAGCCACCAGTTTCACCAAATCGAAGGTTTGGTCGTTGGTAAAAACATCTCAATGGGTGATCTGAAGGGAACGCTTGAGATGATTATTCAAAAAATGTTTGGTGCAGAACGTCGAATCCGTTTGCGTCCTTCTTACTTCCCATTCACTGAACCTTCCGTTGAGGTTGACGTGTCATGCTTCAAGTGTGGTGGTAAAGGATGTAACGTATGCAAGAATACAGGTTGGATTGAGATCCTTGGTGCTGGTATGGTTCACCCACAAGTGCTTGAGATGTCAGGTGTTGATTCTGAAGAATATTCAGGTTTTGTTTTGGGTTTAGGAAG
JMCC0019的分离纯化方法，按照以下步骤顺序进行：
①样品采集
取25mL西藏拉萨市夺底乡牧民家中自制传统的发酵乳制品，加入到250mL生理盐水中，充分混匀，得到样品；
②样品的富集
取样品2mL，加入到100mL的LC液体培养基中，35℃培养72h，得到培养液；
③菌株分离
取培养液1mL，用0.9%（重量与体积的百分比）无菌的生理盐水稀释100000倍，分别为梯度稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍，得到菌悬液；
取MRS琼脂培养基（MRS培养基具有以下组成：10g酪蛋白胨；10g牛肉膏；5g酵母膏；20g葡萄糖；5g乙酸钠；2g柠檬酸二胺；1g吐温-80；K2HPO4：2g；0.2g MgSO4·7H2O；0.05gMnSO4·7H2O；15g琼脂；1000mL蒸馏水；该培养基调节pH6.8±0.1），融化后，倒入培养皿，待其冷却、完全凝固后，吸取0.1mL菌悬液涂布到培养基上；
置35℃环境下厌氧培养72h（H2：CO2：N2=5：10：85），观察菌落生长情况；
待平板出现典型菌落后，根据标准嗜热链球菌的菌落特征以及参考相关文献图片，挑选出相应的菌落，进行下一步的菌株纯化；
④菌株的纯化
挑取选中的单菌落，将菌落培养物划线接种到MRS琼脂培养基上，35℃有氧环境培养72h；然后，再将培养皿上长出的单菌落，继续划线接种到MRS琼脂培养基上，35℃有氧环境培养72h；连续培养三次；
⑤将纯培养物置于无菌的20%甘油中在-70℃保存，同时接种MRS琼脂培养基试管斜面用于临时保存。
嗜热链球菌JMCC0019的菌种细菌学特征
B1．基本特征如表3：
表3 嗜热链球菌JMCC0019基本特征
Figure RE-410085DEST_PATH_IMAGE003
B2．糖发酵特性实验
将菌株挑取单菌落进行平板划线，37℃培养24h，传代一次，取菌悬液接种至糖发酵管中，37℃培养48h，观察颜色变化。具体结果见表4：
表4 产胞外多糖的嗜热链球菌JMCC0019的鉴定结果
Figure RE-252270DEST_PATH_IMAGE004
注：“+”表示发酵利用；“-”表示不发酵利用。
B3．肠细胞粘附特性实验
将肠上皮细胞Caco-2提前铺于细胞培养板中，用DMEM调整嗜热链球菌JMCC0019的菌浓度到1.0×108CFU/mL，铺于细胞上层，于5%CO2、95%空气培养箱中37℃下孵育2.5h。用无菌PBS洗涤除去未结合的乳酸菌，加入1mL1%（v/v）Triton×100，充分捶打混匀，使粘附的菌体同细胞分离，梯度稀释后置于MRS固体培养基上培养并计数，取3次实验的平均值表示细胞的粘附能力。嗜热链球菌JMCC0019对肠上皮细胞黏附实验结果如表5：
表5 嗜热链球菌JMCC0019菌株对肠上皮细胞黏附实验
Figure RE-758338DEST_PATH_IMAGE005
由上表可知，嗜热链球菌JMCC0019活性菌株对Caco-2细胞的黏附率为23.2±1.7个/细胞。
B4.胞外多糖检测实验
将嗜热链球菌JMCC0019的MRS培养液用于胞外多糖提取，并于490nm处测定吸光度值。
表6 菌株JMCC0019胞外多糖的表达量
Figure RE-177818DEST_PATH_IMAGE006
由表6可知，嗜热链球菌JMCC0019产胞外多糖的能力为158.40 mg/L。
B5．菌株发酵特性
取牛奶75-100份，白砂糖2-20份，低聚果糖1-20份，调配均匀后，于60-65℃、15MPa下均质，95℃杀菌300s后，降温至35-40℃，接种JMCC0019 106CFU/mL，于37℃发酵24h，检测其pH为4.0-4.5之间是停止发酵，摇匀后对发酵样品进行感官品评，根据感官品评结果如表7所示：
表7 发酵特性
Figure RE-919378DEST_PATH_IMAGE007
由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：德氏乳杆菌保加利亚亚种JMCC0018（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）作为发酵剂的组成部分，具有产酸增香的功能，能够使得酸奶发酵提高同时提供独特的酸奶香气；嗜热链球菌JMCC0019（Streptococcus thermophiles）作为发酵剂的组成部分，具有发酵前期产酸功能，能够使得酸奶发酵过程中前期发酵速度提升并通过其自身代谢为发酵后期JMCC0018的生长提供适合的发酵条件和营养物质。本发明的发酵剂将德氏乳杆菌保加利亚亚种JMCC0018、嗜热链球菌JMCC0019进行复配，用作发酵剂制备酸奶，发酵速度快，所制备的酸奶香气好、后酸弱。
本发明适用于酸奶的发酵过程，对牛奶/复原乳进行发酵，以生产酸奶。
附图说明
图1为实施例8低温下保质期内后酸曲线图；
图2为实施例8常温下保质期内后酸曲线图。
具体实施方式
本发明下面将结合说明书附图和具体实施例作进一步详细说明。
实施例1-6 酸奶发酵剂及其制备方法
实施例1-6分别提供了一种酸奶发酵剂，都是由德氏乳杆菌保加利亚亚种JMCC0018、嗜热链球菌JMCC0019以活菌数量比为1：100-10000组成。其中：
（1）德氏乳杆菌保加利亚亚种JMCC0018（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）
德氏乳杆菌保加利亚亚种JMCC0018是从西藏传统发酵乳中分离筛选出来的，该菌菌株已于2017年7月14日保存于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，保藏号为CGMCC NO. 14425。经对菌株进行分子生物学鉴定，通过DNA提取、PCR扩增，16SrDNA测序，NCBI网站blast最终确定为德氏乳杆菌保加利亚亚种。
其16Sr DNA序列结果如下：
GACTCCTATAAAGGTTATCCCACCGACTTTGGGCATTGCAGACTTCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCGTGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAGTCCGAACTGAGAACAGCTTTAAGAGATCCGCTTACCCTCGCGGGTTCGCTTCTCGTTGTACTGCCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCTTTAGAGTGCCCAACTTAATGATGGCAACTAAAGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCACCACCTGTCTCTGCGTCCCCGAAGGGAACCACCTATCTCTAGGTGTAGCACAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGCGCTTAATGCGTTTGCTGCGGCACTGAGGACCGGAAAGTCCCCAACACCTAGCGCTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTGCAGACCAGAGAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTCCACCGCTACACATGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGAATGACAGTTTCCGATGCAGTTCCACGGTTGAGCCGTGGGCTTTCACATCAGACTTATCATTCCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGACTTTCTGGTTGATTACCGTCAAATAAAGACCAGTTACTGCCTCTATCCTTCTTCACCAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTGCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATCAGTCTCTCAACTCGGCTACGCATCATTGCCTTGGTAGGCCTTTACCCCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGCTCATCCTAAAGTGACAGCTTACGCCGCCTTTCAAACTTGAATCATGCGATTCATGTTGTTATCCGGTATTAGCACCTGTTTCCAAGTGGTATCCCAGTCTTTAGGGCAGATTGCCCACGTGTTACTCACCCATCCGCCGCTAGCGTCCAACAAATCATCCCGAAGGAAT
其Phes基因测序结果如下：
CACCTGCTGCGGAGCCTCACTTCACCAGTTCAAGCCCGGACCATGGAAAAGCATGACTTCATAAAGGGGACCTCAAGATGATCTCCCCAGGCAAGGTTTACACAATAGACGATGACGACGCCACCCAGTCCCACCAGTTCATGCAGATGGAAGGGCTGGTTGTCAGCAAGAACATCTCCTTGAGTGACCTTAAGGGGACCTTGGAACTGGTGGCCAAACACGAATTCGGCCAGGACCGGGAAACCCGCTTGCGGCCAAGCTACTTCCCATTTACTGAACCATCACTTGAAATGGACTTTTCTTGCTTTGAATGCGGCGGCAAGGGCTGCTCGATCTGCAAGAACACCGGCTGGATCGAAGTTCTGGGTGCCGGGATCGTTCACCCGAATGTTTTGTCTGCCGCCGGCATTGACCCAAACGTCTACTCTGGTT
JMCC0018的分离纯化方法，按照以下步骤顺序进行：
①样品采集
取25mL西藏拉萨市夺底乡牧民家中自制传统的发酵乳制品，加入到250mL生理盐水中，充分混匀，得到样品；
②样品的富集
取样品2mL，加入到100mL的LC液体培养基中，35℃培养72h，得到培养液；
③菌株分离
取培养液1mL，用0.9%（重量与体积的百分比）无菌的生理盐水稀释100000倍，分别为梯度稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍，得到菌悬液；
取MRS琼脂培养基（MRS培养基具有以下组成：10g酪蛋白胨；10g牛肉膏；5g酵母膏；20g葡萄糖；5g乙酸钠；2g柠檬酸二胺；1g吐温-80；K2HPO4：2g；0.2g MgSO4·7H2O；0.05gMnSO4·7H2O；15g琼脂；1000mL蒸馏水；该培养基调节pH6.8±0.1），融化后，倒入培养皿，待其冷却、完全凝固后，吸取0.1mL菌悬液涂布到培养基上；
置35℃环境下厌氧培养72h（H2：CO2：N2=5：10：85），观察菌落生长情况；
待平板出现典型菌落后，根据标准嗜热链球菌的菌落特征以及参考相关文献图片，挑选出相应的菌落，进行下一步的菌株纯化；
④菌株的纯化
挑取选中的单菌落，将菌落培养物划线接种到MRS琼脂培养基上，35℃有氧环境培养72h；然后，再将培养皿上长出的单菌落，继续划线接种到MRS琼脂培养基上，35℃有氧环境培养72h；连续培养三次；
⑤将纯培养物置于无菌的20%甘油中在-70℃保存，同时接种MRS琼脂培养基试管斜面用于临时保存。
德氏乳杆菌保加利亚亚种JMCC0018细菌学特征如下：
A1．基本特征如表1所示：
表1. 德氏乳杆菌保加利亚亚种JMCC0018基本特征
Figure RE-740703DEST_PATH_IMAGE001
由表1可见，德氏乳杆菌保加利亚亚种JMCC0018为革兰氏阳性、杆状、无芽孢、接触酶和氧化酶试验的阴性菌株。
A2．糖发酵特性实验
将上述分离纯化菌株挑取单菌落进行平板划线，37℃培养48h，分别挑取一接种环菌株接入糖发酵管中，37℃培养48h，观察颜色变化。具体结果见下表。
表2. 德氏乳杆菌保加利亚亚种JMCC0018的鉴定结果
Figure RE-417672DEST_PATH_IMAGE008
注：“+”表示发酵利用；“-”表示不发酵利用。
（2）嗜热链球菌JMCC0019（Streptococcus thermophiles）
嗜热链球菌JMCC0019（Streptococcus thermophiles），是从西藏拉萨市夺底乡牧民家中自制传统发酵乳中分离筛选出来的，该菌菌株已于2017年7月14日，保存于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，保藏号为CGMCC NO.14426。将菌株进行分子生物学鉴定，通过DNA提取、PCR扩增，16SrDNA测序，NCBI网站blast最终确定为嗜热链球菌。
嗜热链球菌JMCC0019的16SrDNA测序结果如下：
GTGGCTCAAAGGTTCCTCACCGACTTCGGGTGTTAAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGATTGGCTTTAAGAGATTAGCTCGCCGTCACCGACTCGCAACTCGTTGTACCAACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTATTACCGGCAGTCTCGCTAGAGTGCCCAACTGAATGATGGCAACTAACAATAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACCGATGTACCGAAGTAACTTTCTATCTCTAGAAATAGCATCGGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCGGCACTGAATCCCGGAAAGGATCCAACACCTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGCCGCTTTCGCCACCGGTGTTCCTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTCTCCCCTTCTGCACTCAAGTTTGACAGTTTCCAAAGCGAACTATGGTTGAGCCACAGCCTTTAACTTCAGACTTATCAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTCGGGACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTGGTAAGCTACCGTCACAGTGTGAACTTTCCACTCTCACACCCGTTCTTGACTTACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCGGTCAGGGTTGCCCCCATTGCCGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTATGTATCGTCGCCTAGGTGAGCCATTACCTCACCTACTAGCTAATACAACGCAGGTCCATCTTGTAGTGGAGCAATTGCCCCTTTCAAATAAATGACATGTGTCATCCATTGTTATGCGGTATTAGCTATCGTTTCCAATAGTTATCCCCCGCTACAAGGCAGGTTACCTACGCGTTACTCACCCGTTCGCAACTCATCCAAGAAGAGCAAGCTCCTCTCTTCAGCGTCTACTGCAG
嗜热链球菌JMCC0019的Phes基因测序结果如下：
TCGCAACTCTACAAGTCCTGTCCAAGCTCGTACACTTGATAAACATGATTTTTCTAAAGGTCCTCTTAAGATGATCTCACCAGGACGTGTTTTCCGTCGTGATACCGATGATGCGACTCACAGCCACCAGTTTCACCAAATCGAAGGTTTGGTCGTTGGTAAAAACATCTCAATGGGTGATCTGAAGGGAACGCTTGAGATGATTATTCAAAAAATGTTTGGTGCAGAACGTCGAATCCGTTTGCGTCCTTCTTACTTCCCATTCACTGAACCTTCCGTTGAGGTTGACGTGTCATGCTTCAAGTGTGGTGGTAAAGGATGTAACGTATGCAAGAATACAGGTTGGATTGAGATCCTTGGTGCTGGTATGGTTCACCCACAAGTGCTTGAGATGTCAGGTGTTGATTCTGAAGAATATTCAGGTTTTGTTTTGGGTTTAGGAAG
JMCC0019的分离纯化方法，按照以下步骤顺序进行：
①样品采集
取25mL西藏拉萨市夺底乡牧民家中自制传统的发酵乳制品，加入到250mL生理盐水中，充分混匀，得到样品；
②样品的富集
取样品2mL，加入到100mL的LC液体培养基中，35℃培养72h，得到培养液；
③菌株分离
取培养液1mL，用0.9%（重量与体积的百分比）无菌的生理盐水稀释100000倍，分别为梯度稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍，得到菌悬液；
取MRS琼脂培养基（MRS培养基具有以下组成：10g酪蛋白胨；10g牛肉膏；5g酵母膏；20g葡萄糖；5g乙酸钠；2g柠檬酸二胺；1g吐温-80；K2HPO4：2g；0.2g MgSO4·7H2O；0.05gMnSO4·7H2O；15g琼脂；1000mL蒸馏水；该培养基调节pH6.8±0.1），融化后，倒入培养皿，待其冷却、完全凝固后，吸取0.1mL菌悬液涂布到培养基上；
置35℃环境下厌氧培养72h（H2：CO2：N2=5：10：85），观察菌落生长情况；
待平板出现典型菌落后，根据标准嗜热链球菌的菌落特征以及参考相关文献图片，挑选出相应的菌落，进行下一步的菌株纯化；
④菌株的纯化
挑取选中的单菌落，将菌落培养物划线接种到MRS琼脂培养基上，35℃有氧环境培养72h；然后，再将培养皿上长出的单菌落，继续划线接种到MRS琼脂培养基上，35℃有氧环境培养72h；连续培养三次；
⑤将纯培养物置于无菌的20%甘油中在-70℃保存，同时接种MRS琼脂培养基试管斜面用于临时保存。
嗜热链球菌JMCC0019的菌种细菌学特征
B1．基本特征如表3：
表3 嗜热链球菌JMCC0019基本特征
Figure RE-199815DEST_PATH_IMAGE009
B2．糖发酵特性实验
将菌株挑取单菌落进行平板划线，37℃培养24h，传代一次，取菌悬液接种至糖发酵管中，37℃培养48h，观察颜色变化。具体结果见表4：
表4 产胞外多糖的嗜热链球菌JMCC0019的鉴定结果
Figure RE-354852DEST_PATH_IMAGE010
注：“+”表示发酵利用；“-”表示不发酵利用。
B3．肠细胞粘附特性实验
将肠上皮细胞Caco-2提前铺于细胞培养板中，用DMEM调整嗜热链球菌JMCC0019的菌浓度到1.0×108CFU/mL，铺于细胞上层，于5%CO2、95%空气培养箱中37℃下孵育2.5h。用无菌PBS洗涤除去未结合的乳酸菌，加入1mL1%（v/v）Triton×100，充分捶打混匀，使粘附的菌体同细胞分离，梯度稀释后置于MRS固体培养基上培养并计数，取3次实验的平均值表示细胞的粘附能力。嗜热链球菌JMCC0019对肠上皮细胞黏附实验结果如表5所示：
表5 嗜热链球菌JMCC0019菌株对肠上皮细胞黏附实验
Figure RE-561843DEST_PATH_IMAGE005
由上表可知，嗜热链球菌JMCC0019活性菌株对Caco-2细胞的黏附率为23.2±1.7个/细胞。
B4.胞外多糖检测实验
嗜热链球菌JMCC0019的MRS培养液用于胞外多糖提取，并于490nm处测定吸光度值。
表6 菌株JMCC0019胞外多糖的表达量
Figure RE-268768DEST_PATH_IMAGE005
由表6可知，嗜热链球菌JMCC0019产胞外多糖的能力优良。
B5．菌株发酵特性
取牛奶75-100份，白砂糖2-20份，低聚果糖1-20份，调配均匀后，于60-65℃、15MPa下均质，95℃杀菌300s后，降温至35-40℃，接种JMCC0019 106CFU/mL，于37℃发酵24h，检测其pH为4.0-4.5之间是停止发酵，摇匀后对发酵样品进行感官品评，根据感官品评结果如表7所示：
Figure RE-662840DEST_PATH_IMAGE007
Figure RE-496935DEST_PATH_IMAGE011
实施例1-6所提供的每一种酸奶发酵剂的制备方法，按照以下步骤顺序进行：
（1）菌株活化
德氏乳杆菌保加利亚亚种JMCC0018、嗜热链球菌JMCC0019分别按照以下顺序进行的步骤进行活化：
1）菌株接种至液体MRS培养基（MRS培养基具有以下组成：10g酪蛋白胨；10g牛肉膏；5g酵母膏；20g葡萄糖；5g乙酸钠；2g柠檬酸二胺；1g吐温-80；K2HPO4：2g；0.2g MgSO4·7H2O；0.05g MnSO4·7H2O；15g琼脂；1000mL蒸馏水；该培养基调节pH6.8±0.1），37℃培养48h，为第一代；
2）取第一代1mL，加入9mL脱脂奶中，培养16h，作为第二代；
3）取第二代1mL，加入9mL脱脂奶中，培养16h，作为第三代，得活化后菌种；
（2）菌粉制备
德氏乳杆菌保加利亚亚种JMCC0018、嗜热链球菌JMCC0019每一种菌粉分别按照以下顺序进行的步骤来制备：
1）将活化后菌种放入发37℃发酵罐内进行发酵，发酵10小时；
2）发酵液4℃低温冷却1h后，通过管式离心机进行低温（4℃）菌体分离，并加入冻干保护剂进行乳化，得到乳化液；
3）将乳化液放入真空冷冻干燥机内冻干，温度控制在—40～—35℃，通过金属探针检测水分活度至水活度＜0.2进行质量控制（常规作法），得到冻干菌体；
4）将冻干菌体放入粉碎机内进行粉碎，粉碎后的产品过40目筛，最终制得单菌株菌粉，其中菌株活菌数≥2×1010cfu/g；
（3）复配
取各自分别制备好的德氏乳杆菌保加利亚亚种JMCC0018、嗜热链球菌JMCC0019两种菌粉，按照活菌数量比1：100-10000进行复配，得酸奶发酵剂。
实施例3 实施例2所制酸奶发酵剂的一种应用
实施例2所制酸奶发酵剂，用于通过发酵步骤，用牛奶或复原乳制备酸奶。
该制备方法包括依次进行的基料调配、均质杀菌、发酵、破乳步骤。其中：
①所述基料调配步骤是：
将主料牛乳/复原奶打入混料罐中，加入辅料，搅拌至辅料完全溶解;控温存放，得基料；
控温存放是指：在0～15℃，存放0～1h，于均质杀菌前15 min开启搅拌15min；存放时间达1h但不能进入均质机中进行均质时，需控制温度在0～10℃，继续存放0～1h，并于均质杀菌前15 min开启搅拌15min；
②所述均质步骤是：将基料输入均质机中进行均质，均质二级压力4.8～5.1 MPa、一级压力17.2～17.8 MPa；均质温度58～62℃；
③所述杀菌步骤是：在93～98℃温度下杀菌时间300～310s；
④所述发酵步骤是：将杀菌后的料液降温至40～42℃，输入发酵罐；以与牛奶/复原乳的比例为100kg：1g，取发酵剂加入发酵罐，混合、活化，搅拌30～40min,关闭搅拌;40～42℃保温发酵，自关闭搅拌时刻起3h时开始测酸，当所测滴定酸度达到68～72°T，将发酵罐温度提高至55℃，保持5 min后破乳，搅拌20～30 min，降至室温即成，其中，测酸频次为每隔20min测酸一次，直至滴定酸度达到68～72°T。
实施例7 实施例1-6所制酸奶口味对比试验
为了准确、全面的掌握消费者对实施例1-6所制酸奶的接受程度和评价，我们分别在小区、超市、大学进行了产品的口味盲测。
对象及要求：共调查男性92人，女性87人，年龄在18～63岁，三个月内饮用过酸奶产品。
1）测试方法
对产品从外观、风味和口感三项对样品进行评比。将每项评比的分值乘以评分权重后相加即为该样品的实际得分。按权重法对产品进行评比，三项指标的评分权重和说明见下表：
Figure RE-292853DEST_PATH_IMAGE012
2）测试结果
产品口味测试统计结果见下表，表明80%以上的测试者喜欢此发酵剂发酵的发酵乳产品，仅12%的测试者表示不喜欢，说明产品的口味能够为绝大多数消费者接受。女性对发酵乳的接受比例高于男性，测试者认为该产品的香气浓郁，特征香气明显。
味测试分析
Figure RE-46045DEST_PATH_IMAGE013
实施例8 实施例1-6所制酸奶后弱酸试验
本实施例对实施例1－6所制酸奶进行了后弱酸试验：
①取10个批次在低温条件（2-8℃）检测后酸情况，图1为后酸曲线。从图中可以看出，低温储藏时，在保质期内，最高酸度为101°T；通常情况下，保质期内最高酸度为95°T。
②取10个批次在常温条件（18-25℃）检测后酸情况，图2为后酸曲线。从图中可以看出，10个批次的酸奶，常温放置时，在保质期内最高的酸度为114°T。而通常情况下，最高的酸度为105°T。
序列表
<110> 石家庄君乐宝乳业有限公司
<120> 一种酸奶发酵剂、其制备方法及应用
<130> 2017.12.10
<140> 2017113597508
<141> 2017-12-17
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1399
<212> DNA
<213> Lactobacillus bulgaricus
<400> 1
gactcctata aaggttatcc caccgacttt gggcattgca gacttccatg gtgtgacggg 60
cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca ccgcggcgtg ctgatccgcg attactagcg 120
attccagctt cgtgcaggcg agttgcagcc tgcagtccga actgagaaca gctttaagag 180
atccgcttac cctcgcgggt tcgcttctcg ttgtactgcc cattgtagca cgtgtgtagc 240
ccaggtcata aggggcatga tgacttgacg tcatccccac cttcctccgg tttgtcaccg 300
gcagtctctt tagagtgccc aacttaatga tggcaactaa agacaagggt tgcgctcgtt 360
gcgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacgac agccatgcac cacctgtctc 420
tgcgtccccg aagggaacca cctatctcta ggtgtagcac aggatgtcaa gacctggtaa 480
ggttcttcgc gttgcttcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg gcccccgtca 540
attcctttga gtttcaacct tgcggtcgta ctccccaggc ggagcgctta atgcgtttgc 600
tgcggcactg aggaccggaa agtccccaac acctagcgct catcgtttac ggcatggact 660
accagggtat ctaatcctgt tcgctaccca tgctttcgag cctcagcgtc agttgcagac 720
cagagagccg ccttcgccac tggtgttctt ccatatatct acgcattcca ccgctacaca 780
tggaattcca ctctcctctt ctgcactcaa gaatgacagt ttccgatgca gttccacggt 840
tgagccgtgg gctttcacat cagacttatc attccgcctg cgctcgcttt acgcccaata 900
aatccggaca acgcttgcca cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta gttagccgtg 960
actttctggt tgattaccgt caaataaaga ccagttactg cctctatcct tcttcaccaa 1020
caacagagct ttacgatccg aaaaccttct tcactcacgc ggcgttgctc catcagactt 1080
gcgtccattg tggaagattc cctactgctg cctcccgtag gagtttgggc cgtgtctcag 1140
tcccaatgtg gccgatcagt ctctcaactc ggctacgcat cattgccttg gtaggccttt 1200
accccaccaa ctagctaatg cgccgcgggc tcatcctaaa gtgacagctt acgccgcctt 1260
tcaaacttga atcatgcgat tcatgttgtt atccggtatt agcacctgtt tccaagtggt 1320
atcccagtct ttagggcaga ttgcccacgt gttactcacc catccgccgc tagcgtccaa 1380
caaatcatcc cgaaggaat 1399
<210> 2
<211> 432
<212> DNA
<213> Lactobacillus bulgaricus
<400> 2
cacctgctgc ggagcctcac ttcaccagtt caagcccgga ccatggaaaa gcatgacttc 60
ataaagggga cctcaagatg atctccccag gcaaggttta cacaatagac gatgacgacg 120
ccacccagtc ccaccagttc atgcagatgg aagggctggt tgtcagcaag aacatctcct 180
tgagtgacct taaggggacc ttggaactgg tggccaaaca cgaattcggc caggaccggg 240
aaacccgctt gcggccaagc tacttcccat ttactgaacc atcacttgaa atggactttt 300
cttgctttga atgcggcggc aagggctgct cgatctgcaa gaacaccggc tggatcgaag 360
ttctgggtgc cgggatcgtt cacccgaatg ttttgtctgc cgccggcatt gacccaaacg 420
tctactctgg tt 432
<210> 3
<211> 1407
<212> DNA
<213> Streptococcus thermophilus
<400> 3
gtggctcaaa ggttcctcac cgacttcggg tgttaaaact ctcgtggtgt gacgggcggt 60
gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc ggcgtgctga tccgcgatta ctagcgattc 120
cgacttcatg taggcgagtt gcagcctaca atccgaactg agattggctt taagagatta 180
gctcgccgtc accgactcgc aactcgttgt accaaccatt gtagcacgtg tgtagcccag 240
gtcataaggg gcatgatgat ttgacgtcat ccccaccttc ctccggttta ttaccggcag 300
tctcgctaga gtgcccaact gaatgatggc aactaacaat aggggttgcg ctcgttgcgg 360
gacttaaccc aacatctcac gacacgagct gacgacaacc atgcaccacc tgtcaccgat 420
gtaccgaagt aactttctat ctctagaaat agcatcggga tgtcaagacc tggtaaggtt 480
cttcgcgttg cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc ccgtcaattc 540
ctttgagttt caaccttgcg gtcgtactcc ccaggcggag tgcttaatgc gttagctgcg 600
gcactgaatc ccggaaagga tccaacacct agcactcatc gtttacggcg tggactacca 660
gggtatctaa tcctgttcgc tccccacgct ttcgagcctc agcgtcagtt acagaccaga 720
gagccgcttt cgccaccggt gttcctccat atatctacgc atttcaccgc tacacatgga 780
attccactct ccccttctgc actcaagttt gacagtttcc aaagcgaact atggttgagc 840
cacagccttt aacttcagac ttatcaaacc gcctgcgctc gctttacgcc caataaatcc 900
ggacaacgct cgggacctac gtattaccgc ggctgctggc acgtagttag ccgtcccttt 960
ctggtaagct accgtcacag tgtgaacttt ccactctcac acccgttctt gacttacaac 1020
agagctttac gatccgaaaa ccttcttcac tcacgcggcg ttgctcggtc agggttgccc 1080
ccattgccga agattcccta ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgtg tctcagtccc 1140
agtgtggccg atcaccctct caggtcggct atgtatcgtc gcctaggtga gccattacct 1200
cacctactag ctaatacaac gcaggtccat cttgtagtgg agcaattgcc cctttcaaat 1260
aaatgacatg tgtcatccat tgttatgcgg tattagctat cgtttccaat agttatcccc 1320
cgctacaagg caggttacct acgcgttact cacccgttcg caactcatcc aagaagagca 1380
agctcctctc ttcagcgtct actgcag 1407
<210> 4
<211> 444
<212> DNA
<213> Streptococcus thermophilus
<400> 4
tcgcaactct acaagtcctg tccaagctcg tacacttgat aaacatgatt tttctaaagg 60
tcctcttaag atgatctcac caggacgtgt tttccgtcgt gataccgatg atgcgactca 120
cagccaccag tttcaccaaa tcgaaggttt ggtcgttggt aaaaacatct caatgggtga 180
tctgaaggga acgcttgaga tgattattca aaaaatgttt ggtgcagaac gtcgaatccg 240
tttgcgtcct tcttacttcc cattcactga accttccgtt gaggttgacg tgtcatgctt 300
caagtgtggt ggtaaaggat gtaacgtatg caagaataca ggttggattg agatccttgg 360
tgctggtatg gttcacccac aagtgcttga gatgtcaggt gttgattctg aagaatattc 420
aggttttgtt ttgggtttag gaag 444

Claims (3)

1.一种酸奶发酵剂，其特征在于：它由保藏编号为CGMCC No.14425的德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus )JMCC0018、保藏编号为CGMCCNo.14426的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus )JMCC0019以活菌数配比为1：100-10000组成。
2.权利要求1所述的一种酸奶发酵剂的制备方法，其特征在于它按照以下步骤顺序进行：
(1)菌株活化
德氏乳杆菌保加利亚亚种JMCC0018、嗜热链球菌JMCC0019分别按照以下顺序进行的步骤进行活化：
1)菌株接种至液体MRS培养基，37℃培养48h，为第一代；
2)取第一代1mL，加入9mL脱脂奶中，培养16h，作为第二代；
3)取第二代1mL，加入9mL脱脂奶中，培养16h，作为第三代，得活化后菌种；
(2)菌粉制备
德氏乳杆菌保加利亚亚种JMCC0018、嗜热链球菌JMCC0019每一种菌粉分别按照以下顺序进行的步骤来制备：
1)将活化后菌种放入37℃发酵罐内进行发酵，发酵10小时；
2)发酵液4℃低温冷却1h后，通过管式离心机进行低温菌体分离，并加入冻干保护剂进行乳化，得到乳化液；
3)将乳化液放入真空冷冻干燥机内冻干，温度控制在- 40～- 35℃，通过金属探针检测水分活度至水活度＜0.2进行质量控制，得到冻干菌体；
4)将冻干菌体放入粉碎机内进行粉碎，粉碎后的产品过40目筛，最终制得单菌株菌粉，其中菌株活菌数≥2×1010cfu/g；
(3)复配
取各自分别制备好的德氏乳杆菌保加利亚亚种JMCC0018、嗜热链球菌JMCC0019两种菌粉，按照活菌数量比1：100-10000进行复配，得所述的一种酸奶发酵剂。
3.权利要求1所述的一种酸奶发酵剂的一种应用，其特征在于：它用于通过发酵步骤，用牛奶或复原乳制备酸奶。
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