CN105462883B - 抗痢疾志贺氏菌的嗜热链球菌jmcc0003、其分离纯化方法及应用 - Google Patents

抗痢疾志贺氏菌的嗜热链球菌jmcc0003、其分离纯化方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗痢疾志贺氏菌的嗜热链球菌JMCC0003、其分离纯化方法及应用，该嗜热链球菌是从内蒙传统发酵乳中分离筛选出来的具有很好发酵特性和黏附肠细胞、抑制痢疾志贺氏菌生长的菌株；该菌菌株已保存于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，保藏号为CGMCC NO.6674；本发明筛选出的嗜热链球菌与已有链球菌相比，对低pH值和高胆汁酸盐具有更强的抗性，具有更好的耐受人消化道不良环境的能力，可以更好地发挥其益生作用；该菌株具有良好的发酵特性，可用于功能性乳制品的开发。

Description

抗痢疾志贺氏菌的嗜热链球菌JMCC0003、其分离纯化方法及 应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种菌株、其筛选方法及应用，具体地说，是一种抗痢疾志贺氏菌的嗜热链球菌JMCC0003、其分离纯化方法及应用。
背景技术
目前我国规定可用于食品的益生菌仅有双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种、嗜热链球菌。嗜热链球菌被认为是“公认安全性（GRAS）”成分，广泛用于生产一些重要的发酵乳制品，包括酸奶和奶酪（如瑞士、林堡干酪）。
嗜热链球菌也具有一些功能活性，比如生产胞外多糖、细菌素和维生素。嗜热链球菌也可以作为潜在有益菌，实验证明了其具有健康效果、转运活性和一定的胃肠道粘附性。因此，筛选具有明显功能的嗜热链球菌具有非常重要的现实意义。
中国发明专利CN104877940A“一株嗜热链球菌”，公开了一株食源性嗜热链球菌，保藏号为CTCC NO. 10633，为从自然发酵产生的酸奶风味乳中分离出的一株具有一定粘附能力和胆固醇降解能力的嗜热链球菌，可单独发酵酸奶作为酸奶发酵剂。中国发明专利CN102465108A“一种嗜热链球菌及其应用”，公开了一株嗜热链球菌，保藏号为CGMCC NO.3817，为从传统发酵乳中分离的具有调节肠道菌群平衡、降低胆固醇和抑制病原菌等方面的效果。
发明内容
本发明要解决的技术问题，是提供一种抗痢疾志贺氏菌的嗜热链球菌JMCC0003（Streptococcus thermophilus）它是从内蒙传统发酵乳中分离筛选出来的。
本发明的抗痢疾志贺氏菌的嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）JMCC0003，已于2012年10月15日，保存于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，保藏号为CGMCC NO. 6674；
本发明的另外一个发明目的，是提供上述抗痢疾志贺氏菌的嗜热链球菌JMCC0003的一种分离纯化方法；
本发明还有一个发明目的，是提供一种上述抗痢疾志贺氏菌的嗜热链球菌JMCC0003的应用。与已有链球菌相比，抗痢疾志贺氏菌的嗜热链球菌JMCC0003对低pH值和高胆汁酸盐具有更强的抗性，具有更好的耐受人消化道不良环境的能力，可以更好地发挥其益生作用。
为达到上述目的，本发明的技术方案是：
一种抗痢疾志贺氏菌的嗜热链球菌JMCC0003，是从内蒙传统发酵乳中分离筛选出来的；该菌菌株已于2012年10月15日，保存于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，保藏号为CGMCC NO. 6674。
作为本发明的一种限定，其16SrDNA序列结果如下：
GGGCCAGGGCGGGGTTGCTTATACTGCAAGTAGAACGCTGAAGAGAGGAGCTTGCTCTTCTTGGATGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTGCCTTGTAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAACAATGGATGACACATGTCATTTATTTGAAAGGGGCAATTGCTCCACTACAAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTAGGTGAGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGGGGCAACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTAAGTCAAGAACGGGTGTGAGAGTGGAAAGTTCACACTGTGACGGTAGCTTACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTCCCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTGATAAGTCTGAAGTTAAAGGCTGTGGCTCAACCATAGTTCGCTTTGGAAACTGTCAAACTTGAGTGCAGAAGGGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATGTATGGAGGAACACCGGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGCTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGATCCTTTCCGGGATTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCGATGCTATTTCTAGAGATAGAAAGTTACTTCGGTACATCGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATTGTTAGTTGCCATCATTCAGTTGGGCACTCTAGCGAGACTGCCGGTAATAAACGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTTGGTACAACGAGTTGCGAGTCGGTGACGGCGAGCTAATCTCTTAAAGCCAATCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCAGCCGCCTAAGGTGAACAGAGTTG
本发明也提供了上述抗痢疾志贺氏菌的嗜热链球菌JMCC0003的分离纯化方法，它按照以下步骤顺序进行：
① 样品采集
取25mL内蒙古传统的发酵乳制品，加入到250mL生理盐水中，充分混匀，得到样品；
② 样品的富集
取样品2mL，加入到100mL的LC液体培养基中，35℃培养72h，得到培养液；
③菌株分离
取培养液1mL，用0.9%（重量与体积的百分比）无菌的生理盐水稀释100000倍，分别为梯度稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍，得到菌悬液；
取MRS琼脂培养基，融化后，倒入培养皿，待其冷却、完全凝固后，吸取0.1mL菌悬液涂布到培养基上；
置35℃环境下厌氧培养72h（H2：CO2：N2=5：10：85），观察菌落生长情况；
待平板出现典型菌落后，根据标准嗜热链球菌的菌落特征以及参考相关文献图片，挑选出相应的菌落，进行下一步的菌株纯化；
④菌株的纯化
挑取选中的单菌落，将菌落培养物划线接种到MRS琼脂培养基上，35℃有氧环境培养72h；然后，再将培养皿上长出的单菌落，继续划线接种到MRS琼脂培养基上，35℃有氧环境培养72h；连续培养三次；
最后，将纯培养物置于无菌的20%甘油中在-70℃保存，同时接种MRS琼脂培养基试管斜面用于临时保存。
作为上述分离纯化方法的一种限定，所述MRS培养基，以重量计包括以下成分组成：
酪蛋白胨　 　10份， 牛肉膏　　10份， 酵母膏　　　 　5份，
葡萄糖　　 　20份， 乙酸钠　　5份， 柠檬酸二胺 　　2份，
吐温-80　　　1份， K2HPO4 　 2份， 　MgSO4·7H2O　　0.2份，
MnSO4·7H2O　0.05份， 琼脂　　　15份；
所述培养基还包括蒸馏水1000体积份，所述重量份与体积份的比为ｇ：mL；该培养基调节pH6.8±0.1。
本发明的抗痢疾志贺氏菌的嗜热链球菌JMCC0003细菌学特性如下：
（1）糖发酵特性实验
将上述所分离纯化出的菌株37℃培养48h，分别挑取一接种环菌株接入糖发酵管中进行37℃培养48h，观察颜色变化。
（2）分子生物学鉴定
将上述菌株进行分子生物学鉴定，通过DNA提取、PCR扩增，16SrDNA测序，NCBI网站blast最终确定为嗜热链球菌。
（3）肠细胞粘附特性实验
将肠上皮细胞以每孔1mL细胞悬液加入加有盖玻片的24孔板中，于37℃培养箱中孵育48h；待细胞贴壁完全，以无菌PBS洗涤2次，每孔加入1mL浓度为108个/mL的乳酸菌悬液，孵育1h；然后取出盖玻片，用无菌PBS漂洗3次，然后用质量分数为4%多聚甲醛固定30min，烘干后用结晶紫染色，于显微镜下观察，随机挑选20个视野，每个视野50个细胞，计算其表面粘附的乳酸菌数量并取3次实验的平均值表示细胞的粘附能力。
（4）抑制有害菌特性实验
对上述菌株进行痢疾志贺氏菌黏附拮抗作用实验，将肠上皮细胞以每孔1mL细胞悬液加入24孔板中，于37℃培养箱中孵育48h；待细胞贴壁完全，以无菌PBS洗涤2次，每孔加入108个/ml乳酸菌，孵育30min，除去未黏附的乳酸菌，再加入107个/ml的痢疾志贺氏菌，孵育30min；然后取出盖玻片，用无菌PBS漂洗3次，然后用质量分数为4%多聚甲醛固定30min，烘干后用结晶紫染色，于显微镜下观察，随机挑选20个视野，每个视野50个细胞，计算其表面粘附的乳酸菌数量并取3次实验的平均值表示细胞的粘附能力。
（5）菌株发酵特性实验
取鲜牛奶200份，白砂糖18份，调配均匀后，于65℃、15MPa下均质，95℃杀菌300s后，降温至35-40℃，接种JMCC0003 106cfu/ml，于37℃发酵24h，发酵结束后对发酵样品进行感官品评，根据感官品评结果最终筛选出有抑制痢疾志贺氏菌作用的嗜热链球菌JMCC0003。
作为本发明另外的一种限定，所述步骤③中的糖发酵管中包括：水杨苷、核糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露醇、纤维二塘、蔗糖、棉子糖、山梨醇。
本发明还提供了上述抗痢疾志贺氏菌的嗜热链球菌JMCC0003的一种应用，该抗痢疾志贺氏菌的嗜热链球菌JMCC0003具有抑制肠道有害菌作用，应用于制备功能性乳制品和益生菌菌粉。
由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比所取得的技术进步在于：本发明采用的菌株具有很好的黏附肠道和抑制病原菌的作用，因此具有很好的调节肠道和抑制病原菌侵袭的作用，可用于益生菌菌粉的制备；本发明采用的菌株具有良好的发酵特性，可将其用于功能性乳制品的开发。
本发明下面将结合具体实施例作进一步详细说明。
具体实施方式
以下实施例只用于说明本发明，而并不限定本发明。
实施例１ 一种抗痢疾志贺氏菌的嗜热链球菌JMCC0003及其分离纯化方法
一、 菌种
抗痢疾志贺氏菌的嗜热链球菌JMCC0003，是从内蒙传统发酵乳中分离筛选出来的，该菌菌株已于2012年10月15日，保存于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，保藏号为CGMCC NO. 6674。
二、 上述抗痢疾志贺氏菌的嗜热链球菌JMCC0003的分离纯化方法
该分离纯化方法按照以下步骤顺序进行：
步骤1 样品采集
取25mL内蒙古乌兰察布市西北部四子王旗农户家中自制的传统发酵乳制品，加入到250mL生理盐水中，充分混匀，得到样品。
步骤2 样品的富集
取样品2mL，加入到100mL的LC液体培养基中，35℃培养72h，得到培养液。
步骤3 菌株分离
取培养液1mL，用0.9%（重量与体积的百分比）无菌的生理盐水稀释100000倍，分别为梯度稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍，得到菌悬液；
取MRS琼脂培养基，融化后，倒入培养皿，待其冷却、完全凝固后，吸取0.1mL菌悬液涂布到培养基上；
置35℃环境下厌氧培养72h（H2：CO2：N2=5：10：85），观察菌落生长情况；
待平板出现典型菌落后，根据标准嗜热链球菌的菌落特征以及参考相关文献图片，挑选出相应的菌落，进行下一步的菌株纯化。
步骤4 菌株的纯化
挑取选中的单菌落，将菌落培养物划线接种到MRS琼脂培养基上，35℃有氧环境培养72h；然后，再将培养皿上长出的单菌落，继续划线接种到MRS琼脂培养基上，35℃有氧环境培养72h；连续培养三次；
最后，将纯培养物置于无菌的20%甘油中在-70℃保存，同时接种MRS琼脂培养基试管斜面用于临时保存。
实施例２ 实施例１中菌种的细菌学特征
一．基本特征
本发明所提供的抗痢疾志贺氏菌的嗜热链球菌JMCC0003基本特征如表1所示：
表1. 抗痢疾志贺氏菌的嗜热链球菌JMCC0003基本特征
二．糖发酵特性实验
将上述分离纯化菌株挑取单菌落进行平板划线，37℃培养48h，分别挑取一接种环菌株接入糖发酵管中进行37℃培养48h，观察颜色变化；
其中，糖发酵管中包括：苦杏仁苷、阿拉伯糖、纤维二糖、七叶灵、果糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖酸钠、乳糖、麦芽糖、甘露醇、甘露糖、松三糖、蜜二糖、棉子糖、L-鼠李糖、D-核糖、水杨苷、山梨醇、蔗糖、海藻糖、D-木糖。
表2. 抗痢疾志贺氏菌的嗜热链球菌JMCC0003的鉴定结果
注：“+”表示发酵利用；“-”表示不发酵利用。
三．分子生物学鉴定
将上述菌株进行分子生物学鉴定，通过DNA提取、PCR扩增，16SrDNA测序，NCBI网站blast最终确定为嗜热链球菌。
嗜热链球菌的16SrDNA测序结果如下：
GGGCCAGGGCGGGGTTGCTTATACTGCAAGTAGAACGCTGAAGAGAGGAGCTTGCTCTTCTTGGATGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTGCCTTGTAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAACAATGGATGACACATGTCATTTATTTGAAAGGGGCAATTGCTCCACTACAAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTAGGTGAGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGGGGCAACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTAAGTCAAGAACGGGTGTGAGAGTGGAAAGTTCACACTGTGACGGTAGCTTACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTCCCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTGATAAGTCTGAAGTTAAAGGCTGTGGCTCAACCATAGTTCGCTTTGGAAACTGTCAAACTTGAGTGCAGAAGGGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATGTATGGAGGAACACCGGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGCTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGATCCTTTCCGGGATTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCGATGCTATTTCTAGAGATAGAAAGTTACTTCGGTACATCGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATTGTTAGTTGCCATCATTCAGTTGGGCACTCTAGCGAGACTGCCGGTAATAAACGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTTGGTACAACGAGTTGCGAGTCGGTGACGGCGAGCTAATCTCTTAAAGCCAATCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCAGCCGCCTAAGGTGAACAGAGTTG
Phes基因测序结果如下：
TCCTAGGGCCGAAGGCAAAACCTGAATATTCTTCAGAATCAACACCTGACATCTCAAGCACTTGTGGGTGAACCATACCAGCACCAAGGATCTCAATCCAACCTGTATTCTTGCATACGTTACATCCTTTACCACCACACTTGAAGCATGACACGTCAACCTCAACGGAAGGTTCAGTGAATGGGAAGTAAGAAGGACGCAAACGGATTCGACGTTCTGCACCAAACATTTTTTGAATAATCATCTCAAGCGTTCCCTTCAGATCACCCATTGAGATGTTTTTACCAACGACCAAACCTTCGATTTGGTGAAACTGGTGGCTGTGAGTCGCATCATCGGTATCACGACGGAAAACACGTCCTGGTGAGATCATCTTAAGAGGACCTTTAGAAAAATCATGTTTATCAAGTGTACGAGCTTGGACAGGACTTGTATGAGTGCGAAGCAAGATTTCTTCGGTAATGTAGAAAGTATCTTGCATATCAGGGGGCGGGGATGA
四．肠细胞粘附特性实验
将肠上皮细胞以每孔1mL细胞悬液加入加有盖玻片的24孔板中，于37℃培养箱中孵育48h；待细胞贴壁完全，以无菌PBS洗涤2次，每孔加入1mL浓度为108个/mL的乳酸菌悬液，孵育1h；然后取出盖玻片，用无菌PBS漂洗3次，然后用质量分数为4%多聚甲醛固定30min，烘干后用结晶紫染色，于显微镜下观察，随机挑选20个视野，每个视野50个细胞，计算其表面粘附的乳酸菌数量并取3次实验的平均值表示细胞的粘附能力。嗜热链球菌JMCC0003对肠上皮细胞黏附实验结果如表3所示：
表3. 菌株对肠上皮细胞黏附实验
由上表可知，菌株JMCC0003对于活的乳酸菌对细胞的黏附率均大于14个/细胞，对于灭活的乳酸菌对细胞的黏附率均大于12个/细胞。
五．抑制有害菌特性实验
对上述具有较好肠上皮细胞黏附特性的菌株进行痢疾志贺氏菌黏附拮抗作用实验，将肠上皮细胞以每孔1mL细胞悬液加入24孔板中，于37℃培养箱中孵育48h；待细胞贴壁完全，以无菌PBS洗涤2次，每孔加入108个/ml乳酸菌，孵育30min，除去未黏附的乳酸菌，再加入107个/ml的痢疾志贺氏菌，孵育30min；然后取出盖玻片，用无菌PBS漂洗3次，然后用质量分数为4%多聚甲醛固定30min，烘干后用结晶紫染色，于显微镜下观察，随机挑选20个视野，每个视野50个细胞，计算其表面粘附的痢疾志贺氏菌数量并取3次实验的平均值表示细胞的粘附能力，对痢疾志贺氏菌黏附拮抗作用的结果如表4所示：
表4.菌株JMCC0003对痢疾志贺氏菌黏附拮抗作用
由表4可知，抗痢疾志贺氏菌的菌株嗜热链球菌对痢疾志贺氏菌对细胞的黏附率无论是活菌状态还是灭活菌状态均小于对照。
六．菌株发酵特性
取鲜牛奶200份，白砂糖18份，调配均匀后，于65℃、15MPa下均质，95℃杀菌300s后，降温至35-40℃，接种JMCC0003 106cfu/ml，于37℃发酵24h，发酵结束后对发酵样品进行感官品评，根据感官品评结果最终筛选出抑制肠道有害菌作用的抗痢疾志贺氏菌的嗜热链球菌JMCC0003，结果如表5所示：
表5.发酵特性
实施例３ 实施例１所述抗痢疾志贺氏菌的嗜热链球菌JMCC0003的一种应用
将实施例１所提供的抗痢疾志贺氏菌的嗜热链球菌JMCC0003的用于乳酸菌饮料的制备，制备方法按照下列步骤顺序进行;
将纯牛奶50份，水30份，蔗糖5份混合均匀于110℃下灭菌15min制备培养基液；
将106cfu/ml的抗痢疾志贺氏菌的嗜热链球菌JMCC0003、106cfu/ml的保加利亚乳杆菌接入培养基液中混匀，37℃发酵至pH至4.2-4.6，终止发酵，冷却灌装。冷藏保存。
实施例４ 实施例１所述抗痢疾志贺氏菌的嗜热链球菌JMCC0003的另一种应用
将实施例１所提供的抗痢疾志贺氏菌的嗜热链球菌JMCC0003的用于益生菌菌粉的制备。
该菌粉以重量计，原料组成如下：
抗痢疾志贺氏菌的嗜热链球菌JMCC0003：3%，
植物乳杆菌：3%，
嗜酸乳杆菌：1%，
乳双歧杆菌：1%，
干酪乳杆菌：2%，
低聚果糖（益生元）：80%，
草莓提取物：10%；
该益生菌菌粉制备工艺为：称取原料（菌粉、低聚果糖、草莓提取物）后进行混合，在真空分装机上进行分装，2g/袋（其中活性乳酸菌总数≥4×1010cfu/袋），贴标入库，冷藏保存。
实施例５ 对比例实验
对本发明所提供的抗痢疾志贺氏菌的嗜热链球菌JMCC0003，和加利亚乳杆菌、植物乳杆菌、双歧乳杆菌、干酪乳杆菌（活菌、灭活菌）进行肠上皮细胞黏附实验和肠上皮细胞痢疾志贺氏菌黏附拮抗作用实验，实验结果分别如表6和表7所示：
表6. 不同乳酸菌细胞黏附实验
表7. 不同乳酸菌对致病菌肠上皮细胞黏附拮抗实验
由表6和表7所示，本发明所提供菌种与保加利亚乳杆菌、双歧杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌相比，具有很好的肠上皮细胞黏附作用和抑制有害菌对肠上皮细胞的黏附作用。可见，本发明所提供的抗痢疾志贺氏菌的嗜热链球菌JMCC0003可能在抑制有害菌对人体肠道侵袭方面具有更好的作用。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述技术内容作为启示加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作出的简单修改，等同变化与改型，仍属于本发明权利要求的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 石家庄君乐宝乳业有限公司
<120> 抗痢疾志贺氏菌的嗜热链球菌JMCC0003、其分离纯化方法及应用
<130> 2015
<140> 2015109385818
<141> 2015-12-16
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1468
<212> DNA
<213> 嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus）
<400> 1
gggccagggc ggggttgctt atactgcaag tagaacgctg aagagaggag cttgctcttc 60
ttggatgagt tgcgaacggg tgagtaacgc gtaggtaacc tgccttgtag cgggggataa 120
ctattggaaa cgatagctaa taccgcataa caatggatga cacatgtcat ttatttgaaa 180
ggggcaattg ctccactaca agatggacct gcgttgtatt agctagtagg tgaggtaatg 240
gctcacctag gcgacgatac atagccgacc tgagagggtg atcggccaca ctgggactga 300
gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttcggcaat gggggcaacc 360
ctgaccgagc aacgccgcgt gagtgaagaa ggttttcgga tcgtaaagct ctgttgtaag 420
tcaagaacgg gtgtgagagt ggaaagttca cactgtgacg gtagcttacc agaaagggac 480
ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtcc cgagcgttgt ccggatttat 540
tgggcgtaaa gcgagcgcag gcggtttgat aagtctgaag ttaaaggctg tggctcaacc 600
atagttcgct ttggaaactg tcaaacttga gtgcagaagg ggagagtgga attccatgtg 660
tagcggtgaa atgcgtagat gtatggagga acaccggtgg cgaaagcggc tctctggtct 720
gtaactgacg ctgacgctga ggctcgaaag cgctggggag cgaacaggat tagataccct 780
ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta ggtgttggat cctttccggg attcagtgcc 840
gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg gagtacgacc gcaaggttga aactcaaagg 900
aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga 960
accttaccag gtcttgacat cccgatgcta tttctagaga tagaaagtta cttcggtaca 1020
tcggtgacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc 1080
cgcaacgagc gcaaccccta ttgttagttg ccatcattca gttgggcact ctagcgagac 1140
tgccggtaat aaacggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct 1200
gggctacaca cgtgctacaa tggttggtac aacgagttgc gagtcggtga cggcgagcta 1260
atctcttaaa gccaatctca gttcggattg taggctgcaa ctcgcctaca tgaagtcgga 1320
atcgctagta atcgcggatc agcacgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac 1380
cgcccgtcac accacgagag tttgtaacac ccgaagtcgg tgaggtaacc ttttggagcc 1440
agccagccgc ctaaggtgaa cagagttg 1468
<210> 2
<211> 499
<212> DNA
<213> 嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus）
<400> 2
tcctagggcc gaaggcaaaa cctgaatatt cttcagaatc aacacctgac atctcaagca 60
cttgtgggtg aaccatacca gcaccaagga tctcaatcca acctgtattc ttgcatacgt 120
tacatccttt accaccacac ttgaagcatg acacgtcaac ctcaacggaa ggttcagtga 180
atgggaagta agaaggacgc aaacggattc gacgttctgc accaaacatt ttttgaataa 240
tcatctcaag cgttcccttc agatcaccca ttgagatgtt tttaccaacg accaaacctt 300
cgatttggtg aaactggtgg ctgtgagtcg catcatcggt atcacgacgg aaaacacgtc 360
ctggtgagat catcttaaga ggacctttag aaaaatcatg tttatcaagt gtacgagctt 420
ggacaggact tgtatgagtg cgaagcaaga tttcttcggt aatgtagaaa gtatcttgca 480
tatcaggggg cggggatga 499

Claims (4)

1.一种抗痢疾志贺氏菌的嗜热链球菌JMCC0003，该菌菌株已保藏于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，保藏号：CGMCC NO. 6674；
其16SrDNA测序结果如下：
GGGCCAGGGCGGGGTTGCTTATACTGCAAGTAGAACGCTGAAGAGAGGAGCTTGCTCTTCTTGGATGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTGCCTTGTAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAACAATGGATGACACATGTCATTTATTTGAAAGGGGCAATTGCTCCACTACAAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTAGGTGAGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGGGGCAACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTAAGTCAAGAACGGGTGTGAGAGTGGAAAGTTCACACTGTGACGGTAGCTTACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTCCCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTGATAAGTCTGAAGTTAAAGGCTGTGGCTCAACCATAGTTCGCTTTGGAAACTGTCAAACTTGAGTGCAGAAGGGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATGTATGGAGGAACACCGGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGCTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGATCCTTTCCGGGATTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCGATGCTATTTCTAGAGATAGAAAGTTACTTCGGTACATCGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATTGTTAGTTGCCATCATTCAGTTGGGCACTCTAGCGAGACTGCCGGTAATAAACGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTTGGTACAACGAGTTGCGAGTCGGTGACGGCGAGCTAATCTCTTAAAGCCAATCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCAGCCGCCTAAGGTGAACAGAGTTG；
其Phes基因测序结果如下：
TCCTAGGGCCGAAGGCAAAACCTGAATATTCTTCAGAATCAACACCTGACATCTCAAGCACTTGTGGGTGAACCATACCAGCACCAAGGATCTCAATCCAACCTGTATTCTTGCATACGTTACATCCTTTACCACCACACTTGAAGCATGACACGTCAACCTCAACGGAAGGTTCAGTGAATGGGAAGTAAGAAGGACGCAAACGGATTCGACGTTCTGCACCAAACATTTTTTGAATAATCATCTCAAGCGTTCCCTTCAGATCACCCATTGAGATGTTTTTACCAACGACCAAACCTTCGATTTGGTGAAACTGGTGGCTGTGAGTCGCATCATCGGTATCACGACGGAAAACACGTCCTGGTGAGATCATCTTAAGAGGACCTTTAGAAAAATCATGTTTATCAAGTGTACGAGCTTGGACAGGACTTGTATGAGTGCGAAGCAAGATTTCTTCGGTAATGTAGAAAGTATCTTGCATATCAGGGGGCGGGGATGA。
2.权利要求1所述的抗痢疾志贺氏菌的嗜热链球菌JMCC0003的一种纯化方法，其特征在于它按照如下步骤顺序进行：
将所述的抗痢疾志贺氏菌的嗜热链球菌JMCC0003的单菌落培养物划线接种到MRS琼脂培养基上，35℃有氧环境培养72h；然后，再将培养皿上长出的单菌落，继续划线接种到MRS琼脂培养基上，35℃有氧环境培养72h；连续培养三次；
最后，将纯培养物置于无菌的20%甘油中在-70℃保存，同时接种MRS琼脂培养基试管斜面用于临时保存。
3.根据权利要求2所述的抗痢疾志贺氏菌的嗜热链球菌JMCC0003的纯化方法，其特征在于所述MRS琼脂培养基，以重量计包括以下成分组成：
酪蛋白胨 　　10份， 牛肉膏　 　10份， 酵母膏　　　　5份，
葡萄糖　　 　20份， 乙酸钠　 　5份， 柠檬酸二胺　　2份，
吐温-80　　　1份， K2HPO4　 　2份， 　MgSO4·7H2O　 0.2份，
MnSO4·7H2O　0.05份， 琼脂　　 　15份；
所述培养基还包括蒸馏水1000体积份，所述重量份与体积份的比为ｇ：mL；该培养基调节pH6.8±0.1。
4.权利要求1所述的抗痢疾志贺氏菌的嗜热链球菌JMCC0003的一种应用，其特征在于：所述抗痢疾志贺氏菌的嗜热链球菌JMCC0003具有抑制肠道有害菌作用，应用于制备功能性乳制品和益生菌菌粉。
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