WO2012029835A1 - ビフィドバクテリウム属細菌含有発酵食品の製造方法 - Google Patents

ビフィドバクテリウム属細菌含有発酵食品の製造方法 Download PDF

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俊孝 小田巻
寿美子 米澤
広志 丸山
典俊 高橋
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    • C12R2001/46—Streptococcus ; Enterococcus; Lactococcus

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing fermented foods obtained by fermenting milk raw materials using Lactococcus lactis and Bifidobacterium, and Lactococcus lactis used suitably for the same.
  • Bifidobacterium bacteria such as Bifidobacterium longum (hereinafter also referred to as “bifidobacteria”) are the intestinal flora formed in the human intestinal tract.
  • Bifidobacteria are known to have an intestinal regulating action that restores the balance of enteric bacteria, an immune enhancing action, a carcinogenesis inhibiting action, and the like. For this reason, in recent years, the demand for foods containing living bifidobacteria such as fermented bifidobacteria has been increasing with the increasing health awareness of consumers.
  • Bifidobacteria have poor growth in milky media. For this reason, for example, in order to contain 1 ⁇ 10 7 CFU (colony forming unit) / mL of bifidobacteria, a certain amount of various growth promoting substances is usually added to the fermented milk.
  • the growth promoting substance is generally expensive and may impair the flavor of the food.
  • bifidobacteria are difficult to preserve under acidic conditions and are likely to die. For this reason, even if bifidobacteria once proliferate during manufacture of fermented milk products etc., the amount of living bifidobacteria in fermented milk products will decrease at an accelerated rate in the process in which fermented milk products etc. circulate.
  • Examples of the method for improving the viability of bifidobacteria in fermented milk production include, for example, Lactococcus lactis subsp. Lactis and Lactococcus lactis subsp. Morimoris. And yogurt characterized by containing bifidobacteria and a method for producing the same (for example, see Patent Document 1).
  • bifidobacteria in fermented milk include, for example, Bifidobacterium breve and lactate that does not produce diacetyl and acetoin in a milk-based medium.
  • a method for producing bifidobacteria fermented milk characterized by coculturing Coccus lactis subspecies lactis is disclosed (for example, see Patent Document 2).
  • the fermentation base is fermented using Lactococcus lactis having a cell wall-localized proteolytic enzyme (cell wall-enveloped proteinase, PrtP) and Bifidobacterium, Contains milk protein containing fermented milk production method (for example, see Patent Document 3), crushed lactic acid bacteria having cell wall-localized proteolytic enzyme or enzyme fraction fractionated from lactic acid bacteria
  • a method for producing a Bifidobacterium-containing composition characterized by inoculating a Bifidobacterium genus into a culture medium (see, for example, Patent Document 4), and further fermentation in a 10% reduced skim milk medium And a lactococcus having a growth promoting effect on Bifidobacterium longum and a survival improvement effect.
  • the method of manufacturing milk, and fermented milk produced by the production method is disclosed (e.g., refer to Patent Document 5).
  • Patent Document 3 has an effect that the growth of bifidobacteria is promoted by using Lactococcus lactis having cell wall-localized proteolytic enzyme (PrtP). Many oligopeptides and amino acids are produced from protein, resulting in bitterness and umami taste, which may affect the flavor of fermented milk (for example, Pildge, CJ et al., Int. Dairy Journal 2003, 13) : 345-354).
  • the method described in Patent Document 4 is the same.
  • the present invention includes a method for producing a savory fermented food using lactic acid bacteria capable of improving the storage viability of Bifidobacterium, and a fermented food produced by the production method, as well as the lactic acid bacteria.
  • An object of the present invention is to provide a starter for fermenting milk raw materials containing Bifidobacterium bacteria.
  • the present invention is a method for producing a fermented food comprising fermenting a milk raw material using Lactococcus lactis having no cell wall-localized proteolytic enzyme and a Bifidobacterium bacterium. . Moreover, this invention provides the fermented food manufactured by the said method. The present invention also provides a starter for fermenting milk raw material containing Bifidobacterium, which includes Lactococcus lactis that does not have cell wall-localized proteolytic enzymes.
  • a medium containing skim milk powder is inoculated with 5.0 ⁇ 10 6 to 2.0 ⁇ 10 8 CFU of the same bacteria per ml of the medium and cultured at 37 ° C. for 4 to 24 hours. Is a preferred embodiment.
  • the Lactococcus lactis may be added to a medium containing 1% (W / W) glucose and 10% (W / W) reduced nonfat dry milk in an amount of 5.0 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 1 ml of the medium.
  • 2.0 ⁇ 10 8 CFU and 1.0 ⁇ 10 7 to 3.0 ⁇ 10 9 CFU per ml of medium are inoculated and cultured, and the pH of the medium is 4.6 to When reaching 5.5, the culture medium is rapidly cooled from the culture temperature to 10 ° C. and stored at 10 ° C. for 2 weeks, so that the dissolved oxygen concentration is maintained at 2 ppm or less.
  • the Lactococcus lactis may be added to a medium containing 1% (W / W) glucose and 10% (W / W) reduced nonfat dry milk in an amount of 5.0 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 1 ml of the medium.
  • 2.0 ⁇ 10 8 CFU and 1.0 ⁇ 10 7 to 3.0 ⁇ 10 9 CFU per ml of medium are inoculated and cultured, and the pH of the medium is 4.6 to When the temperature reaches 5.5, the medium is rapidly cooled from the culture temperature to 10 ° C., and has a property of maintaining the survival rate of Bifidobacterium genus at 30% or more when stored at 10 ° C. for 2 weeks. Is a preferred embodiment.
  • the Lactococcus lactis may be added to a medium containing 1% (W / W) glucose and 10% (W / W) reduced nonfat dry milk in an amount of 5.0 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 1 ml of the medium.
  • Each medium is inoculated with 2.0 ⁇ 10 5 to 9.0 ⁇ 10 7 CFU per 1 ml of the medium and cultured at 37 ° C. for 3 to 24 hours.
  • the present invention has a preferable aspect in which the Lactococcus lactis is selected from the group consisting of Lactococcus lactis subspecies lactis and Lactococcus lactis subspecies cremolith.
  • the present invention provides the Lactococcus lactis, Lactococcus lactis subspecies lactis LcL13L (FERM BP-11276), Lactococcus lactis subspecies lactis LcL26 (FERM BP-11277), and Lactococcus A preferred embodiment is selected from the group consisting of Lactis Subspecies Cremolis LcC46 (FERM BP-11275).
  • the Bifidobacterium genus bacterium is Bifidobacterium longum.
  • the Bifidobacterium longum is preferably a Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 strain.
  • a lactic acid bacterium selected from the group consisting of Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbrucky for fermentation.
  • the present invention also includes Lactococcus lactis subspecies lactis LcL13 (FERM BP-11276), Lactococcus lactis subspecies lactis LcL26 (FERM BP-11277), and Lactococcus lactis subspecies cremolith.
  • a strain selected from the group consisting of LcC46c (FERM BP-11275) is provided.
  • the bacterium used in the present invention is Lactococcus lactis that does not have a cell wall-localized proteolytic enzyme.
  • Cell wall-enveloped proteinase (EC 3.4.21.96, also referred to as “PrtP”) is an enzyme that is present on the cell membrane and has an active site exposed on the cell surface.
  • PrtP enzymes derived from Lactococcus lactis include PI type ( ⁇ -casein is not degraded much, ⁇ -casein is well degraded from the vicinity of the C terminus), and PIII type ( ⁇ -casein and ⁇ -casein are C-terminal And its intermediate type (PI / PIII type) are known (eg, Reid, JR et al., Applied and Environmental Microbiology, 1994, Vol. 60, No. 3). , Pages 801-806).
  • Specific examples of PrtP include PrtP derived from Lactococcus lactis, PrtP whose gene sequence is registered in NCBI as accession numbers AY542690, AY542691, and the like and homologs thereof.
  • the homolog examples include a protein having an amino acid sequence containing substitution, deletion, insertion or addition of one or several amino acids in the amino acid sequence encoded by the gene sequence and having PrtP activity.
  • One or several is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, still more preferably 1 to 5, and particularly preferably 1 to 3.
  • Bacteria do not have PrtP means that the bacterium does not have the enzyme activity that PrtP has, and even if it does not have PrtP protein, it does not have enzyme activity The case is included in “has no PrtP”. Further, even if the bacterium has PrtP, when the amount of PrtP protein or its activity is significantly lower than that of the strain having PrtP, it is substantially included in “not having PrtP”.
  • Lactococcus lactis is not particularly limited, but those having strains having PrtP and strains not having it are preferable. Specific examples thereof include Lactococcus lactis subspecies lactis and Lactococcus lactis subspecies cremolith. Lactococcus lactis that does not have PrtP can be obtained from nature by selecting as a strain that does not have PrtP activity or a strain that does not have a gene encoding PrtP.
  • PrtP Since PrtP has an enzyme active site outside the cell, a strain having PrtP can decompose the protein in the medium and use it for its own growth, but a strain not having PrtP has a protein in the medium. Cannot be used for growth. Therefore, by observing the growth in a medium containing protein, for example, a medium containing 10% (W / W) reduced skim milk powder, a strain having no PrtP can be selected.
  • a strain having no gene encoding PrtP can be selected by detecting the PrtP gene or a part thereof by PCR, for example, as described in the Examples.
  • a primer for amplifying a PrtP gene the set of sequence number 1 and 2 and the set of sequence number 3 and 4 are mentioned.
  • a strain not having PrtP can also be obtained from a strain having PrtP by inactivating, destroying or deleting the PrtP gene by mutation or gene recombination.
  • the PrtP encoded by the PrtP gene to be inactivated or destroyed or deleted may be PI type, PIII, or PI / PIII type.
  • Lactococcus lactis having no PrtP is, 1% (W / W) glucose, and 10% (W / W) the bacterium of medium 1ml per 5.0 ⁇ 10 6 ⁇ medium containing a reconstituted skim milk It is a strain having the property that the medium does not coagulate when inoculated at 2.0 ⁇ 10 8 CFU and cultured at 37 ° C. for 4 to 24 hours, for example, 16 hours.
  • the medium containing 1% (W / W) glucose and 10% (W / W) reduced skim milk is such that glucose is 1% (W / W) and reduced skim milk is 10% (W / W).
  • it can be produced by dissolving in water and sterilizing. Sterilization can be performed, for example, by heat treatment at 80 to 122 ° C. for 40 to 5 minutes, preferably at 85 to 95 ° C. for 35 to 5 minutes.
  • the number of bacterial cells is determined by spreading an appropriately diluted bacterial suspension on a suitable agar medium, for example, BCP-added plate count agar medium (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.) Can be measured.
  • a suitable agar medium for example, BCP-added plate count agar medium (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.) Can be measured.
  • the presence / absence of coagulation of the medium can be determined, for example, by culturing using a test tube or the like. Specifically, it is determined that the test tube is inverted and the medium is solidified if the medium does not have fluidity, and the medium does not solidify if the medium has fluidity.
  • Lactococcus lactis without PrtP is 5.0 ⁇ 10 6 to 2 per 1 ml of the medium in a medium containing 1% (W / W) glucose and 10% (W / W) reduced skim milk powder.
  • 1.0 ⁇ 10 8 CFU and 1.0 ⁇ 10 7 to 3.0 ⁇ 10 9 CFU preferably 1.0 ⁇ 10 7 to 5.0 ⁇ 10 7 CFU per ml of medium Inoculated and cultured, and when the pH of the medium reached 4.6 to 5.5, the dissolved oxygen concentration when the medium was rapidly cooled from the culture temperature to 10 ° C. and stored at 10 ° C.
  • the rapid cooling from the culture temperature to 10 ° C. is preferably performed within 1 hour, more preferably within 30 minutes, and particularly preferably within 10 minutes.
  • the culture temperature is preferably 30 ° C. to 40 ° C., more preferably 36 ° C. to 38 ° C., and particularly preferably 37 ° C. The same applies to the following description.
  • Lactococcus lactis without PrtP is added to a medium containing 1% (W / W) glucose and 10% (W / W) reduced skim milk powder per ml of the medium.
  • a medium containing 1% (W / W) glucose and 10% (W / W) reduced skim milk powder per ml of the medium 5.0 ⁇ 10 6 to 2.0 ⁇ 10 8 CFU and Bifidobacterium spp. 1.0 ⁇ 10 7 to 3.0 ⁇ 10 9 CFU, preferably 1.0 ⁇ 10 7 per ml of medium -5.0 ⁇ 10 7 CFU, each inoculated and cultured.
  • the pH of the medium reached 4.6-5.5, the medium was rapidly cooled from the culture temperature to 10 ° C. and stored at 10 ° C. for 2 weeks.
  • the strain has the property of maintaining the survival rate of the Bifidobacterium genus at 30% or higher, preferably 50% or higher, more preferably 80% or higher.
  • the survival rate refers to the ratio of the viable cell count after storage to the viable cell count at the start of storage. Although this property may be independent of the property which does not raise the dissolved oxygen concentration in the said culture medium, it is preferable that Lactococcus lactis has both properties.
  • Lactococcus lactis without PrtP is added to a medium containing 1% (W / W) glucose and 10% (W / W) reduced skim milk powder per ml of the medium.
  • 5.0 ⁇ 10 6 to 2.0 ⁇ 10 8 CFU, 1.0 ⁇ 10 7 to 3.0 ⁇ 10 9 CFU per ml of medium, preferably 1.0 ⁇ 10 7 to 5 0.0 ⁇ 10 7 CFU, and Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbruecki subspecies bulgaricus were inoculated at 2.0 ⁇ 10 5 to 9.0 ⁇ 10 7 CFU per ml of medium, respectively, at 37 ° C. It is preferable that the medium has a property of solidifying when cultured for -24 hours, for example, 8 hours.
  • the increase indicates that the Lactococcus lactis of the present invention is suitable for producing a fermented food containing a Bifidobacterium bacterium from a milk raw material.
  • Lactococcus lactis that does not have PrtP, particularly a strain having the above properties is suitable as a starter for producing a fermented food containing Bifidobacterium.
  • the “starter for fermenting milk raw material containing Bifidobacterium bacteria” of the present invention is a starter for producing such fermented foods containing Bifidobacterium bacteria, that is, for producing fermented foods. Refers to bacteria inoculated into milk raw materials together with Bifidobacterium.
  • the method of the present invention is a method for producing a fermented food by fermenting a milk raw material using Lactococcus lactis having no PrtP as described above and a Bifidobacterium bacterium.
  • Bifidobacterium is not particularly limited, but includes Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium And Bifidobacterium infantis (reclassified to Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum subspecies INFANTIS). Of these, Bifidobacterium longum is preferred. More specific examples of Bifidobacterium longum include Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 strain. The strain can be purchased from, for example, the American Type Culture Collection (address: 12301, Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States States of America, USA).
  • Milk raw material is a milk-derived raw material that is fermented with Lactococcus lactis, Bifidobacterium, and other lactic acid bacteria as needed, without PrtP
  • milk or a fraction or processed product thereof such as milk, skim milk, fresh cream, butter, whole milk powder, and skim milk powder, or skim milk powder can be used. And the like mixed, dissolved or suspended.
  • the milk raw material may be blended with sweeteners such as sucrose, pectin, fruit, fruit juice, agar, gelatin, fats and oils, fragrances, coloring agents, stabilizers, reducing agents and the like as necessary.
  • the milk raw material may be sterilized, homogenized, cooled, etc. according to a conventional method before fermentation.
  • the amount of Lactococcus lactis that does not have PrtP and the amount of Bifidobacterium inoculated to the milk material is not particularly limited, but for Lactococcus lactis, preferably 10 4 to 10 8 CFU / ml milk material, more preferably Is 10 6 to 10 7 CFU / ml milk raw material, and for Bifidobacterium, preferably 10 5 to 10 9 CFU / ml milk raw material, more preferably 10 7 to 10 8 CFU / ml milk raw material. Further, the ratio of the inoculation amount of Lactococcus lactis and Bifidobacterium is not particularly limited, but is preferably 1000: 1 to 1:10, more preferably 10: 1 to 1: 1. .
  • Lactococcus lactis that does not have PrtP inoculated into the milk raw material may be a single strain or a plurality of strains.
  • the Bifidobacterium genus bacterium may be a single strain or a plurality of strains.
  • Lactococcus lactis and Bifidobacterium genus bacteria to be inoculated into the milk raw material and, if necessary, other lactic acid bacteria are seeded or pre-cultured in another medium in advance.
  • the medium is not particularly limited as long as it is a medium suitable for cultivation of Lactococcus lactis, Bifidobacterium, and other lactic acid bacteria as required. Examples include a medium containing reduced skim milk powder. .
  • the concentration of the reduced skim milk powder is preferably 3% (W / W) or more, particularly preferably 8% (W / W) or more.
  • a growth promoting substance such as yeast extract, a reducing agent such as L-cysteine, etc.
  • Bifidobacterium in particular, has a low growth potential in a medium containing reduced skim milk, so use a medium containing a growth promoting substance, for example, 0.1 to 1% (W / W) yeast extract. Is preferred.
  • the sterilization conditions for the medium are the same as described above.
  • lactic acid bacteria may be added to the milk raw material for fermentation.
  • Other lactic acid bacteria are not particularly limited as long as they can be used for food production and do not inhibit the growth of Lactococcus lactis and Bifidobacterium, but for example, when fermented food is yogurt , Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbruecki and the like. These lactic acid bacteria may be a single strain or a plurality of strains.
  • the ratio of the inoculum of Lactococcus lactis and Bifidobacterium and the inoculum of other lactic acid bacteria is not particularly limited, but is preferably 1000: 1 to 10: 1.
  • the order of inoculating the milk raw material with Lactococcus lactis, Bifidobacterium, and other lactic acid bacteria is not particularly limited, and all may be administered simultaneously. Moreover, you may inoculate arbitrary bacteria among these bacteria in multiple times.
  • the fermentation conditions such as the culture temperature and the culture time can be the same as the production of fermented foods from ordinary milk raw materials.
  • the culture temperature is preferably 30 ° C. to 40 ° C., more preferably 36 ° C. to 38 ° C.
  • the culture time can be appropriately set depending on the type of fermented food to be produced, but usually 3 to 18 hours are preferable.
  • the obtained fermented food can be appropriately processed in the same manner as fermented food from ordinary milk raw materials.
  • the fermented food after fermentation may be used as it is, or may be homogenized and processed into a liquid state.
  • sweeteners such as sucrose, pectin, fruit, fruit juice, agar, gelatin, fats and oils, fragrances, coloring agents, stabilizers, reducing agents and the like may be added.
  • the fermented food produced as described above has little bitterness and umami caused by protein degradation, and is excellent in the preservation survival of Bifidobacterium bacteria.
  • [Anaerobic diluent] Salt solution I (0.78% K 2 HPO 4 solution) 37.5 ml Saline solution II (0.47% KH 2 PO 4 , 1.18% NaCl, 1.20% (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.12% CaCl 2 , 0.25% 37.5 ml of a solution containing MgSO 4 ⁇ H 2 O Resazurin (0.1% aqueous solution) 1 ml L-cysteine HCl ⁇ H 2 O 0.5 g L-ascorbic acid (25% aqueous solution) 2 ml Na 2 CO 3 (8% solution) 50 ml Agar 0.5 g 860 ml of purified water
  • Solution A MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 15g, FeSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.5g, dissolved NaCl 0.5 g, the MnSO 4 0.337 g purified water 250 ml.
  • Ingredients other than L-cysteine and horse blood are dissolved in hot water, adjusted to pH, sterilized at 115 ° C for 20 minutes, cooled to 50 ° C, added with L-cysteine and horse blood, and dispensed into a petri dish. A flat plate.
  • the base sequences of the genomic DNA of these strains were identified by a conventional method. On the international base sequence database (GenBank) of NCBI (National Center for Biotechnology Information), BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi The homologous search for the full length of the 16S ribosomal RNA gene sequence was performed, and 280 Lactococcus bacteria having 98% or more homology with each type strain were identified.
  • Lactose is utilized among 242 strains having 98% or more homology with Lactococcus lactis, and Lactococcus lactis subspecies lactis is the most homologous among the type strains of Lactococcus lactis subspecies A group of highly virulent strains was identified as Lactococcus lactis subspecies lactis. Moreover, among the strains of Lactococcus lactis subspecies type strains, the strain having the highest homology to Lactococcus lactis subspecies cremollis was identified as Lactococcus lactis subspices cremolith. The obtained strains were all non-spore, non-motile facultative anaerobic gram-positive cocci, and both catalase and gas production were negative.
  • Lactococcus lactis strain possessed the PrtP enzyme.
  • Difco (registered trademark) M17 Broth manufactured by Becton Dickinson
  • 0.5% lactose and glucose was inoculated with a colony of each strain on a BL agar medium at 30 ° C. For 16 hours.
  • the obtained culture broth 3% was inoculated into the same medium and cultured at 30 ° C. for 16 hours.
  • Bacteria were obtained by centrifugation, DNA was extracted using DNeasy Blood Tissue kit (Qiagen), and the possession of the PrtP gene was confirmed by PCR.
  • the primer is a primer set of forward primer GBf (GCAAATACGGTGACGGCTGCGA, SEQ ID NO: 1) and reverse primer GB2r (TGAGCATTATAATAGGTCTTCTTCC, SEQ ID NO: 2), or forward primer GHf (CAAATACGGTGACGGCTGCTAA, SEQ ID NO: 3) and reverse primer GH2r (TAGCATTATAATAGGTCTTCGTC)
  • the primer set was used. As a result, it was confirmed that 128 of Lactococcus lactis 242 strains possessed the PrtP gene. On the other hand, the remaining 114 strains were found not to carry the PrtP gene.
  • NBRC12007 and NBRC100676 can be obtained from the National Institute of Technology and Evaluation (2-5-8 Kazusa Kamashi, Kisarazu City, Chiba Prefecture 292-0818).
  • JCM20101 can be obtained from RIKEN Microbial System Preservation Facility (JCM) (2-1 Hirosawa, Wako, Saitama 351-0198).
  • ATCC 9625 is also available from the American Type Culture Collection at 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America.
  • 5.0 ⁇ 10 6 to 2.0 ⁇ 10 8 CFU of the seed culture of each strain is inoculated into a milk medium (sterilized at 95 ° C. for 30 minutes) having the same composition as described above, and cultured at 37 ° C. for 16 hours. did.
  • the obtained culture solution was rapidly cooled to 10 ° C., and the coagulation state, pH, and the number of lactic acid bacteria contained were measured.
  • the number of lactic acid bacteria was measured using a commercially available BCP-added plate count agar plate (Eiken Chemical Co., Ltd.). The results are shown in Table 1. In the table, “E + N” represents “ ⁇ 10 n ”.
  • the seed culture of each strain of Lactococcus lactis is 5.0 ⁇ 10 6 to 2.0 ⁇ 10 8 CFU per ml of the medium
  • the Bifidobacterium A seed culture of Longham ATCC BAA-999 strain was inoculated at 1.0 ⁇ 10 7 to 5.0 ⁇ 10 7 CFU per ml of the medium, and cultured at 37 ° C. for 16 hours to obtain fermented milk.
  • the fermented milk was rapidly cooled to 10 ° C., and the pH, the number of bifidobacteria contained therein, and dissolved oxygen were measured.
  • the number of bifidobacteria was measured on a TOS propionate agar medium (manufactured by Yakult Pharmaceutical Co., Ltd.) flat plate.
  • the dissolved oxygen was measured using a fluorescent oxygen meter FO-960S (manufactured by ASR) while maintaining the temperature of the fermented milk at 10 ° C. The measurement results are shown in Table 2.
  • Test Example 4 The bifidobacteria-containing fermented milk obtained in Test Example 3 had a drink yogurt form because most of the pH was around 5. Tested except that Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbrucky sub-species bulgaricus were added to the medium to produce a fermented milk (normal yogurt that can be consumed with a spoon) with a firmer tissue The milky medium was fermented in the same manner as in Example 3.
  • each strain of Lactococcus lactis and Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 seed culture was inoculated into the milk medium at the same inoculation amount as in Test Example 3, and Streptococcus thermophilus was further inoculated.
  • yogurt starter manufactured by Danisco
  • Lactobacillus delbruecki subspecies bulgaricus into a medium containing 1% (W / W) glucose and 10% (W / W) reduced skim milk powder, respectively.
  • 2.0 ⁇ 10 6 CFU and 2.0 ⁇ 10 5 CFU were inoculated per ml, and cultured at 37 ° C. for 8 hours to obtain fermented milk.
  • the fermented milk was rapidly cooled to 10 ° C., and the pH and coagulation state were measured. The results are shown in Table 3.
  • the fermented milk produced using the strain having PrtP felt strongly umami and bitterness.
  • the fermented milk produced using the strain which does not have PrtP hardly felt umami and bitterness, and the original flavor of fermented milk was not impaired.
  • Example 1 Production of drink yogurt using Lactococcus lactis subspecies lactis 10% (W / W) reduced skim milk powder in 1000 mL of medium (sterilized at 90 ° C for 30 minutes) with Lactococcus lactis lactis 30 mL of the seed culture of Subspecies lactis LcL26 strain was inoculated and cultured at 25 ° C. for 16 hours.
  • Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 strain was added to 1000 mL of medium containing 0.2% (W / W) yeast extract and 11% (W / W) reduced skim milk powder (sterilized at 90 ° C. for 30 minutes).
  • the seed culture of Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 strain is a medium containing 0.6% (W / W) yeast extract and 11% (W / W) reduced skim milk powder.
  • the longum ATCC BAA-999 strain was inoculated with 1.0 ⁇ 10 6 to 5.0 ⁇ 10 7 CFU and cultured at 37 ° C. for 16 hours to obtain a seed culture.
  • skim milk powder, whole milk powder, sucrose and pectin are mixed and dissolved as raw materials, milk fat 0.5% (W / W), non-fat milk solid content 8.0% (W / W), sucrose A milk raw material 50L composed of 8.0% (W / W) and pectin 0.2% (W / W) was prepared, sterilized at 90 ° C. for 10 minutes, and cooled to 40 ° C.
  • the sterilized milk raw material is inoculated with 500 mL of the culture of Lactococcus lactis sub-species Lactis LcL26 strain and the culture of Bifidobacterium longum ATCCABAA-999 strain, which have been precultured as described above, at 37 ° C And cultured for 16 hours to obtain fermented milk.
  • the fermented milk was homogenized at a pressure of 15 MPa and filled into a 200 mL glass container, then cooled until the temperature of the fermented milk reached 10 ° C., and further sealed to obtain a drink yogurt.
  • the obtained drink yogurt contained bifidobacteria having a lactic acid acidity of 0.64%, a pH of 4.9, and 1.6 ⁇ 10 8 CFU / ml.
  • this drink yogurt was stored at 10 ° C. for 14 days, the number of bifidobacteria was 1.1 ⁇ 10 8 CFU / ml, and the survival rate was 68%.
  • the dissolved oxygen concentration at this time was 0.93 ppm.
  • Example 2 Manufacture of drink yogurt using Lactococcus lactis subspecies Cremolis 10% (W / W) reduced nonfat dry milk in 1000 mL medium (sterilized at 90 ° C for 30 minutes) with Lactococcus lactis lactis 30 mL of seed culture of Subspecies Cremolis LcC46 strain was inoculated and cultured at 25 ° C. for 16 hours.
  • Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 strain was added to 1000 mL of medium containing 0.2% (W / W) yeast extract and 11% (W / W) reduced skim milk powder (sterilized at 90 ° C. for 30 minutes).
  • the seed culture of Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 strain is a medium containing 0.6% (W / W) yeast extract and 11% (W / W) reduced skim milk powder.
  • the longum ATCC BAA-999 strain was inoculated with 1.0 ⁇ 10 6 to 5.0 ⁇ 10 7 CFU and cultured at 37 ° C. for 16 hours to obtain a seed culture.
  • skim milk powder, whole milk powder, sucrose and pectin are mixed and dissolved as raw materials, milk fat 0.5% (W / W), non-fat milk solid content 8.0% (W / W), sucrose
  • a milk raw material 50L composed of 8.0% (W / W) and pectin 0.2% (W / W) was prepared, sterilized at 90 ° C. for 10 minutes, and cooled to 40 ° C.
  • the sterilized milk raw material is inoculated with 500 mL culture of Lactococcus lactis subspecies Cremolis LcC46 strain and Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 culture precultured as described above at 37 ° C. And cultured for 16 hours to obtain fermented milk.
  • the fermented milk was homogenized at a pressure of 15 MPa and filled into a 200 mL glass container, then cooled until the temperature of the fermented milk reached 10 ° C., and further sealed to obtain a drink yogurt.
  • the obtained drink yogurt contained bifidobacteria having a lactic acid acidity of 0.66%, a pH of 4.8, and 9.6 ⁇ 10 7 CFU / ml.
  • the drink yogurt was stored at 10 ° C. for 14 days, the number of bifidobacteria was 6.9 ⁇ 10 7 CFU / ml, and the survival rate was 71%.
  • the dissolved oxygen concentration at this time was 0.88 ppm.
  • Example 3 Production of yogurt using Lactococcus lactis subspecies lactis (I) 1000 mL of a medium (115 ° C, sterilized for 20 minutes) containing 10% (W / W) reduced skim milk powder is inoculated with 30 mL of a seed culture of Lactobacillus delbruecki subspecies lactis FERM BP-10758 strain at 37 ° C, Cultured for 16 hours. On the other hand, seed culture of Streptococcus thermophilus FERM P-17216 strain in 1000 mL of medium (sterilized at 90 ° C.
  • the seed culture of Lactobacillus delbruecki subspecies lactis FERM BP-10758 strain is 1.0% in a medium containing 0.1% (W / W) yeast extract and 10% (W / W) reduced skim milk powder. Inoculated with ⁇ 10 5 to 1.0 ⁇ 10 7 CFU and cultured at 37 ° C. for 16 hours.
  • the seed culture of Streptococcus thermophilus FERM P-17216 strain is 1.0 ⁇ 10 5 to 1.0 ⁇ in a medium containing 0.1% (W / W) yeast extract and 10% (W / W) reduced skim milk powder. 10 7 CFU was inoculated and cultured at 37 ° C. for 16 hours.
  • the obtained yogurt had a lactic acid acidity of 0.74% and a pH of 4.69, and contained 1.0 ⁇ 10 8 CFU / ml of bifidobacteria.
  • the number of bifidobacteria was 9.3 ⁇ 10 7 CFU / ml, and the survival rate was 93%.
  • the dissolved oxygen concentration at this time was 0.5 ppm or less.
  • Example 4 Production of yogurt using Lactococcus lactis subspecies lactis (II)
  • Non-fat dry milk, cream and milk protein are mixed and dissolved to prepare 50 L of milk raw material consisting of milk fat 3.0% (W / W) and non-fat milk solid content 12.0% (W / W) at 70 ° C.
  • the resulting yogurt had a lactic acid acidity of 0.65%, a pH of 4.84, and contained 1.2 ⁇ 10 8 CFU / ml bifidobacteria.
  • the number of bifidobacteria was 1.0 ⁇ 10 8 CFU / ml, and the survival rate was 83%.
  • the dissolved oxygen concentration at this time was 0.5 ppm or less.
  • Example 5 Production of yogurt using Lactococcus lactis subspecies lactis (III) Non-fat dry milk, cream and milk protein are mixed and dissolved to prepare 50 L of milk raw material consisting of milk fat 3.0% (W / W) and non-fat milk solid content 12.0% (W / W) at 70 ° C. And homogenized at a pressure of 15 MPa, sterilized at 90 ° C. for 10 minutes, and cooled to 40 ° C.
  • the obtained yogurt had a lactic acid acidity of 0.70% and a pH of 4.74, and contained 4.2 ⁇ 10 9 CFU / ml of bifidobacteria.
  • the number of bifidobacteria was 2.0 ⁇ 10 9 CFU / ml, and the survival rate was 47.6%.
  • the dissolved oxygen concentration at this time was 1.47 ppm.
  • the fermented food containing a large amount of Bifidobacterium, particularly Bifidobacterium longum, can be efficiently produced by the method for producing fermented milk of the present invention. Moreover, it goes without saying that the fermented food produced by the method for producing fermented food of the present invention is also useful for health management, and has a high palatability with excellent flavor.
  • the starter for milk raw material fermentation containing the Bifidobacterium genus bacteria of this invention can be used for manufacture of the said fermented food.

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Abstract

細胞壁局在性タンパク質分解酵素を有しないラクトコッカス・ラクティス、例えば、１％（Ｗ／Ｗ）グルコース、及び１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に同細菌を培地１ｍｌ当たり５．０×１０6 ～２．０×１０8 ＣＦＵ、及び、ビフィドバクテリウム属細菌を培地１ｍｌ当たり１．０×１０7 ～３．０×１０9 ＣＦＵ、各々接種して培養し、培地のｐＨが４．６～５．５に達した時点で培地を培養温度から１０℃に急冷して、１０℃で２週間保存したときのビフィドバクテリウム属細菌の生残率を３０％以上に維持する性質を有するラクトコッカス・ラクティスと、ビフィドバクテリウム属細菌とを用いて、乳原料を発酵させる。

Description

ビフィドバクテリウム属細菌含有発酵食品の製造方法
　本発明は、ラクトコッカス・ラクティスとビフィドバクテリウム属細菌とを用いて乳原料を発酵させることにより得られる発酵食品の製造方法、及びそれに好適に用いられるラクトコッカス・ラクティスに関する。
　ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）等のビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属細菌（以下、「ビフィズス菌（bifidobacteria）」ともいう。）は、ヒトの腸管内で形成される腸内菌叢の優勢菌種の一つである。ビフィズス菌は、腸内細菌のバランスを回復させる整腸作用や、免疫増強作用、発ガン抑制作用等を有することが知られている。このため、近年、生活者の健康志向の高まりと共に、ビフィズス菌発酵乳等の、生きているビフィズス菌を含む食品への需要が高まっている。
　ビフィズス菌は、乳性培地における増殖性が悪い。このため、例えば１×１０7ＣＦＵ（colony forming unit）／ｍＬのビフィズス菌を含有させるためには、通常、発酵乳中に一定量の様々な生育促進物質を添加することが行われている。
　しかし、前記生育促進物質は一般的に高価であり、かつ、食品の風味を損なうおそれもある。また、ビフィズス菌は、酸性条件下での保存が難しく、死滅し易い。このため、発酵乳製品等の製造中にビフィズス菌が一旦増殖しても、発酵乳製品等が流通する過程で、発酵乳製品中の生きているビフィズス菌量は加速度的に減少してしまう。
　そこで、ビフィズス菌の生育性や保存生残性を改善することにより、生きているビフィズス菌を多く含有する発酵乳を製造するとともに、生きているビフィズス菌が、製造直後と同様に、消費者が摂食する時点においても豊富に含有されている発酵乳を製造することが課題となっている。
　ビフィズス菌を、それ以外の乳酸菌と混合発酵させることにより、前記のような生育促進物質等を添加することなく、ビフィズス菌の生育性や保存生残性を改善する種々の方法が開示されている。
　発酵乳製造におけるビフィズス菌の生育性を改善させる方法については、例えば、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス（Lactococcuslactis subsp. cremoris）、およびビフィズス菌を含有することを特徴とするヨーグルト及びその製造方法が開示されている（例えば、特許文献１参照）。
　その他、発酵乳のビフィズス菌の保存生残性を改善させる方法については、例えば、乳を主成分とする培地で、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）、並びにダイアセチル及びアセトインを生成しないラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスを混合培養することを特徴とするビフィズス菌発酵乳の製造方法が開示されている（例えば、特許文献２参照）。
　また、例えば、細胞壁局在性タンパク質分解酵素（cell wall-enveloped proteinase, PrtP）を有するラクトコッカス・ラクティスと、ビフィドバクテリウム属菌とを用いて発酵用ベースを発酵させることを特徴とする、発酵乳の製造方法（例えば、特許文献３参照）や、細胞壁局在性タンパク質分解酵素を有する乳酸菌の菌体破砕物又は前記乳酸菌から分画された前記酵素画分を添加した、乳タンパク質を含有する培地に、ビフィドバクテリウム属菌を接種することを特徴とするビフィドバクテリウム属菌含有組成物の製造方法（例えば、特許文献４参照）、さらには、10%還元脱脂粉乳培地における発酵性を有し、且つビフィドバクテリウム・ロンガムに対する増殖促進効果と生残性改善効果を有するラクトコッカスを用いることを特徴とする、発酵乳の製造方法、及び、該製造方法により製造された発酵乳が開示されている（例えば、特許文献５参照）。
特許第３３６４４９１号公報 特許第３０６８４８４号公報 特許第４４４８８９６号公報 特開２００９－２９６９１０号公報 国際公開第２００８／０９９５４３号パンフレット
　前記のように、ビフィズス菌の生育性や保存生残性を改善する種々の方法が開示されているが、さらに改善の余地がある。例えば、上記特許文献１の方法では、ビフィズス菌の生育が促進され、発酵時間を短縮することができるものの、ビフィズス菌の保存生残性については一切記載がない。
　一方、上記特許文献２の方法では、特定のビフィズス菌と特定の乳酸菌とからなる混合菌を用いることにより、増殖促進効果と生残性改善効果の両方が認められるものの、ビフィドバクテリウム・ブレーベ以外のビフィズス菌、例えば食品に汎用されているビフィドバクテリウム・ロンガムについては、一切記載がない。実際に、後述するように、特許文献２に示された菌株（FERM BP-6224）を用いて実験したところ、ビフィドバクテリウム・ロンガムについては十分な生残性を得ることが出来なかった。
　また、上記特許文献３に記載の方法では、細胞壁局在性タンパク質分解酵素(PrtP)を有するラクトコッカス・ラクティスを用いることにより、ビフィズス菌の増殖が促進されるという効果があるが、PrtPは、タンパク質から多くのオリゴペプチドやアミノ酸を生成するため、苦味や旨味が生じてしまい、発酵乳の風味に影響を及ぼす可能性がある（例えば、Pillidge, C.J. et al., Int. Dairy Journal 2003, 13:345-354）。特許文献４に記載の方法も同様である。
　さらに、Yonezawa S. et al., J. Dairy Sci. 2010, 93:1815-23、および特許文献３によれば、脱脂粉乳培地における発酵性を有するラクトコッカス・ラクティスはPrtPを有していることから、特許文献５についても特許文献３と同様に風味に対する課題が残されていた。
　一方で、PrtPを有していないラクトコッカス・ラクティスは、脱脂粉乳培地から十分な栄養を取り込むことが出来ないため、ほとんどの菌株は脱脂粉乳培地で生育できず、ビフィズス菌に対する増殖促進効果と生残性改善効果は認められていなかった。
　本発明は、ビフィドバクテリウム属細菌の保存生残性を改善させ得る乳酸菌を用いた、風味の良い発酵食品の製造方法、及び、該製造方法により製造された発酵食品、並びに前記乳酸菌を含むビフィドバクテリウム属細菌入り乳原料発酵用スターターを提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、細胞壁局在性タンパク質分解酵素PrtPを有していないラクトコッカス・ラクティスと、ビフィドバクテリウム属細菌とを混合発酵させた場合に、ビフィドバクテリウム属細菌の保存性を向上し得る菌株が存在することを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、細胞壁局在性タンパク質分解酵素を有しないラクトコッカス・ラクティスと、ビフィドバクテリウム属細菌とを用いて、乳原料を発酵させることを特徴とする発酵食品の製造方法である。
　また、本発明は、前記方法により製造された発酵食品を提供する。
　また、本発明は、細胞壁局在性タンパク質分解酵素を有しないラクトコッカス・ラクティスを含むビフィドバクテリウム属細菌入り乳原料発酵用スターターを提供する。
　本発明の発酵食品の製造方法、及び、ビフィドバクテリウム属細菌入り乳原料発酵用スターターは、前記ラクトコッカス・ラクティスは、１％（Ｗ／Ｗ）グルコース、及び１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に同細菌を培地１ｍｌ当たり５．０×１０6 ～２．０×１０8 ＣＦＵ接種し、３７℃で４～２４時間培養したときに、当該培地が凝固しない性質を有することを好ましい態様としている。
　また、本発明は、前記ラクトコッカス・ラクティスは、１％（Ｗ／Ｗ）グルコース、及び１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に同細菌を培地１ｍｌ当たり５．０×１０6 ～２．０×１０8 ＣＦＵ、及び、ビフィドバクテリウム属細菌を培地１ｍｌ当たり１．０×１０7 ～３．０×１０9 ＣＦＵ、各々接種して培養し、培地のｐＨが４．６～５．５に達した時点で培地を培養温度から１０℃に急冷して、１０℃で２週間保存したときの溶存酸素濃度を、２ｐｐｍ以下に維持する性質を有することを好ましい態様としている。
　また、本発明は、前記ラクトコッカス・ラクティスは、１％（Ｗ／Ｗ）グルコース、及び１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に同細菌を培地１ｍｌ当たり５．０×１０6 ～２．０×１０8 ＣＦＵ、及び、ビフィドバクテリウム属細菌を培地１ｍｌ当たり１．０×１０7 ～３．０×１０9 ＣＦＵ、各々接種して培養し、培地のｐＨが４．６～５．５に達した時点で培地を培養温度から１０℃に急冷して、１０℃で２週間保存したときのビフィドバクテリウム属細菌の生残率を３０％以上に維持する性質を有することを好ましい態様としている。
　また、本発明は、前記ラクトコッカス・ラクティスは、１％（Ｗ／Ｗ）グルコース、及び１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に同細菌を培地１ｍｌ当たり５．０×１０6 ～２．０×１０8 ＣＦＵ、ビフィドバクテリウム属細菌を培地１ｍｌ当たり１．０×１０7 ～３．０×１０9 ＣＦＵ、並びに、ストレプトコッカス・サーモフィラス及びラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスをそれぞれ培地１ｍｌ当たり２．０×１０5 ～９．０×１０7 ＣＦＵ接種し、３７℃で３～２４時間培養したときに、当該培地が凝固する性質を有することを好ましい態様としている。
　また、本発明は、前記ラクトコッカス・ラクティスが、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス、およびラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリスからなる群より選択されることを好ましい態様としている。
　また、本発明は、前記ラクトコッカス・ラクティスが、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスLcL13 (FERM BP-11276)、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスLcL26 (FERM BP-11277)、およびラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリスLcC46 (FERM BP-11275)からなる群より選択されることを好ましい態様としている。
　また、本発明は、前記ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガムであることを好ましい態様としている。
　また、本発明は、前記ビフィドバクテリウム・ロンガムが、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株であることを好ましい態様としている。
　さらに、本発明は、ストレプトコッカス・サーモフィラスおよびラクトバチルス・デルブルッキーからなる群より選択される乳酸菌とを発酵に用いることを好ましい態様としている。
　また、本発明は、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスLcL13 (FERM BP-11276)、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスLcL26 (FERM BP-11277)、およびラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリスLcC46 (FERM BP-11275)からなる群より選択される菌株を提供する。
本発明の方法により製造されたヨーグルトの味覚評価の結果を示す図。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明に用いる細菌は、細胞壁局在性タンパク質分解酵素を有しないラクトコッカス・ラクティスである。細胞壁局在性タンパク質分解酵素（cell wall-enveloped proteinase、EC 3.4.21.96。「PrtP」とも記載する。）は、細胞膜に存在し、細胞表面に活性部位が剥き出しになっている酵素である。ラクトコッカス・ラクチス由来のPrtP酵素には、PI型（α－カゼインをあまり分解せず、β－カゼインをＣ末端の近辺からよく分解する）、PIII型（α－カゼイン及びβ－カゼインをＣ末端及びＮ末端の両方からよく分解する）、及びその中間型（PI／PIII型）が知られている（例えば、Reid, J.R. et al., Applied and Environmental Microbiology、１９９４年、第６０巻第３号、第８０１～８０６ページ）。PrtPとして具体的には、ラクトコッカス・ラクティス由来のPrtPとして、NCBIにアクセッション番号AY542690, AY542691等として遺伝子配列が登録されているPrtP、及びそのホモログが挙げられる。ホモログとしては、前記遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、PrtP活性を有するタンパク質が挙げられる。１若しくは数個とは、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３である。又、前記ホモログとして、前記アクセッション番号AY542690、又はAY542691の塩基配列によってコードされるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であって、かつ、PrtP活性を有するタンパク質が挙げられる。
　細菌が「PrtPを有しない」とは、同細菌がPrtPの持つ酵素活性を有しないことを意味し、PrtPタンパク質を有しないか、PrtPタンパク質を持っていても、同タンパク質が酵素活性を有しない場合は、「PrtPを有しない」に包含される。また、細菌がPrtPを有していても、PrtPを有する菌株に比べて、著しくPrtPタンパク質の量又はその活性が低い場合は、実質的に「PrtPを有しない」に包含される。
　ラクトコッカス・ラクティスは、亜種（サブスピーシーズ）は特に制限されないが、PrtPを有している菌株と、有していない菌株が存在するものが好ましい。具体的には例えば、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス、及びラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリスが挙げられる。PrtPを有しないラクトコッカス・ラクティスは、自然界から、PrtP活性を有しない菌株、又はPrtPをコードする遺伝子を有しない菌株として選択することによって、取得することができる。
　PrtPは、細胞外に酵素活性部位を有するため、PrtPを有する菌株は、培地中のタンパク質を分解して、自身の生育に利用することができるが、PrtPを有しない菌株は、培地中のタンパク質を生育に利用することができない。したがって、タンパク質を含む培地、例えば１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地での生育を観察することにより、PrtPを有しない菌株を選択することができる。
　また、PrtPをコードする遺伝子を有しない菌株は、例えば実施例に記載したように、PrtP遺伝子又はその一部をPCR法により検出することによって、選択することができる。PrtP遺伝子を増幅するためのプライマーとしては、配列番号１及び２のセット、及び配列番号３及び４のセットが挙げられる。
　PrtPを有しない菌株は、PrtPを有する菌株から、突然変異法、又は遺伝子組換えにより、PrtP遺伝子を不活化、又は破壊もしくは欠失させることによっても、取得することができる。不活化、又は破壊もしくは欠失させるPrtP遺伝子がコードするPrtPは、PI型、PIII、又はPI／PIII型のいずれであってもよい。
　PrtPを有しないラクトコッカス・ラクティスの一態様は、１％（Ｗ／Ｗ）グルコース、及び１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に同細菌を培地１ｍｌ当たり５．０×１０6 ～２．０×１０8 ＣＦＵ接種し、３７℃で４～２４時間、例えば１６時間培養したときに、当該培地が凝固しない性質を有する菌株である。
　１％（Ｗ／Ｗ）グルコース、及び１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地は、グルコースが１％（Ｗ／Ｗ）、及び還元脱脂粉乳が１０％（Ｗ／Ｗ）となるように、水に溶解し、殺菌することによって製造することができる。殺菌は、例えば、８０～１２２℃で４０～５分間、好ましくは８５～９５℃で３５～５分間の加熱処理により行うことができる。
　前記細菌の細胞数（ＣＦＵ）は、適当に希釈した菌の懸濁液を、好適な寒天培地、例えばＢＣＰ加プレートカウント寒天培地（栄研化学社製）に広げて培養し、出現するコロニー数によって測定することができる。
　培地の凝固の有無は、例えば、試験管等を用いた培養により判定することができる。具体的には、試験管を倒置させ、培地に流動性が無ければ、培地は凝固する、流動性が有れば、培地は凝固しない、と判定される。
　また、PrtPを有しないラクトコッカス・ラクティスは、１％（Ｗ／Ｗ）グルコース、及び１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に同細菌を培地１ｍｌ当たり５．０×１０6 ～２．０×１０8 ＣＦＵ、及び、ビフィドバクテリウム属細菌を培地１ｍｌ当たり１．０×１０7 ～３．０×１０9 ＣＦＵ、好ましくは１．０×１０7 ～５．０×１０7 ＣＦＵ、各々接種して培養し、培地のｐＨが４．６～５．５に達した時点で培地を培養温度から１０℃に急冷して、１０℃で２週間保存したときの溶存酸素濃度を、２ｐｐｍ以下、好ましくは１ｐｐｍ以下、より好ましくは０．５ｐｐｍ以下に維持する性質を有することが好ましい。ビフィドバクテリウム属細菌は、培地中の溶存酸素濃度が高いと生育し難くなるため、ラクトコッカス・ラクティスをビフィドバクテリウム属細菌とともに用いて乳原料を発酵させる場合、ラクトコッカス・ラクティスは、培地中の溶存酸素濃度を高めないものであることが好ましい。
　培養温度から１０℃への急冷は、好ましくは１時間以内、より好ましくは３０分以内、特に好ましくは１０分以内に行うことが望ましい。培養温度としては、３０℃～４０℃が好ましく、３６℃～３８℃がより好ましく、３７℃が特に好ましい。以下の記載においても同様である。
　また、本発明の他の態様では、PrtPを有しないラクトコッカス・ラクティスは、１％（Ｗ／Ｗ）グルコース、及び１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に同細菌を培地１ｍｌ当たり５．０×１０6 ～２．０×１０8 ＣＦＵ、及び、ビフィドバクテリウム属細菌を培地１ｍｌ当たり１．０×１０7 ～３．０×１０9 ＣＦＵ、好ましくは１．０×１０7 ～５．０×１０7 ＣＦＵ、各々接種して培養し、培地のｐＨが４．６～５．５に達した時点で培地を培養温度から１０℃に急冷して、１０℃で２週間保存したときのビフィドバクテリウム属細菌の生残率を３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上に維持する性質を有する菌株である。生残率は、保存開始時の生菌数に対する保存後の生菌数の割合をいう。この性質は、前記の培地中の溶存酸素濃度を高めない性質と独立であってもよいが、ラクトコッカス・ラクティスは両方の性質を有することが好ましい。
　また、本発明の他の態様では、PrtPを有しないラクトコッカス・ラクティスは、１％（Ｗ／Ｗ）グルコース、及び１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に同細菌を培地１ｍｌ当たり５．０×１０6 ～２．０×１０8 ＣＦＵ、ビフィドバクテリウム属細菌を培地１ｍｌ当たり１．０×１０7 ～３．０×１０9 ＣＦＵ、好ましくは１．０×１０7 ～５．０×１０7 ＣＦＵ、並びに、ストレプトコッカス・サーモフィラス及びラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスをそれぞれ培地１ｍｌ当たり２．０×１０5 ～９．０×１０7 ＣＦＵ接種し、３７℃で３～２４時間、例えば８時間培養したときに、当該培地が凝固する性質を有することが好ましい。
　PrtPを有しないラクトコッカス・ラクティスが、還元脱脂粉乳を含む培地を凝固しないことは、前記培地で単独で発酵性を有しないことを意味しているが、同細菌をビフィドバクテリウム属細菌とともに同培地で培養したときに、培地中の溶存酸素濃度を低下させること、及び、培地を凝固する、すなわち培地のｐＨを低下させること、並びに、発酵後にビフィドバクテリウム属細菌の生残率を高めることは、本発明のラクトコッカス・ラクティスが、乳原料からビフィドバクテリウム属細菌を含有する発酵食品の製造に好適であることを示している。したがって、PrtPを有しないラクトコッカス・ラクティス、特に上記の性質を有する菌株は、ビフィドバクテリウム属細菌を含有する発酵食品を製造するためのスターターとして好適である。本発明の「ビフィドバクテリウム属細菌入り乳原料発酵用スターター」とは、このような、ビフィドバクテリウム属細菌を含有する発酵食品を製造するためのスターター、すなわち、発酵食品を製造するためにビフィドバクテリウム属細菌とともに乳原料に接種される細菌をいう。
　本発明に用いるラクトコッカス・ラクティスの具体的菌株としては、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスLcL13 (FERM BP-11276)、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスLcL26 (FERM BP-11277)、及び、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリスLcC46 (FERM BP-11275)が挙げられる。
　これらの菌株は、平成２２年８月１１日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、各々カッコ内に記載された受託番号で、ブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
　本発明の方法は、上記のような、PrtPを有しないラクトコッカス・ラクティスと、ビフィドバクテリウム属細菌とを用いて、乳原料を発酵させることにより、発酵食品を製造する方法である。
　ビフィドバクテリウム属細菌としては、特に制限されないが、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、及び、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスに再分類されている）が挙げられる。これらの中では、ビフィドバクテリウム・ロンガムが好ましい。また、ビフィドバクテリウム・ロンガムとしてより具体的には、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株が挙げられる。同菌株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所 12301　Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America）から購入することができる。
　乳原料（milk raw material）としては、乳由来の原料であって、PrtPを有しないラクトコッカス・ラクティス、及びビフィドバクテリウム属細菌、並びに必要に応じて他の乳酸菌を用いて発酵させることにより、発酵食品を製造することができるものであれば特に制限されず、乳又はその分画物又は加工品、例えば牛乳、脱脂乳、生クリーム、バター、全粉乳、及び脱脂粉乳、又はこれらを水に混合、溶解または懸濁させたもの等が挙げられる。乳原料は、必要に応じて蔗糖等の甘味料、ペクチン、果実、フルーツジュース、寒天、ゼラチン、油脂、香料、着色料、安定剤、還元剤等を配合されてもよい。乳原料は、発酵前に、常法に従って殺菌、均質化、冷却等を施してもよい。
　PrtPを有しないラクトコッカス・ラクティス、及びビフィドバクテリウム属細菌の乳原料への接種量は特に制限されないが、ラクトコッカス・ラクティスについては好ましくは１０4～１０8ＣＦＵ／ｍｌ乳原料、より好ましくは１０6～１０7ＣＦＵ／ｍｌ乳原料、ビフィドバクテリウム属細菌については好ましくは１０5～１０9ＣＦＵ／ｍｌ乳原料、より好ましくは１０7～１０8ＣＦＵ／ｍｌ乳原料である。また、ラクトコッカス・ラクティス、及びビフィドバクテリウム属細菌の接種量の比率（菌数比）は特に制限されないが、１０００：１～１：１０が好ましく、１０：１～１：１がより好ましい。
　乳原料に接種するPrtPを有しないラクトコッカス・ラクティスは、単一の菌株であってもよく、複数の菌株であってもよい。また、ビフィドバクテリウム属細菌も、単一の菌株であってもよく、複数の菌株であってもよい。
　乳原料に接種するラクトコッカス・ラクティス、及びビフィドバクテリウム属細菌、並びに必要に応じて他の乳酸菌は、予め他の培地で種培養又は前培養しておくことが好ましい。培地としては、ラクトコッカス・ラクティス、及びビフィドバクテリウム属細菌、並びに必要に応じて他の乳酸菌の培養に適した培地であれば特に制限されないが、例えば、還元脱脂粉乳を含む培地が挙げられる。還元脱脂粉乳の濃度は、３％（Ｗ／Ｗ）以上が好ましく、８％（Ｗ／Ｗ）以上が特に好ましい。また種培養又は前培養に用いられる培地には、酵母エキス等の生育促進物質や、Ｌ－システイン等の還元剤等を添加してもよい。特にビフィドバクテリウム属細菌は、還元脱脂粉乳を含む培地での増殖性が低いため、生育促進物質、例えば、０．１～１％（Ｗ／Ｗ）の酵母エキスを含有する培地を用いることが好ましい。培地の殺菌条件は、前記と同様である。
　必要に応じて、乳原料に、PrtPを有しないラクトコッカス・ラクティス、及びビフィドバクテリウム属細菌に加えて、他の乳酸菌を加えて発酵を行ってもよい。他の乳酸菌としては、食品の製造に用いられ得るものであって、ラクトコッカス・ラクティス及びビフィドバクテリウム属細菌の生育を阻害しないものであれば特に制限されないが、例えば発酵食品がヨーグルトの場合、ストレプトコッカス・サーモフィルス、および、ラクトバチルス・デルブルッキー等が挙げられる。これらの乳酸菌は、単一の菌株であってもよく、複数の菌株であってもよい。
　PrtPを有しないラクトコッカス・ラクティス、及びビフィドバクテリウム属細菌を用いて乳を発酵させた場合、通常、ｐＨが５付近であり、ドリンクヨーグルトが得られる。さらにストレプトコッカス・サーモフィルスやラクトバチルス・デルブルッキー等の乳酸菌を併用して発酵させると、ｐＨが低下し、よりしっかりとした組織を有したヨーグルト（スプーンで摂取できるヨーグルト）を製造することができる。
　ラクトコッカス・ラクティス及びビフィドバクテリウム属細菌の接種量と、上記他の乳酸菌の接種量の比率（菌数比）は特に制限されないが、１０００：１～１０：１が好ましい。
　ラクトコッカス・ラクティス、ビフィドバクテリウム属細菌、及び他の乳酸菌を乳原料に接種する順序は特に問わず、全てを同時に投与してもよい。また、これらの細菌のうち任意の細菌を、複数回接種してもよい。
　培養温度、培養時間等の発酵条件は、通常の乳原料からの発酵食品の製造と同様の条件を採用することができる。例えば、培養温度は３０℃～４０℃が好ましく、３６℃～３８℃がより好ましい。培養時間は、製造する発酵食品の種類によって適宜設定することができるが、通常、３～１８時間が好ましい。
　得られた発酵食品は、通常の乳原料からの発酵食品と同様に適宜加工することができる。例えば、発酵後の発酵食品をそのまま食品としてもよいし、均質化して液状に加工してもよい。さらに、蔗糖等の甘味料、ペクチン、果実、フルーツジュース、寒天、ゼラチン、油脂、香料、着色料、安定剤、還元剤等を添加してもよい。また、発酵食品は、適宜、容器に充填してもよい。
　上記のようにして製造される発酵食品は、タンパク質の分解に起因する苦味や旨味が少なく、ビフィドバクテリウム属細菌の保存生残性にも優れている。
　次に、試験例及び実施例を示して本発明をさらに具体的に説明する。
〔試験例１〕ラクトコッカス・ラクティス菌株の取得
　ラクトコッカス・ラクティスに属し、PrtP酵素を保有しない菌株を自然界から取得すべく、日本国内の自然界から採集したサンプルを嫌気性希釈液（光岡知足著「腸内菌の世界」、叢文社発行、１９８０年、 第３２２ページ）で希釈し、下記組成のBriggs liver broth（前記文献、３１９ページ）の平板（寒天１５g/Lを含む）に塗布し、３０℃で嫌気培養した。
〔嫌気性希釈液〕
塩類溶液I（0.78% K2HPO4溶液）     37.5 ml
塩類溶液II（0.47% KH2PO4、1.18% NaCl、
1.20% (NH4)2SO4、0.12% CaCl2、0.25% 
MgSO4・H2O を含む溶液）            37.5 ml
Resazurin （0.1%水溶液）            1 ml
Ｌ－システイン HCl・H2O            0.5 g
Ｌ－アスコルビン酸 （25%水溶液）    2 ml
Na2CO3 （8%溶液）                  50 ml
寒天                             0.5 g
精製水                           860 ml
〔Briggs liver broth〕
トマトジュース浸出液            400 ml
ネオペプトン（Difco）             15 g
酵母エキス（Difco）                6 g
肝臓エキス                       75 ml
グルコース                        20 g
可溶性でんぷん                   0.5 g
NaCl                               5 g
Tween 80                           1 g
Ｌ－システイン HCl・H2O          0.2 g
精製水                          525 ml
　pH 6.8
　そして、得られたコロニーの中で連鎖球菌の形態を示し、かつ塗布標本の顕微鏡観察によりグラム陽性である菌を釣菌した。これらの菌を、下記組成のＢＬ寒天培地に画線塗布し、前記と同様の方法で嫌気培養を反復し、純粋単離された菌株を得た。
〔ＢＬ寒天培地〕
Lab-Lemco powder（Oxoid）          2.4 g
プロテオースペプトン No.3（Difco）  10 g
トリプチケース（Trypticase）（BBL）  5 g
フィトン（Phytone）                  3 g
酵母エキス（Difco）　　　　　　      5 g
肝臓エキス　　　　　              150 ml
グルコース                          10 g
可溶性でんぷん                     0.5 g
溶液Ａ                             10 ml
トーレシリコンSH5535（10%溶液）     5 ml
Tween 80                             1 g
寒天                                15 g
Ｌ－システイン HCl・H2O            0.5 g
馬血液                             50 ml
　pH 7.2
　肝臓エキス：肝臓末（極東）10gを170mlの精製水で50～60℃の温浴槽中約１時間浸出した後、100℃で数分間加熱し、pH 7.2に調整してから濾紙で濾過する。
　溶液Ａ：MgSO4・7H2O 15g、FeSO4・7H2O 0.5g、NaCl 0.5g、MnSO4 0.337gを精製水250mlに溶解する。
　Ｌ－システインと馬血液以外の成分を湯煎して溶解させ、pHを調整し、115℃で20分滅菌後、50℃に冷却し、Ｌ－システインと馬血液を加え、シャーレに分注して平板とする。
　これらの菌株のゲノムＤＮＡの塩基配列を常法により同定した。ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information、国立バイオテクノロジー情報センター）の国際塩基配列データベース（GenBank）上で、ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool、http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）による16S リボソーマルRNA遺伝子配列の全長についての相同性検索を行い、それぞれのタイプストレインと９８％以上の相同性を有するラクトコッカス属細菌を２８０株同定した。ラクトコッカス・ラクティスと９８％以上の相同性を有していた２４２菌株のうち、ラクトースを資化し、かつラクトコッカス・ラクティス亜種のタイプストレインのうちラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスに最も相同性が高い群の菌株をラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスと同定した。また、ラクトコッカス・ラクティス亜種のタイプストレインのうちラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリスに最も相同性が高い群の菌株をラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリスと同定した。得られた菌株はすべて無芽胞、非運動性の通性嫌気性グラム陽性球菌で、カタラーゼおよびガス産生はいずれも陰性であった。
　続いて、得られたラクトコッカス・ラクティス株が、ＰｒｔＰ酵素を保有しているか否かを確認した。具体的には、ラクトース及びグルコースを０．５％添加したDifco（登録商標）M17 Broth（ベクトン・ディッキンソン社製）に、ＢＬ寒天培地上の各菌株のコロニーを白金耳にて接種し、３０℃で１６時間培養した。得られた培養液３％を同様の培地に接種し、３０℃で１６時間培養した。遠心分離により菌体を得て、DNeasy Blood and Tissue kit（キアゲン社製）を用いてＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法によりPrtP遺伝子の保有性を確認した。
　ＰＣＲは、Journal of Applied Microbiology、2006年、第100巻、第1307～1317ページに記載の手法に準じて行った。プライマーは、フォワードプライマーＧＢｆ（GCAAATACGGTGACGGCTGCGA、配列番号１）及びリバースプライマーＧＢ２ｒ（TGAGCATTATAATAGGTCTTCTTCC、配列番号２）のプライマーセット、又はフォワードプライマーＧＨｆ（CAAATACGGTGACGGCTGCTAA、配列番号３）及びリバースプライマーＧＨ２ｒ（TAGCATTATAATAGGTCTTCGTCA、配列番号４）のプライマーセットを用いた。その結果、ラクトコッカス・ラクティス２４２株中１２８株にはPrtP遺伝子の保有が確認された。一方、残りの１１４株はPrtP遺伝子を保有していないことが判明した。
〔試験例２〕乳性培地でのラクトコッカス・ラクティス菌株の発酵性試験
　ラクトースおよびグルコースを０．５％添加したDifco（登録商標）M17 Broth（ベクトン・ディッキンソン社製）に、試験例１で得られた各菌株、及び表１に記載の菌株の培養液を３％接種し、３０℃で１６時間培養した。遠心分離により集菌し、洗浄後、元の培養液と同量の乳性培地（１％（Ｗ／Ｗ）グルコース、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳（森永乳業社製））に菌体を懸濁し、シードカルチャーを得た。NBRC12007、及びNBRC100676は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（the National Institute of Technology and Evaluation）（〒292-0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）から入手することができる。また、JCM20101は、独立行政法人理化学研究所微生物系統保存施設（JCM）（〒351-0198 埼玉県和光市広沢2-1）から入手することができる。また、ATCC 9625は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所 12301　Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America）から入手することができる。
　次に、前記と同じ組成の乳性培地（９５℃で３０分間殺菌）に、前記各菌株のシードカルチャーを培地 1mlあたり5.0×106～2.0×108 CFU接種し、３７℃で１６時間培養した。得られた培養液を１０℃に急冷し、凝固状況、ｐＨ、及び含有される乳酸菌数を測定した。乳酸菌数の測定は、市販されているＢＣＰ加プレートカウント寒天培地（栄研化学社製）平板で行った。結果を表１に示す。表中、「E+N」は、「×10n」を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　Yonezawa S. et al., J. Dairy Sci. 2010, 93:1815-23に記載されているように、PrtPを有していないラクトコッカス・ラクティス亜種菌株は、乳性培地を固化しなかった。
〔試験例３〕PrtPを有しないラクトコッカス・ラクティスとビフィドバクテリウム・ロンガムとの混合培養試験
　まず、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株を、０．６％（Ｗ／Ｗ）酵母エキス及び１１％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に、培地 1mlあたり1.0×106～5.0×107CFU接種し、３７℃で１６時間培養して、シードカルチャーを得た。
　また、ラクトースおよびグルコースを０．５％添加したDifco（登録商標）M17 Broth（ベクトン・ディッキンソン社製）に、ラクトコッカス・ラクティス各菌株の試験例１で得られた培養液を３％接種し、３０℃で１６時間培養した。各培養菌体を、遠心分離により集菌し、洗浄後、元の培養液と同量の前記と同じ組成の乳性培地に懸濁し、シードカルチャーを得た。
　前記と同じ組成の乳性培地（９０℃で１０分間殺菌）に、ラクトコッカス・ラクティスの各菌株のシードカルチャーを培地 1mlあたり5.0×106～2.0×108 CFUと、前記ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株のシードカルチャーを培地 1mlあたり1.0×107～5.0×107 CFU接種し、３７℃で１６時間培養して発酵乳を得た。
　前記発酵乳を１０℃に急冷し、ｐＨ及び含有されるビフィズス菌数、及び溶存酸素を測定した。ビフィズス菌数の測定は、ＴＯＳプロピオン酸寒天培地（ヤクルト薬品工業社製）平板で行った。また、溶存酸素の測定は、発酵乳の温度を10℃に保ちながら蛍光式酸素計FO-960S (ASR社製)を用いて計測した。測定結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　PrtPを有していない株の中にも、PrtPを有している菌株（JCM20101、NBRC 100676）と同様にビフィズス菌を生残させる菌が存在していた。これらの菌株はいずれも、２週間保存後の発酵乳中の溶存酸素が2.0ppm以下であった。
〔試験例４〕
　試験例３で得られたビフィズス菌含有発酵乳は、ほとんどのpHが５付近であるため、形態はドリンクヨーグルトであった。よりしっかりとした組織を有した発酵乳（スプーンで摂取できる通常のヨーグルト）を製造するために、ストレプトコッカス・サーモフィルスおよびラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスを培地に添加した以外は、試験例３と同様に乳性培地の発酵を行った。
　試験例３と同様にラクトコッカス・ラクチスの各菌株とビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株のシードカルチャーを、乳性培地に試験例３と同じ接種量で接種し、さらにストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスを含むヨーグルトスターター（ダニスコ社製）を、１％（Ｗ／Ｗ）グルコース、及び１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に、それぞれ培地 1mlあたり２．０×１０6 ＣＦＵ、２．０×１０5 ＣＦＵ接種し、３７℃で８時間培養して発酵乳を得た。前記発酵乳を１０℃に急冷し、ｐＨ及び凝固状態を測定した。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ラクトコッカス・ラクティスが含まれていない系、およびPrtPを有する菌株を含む系では、通常の発酵乳が製造出来たが、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス LcL49およびラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス LcC 53を用いた発酵乳は、pHが下がらず凝固しなかった。
〔試験例５〕発酵乳の評価
　後記実施例３に記載の方法で発酵乳（ヨーグルト）を作製し、５名の専門パネラーに、旨味、苦味について１０段階評価してもらった。高い値ほど、その味が強いことを示している。スコア５を超えた場合、発酵乳としては強すぎる味であることを示している。結果を図１に示す。
　その結果、PrtPを有している菌株を用いて作製した発酵乳は、旨味や苦味が強く感じられた。一方、PrtPを有していない菌株を用いて作製した発酵乳は、旨味や苦味をほとんど感じず、発酵乳本来の風味が損われていなかった。
〔実施例１〕ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスを用いたドリンクヨーグルトの製造
　１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地１０００ｍＬ（９０℃で３０分間殺菌）に、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスLcL26株のシードカルチャーを３０ｍＬ接種し、２５℃で１６時間培養した。一方、０．２％（Ｗ／Ｗ）酵母エキス、及び１１％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地１０００ｍＬ（９０℃で３０分間殺菌）に、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株のシードカルチャーを１００ｍＬ接種し、３７℃で４時間培養した。
　なお、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株のシードカルチャーは、０．６％（Ｗ／Ｗ）酵母エキス及び１１％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株を1.0×106～5.0×107CFU接種し、３７℃で１６時間培養して、シードカルチャーを得た。
　これとは別に、原料として脱脂粉乳、全粉乳、蔗糖及びペクチンを混合溶解して、乳脂肪０．５％（Ｗ／Ｗ）、無脂乳固形分８．０％（Ｗ／Ｗ）、蔗糖８．０％（Ｗ／Ｗ）、ペクチン０．２％（Ｗ／Ｗ）からなる乳原料５０Ｌを調製し、９０℃で１０分間殺菌し、４０℃に冷却した。前記殺菌した乳原料に、前記の通り前培養を行ったラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスLcL26株のカルチャー５００ｍＬとビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株のカルチャー５００ｍＬを接種し、３７℃で１６時間培養して発酵乳を得た。
　前記発酵乳を１５ＭＰａの圧力で均質化し、２００ｍＬ容のガラス容器に充填した後、発酵乳の温度が１０℃になるまで冷却し、さらに密封して、ドリンクヨーグルトを得た。得られたドリンクヨーグルトは乳酸酸度０．６４％、ｐＨ４．９、１．６×１０8ＣＦＵ／mlのビフィズス菌を含有していた。このドリンクヨーグルトを１０℃で１４日間保存した時のビフィズス菌数は１．１×１０8ＣＦＵ／mlであり、生残率は６８％であった。また、この時の溶存酸素濃度は0.93ppmであった。
〔実施例２〕ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリスを用いたドリンクヨーグルトの製造
　１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地１０００ｍＬ（９０℃で３０分間殺菌）に、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリスLcC46株のシードカルチャーを３０ｍＬ接種し、２５℃で１６時間培養した。一方、０．２％（Ｗ／Ｗ）酵母エキス、及び１１％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地１０００ｍＬ（９０℃で３０分間殺菌）に、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株のシードカルチャーを１００ｍＬ接種し、３７℃で４時間培養した。
　なお、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株のシードカルチャーは、０．６％（Ｗ／Ｗ）酵母エキス及び１１％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株を1.0×106～5.0×107CFU接種し、３７℃で１６時間培養して、シードカルチャーを得た。
　これとは別に、原料として脱脂粉乳、全粉乳、蔗糖及びペクチンを混合溶解して、乳脂肪０．５％（Ｗ／Ｗ）、無脂乳固形分８．０％（Ｗ／Ｗ）、蔗糖８．０％（Ｗ／Ｗ）、ペクチン０．２％（Ｗ／Ｗ）からなる乳原料５０Ｌを調製し、９０℃で１０分間殺菌し、４０℃に冷却した。前記殺菌した乳原料に、前記の通り前培養を行ったラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリスLcC46株のカルチャー５００ｍＬとビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株のカルチャー５００ｍＬを接種し、３７℃で１６時間培養して発酵乳を得た。
　前記発酵乳を１５ＭＰａの圧力で均質化し、２００ｍＬ容のガラス容器に充填した後、発酵乳の温度が１０℃になるまで冷却し、さらに密封して、ドリンクヨーグルトを得た。得られたドリンクヨーグルトは乳酸酸度０．６６％、ｐＨ４．８、９．６×１０7ＣＦＵ／mlのビフィズス菌を含有していた。この前記ドリンクヨーグルトを１０℃で１４日間保存した時のビフィズス菌数は６．９×１０7ＣＦＵ／mlであり、生残率は７１％であった。また、この時の溶存酸素濃度は0.88ppmであった。
〔実施例３〕ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスを用いたヨーグルトの製造（Ｉ）
　還元脱脂粉乳１０％（Ｗ／Ｗ）を含む培地（１１５℃、２０分殺菌）１０００ｍＬに、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスFERM BP-10758株のシードカルチャーを３０ｍＬ接種し、３７℃、１６時間培養した。一方、酵母エキス０．１％（Ｗ／Ｗ）、及び還元脱脂粉乳１０％（Ｗ／Ｗ）を含む培地（９０℃で３０分間殺菌）１０００ｍＬにストレプトコッカス・サーモフィルスFERM P-17216株のシードカルチャーを３０ｍＬ接種し、３７℃、５時間培養した。
　なお、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスFERM BP-10758株のシードカルチャーは、０．１％（Ｗ／Ｗ）酵母エキスおよび１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に、1.0×105～1.0×107CFU接種し、３７℃で１６時間培養して得た。
　なお、ストレプトコッカス・サーモフィルスFERM P-17216株のシードカルチャーは、０．１％（Ｗ／Ｗ）酵母エキスおよび１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に、1.0×105～1.0×107CFU接種し、３７℃で１６時間培養して得た。
　脱脂粉乳、クリーム及び乳タンパク質などの原料を混合溶解して、乳脂肪３．０％（Ｗ／Ｗ）、無脂乳固形分１２．０％（Ｗ／Ｗ）からなる乳原料５０Ｌを調製し、７０℃に加温し、１５ＭＰａの圧力で均質し、９０℃で１０分間殺菌し、４０℃に冷却した。
　この殺菌した乳原料に、前記の通り前培養を行ったラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスFERM BP-10758株のカルチャーを５０ｍｌ、ストレプトコッカス・サーモフィルスFERM P-17216株のカルチャーを４５０ｍＬ、実施例１のLcL26株と同様の方法にて前培養を行ったラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスLcL13株のカルチャー５００ｍＬとビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株のカルチャー５００ｍＬを接種し、３７℃で４時間培養して発酵乳を得た。得られた発酵乳は、直ちに発酵乳の温度が１０℃になるまで攪拌冷却し、さらに、１００ｍＬ容の紙カップ容器に充填し、密封して、ヨーグルトを得た。
　得られたヨーグルトは乳酸酸度０．７４％、ｐＨ４．６９であり、１．０×１０8ＣＦＵ／ｍｌのビフィズス菌を含有していた。このヨーグルトを１０℃で１４日間保存した時のビフィズス菌数は９．３×１０7ＣＦＵ／ｍｌであり、生残率は９３％であった。また、この時の溶存酸素濃度は0.5ppm以下であった。
〔実施例４〕ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスを用いたヨーグルトの製造（II）
　脱脂粉乳、クリーム及び乳タンパク質を混合溶解して、乳脂肪３．０％（Ｗ／Ｗ）、無脂乳固形分１２．０％（Ｗ／Ｗ）からなる乳原料５０Ｌを調製し、７０℃に加温し、１５ＭＰａの圧力で均質し、９０℃で１０分間殺菌し、４０℃に冷却した。
　この殺菌した乳原料に、実施例１と同様にして得られたラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスLcL26株のカルチャー５００ｍＬと、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株のカルチャー５００ｍＬ、さらにストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスを含むヨーグルトスターター（ダニスコ社製）０．００２％を接種し、３７℃で８時間培養して発酵乳を得た。得られた発酵乳は、直ちに発酵乳の温度が１０℃になるまで攪拌冷却し、１００ｍＬ容の紙カップ容器に充填し、密封し、ヨーグルトを得た。
　得られたヨーグルトは、乳酸酸度０．６５％、ｐＨ４．８４であり、１．２×１０8ＣＦＵ／mlのビフィズス菌を含有していた。このヨーグルトを１０℃で１４日間保存した時のビフィズス菌数は１．０×１０8ＣＦＵ／ｍｌであり、生残率は８３％であった。また、この時の溶存酸素濃度は0.5ppm以下であった。
〔実施例５〕ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスを用いたヨーグルトの製造（III）
　脱脂粉乳、クリーム及び乳タンパク質を混合溶解して、乳脂肪３．０％（Ｗ／Ｗ）、無脂乳固形分１２．０％（Ｗ／Ｗ）からなる乳原料５０Ｌを調製し、７０℃に加温し、１５ＭＰａの圧力で均質し、９０℃で１０分間殺菌し、４０℃に冷却した。
　この殺菌した乳原料に、実施例１と同様にして得られたラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスLcL26株のカルチャー５００ｍＬと、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株の凍結菌体（森永乳業社製）1.5×1014 CFU(colony forming unit) 、さらにストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスを含むヨーグルトスターター（ダニスコ社製）０．００２％を接種し、３７℃で４時間培養して発酵乳を得た。得られた発酵乳は、直ちに発酵乳の温度が１０℃になるまで攪拌冷却し、１００ｍＬ容の紙カップ容器に充填し、密封して、ヨーグルトを得た。
　得られたヨーグルトは、乳酸酸度０．７０％、ｐＨ４．７４であり、４．２×１０9ＣＦＵ／mlのビフィズス菌を含有していた。このヨーグルトを１０℃で１４日間保存した時のビフィズス菌数は２．０×１０9ＣＦＵ／ｍｌであり、生残率は４７．６％であった。また、この時の溶存酸素濃度は1.47ppmであった。
　本発明の発酵乳の製造方法により、ビフィドバクテリウム属細菌、特にビフィドバクテリウム・ロンガムを多く含有する発酵食品を効率よく製造することができる。また、本発明の発酵食品の製造方法により製造された発酵食品は、健康管理上も有用なものであることは言うまでも無く、風味に優れた嗜好性の高いものである。
　また、本発明のビフィドバクテリウム属細菌入り乳原料発酵用スターターは、前記発酵食品の製造に使用することができる。

Claims (20)

  1. 　細胞壁局在性タンパク質分解酵素を有しないラクトコッカス・ラクティスと、ビフィドバクテリウム属細菌とを用いて、乳原料を発酵させることを特徴とする発酵食品の製造方法。
  2. 　前記ラクトコッカス・ラクティスは、１％（Ｗ／Ｗ）グルコース、及び１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に同細菌を培地１ｍｌ当たり５．０×１０6 ～２．０×１０8 ＣＦＵ接種し、３７℃で４～２４時間培養したときに、当該培地が凝固しない性質を有する、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記ラクトコッカス・ラクティスは、１％（Ｗ／Ｗ）グルコース、及び１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に同細菌を培地１ｍｌ当たり５．０×１０6 ～２．０×１０8 ＣＦＵ、及び、ビフィドバクテリウム属細菌を培地１ｍｌ当たり１．０×１０7 ～３．０×１０9 ＣＦＵ、各々接種して培養し、培地のｐＨが４．６～５．５に達した時点で培地を培養温度から１０℃に急冷して、１０℃で２週間保存したときの溶存酸素濃度を、２ｐｐｍ以下に維持する性質を有する、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記ラクトコッカス・ラクティスは、１％（Ｗ／Ｗ）グルコース、及び１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に同細菌を培地１ｍｌ当たり５．０×１０6 ～２．０×１０8 ＣＦＵ、及び、ビフィドバクテリウム属細菌を培地１ｍｌ当たり１．０×１０7 ～３．０×１０9 ＣＦＵ、各々接種して培養し、培地のｐＨが４．６～５．５に達した時点で培地を培養温度から１０℃に急冷して、１０℃で２週間保存したときのビフィドバクテリウム属細菌の生残率を３０％以上に維持する性質を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　前記ラクトコッカス・ラクティスは、１％（Ｗ／Ｗ）グルコース、及び１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に同細菌を培地１ｍｌ当たり５．０×１０6 ～２．０×１０8 ＣＦＵ、ビフィドバクテリウム属細菌を培地１ｍｌ当たり１．０×１０7 ～３．０×１０9 ＣＦＵ、並びに、ストレプトコッカス・サーモフィラス及びラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスをそれぞれ培地１ｍｌ当たり１．０×１０3 ～９．０×１０7 ＣＦＵ接種し、３７℃で３～２４時間培養したときに、当該培地が凝固する性質を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　前記ラクトコッカス・ラクティスが、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス、およびラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリスからなる群より選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　前記ラクトコッカス・ラクティスが、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスLcL13 (FERM BP-11276)、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスLcL26 (FERM BP-11277)、およびラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリスLcC46 (FERM BP-11275)からなる群より選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　前記ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガムである請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　前記ビフィドバクテリウム・ロンガムが、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株である請求項８に記載の方法。
  10. 　さらに、ストレプトコッカス・サーモフィラスおよびラクトバチルス・デルブルッキーからなる群より選択される乳酸菌とを発酵に用いることを特徴とする、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 　請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法により製造された発酵食品。
  12. 　細胞壁局在性タンパク質分解酵素を有しないラクトコッカス・ラクティスを含むビフィドバクテリウム属細菌入り乳原料発酵用スターター。
  13. 　前記ラクトコッカス・ラクティスは、１％（Ｗ／Ｗ）グルコース、及び１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に同細菌を培地１ｍｌ当たり５．０×１０6 ～２．０×１０8 ＣＦＵ接種し、３７℃で４～２４時間培養したときに、当該培地が凝固しない性質を有する、請求項１２に記載のビフィドバクテリウム属細菌入り乳原料発酵用スターター。
  14. 　前記ラクトコッカス・ラクティスは、１％（Ｗ／Ｗ）グルコース、及び１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に同細菌を培地１ｍｌ当たり５．０×１０6 ～２．０×１０8 ＣＦＵ、及び、ビフィドバクテリウム属細菌を培地１ｍｌ当たり１．０×１０7 ～３．０×１０9 ＣＦＵ、各々接種して培養し、培地のｐＨが４．６～５．５に達した時点で培地を培養温度から１０℃に急冷して、１０℃で２週間保存したときのビフィドバクテリウム属細菌の生残率を３０％以上に維持する性質を有する、請求項１２又は１３に記載のビフィドバクテリウム属細菌入り乳原料発酵用スターター。
  15. 　前記ラクトコッカス・ラクティスは、１％（Ｗ／Ｗ）グルコース、及び１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に同細菌を培地１ｍｌ当たり５．０×１０6 ～２．０×１０8 ＣＦＵ、ビフィドバクテリウム属細菌を培地１ｍｌ当たり１．０×１０7 ～３．０×１０9 ＣＦＵ、並びに、ストレプトコッカス・サーモフィラス及びラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスをそれぞれ培地１ｍｌ当たり２．０×１０5 ～９．０×１０7 ＣＦＵ接種し、３７℃で３～２４時間培養したときに、当該培地が凝固する性質を有する、請求項１２～１４のいずれか一項に記載のビフィドバクテリウム属細菌入り乳原料発酵用スターター。
  16. 　前記ラクトコッカス・ラクティスが、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス、およびラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリスからなる群より選択される、請求項１２～１５のいずれか一項に記載のビフィドバクテリウム属細菌入り乳原料発酵用スターター。
  17. 　前記ラクトコッカス・ラクティスが、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスLcL13 (FERM BP-11276)、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスLcL26 (FERM BP-11277)、およびラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリスLcC46 (FERM BP-11275)からなる群より選択される、請求項１２～１６のいずれか一項に記載のビフィドバクテリウム属細菌入り乳原料発酵用スターター。
  18. 　前記ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガムである請求項１２～１７のいずれか一項に記載のビフィドバクテリウム属細菌入り乳原料発酵用スターター。
  19. 　前記ビフィドバクテリウム・ロンガムが、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株である請求項１８に記載のビフィドバクテリウム属細菌入り乳原料発酵用スターター。
  20. 　ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスLcL13 (FERM BP-11276)、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスLcL26 (FERM BP-11277)、およびラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリスLcC46 (FERM BP-11275)からなる群より選択される菌株。
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