ES2425580T3 - Bacterias ácido lácticas novedosas - Google Patents
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Abstract
Bacterias del género Lactococcus que tienen propiedades bacteriológicas de: (1) fermentabilidad que cuaja un medio de leche desnatada reconstituida al 10 % (p/p) cuando se cultiva a unatemperatura de 25 °C a 37 °C durante 16 horas; (2) propiedades que promueven el crecimiento de Bifidobacterium longum que conducen a un conteo viable deBifidobacterium longum de 5 x 108 UFC/g o superior, cuando se cultiva conjuntamente con Bifidobacterium longumen el medio de leche desnatada reconstituida al 10 % (p/p) hasta un pH del mismo de 4,4 a 4,6; y (3) propiedades que mejoran la superviviencia de Bifidobacterium longum durante el almacenamiento que conducena una tasa de supervivencia de Bifidobacterium longum del 30 % o superior después de cultivo conjunto conBifidobacterium longum en el medio de leche desnatada reconstituida al 10 % (p/p) hasta un pH del mismo de 4,4 a4,6, enfriamiento rápido y almacenamiento de dos semanas a 10 ºC, seleccionándose dichas bacterias del género Lactococcus del grupo que consiste en Lactococcus lactis subsp. lactisMCC852 (FERM BP-10742), Lactococcus lactis subsp. lactis MCC857 (FERM BP-10757), Lactococcus lactis subsp.lactis MCC859 (FERM BP-10744), Lactococcus lactis subsp. lactis MCC865 (FERM BP-10745) y Lactococcus lactissubsp. lactis MCC866 (FERM BP-10746).
Description
Bacterias ácido lácticas novedosas
La presente invención se refiere a bacterias ácido lácticas novedosas que pertenecen al género Lactococcus, a polvo de bacterias que contienen bacterias ácido lácticas, a una composición farmacéutica que contiene las bacterias ácido lácticas, a un agente de control de la función intestinal que contiene bacterias ácido lácticas y a un
10 procedimiento para promover el crecimiento de Bifidobacterium longum y mejorar su supervivencia usando las bacterias ácido lácticas.
Se reivindica prioridad sobre la solicitud de patente japonesa 2007-032645, presentada el 13 de febrero de 2007, el contenido de la cual se incorpora a la presente por referencia.
15 Técnica anterior
Se sabe que las bacterias ácido lácticas tales como las bacterias del género Lactococcus o las bacterias del género Bifidobacterium (en adelante, abreviado como “bifidobacterias”) tienen una actividad reguladora de la función
20 intestinal, una actividad inmunoestimulante y una actividad anticancerosa. En consecuencia, las bacterias ácido lácticas tienden a formularse frecuentemente en alimentos de acuerdo con un aumento de la concienciación sobre salud por parte de los consumidores. En particular, las bifidobacterias tales como Bifidobacterium longum son una de las cepas bacterianas predominantes en la microflora intestinal formada en el conducto intestinal humano, y son crecientes las demandas de leche fermentada u otros productos alimentarios que contengan bifidobacterias viables.
25 Las bifidobacterias muestran una potencia de proliferación baja en medio acuoso. En consecuencia, se formulan generalmente diversas sustancias que estimulan el crecimiento en leche fermentada de modo que las bifidobacterias estén contenidas en la misma en un contenido constante, tal como 1 x 107 UFC/ml. No obstante, las sustancias estimulantes del crecimiento son generalmente caras y pueden deteriorar el sabor. Además, la conservación de
30 bifidobacterias en condiciones ácidas es difícil y tiende a tener como consecuencia la muerte de las mismas. Por lo tanto, el conteo viable de bifidobacterias en productos de leche fermentada disminuye con una velocidad acelerada durante la distribución de los productos de leche fermentada.
En consecuencia, se espera que una promoción del crecimiento de bifidobacterias o una mejora de su supervivencia
35 durante el almacenamiento permita no solo la preparación de leche fermentada que contenga una cantidad grande de bifidobacterias viables, sino también la preparación de leche fermentada que conserve una cantidad abundante de bifidobacterias viables desde inmediatamente después de la preparación hasta su consumo.
Se han divulgado diversos procedimientos para promover el crecimiento de bifidobacterias o mejorar su
40 supervivencia durante el almacenamiento por fermentación con bifidobacterias y otra bacteria ácido láctica sin añadir ninguna sustancia estimulante del crecimiento o similares. Por ejemplo, (1) se ha divulgado yogur que contiene Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris y bifidobacterias, y un procedimiento de preparación del yogur (véase, por ejemplo, el documento de patente 1), como un procedimiento para promover el crecimiento de bifidobacterias para preparar leche fermentada.
45 Por ejemplo, (2) se ha divulgado un procedimiento para fermentar leche con bifidobacterias que incluye cultivar Bifidobacterium breve junto con Lactococcus lactis subsp. lactis, que no forme ni diacetilo ni acetoína, en un medio que contiene leche como su componente principal (véase, por ejemplo, el documento de patente 2), como un procedimiento para mejorar la supervivencia de bifidobacterias durante el almacenamiento de leche fermentada.
50 Documento de patente 1: Publicación de patente japonesa Nº 3.364.491.
Documento de patente 2: Publicación de patente japonesa Nº 3.068.484.
[Problema que debe solucionarse mediante la invención]
Aunque se promueva el crecimiento de bifidobacterias y el tiempo de fermentación se reduzca según el
60 procedimiento (1) mencionado anteriormente, no existe ninguna divulgación con respecto a la supervivencia de bifidobacterias durante el almacenamiento en el documento de patente 1. Por el contrario, aunque se reconozcan tanto efectos estimulantes del crecimiento como efectos que mejoran la supervivencia usando una mezcla compuesta por una bifidobacteria específica y una bacteria ácido láctica específica según el procedimiento (2) mencionado anteriormente, no existe ninguna divulgación con respecto a una bifidobacteria diferente a
65 Bifidobacterium breve, tal como Bifidobacterium longum, que se formule generalmente en alimentos.
La presente invención tiene por objeto proporcionar cepas de bacterias ácido lácticas que estimulen el crecimiento de bifidobacterias, preferentemente de Bifidobacterium longum, y mejoren su supervivencia durante el almacenamiento.
5 La presente invención también tiene por objeto proporcionar polvo de bacterias que contengan las bacterias ácido lácticas, una composición farmacéutica que contenga las bacterias ácido lácticas, un agente de control de la función intestinal que contenga las bacterias ácido lácticas y un procedimiento para promover el crecimiento de Bifidobacterium longum y mejorar su supervivencia usando las bacterias ácido lácticas.
10 [Medios para resolver los problemas]
Los inventores de la presente invención han investigado intensamente con el fin de resolver los problemas mencionados anteriormente y han realizado un ensayo de fermentación mediante cultivo conjunto con Bifidobacterium longum para encontrar cepas de bacterias ácido lácticas que muestren una fermentabilidad
15 excelente en medio de leche desnatada reconstituida al 10 % (p/p). Como resultado, los inventores han hallado cepas de bacterias ácido lácticas tal como se definen en la reivindicación 1 que pueden promover el crecimiento de Bifidobacterium longum a un conteo viable de 5 x 108 UFC/g cuando el pH es de 4,4 a 4,6, y mejorar la tasa de supervivencia de Bifidobacterium longum al 30 % o más después de finalizar la fermentación, un enfriamiento rápido y un almacenamiento de dos semanas a 10 °C. De este modo, los inventores completaron la presente invención.
20 Es decir, la presente invención proporciona cinco cepas bacterianas del género Lactococcus que tienen las propiedades bacteriológicas siguientes:
(1) fermentabilidad que cuaja un medio de leche desnatada reconstituida al 10 % (p/p) cuando se cultivan a una 25 temperatura de 25 °C a 37 °C durante 16 horas;
(2) propiedades que promueven el crecimiento de Bifidobacterium longum que conducen a un conteo viable de Bifidobacterium longum de 5 x 108 UFC/g o superior, cuando se cultivan conjuntamente con Bifidobacterium longum en el medio de leche desnatada reconstituida al 10 % (p/p) hasta un pH del mismo de 4,4 a 4,6; y
(3) propiedades que mejoran la superviviencia de Bifidobacterium longum durante el almacenamiento que conducen a una tasa de supervivencia de Bifidobacterium longum del 30 % o superior, después de cultivo conjunto con Bifidobacterium longum en el medio de leche desnatada reconstituida al 10 % (p/p) hasta un pH del mismo de 4,4 a 4,6, enfriamiento rápido y almacenamiento de dos semanas a 10 ºC
35 La presente invención también proporciona cinco cepas bacterianas del género Lactococcus caracterizadas porque las bacterias no tienen la capacidad de fermentar xilosa y no producen ni diacetilo ni acetoína.
La presente invención también proporciona cinco cepas bacterianas del género Lactococcus en las que las bacterias 40 son Lactococcus lactis subsp. lactis.
La presente invención también proporciona cinco cepas bacterianas del género Lactococcus en las que al menos una cepa bacteriana de Bifidobacterium longum se selecciona del grupo que consiste en Bifidobacterium longum FERM BP-7787 y la cepa de tipo Bifidobacterium longum ATCC 15707.
45 La presente invención también proporciona cinco cepas bacterianas del género Lactococcus lactis subsp. lactis MCC852 (FERN BP-10742).
La presente invención también proporciona cinco cepas bacterianas del género Lactococcus lactis subsp. lactis 50 MCC857 (FERN BP-10757).
La presente invención también proporciona cinco cepas bacterianas del género Lactococcus lactis subsp. lactis MCC859 (FERN BP-10744).
55 La presente invención también proporciona cinco cepas bacterianas del género Lactococcus lactis subsp. lactis MCC865 (FERN BP-10745).
La presente invención también proporciona cinco cepas bacterianas del género Lactococcus lactis subsp. lactis MCC866 (FERN BP-10746).
60 La presente invención también proporciona polvo de bacterias que contiene cualquiera de las bacterias del género Lactococcus mencionadas anteriormente.
La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que contiene cualquiera de las bacterias 65 del género Lactococcus mencionadas anteriormente.
La presente invención también proporciona cualquiera de las bacterias del género Lactococcus mencionadas anteriormente.
La presente invención también proporciona un procedimiento para promover el crecimiento de Bifidobacterium 5 longum y mejorar su supervivencia que incluye el uso de cualquiera de las bacterias del género Lactococcus mencionadas anteriormente.
[Efectos de la invención]
Las bacterias del género Lactococcus según la presente invención y el procedimiento para promover el crecimiento de Bifidobacterium longum y mejorar su supervivencia según la presente invención mejoran significativamente el crecimiento de Bifidobacterium longum y su supervivencia durante el almacenamiento y, por lo tanto, se producen de forma más eficaz que anteriormente productos fermentados que contienen una cantidad elevada de Bifidobacterium longum. Además, el conteo viable de Bifidobacterium longum en productos de leche fermentada se mantiene en
15 niveles suficientes incluso durante su distribución. Los productos de leche fermentada proporcionados de este modo muestran efectos reguladores de la función intestinal elevados y son útiles para el control de la salud.
Las bacterias del género Lactococcus, particularmente Lactococcus lactis subsp. lactis, según la presente invención tienen las propiedades (1), (2) y (3).
La propiedad (1) se refiere a la fermentabilidad. Si las bacterias ácido lácticas pueden proliferar rápidamente y tienen una fermentabilidad fuerte suficiente para cuajar un medio de leche desnatada reconstituida al 10 % (p/p) cuando se
25 cultivan en el mismo a una temperatura de entre 25 °C y 37 °C durante 16 horas, las bacterias ácido lácticas pueden promover eficazmente el crecimiento de Bifidobacterium longum cuando se prepara la leche fermentada. Tal como se usa en el presente documento, la expresión “cuaja un medio de cultivo” se refiere a un fenómeno en el que el pH del medio de cultivo disminuye por debajo del punto isoeléctrico de una proteína láctea presente en el mismo mediante fermentación ácida y, por lo tanto, la proteína láctea se aglomera y el medio de cultivo se cuaja. El “medio de leche desnatada reconstituida al 10 % (p/p)” puede prepararse, por ejemplo, disolviendo el 10 % en masa de polvos de leche desnatada (fabricados por MORlNAGA MlLK INDUSTRY CO., LTD., por ejemplo) en agua.
Aunque el intervalo de temperatura adecuado para la fermentación con bacterias del género Lactococcus se encuentra generalmente entre 20 °C y 30 °C, las bacterias del género Lactococcus según la presente invención
35 muestran una fermentabilidad fuerte a una temperatura de entre 25 °C y 37 °C. En otras palabras, las bacterias del género Lactococcus según la presente invención muestran una fermentabilidad suficiente dentro de un intervalo de temperatura adecuado para la fermentación con Bifidobacterium longum (de 30 °C a 40 °C)
La propiedad (2) se refiere a propiedades promotoras del crecimiento de Bifidobacterium longum. Un medio lácteo tal como un medio de leche desnatada reconstituida al 10 % (p/p) presenta un sabor, una sensación en la boca y una apariencia externa excelentes; cuando el pH del mismo es aproximadamente 4,6, la caseína y otros componentes contenidos en el mismo están generalmente precipitados y el medio de cultivo está totalmente cuajado. En consecuencia, la fermentación se detiene generalmente mediante enfriamiento rápido o similar cuando el pH alcanza aproximadamente 4,6 para preparar productos de leche fermentada. Por lo tanto, las bacterias ácido
45 lácticas que tienen las propiedades promotoras del crecimiento que pueden conducir al conteo viable de Bifidobacterium longum, que es un conteo alto de 5 x 108 UFC/g o superior, cuando se cultivan conjuntamente con Bifidobacterium longum en el medio de leche desnatada reconstituida al 10 % (p/p) hasta que el pH del mismo es de 4,4 a 4,6, pueden aumentar eficazmente el conteo viable de Bifidobacterium longum en leche fermentada en el momento de preparación de la leche fermentada.
La propiedad (3) se refiere a propiedades que mejoran la supervivencia de Bifidobacterium longum durante el almacenamiento. El periodo de conservación con calidad de productos de leche fermentada es generalmente de aproximadamente dos semanas cuando se almacena a 10 ºC o más. En consecuencia, puede producirse leche fermentada que mantenga un conteo viable suficiente de Bifidobacterium longum incluso en el punto final del periodo
55 de conservación con calidad de la misma, siempre que las bacterias ácido lácticas tengan propiedades que mejoren la supervivencia durante el almacenamiento que puedan conducir a una tasa de supervivencia de Bifidobacterium longum que sea del 30 % o superior, después de cultivo conjunto con Bifidobacterium longum en el medio de leche desnatada reconstituida al 10 % (p/p) hasta que el pH del mismo sea de 4,4 a 4,6, enfriamiento rápido y dos semanas de almacenamiento a 10 ºC
Las bacterias del género Lactococcus según la presente invención pueden prepararse, por ejemplo, según el procedimiento siguiente. En primer lugar, las cepas bacterianas se aíslan a partir de varias muestras, y las cepas que muestran una fermentabilidad excelente en el medio de leche desnatada reconstituida al 10 % (p/p), más específicamente una fermentabilidad suficiente para cuajar el medio de leche desnatada reconstituida al 10 % (p/p) 65 cuando se cultivan en el mismo a una temperatura de 25 a 37 ºC durante 16 horas, se seleccionan a partir de las cepas bacterianas aisladas. Después, las cepas bacterianas seleccionadas se cultivan conjuntamente con
Bifidobacterium longum y se seleccionan las cepas bacterianas que tienen propiedades promotoras del crecimiento de Bifidobacterium longum y propiedades que mejoran su supervivencia durante el almacenamiento definidas como las propiedades (2) y (3) mencionadas anteriormente. Es preferente que se seleccionen adicionalmente las cepas bacterianas que no tengan la capacidad de fermentar xilosa y que no produzcan ni diacetilo ni acetoína.
5
A continuación, la presente invención se explicará con más detalle.
1. Aislamiento de cepas bacterianas
10 Con el fin de aislar cepas bacterianas que tengan las propiedades mencionadas anteriormente de la naturaleza, los presentes inventores recogieron muestras de la naturaleza en Japón, diluyeron las muestras con un tampón de dilución anaeróbico (“The World of Enterobacteria” publicado por Soubunsha Co., Ltd., escrito por Tomotari Mitsuoka, página 322, 1980; en adelante abreviado como “referencia 1”), inocularon las muestras diluidas en cada placa de caldo de hígado de Briggs (véase la referencia 1 mencionada anteriormente, página 319) y después se
15 cultivaron las muestras inoculadas a 30 ºC en condiciones anaerobias. Entre las colonias obtenidas de este modo, se recogieron las cepas bacterianas que mostraron características morfológicas de bacterias estreptocócicas y se reconocieron como bacterias Gram positivas mediante observación con microscopio de especímenes aplicados. Cada una de las cepas recogidas se inoculó en bandas en cada placa plana de agar BL y después se cultivó repetidamente en condiciones anaerobias del mismo modo que se ha descrito anteriormente para obtener cepas
20 bacterianas aisladas con pureza. Las cepas bacterianas aisladas se sometieron a un ensayo de fermentación en el medio de leche desnatada reconstituida al 10 % (p/p) descrito anteriormente para obtener 20 cepas bacterianas con fermentabilidad definida como la propiedad (1) mencionada anteriormente. Después, las cepas bacterianas obtenidas se cultivaron conjuntamente con Bifidobacterium longum para obtener 5 cepas bacterianas que tenían tanto las propiedades promotoras del crecimiento que aumentan el conteo viable de Bifidobacterium longum a un pH
25 de 4,4 a 4,6 a 5 x 108 UFC/g o más como las propiedades que mejoran la supervivencia durante el almacenamiento que aumentan la tasa de supervivencia de Bifidobacterium longum al 30 % o más cuando se almacenan a 10 ºC durante dos semanas después de un enfriamiento rápido a un pH de 4,4 a 4,6. Las 5 cepas bacterianas se denominan “MCC852”, “MCC857”, “MCC859”, “MCC865” y “MCC866’, respectivamente.
30 2. Propiedades bacteriológicas
A continuación se mostrarán las propiedades bacteriológicas de las 5 cepas bacterianas. Los ensayos para determinar las propiedades bacteriológicas se realizaron con referencia al manual Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, editado por Peter H. A. Sneath, Vol. 2, publicado por Williams and Wilkins Company, 1986)
(I) Morfología bacteriana (observada mediante un microscopio óptico después de cultivo anaerobio en una placa plana de agar BL a 30 °C durante 72 horas)
Tamaño: 1 a 2 μm (diámetro)
40 Morfología: Bacteria estreptocócica
(II) Tinción Gram: Positiva
45 (III) Leche Litmus: Cuajada
(IV) Formación de endoesporas: Negativa
(V) Producción de gas a partir de glucosa: Negativa 50
(VI) Motilidad: Negativa
(VII) Actividad de catálisis: Negativa
55 (VIII) Ensayo de arginina descarboxilasa: Positivo
(IX) Producción de gas a partir de ácido cítrico: Negativa
(X) Susceptibilidad a la temperatura (a 60 °C durante 30 minutos y a 65 °C durante 30 minutos): Positiva en ambos 60 casos
(XI) Producto de degradación de la glucosa: Ácido L-láctico
Tabla 1 65
- Cepa bacteriana
- MCC 852 MCC 857 MCC 859 MCC 865 MCC 866 ATCC 19435
- XII
- Temperatura de crecimiento 10 ºC +s +s + +s +s +s
- 40 ºC
- + + + + + +
- 45 ºC
- - - - - - -
- XIII
- Resistencia a la sal 2 % + + + + + +
- 3 %
- + + + + + +
- 4 %
- + + + + + +
- 6,5 %
- (+)s - - (+)s (+)s -
- XIV
- Resistencia al pH 9,2 + + + + + +
- 9,6
- +s + + + - -
- XV
- Resistencia a azul de metileno 0,01 % + + + + + +
- 0,1 %
- + + + + + +
- 0,3 %
- ± +s + +s + -
- XVI
- Producibilidad de amoniaco a partir de arginina + + + + ± +
- XVII
- Fermentación de azúcar Arabinosa - - - - - -
- Xilosa
- - - - - - +
- Ramnosa
- - - - - - -
- Ribosa
- + + +s + + +
- Glucosa
- + + + + + +
- Manosa
- + + + + + +
- Fructosa
- + + + + + +
- Galactosa
- + + + + + +
- Sacarosa
- - - - - - -
- Maltosa
- + + + + + +
- Celobiosa
- + + + + + +
- Lactosa
- + + + + + +
- Trehalosa
- + + + + + +
- Melibiosa
- - - - - - -
- Rafinosa
- - - - - - -
- Melecitosa
- - - - - - -
- Dextrina
- + + + + + +
- Almidón
- +s + - + + ±s
- Glicógeno
- - - - - - -
- Inulina
- - - - - - -
- Manitol
- Sorbitol
- - - - - - -
- Inositol
- - - - - - -
- Esculina
- (+)s + + - - -
- Salicina
- + + +s + + +
- Amigdalina
- - ± - (+)s (+)s -
- Glucósido de metilo
- - - - - - -
- Gluconato de sodio
- - ± ± - - -
- +: positivo. (+): ligeramente positivo. ±: extremadamente ligeramente positivo. -: negativo. s: reacción lenta
Las propiedades bacteriológicas (I) a (XI) mencionadas anteriormente son comunes a las 5 cepas bacterianas y a la cepa de tipo Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 19435. La temperatura de crecimiento (XII), la resistencia a la sal
5 (XIII), la resistencia al pH (XIV), la resistencia al azul de metileno (XV), la producibilidad de amoniaco a partir de arginina (XVI) y la fermentabilidad de azúcar (XVII) de cada cepa se muestran en la tabla 1. La fermentación de azúcar se examinó con respecto a 28 clases de azúcar usando un medio para la fermentación de azúcar divulgado por Mitsuoka (Tomotari Mitsuoka, The bacteriology of lactic acid bacteria”, Clinical Exarnination 18, páginas 1163 a 1172, 1974).
10 Es evidente a partir de los resultados mencionados anteriormente que la totalidad de las 5 cepas bacterianas tiene propiedades bacteriológicas comunes con las cepas bacterianas de Lactococcus lactis subsp. lactis. Por lo tanto, se ha reconocido que las 5 cepas bacterianas son cepas bacterianas de Lactococcus lactis subsp. lactis. Por otra parte, es evidente a partir de las propiedades bacteriológicas (XII) a (XVII) mencionadas anteriormente que las 5 cepas
15 bacterianas son diferentes de la cepa de tipo Lactococcus lactis subsp. lactis en que las 5 cepas bacterianas no tienen ninguna capacidad para fermentar la xilosa.
Las 5 cepas bacterianas fueron depositadas por el solicitante en el International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, (Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, 20 Ibaraki-ken, JAPÓN (código postal: 305-8566)) com cepas bacterianas novedosas. El número de acceso de la Lactococcus lactis subsp. lactis MCC852 es FERM BP-10742, el de la Lactococcus lactis subsp. lactis MCC857 es FERM BP-10757, el de la Lactococcus lactis subsp. lactis MCC859 es FERM BP-10744, el de la Lactococcus lactis subsp. lactis MCC865 es FERM BP-10745 y el de la Lactococcus lactis subsp. lactis MCC866 es FERM BP-10746. Las Lactococcus lactis subsp. lactis MCC852, 859, 865 y 866 se depositaron el 1 de diciembre de 2006 y la
25 Lactococcus lactis subsp. Iactis MCC857 se depositó el 10 de enero de 2007.
3. Ensayo con respecto a la fermentabilidad en medio de lecho desnatada reconstituida al 10 % (p/p).
Un medio de leche desnatada reconstituida al 10 % (p/p) preparado disolviendo polvos de leche desnatada
30 (fabricados por MORINAGA MILK INDUSTRY CO., LTD.) en agua se esterilizó a 95 ºC durante 30 minutos. Se inoculó cada uno de los iniciadores de cepas bacterianas al 3 % (v/v) en el medio de leche desnatada reconstituida y después se cultivó a 25, 30 o 37 ºC durante 16 horas. Después, el medio de cultivo obtenido se enfrió rápidamente, se observó el estado cuajado y se midieron el pH y el conteo viable de las bacterias ácido lácticas contenidas. El conteo viable se midió usando placas planas de agar de conteo de placa BCP disponibles comercialmente
35 (fabricadas por Eiken Chemical Co., LTD.). Los resultados de la medición se muestran en la tabla 2.
Se usó como cepa de control la cepa de tipo Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 19435 divulgada en el documento de patente 2.
40 Tabla 2
- Condiciones de cultivo
- a 25 ºC durante 16 horas
- a 30 ºC durante 16 horas a 37 ºC durante 16 horas
- Conteo viable (UFC/g)
- pH Conteo viable (UFC/g) pH Conteo viable (UFC/g) pH
- MCC852
- 2,0 x 108 4,53 cuajado 1,5 x 109 4,44 cuajado 8,0 x 108 4,63 cuajado
- MCC857
- 1,7 x 109 4,53 cuajado 1,5 x 109 4,41 cuajado 1,1 x 109 4,5 cuajado
- MCC859
- 1,4 x 109 4,54 cuajado 8,5 x 108 4,44 cuajado 8,1 x 108 4,59 cuajado
- MCC865
- 2,0 x 109 4,52 cuajado 1,5 x 109 4,42 cuajado 8,8 x 108 4,63 cuajado
- MCC866
- 2,0 x 109 4,52 cuajado 1,3 x 109 4,4 cuajado 8,5 x 108 4,61 cuajado
- ATCC 19435
- 5,2 x 108 5,93 no cuajado 4,4 x 108 5,65 no cuajado 3,2 x 108 5,51 no cuajado
Cuando se usó cada una de las cepas bacterianas de Lactococcus lactis subsp. lactis MCC852, 857, 859, 865 y 866,
es decir, las bacterias del género Lactococcus según la presente invención, el pH del medio de cultivo se redujo a 4,4 a 4,6 en todas las condiciones de temperatura, y el medio de cultivo cuajó. Además, el conteo viable de las bacterias ácido lácticas contenidas fue aproximadamente de 1 x 109 UFC/g y, por lo tanto, se reconocieron condiciones de proliferación y fermentabilidad favorables.
5 Por otra parte, cuando se usó la cepa de tipo Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 19435, el pH del medio de cultivo fue de 5,5 o superior y el medio de cultivo no cuajó en ninguna de las condiciones de temperatura. Además, el conteo viable de las bacterias ácido lácticas fue significativamente menor a 30 ºC o más, particularmente, que el de las bacterias del género Lactococcus según la presente invención.
4. Ensayo de cultivo conjunto con Bifidobacterium longum
(1) Ensayo de cultivo conjunto con Bifidobaceterium longum FERM BP-7787.
15 Se usó como cepa de control la cepa de tipo Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 19435.
En primer lugar, cada cultivo de las 5 cepas bacterianas (Lactococcus lactis subsp. lactis MCC852, 857, 859, 865 y 866) y de Bifidobacterium longum FERM BP-7787 se preparó según un procedimiento descrito en el ejemplo 1.
20 La Bifidobacterium longum FERM BP-7787 fue aceptada por el International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, (Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, JAPÓN (código postal: 305-8566)) el 31 de octubre de 2001.
Además, se esterilizaron 1.000 ml de un medio de leche desnatada reconstituida al 10 % (p/p) que contenía el 0,2 %
25 (p/p) de extracto de levadura (fabricado por Difco) a 90 °C durante 30 minutos. Después, se inocularon 30 ml de un cultivo de la cepa de tipo Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 19435 en el medio de leche desnatada reconstituida y se cultivaron a 30 ºC durante 16 horas para preparar un cultivo de la cepa de tipo Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 19435.
30 En el 1 % (v/v) de cada cultivo de las cepas de Lactococcus lactis subsp. lactis preparado como anteriormente se inoculó el 1 % (v/v) del cultivo de Bifidobacterium longum FERM BP-7787 en un medio de leche desnatada reconstituida al 10 % (p/p) esterizado a 90 °C durante 10 minutos, y la mezcla se cultivó a 37 ºC durante 16 horas para obtener la leche fermentada. La leche fermentada se enfrió rápidamente y se midieron el pH del mismo y el conteo viable de Bifidobacterium longum contenida. Después, el producto resultante se almacenó posteriormente a
35 10 ºC durante dos semanas, y el conteo viable de Bifidobacterium longum se midió una semana y dos semanas después de la iniciación del almacenamiento. El conteo viable de Bifidobacterium longum se midió usando placas planas de agar-propionato-TOS (fabricado por YAKULT PHARMACEUTICAL INDUSTRY CO., LTD.). Los resultados de la medición se muestran en la tabla 3.
40 Tabla 3
- Cepa bacteriana
- Conteo viable de bifidobacterias (UFC/g) pH
- Inmediatamente después de finalizar la fermentación
- Después de una semana de almacenamiento Después de dos semanas de almacenamiento
- Inmediatamente después de finalizar la fermentación
- MCC852
- 5,7 x 108 5,5 x 108 5,5 x 108 4,52
- MCC857
- 8,0 x 108 7,5 x 108 6,5 x 108 4,47
- MCC859
- 6,8 x 108 6,9 x 108 5,7 x 108 4,55
- MCC865
- 8,3 x 108 8,0 x 108 7,3 x 108 4,56
- MCC866
- 6,4 x 108 6,3 x 108 5,3 x 108 4,42
- ATCC 19435
- 1,2 x 108 El pH fue de 5 o superior y el ensayo de almacenamiento no pudo realizarse
Cada leche fermentada preparada usando Lactococcus lactis subsp. lactis MCC852, 857, 859, 865 o 866 tenía un
45 pH de aproximadamente 4,5 y un conteo viable de Bifidobacterium longum de 5 x 108 UFC/g o más después de la fermentación. Cuando cada leche fermentada se almacenó a 10 ºC durante dos semanas, la tasa de supervivencia de Bifidobacterium longum fue del 80 % o superior.
Por otra parte, la fermentación de la leche no tuvo lugar con la cepa de tipo Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 50 19435, y el pH de la leche fermentada fue de 5,0 o superior y el almacenamiento de la misma a 10 ºC fue imposible.
Además, el conteo de Bifidobacterium longum viable inmediatamente después de terminar la fermentación fue aproximadamente de 1 x 108 UFC/g, lo que era significativamente pequeño en comparación con el caso en el se usó la bacteria del género Lactococcus según la presente invención.
5 Por lo tanto, es evidente que las 5 cepas bacterianas (Lactococcus lactis subsp. lactis MCC852, 857, 859, 865 y 866) promueven de forma excelente el crecimiento de Bifidobacterium longum FERM BP-7787 y mejoran su tasa de supervivencia durante el almacenamiento en comparación con otras cepas bacterianas conocidas pertenecientes a Lactococcus lactis subsp. lactis.
10 También es evidente que el caso en el que Bifidobacterium longum se cultiva conjuntamente con Lactococcus lactis subsp. lactis que no forma ni diacetilo ni acetoína tal como se describe en el documento de patente 2 es diferente del caso en el que se usa Bifidobacterium breve, y no se muestran ni dichos efectos promotores de la proliferación de Bifidobacterium longum ni efectos que mejoran la supervivencia como los divulgados en el documento de patente 2.
15 (2) Ensayo de cultivo conjunto con la cepa de tipo Bifidobacterium longum ATCC 15707.
Las propiedades promotoras del crecimiento de Bifidobacterium longum de las bacterias del género Lactococcus según la presente invención y las propiedades que mejoran la supervivencia de Bifidobacterium longum de las mismas durante el almacenamiento se evaluaron usando Bifidobacterium longum FERM BP-7787 y la cepa de tipo
20 Bifidobacterium longum ATCC 15707.
En primer lugar, se prepararon un cultivo de Lactococcus lactis subsp. lactis MCCB57 y un cultivo de Bifidobacterium longum FERM EP-7787 según el procedimiento descrito en el ejemplo 1 siguiente.
25 Además, se preparó un cultivo mixto de Streptococcus thermophilus y Lactobacillus bulgaricus según el procedimiento descrito en el ejemplo 21 siguiente.
Además, se esterilizó un medio de leche desnatada al 11 % (p/p) que contenía el 0,2 % (p/p) de extracto de levadura a 90 °C durante 30 minutos. Después, se inoculó el 10 % (v/v) de la cepa de tipo Bifidobacteriurn longum ATCC
30 15707 como iniciador en el medio de lecho desnatada y se cultivó a 37 °C hasta que el pH alcanzó 4,6 para preparar un cultivo de la cepa de tipo Bifidobacterium longum ATCC 15707.
Se preparó el 1 % (v/v) del cultivo de Lactococcus lactis subsp. lactis MCC857 tal como se ha descrito anteriormente, bien el 1 % (v/v) del cultivo de Bifidobacterium longum FERM BP-7787 o bien el 1 % (v/v) del cultivo 35 de la cepa de tipo Bifidobacterium longum ATCC 15707, y se inoculó el 0,01 % (v/v) del cultivo mixto de Streptococcus thermophilus y Lactobacillus bulgaricus en un medio de leche desnatada reconstituida al 10 % (p/p) esterilizado a 90 °C durante 10 minutos, y se cultivó a 37 °C hasta que el pH alcanzó 4,6 para obtener leche fermentada. Después, la leche fermentada obtenida se enfrió rápidamente, el conteo viable de Bifidobacterium longum se midió. Además, la leche fermentada se almacenó a 10 ºC durante dos semanas y el conteo viable de
40 Bifidobacterium longum se midió una semana o dos semanas después del inicio del almacenamiento.
Por otra parte, se preparó bien el 1,5 % (v/v) del cultivo de Bifidobacterium longum FERM BP-7787 tal como se ha descrito anteriormente o bien el 1,5 % (v/v) del cultivo de la cepa de tipo Bifidobacterium longum ATCC 15707, y se inoculó el 0,4 % (v/v) del cultivo mixto de Streptococcus thermophilus y Lactobacillus bulgaricus en un medio de
45 leche desnatada reconstituida al 10 % (p/p) esterilizado a 90 °C durante 10 minutos, y se cultivó a 37 °C hasta que el pH alcanzó 4,6 para obtener leche fermentada como control. El conteo de Bifidobacterium longum viable en la leche fermentada se midió del mismo modo. Los resultados de la medición se muestran en la tabla 4.
Tabla 4 50
- MCC857
- Bifidobacterium longum Conteo viable de bifidobacterias (UFC/g)
- Inmediatamente después de finalizar la fermentación
- Después de una semana de almacenamiento Después de dos semanas de almacenamiento
- Presencia
- FERM BP-7787 1,0 x 109 1,0 x 108 7,1 x 108
- Presencia
- ATCC 15707 6,5 x 108 3,8 x 108 2,0 x 108
- Ausencia
- FERM BP-7787 2,0 x 108 1,9 x 108 4,0 x 107
- Ausencia
- ATCC 15707 3,0 x 107 1,1 x 106 No detectable
Los conteos viables tanto de Bifidobacterium longum FERM BP-7787 como de la cepa de tipo Bifidobacterium longum ATCC 15707 en leche fermentada se aumentaron significativamente mediante el cultivo conjunto con 55 Lactococcus lactis subsp. lactis MCC857. Además, la tasa de supervivencia de cada Bifidobacterium longum
almacenada a 10 °C durante dos semanas fue del 30 % o superior: la de Bifidobacterium longum FERM BP-7787 fue del 71 % y la de la cepa de tipo Bifidobacterium longum ATCC 15707 fue del 31 %.
Por el contrario, la tasa de supervivencia de Bifidobacterium longum FERM BP-7787 almacenada a 10 °C durante
5 dos semanas en ausencia de Lactococcus lactis subsp. lactis MCC857 fue del 20 % y se detectó la cepa de tipo Bifidobacterium longum ATCC 15707 almacenada a 10 °C durante dos semanas después de cultivarla en ausencia de Lactococcus lactis subsp. lactis MCC857.
Se obtuvo el mismo resultado cuendo se usó cada una de Lactococcus lactis subsp. lactis MCC852, 859, 865 y 866 en vez de Lactococcus lactis subsp. lactis MCC857.
Por lo tanto, es evidente que cada una de Lactococcus lactis subsp. lactis MCC852, 857, 859, 865 y 866 tiene tanto propiedades excelentes para promover el crecimiento de cepas de Bifidobacterium longum diferentes a las de Bifidobacterium longum FERM BP-7787, que tiene una supervivencia excelente durante el almacenamiento y
15 propiedades para mejorar la supervivencia de cepas Bifidobacterium longum diferentes a Bifidobacterium longum FERM BP-7787 durante el almacenamiento.
5. Ensayo comparativo con la mezcla de Lactococcus lactis subsp. lactis y Lactococcus lactis subsp. cremoris divulgada en el documento de patente 1.
El cultivo de Lactococcus lactis subsp. lactis MCC857, el cultivo de la cepa de tipo Bifidobacterium longum ATCC 15707 y el cultivo mixto de Streptococcus thermophilus y Lactobacillus bulgaricus se prepararon según el procedimiento descrito en 4(2) anterior.
25 Se preparó el 1 % (v/v) del cultivo de Lactococcus lactis subsp. lactis MCC857, el 1 % (v/v) del cultivo de la cepa de tipo Bifidobacterium longum ATCC 15707, y se inoculó el 0,01 % (v/v) del cultivo mixto de Streptococcus thermophilus y Lactobacillus bulgaricus, preparado del modo anterior, en un medio de leche desnatada reconstituida al 10 % (p/p) esterilizado a 90 °C durante 10 minutos, y se cultivó a 37 °C hasta que el pH alcanzó 4,6 para preparar leche fermentada. La leche fermentada se enfrió rápidamente y se midió el conteo viable de Bifidobacterium longum contenida.
En cambio, se inocularon el 1 % (v/v) del cultivo de la cepa de tipo Bifidobacterium longum ATCC 15707 preparada del modo anterior y el 2 % (v/v) de la mezcla “EZAL MA14” compuesta por Lactococcus lactis subsp. lactis y Lactococcus lactis subsp. cremoris (fabricada por Rhodia) en un medio de leche desnatada reconstituida al 10 %
35 (p/p) esterilizado a 90 °C durante 10 minutos, como control. La mezcla se cultivó a 36 ºC hasta que alcanzó un pH de 4,6 para preparar leche fermentada. El conteo viable de Bifidobacterium longum en la leche fermentada se midió. La mezcla “EZAL MA14” corresponde a un producto ‘EZAL MR014” (fabricado por Rhodia) descrito en el documento de patente 1.
El conteo de Bifidobacterium lonqum en leche fermentada preparada usando Lactococcus lactis subsp. lactis MCC857 fue de 5,5 x 108 UFC/g. En cambio, no se detectó Bifidobacterium longum viable en una solución diluida obtenida diluyendo de leche fermentada preparada usando la mezcla “EZAL MA14” 106 veces y, por lo tanto, el conteo viable de Bifidobacterium longum presente en la leche fermentada se reveló que era 1 x 106 UFC/g o inferior.
45 En otras palabras, se reveló que no se lograron ni efectos promotores del crecimiento de Bifidobacterium longum ni efectos de reducción del tiempo de fermentación, tal como se menciona en el documento de patente 1, cuando se cultivaron conjuntamente Bifidobacterium longum con Lactococcus lactis subsp. lactis y Lactococcus lactis subsp. cremoris.
Tal como se ha descrito anteriormente, las bacterias del género Lactococcus según la presente invención muestran una fuerte fermentabilidad en el medio de leche desnatada reconstituido al 10 % (p/p) a una temperatura adecuada para la fermentación con bifidobacterias. Además, cuando las bacterias del género Lactococcus se cultivan conjuntamente con Bifidobacterium longum, las bacterias del género Lactococcus muestran efectos promotores del crecimiento de Bifidobacterium longum excelentes y efectos de mejora de su supervivencia durante el
55 almacenamiento excelentes, y tienen propiedades que no se consiguen con cepas bacterianas conocidas convencionalmente pertenecientes al género Lactococcus. Además, las bacterias del género Lactococcus pueden producir eficazmente productos fermentados tales como leche fermentada debido a la fermentabilidad extremadamente fuerte de las mismas. Además, se espera que puedan producirse productos fermentados con sabor favorable mediante las bacterias del género Lactococcus, debido a que las bacterias del género Lactococcus no producen ni diacetilo ni acetoína.
En particular, las 5 cepas bacterianas (Lactococcus lactis subsp. lactis MCC852, 857, 859, 865 y 866) pueden formularse con seguridad en diversos alimentos y bebidas tales como productos alimenticios fermentados, debido a que las 5 cepas bacterianas se seleccionaron a partir de bacterias ácido lácticas aisladas a partir de la naturaleza en
65 términos de fermentabilidad y posesión de propiedades promotoras del crecimiento de Bifidobacterium longum y propiedades de mejora de la supervivencia de Bifidobacterium longum durante el almacenamiento favorables.
Las bacterias del género Lactococcus según la presente invención pueden usarse en forma de polvo de bacterias del mismo modo que las bacterias ácido lácticas. Los polvos de bacterias pueden formularse en alimentos o piensos.
5 Las bacterias del género Lactococcus según la presente invención también pueden formularse preferentemente en una composición farmacéutica tal como un agente de control de la función intestinal. En el caso en el que las bacterias del género Lactecoccus según la invención se formulen en un agente de control de la función intestinal, el contenido de las bacterias del género Lactococcus o la dosis diaria de las mismas no están particularmente limitados, siempre que se estime que el contenido o la dosis diaria sea suficiente para mostrar efectos de control de la función intestinal. Es preferente, por ejemplo, que la cantidad ingerida diariamente de las bacterias del género Lactococcus sea de aproximadamente 1x109 UFC.
Aunque un medio de precultivo usado para cultivar Bifidobacterium longum y las bacterias del género Lactococcus previamente no está particularmente limitado siempre que el medio de precultivo se use habitualmente, el medio de
15 precultivo es preferentemente un medio lácteo. El medio de precultivo es más preferentemente un medio de leche desnatada reconstituida, debido a que el medio de leche desnatada reconstituida es fácil de manejar. Es preferente que la concentración del medio de leche desnatada reconstituida sea del 3 % (p/p) o superior, y más preferentemente del 8 % (p/p) o superior. Además, el medio de precultivo puede contener sustancias estimulantes del crecimiento tales como extracto de levadura o agentes reductores tales como L-cisteína. Es particularmente preferente que una sustancia estimulante del crecimiento se formule en un medio precultivado, ya que las bifidobacterias muestran un nivel bajo de proliferación en el medio acuoso. Específicamente, puede usarse un medio de cultivo que contiene del 0,1 al 1 % (p/p) de extracto de levadura. El medio de precultivo se somete a esterilización para su uso. La esterilización puede realizarse según un procedimiento convencional; se realiza específicamente calentando a 80 a 122 °C durante 5 a 40 minutos, preferentemente a 85 a 95 °C durante 5 a 35 minutos.
25 El crecimiento de Bifidobacterium longum y su supervivencia durante el almacenamiento puede mejorarse sencilla y eficazmente según el procedimiento para promover el crecimiento de Bifidobacterium longum y mejorar su supervivencia según la presente invención. Específicamente, las bacterias del género Lactococcus según la presente invención y la Bifidobacterium longum se cultivan conjuntamente según el procedimiento. Aunque la relación de inoculación de Bifidobacterium longum con respecto a las bacterias del género Lactococcus según la presente invención que se van a cultivar conjuntamente como iniciadores en un medio de base no está particularmente limitada, la relación de inoculación es preferentemente de 100:1 a 1:10, y más preferentemente de
10:1 a 1:1. Aunque la cantidad de las mismas que se van a inocular en el medio de base no está particularmente limitada, es preferente que la cantidad total de Bifidobacterium longum y de las bacterias del género Lactococcus
35 inoculada sea del 0,01 al 10 % (v/v), más preferentemente del 0,1 al 5 % (v/v), con respecto a la cantidad del medio de base.
Aunque el medio de base no está particularmente limitado, siempre que el medio de base se use habitualmente para el cultivo conjunto de bifidobacterias con bacterias ácido lácticas, es preferente que el medio de base contenga leche como su componente principal. Según el procedimiento para promover el crecimiento de Bifidobacterium longum y mejorar su supervivencia según la presente invención, la proliferación de Bifidobacterium longum y su supervivencia puede mejorarse incluso en dicho medio de leche que es habitualmente inadecuado para el cultivo de bifidobacterias. El medio de base puede prepararse formulando un edulcorante tal como sacarosa, pectina, fruta, zumo de fruta, agar, gelatina, aceite y grasa, aroma, agente colorante, estabilizante, agente reductor o similares en
45 leche de vaca, leche desnatada, nata fresca, mantequilla, leche entera en polvo, leche desnatada en polvo o similares, según la necesidad, seguido por esterilización, homogeneización, enfriamiento y similares. Es particularmente preferente que el medio de base se use para preparar leche fermentada que contenga Bifidobacterium longum.
A continuación, la presente invención se explicará circunstancialmente indicando algunos ejemplos. No obstante, la presente invención no está limitada a los ejemplos siguientes.
EJEMPLO 1
55 Se inocularon 30 ml de un cultivo de semillas de Lactococcus lactis subsp. lactis MCC852 en 1000 ml de medio de leche desnatada reconstituida al 10 % (p/p) esterilizado a 90 °C durante 30 minutos y después se cultivaron a 25 °C durante 16 horas. Por otro lado, se esterilizaron 1000 ml de medio de leche desnatada al 11 % (p/p) que contenía el 0,2 % (p/p) de extracto de levadura a 90 °C durante 30 minutos, y se inocularon 100 ml de un cultivo de semillas de Bifidobacterium longum FERM BP-7787 en un medio de leche desnatada, seguido por cultivo a 37 °C durante 6 horas.
Aparte de lo anterior, se esterilizaron 50 l de un medio de base preparado mezclando y disolviendo materiales brutos compuesto por leche desnatada en polvo, leche entera en polvo, pectina y sacarosa, conteniendo el medio de base el 0,5 % (p/p) de grasa butírica, el 8,0 % (p/p) de componente sólido de leche no graso, el 5,0 % (p/p) de sacarosa y 65 el 0,2 % (p/p) de pectina, a 90 °C durante 10 minutos, seguido por enfriamiento a 40 °C. Se inocularon 50 ml del cultivo obtenido anteriormente de Lactococcus lactis subsp. lactis MCC852 precultivado y 500 ml del cultivo obtenido
anteriormente de Bifidobacterium longum FERM BP-7787 precultivado en el medio de base esterilizado, seguido por cultivo a 37 °C durante 16 horas para obtener leche fermentada. La leche fermentada se enfrió inmediatamente con agitación y la leche fermentada enfriada se homogeneizó a una presión de 15 MPa, después se dispuso el producto resultante en un recipiente de vidrio que tenía una capacidad de 200 ml y después se selló el recipiente para obtener
5 la bebida de yogur. La bebida de yogur obtenida tenía un pH de 4,64 y contenía 6,8 x 108 UFC/g de Bifidobacterium longum. Cuando la bebida de yogur se almacenó a 10 °C durante 14 días, el conteo viable de Bifidobacterium longum fue de 5,8 x 108 UFC/g y su tasa de supervivencia fue del 85 %.
EJEMPLO 2
Se obtuvo bebida de yogur del mismo modo que en el ejemplo 1, excepto en que se usó Lactococcus lactis subsp. lactis MCC857 en vez de Lactococcus lactis subsp. lactis MCC852. La bebida de yogur obtenida tenía un pH de 4,62 y contenía 8,5 x 108 UFC/g de Bifidobacterium longum. Cuando la bebida de yogur se almacenó a 10 °C durante 14 días, el conteo viable de Bifidobacterium longum fue de 7,6 x 108 UFC/g y su tasa de supervivencia fue del 89 %.
Se obtuvo bebida de yogur del mismo modo que en el ejemplo 1, excepto en que se usó Lactococcus lactis subsp. lactis MCC859 en vez de Lactococcus lactis subsp. lactis MCC852. La bebida de yogur obtenida tenía un pH de 4,56 y contenía 7,2 x 108 UFC/g de Bifidobacterium longum. Cuando la bebida de yogur se almacenó a 10 °C durante 14 días, el conteo viable de Bifidobacterium longum fue de 5,8 x 108 UFC/g y su tasa de supervivencia fue del 81 %.
EJEMPLO 4
25 Se obtuvo bebida de yogur del mismo modo que en el ejemplo 1, excepto en que se usó Lactococcus lactis subsp. lactis MCC865 en vez de Lactococcus lactis subsp. lactis MCC852. La bebida de yogur obtenida tenía un pH de 4,54 y contenía 6,9 x 108 UFC/g de Bifidobacterium longum. Cuando la bebida de yogur se almacenó a 10 °C durante 14 días, el conteo viable de Bifidobacterium longum fue de 6,6 x 108 UFC/g y su tasa de supervivencia fue del 96 %.
EJEMPLO 5
Se obtuvo bebida de yogur del mismo modo que en el ejemplo 1, excepto en que se usó Lactococcus lactis subsp. lactis MCC866 en vez de Lactococcus lactis subsp. lactis MCC852. La bebida de yogur obtenida tenía un pH de 4,55 y contenía 6,5 x 108 UFC/g de Bifidobacterium longum. Cuando la bebida de yogur se almacenó a 10 °C durante 14
35 días, el conteo viable de Bifidobacterium longum fue de 6,2 x 108 UFC/g y su tasa de supervivencia fue del 95 %.
EJEMPLO 6
500 ml de un cultivo de semillas de Lactococcus lactis subsp. lactis MCC852 cultivado a 37 °C durante 16 horas en un medio de cultivo compuesto por 50 g de extracto de carne, 100 g de extracto de levadura, 100 g de peptona, 200 g de lactosa, 50 g de K2HPO4, 10 g de KH2PO4, 4 g de cistina y 9,5 l de agua, se inoculó en 10 l de un medio de cultivo que tenía la misma composición que el medio de cultivo mencionado anteriormente y después se cultivó a 37 °C durante 16 horas. Además, todo el líquido de cultivo obtenido de este modo (10,5 l) se inoculó en 200 l de un medio de cultivo esterilizado a 90 °C durante 30 minutos que tenía la misma composición que el medio de cultivo
45 mencionado anteriormente y después se cultivó a 37 °C durante 16 horas. El conteo viable después del cultivo fue de 3,0 109 UFC/ml.
Después, las células bacterianas se recogieron por centrifugación (15.000 rpm) usando un dispositivo de centrifugación de tipo romo (fabricado por TOMY SEIKO CO., LTD., con la denominación comercial RD-20IV), y se suspendieron de nuevo en solución salina fisiológica (esterilizada a 90 °C durante 30 minutos) en la misma cantidad que el medio de cultivo, seguido por centrifugación tal como se ha descrito anteriormente para recoger las células bacterianas de nuevo. Las células bacterianas recogidas se suspendieron en 20 l de una solución (esterilizada a 90 °C durante 30 minutos) que contenía el 10 % (p/p) de leche desnatada, el 1 % (p/p) de sacarosa y el 1 % (p/p) de glutamato monosódico, y se liofilizaron según un procedimiento convencional para obtener aproximadamente 2,2 kg
55 de polvo que contenía 8,6 x 1010 UFC/g de Lactococcus lactis subsp. lactis MCC852.
EJEMPLO 7
Se obtuvieron aproximadamente 2,2 kg de polvo que contenía 9,2 x 1010 UFC/g de Lactococcus lactis subsp. lactis MCC857 del mismo modo que en el EJEMPLO 6 excepto en que se usó Lactococcus lactis subsp. lactis MCC857 en vez de Lactococcus lactis subsp. lactis MCC852.
EJEMPLO 8
65 Se obtuvieron aproximadamente 2,2 kg de polvo que contenía 8,5 x 1010 UFC/g de Lactococcus lactis subsp. lactis MCC859 del mismo modo que en el EJEMPLO 6 excepto en que se usó Lactococcus lactis subsp. lactis MCC859 en
vez de Lactococcus lactis subsp. lactis MCC852.
EJEMPLO 9
5 Se obtuvieron aproximadamente 2,2 kg de polvo que contenía 9,4 x 1010 UFC/g de Lactococcus lactis subsp. lactis MCC865 del mismo modo que en el EJEMPLO 6 excepto en que se usó Lactococcus lactis subsp. lactis MCC865 en vez de Lactococcus lactis subsp. lactis MCC852.
EJEMPLO 10
Se obtuvieron aproximadamente 2,2 kg de polvo que contenía 8,8 x 1010 UFC/g de Lactococcus lactis subsp. lactis MCC866 del mismo modo que en el EJEMPLO 6 excepto en que se usó Lactococcus lactis subsp. lactis MCC866 en vez de Lactococcus lactis subsp. lactis MCC852.
Se obtuvieron aproximadamente 20 kg de un agente de control de la función intestinal que contenía polvo bacteriano de Lactococcus lactis subsp lactis MCC852 mezclando uniformemente 20 g de polvo bacteriano que contenía Lactococcus lactis subsp. lactis MCC852, siendo el polvo bacteriano el preparado en el EJEMPLO 6, con 14 kg de almidón esterilizado en seco y 6 kg de lactosa.
EJEMPLO 12
Se obtuvieron aproximadamente 20 kg de un agente de control de la función intestinal que contenía polvo bacteriano
25 de Lactococcus lactis subsp. lactis MCC857 mezclando uniformemente 20 g de polvo bacteriano que contenía Lactococcus lactis subsp. lactis MCC857, siendo el polvo bacteriano el preparado en el EJEMPLO 7, con 14 kg de almidón esterilizado en seco y 6 kg de lactosa.
EJEMPLO 13
Se obtuvieron aproximadamente 20 kg de un agente de control de la función intestinal que contenía polvo bacteriano de Lactococcus lactis subsp. lactis MCC859 mezclando uniformemente 20 g de polvo bacteriano que contenía Lactococcus lactis subsp. lactis MCC859, siendo el polvo bacteriano el preparado en el EJEMPLO 8, con 14 kg de almidón esterilizado en seco y 6 kg de lactosa.
35 EJEMPLO 14
Se obtuvieron aproximadamente 20 kg de un agente de control de la función intestinal que contenía polvo bacteriano de Lactococcus lactis subsp. lactis MCC865 mezclando uniformemente 20 g de polvo bacteriano que contenía Lactococcus lactis subsp. lactis MCC865, siendo el polvo bacteriano el preparado en el EJEMPLO 9, con 14 kg de almidón esterilizado en seco y 6 kg de lactosa.
EJEMPLO 15
45 Se obtuvieron aproximadamente 20 kg de un agente de control de la función intestinal que contenía polvo bacteriano de Lactococcus lactis subsp. lactis MCC866 mezclando uniformemente 20 g de polvo bacteriano que contenía Lactococcus lactis subsp. lactis MCC866, siendo el polvo bacteriano el preparado en el EJEMPLO 10, con 14 kg de almidón esterilizado en seco y 6 kg de lactosa.
EJEMPLO 16
Se inocularon 30 ml de un cultivo de semillas de Lactococcus lactis subsp. lactis MCC852 en 1000 ml de medio de leche desnatada reconstituida al 10 % (p/p) esterilizado a 90 °C durante 30 minutos y después se cultivaron a 25 °C durante 16 horas.
55 Aparte de lo anterior, se calentaron 50 l de leche bruta compuesta por el 3,0 % (p/p) de grasa butírica y el 9,5 % (p/p) de componente sólido de leche no graso a 70 ºC, se homogeneizaron a una presión de 15 MPa, se esterilizaron a 90 °C durante 10 minutos y después se enfriaron a 40 °C. Después se inocularon 500 ml de cultivo de Lactococcus lactis subsp. lactis MCC852 precultivado tal como se ha descrito anteriormente en medio de base esterilizado y después se dispusieron en un recipiente de resina que tenía 500 ml de capacidad; el recipiente se selló. El cultivo se cultivó a 37 °C durante 16 horas y después se enfrió inmediatamente. La leche fermentada obtenida de este modo tenía un pH de 4,70 y contenía 1,3 x 109 UFC/g de bacterias ácido lácticas.
EJEMPLO 17
65 Se obtuvo leche fermentada del mismo modo que en el Ejemplo 16, excepto en que se usó Lactococcus lactis subsp. lactis MCC857 en vez de Lactococcus lactis subsp. lactis MCC852. La leche fermentada obtenida tenía un pH de 4,69 y contenía 1,5 x 109 UFC/g de bacterias ácido lácticas.
EJEMPLO 18
5 Se obtuvo leche fermentada del mismo modo que en el Ejemplo 16, excepto en que se usó Lactococcus lactis subsp. lactis MCC859 en vez de Lactococcus lactis subsp. lactis MCC852. La leche fermentada obtenida tenía un pH de 4,65 y contenía 1,4 x 109 UFC/g de bacterias ácido lácticas.
EJEMPLO 19
Se obtuvo leche fermentada del mismo modo que en el Ejemplo 16, excepto en que se usó Lactococcus lactis subsp. lactis MCC865 en vez de Lactococcus lactis subsp. lactis MCC852. La leche fermentada obtenida tenía un pH de 4,64 y contenía 1,5 x 109 UFC/g de bacterias ácido lácticas.
Se obtuvo leche fermentada del mismo modo que en el Ejemplo 16, excepto en que se usó Lactococcus lactis subsp. lactis MCC866 en vez de Lactococcus lactis subsp. lactis MCC852. La leche fermentada obtenida de este modo tenía un pH de 4,62 y contenía 1,3 x 109 UFC/g de bacterias ácido lácticas.
EJEMPLO 21
Se inocularon 30 ml de un cultivo de semillas de Lactococcus lactis subsp. lactis MCC852 en 1000 ml de medio de
25 leche desnatada reconstituida al 10 % (p/p) esterilizado a 90 °C durante 30 minutos y después se cultivaron a 25 °C durante 16 horas. Aparte de lo anterior, se inocularon 50 ml de un cultivo mixto de Streptococcus thermophilus (fabricado por HANSEN) y Lactobacillus bulgaricus (fabricado por HANSEN) en 1500 ml de un medio de leche desnatada reconstituida al 10 % (p/p) esterilizado a 90 °C durante 30 minutos y después se cultivaron a 37 °C durante 5 horas.
Aparte de lo anterior, se calentaron 50 l de leche bruta compuesta por el 3,0 % (p/p) de grasa butírica y el 9,0 % (p/p) de componente sólido de leche no graso a 70 ºC, se homogeneizaron a una presión de 15 MPa, se esterilizaron a 90 °C durante 10 minutos y después se enfriaron a 40 °C. Se inocularon 500 ml del cultivo de Lactococcus lactis subsp. lactis MCC852 precultivado tal como se ha descrito anteriormente en 50 ml de un cultivo
35 mixto de Streptococcus therrnophilus y Lactobacillus bulgaricus al medio de base esterilizado y después se dispusieron en un recipiente de resina que tenía 500 ml de capacidad. Después, el recipiente se selló, las bacterias se cultivaron a 37 °C durante 7 horas y después se enfriaron inmediatamente. La leche fermentada obtenida de este modo tenía un pH de 4,75 y contenía 9,8 x 108 UFC/g de bacterias ácido lácticas.
EJEMPLO 22
Se obtuvo leche fermentada del mismo modo que en el EJEMPLO 21, excepto en que se usó Lactococcus lactis subsp. lactis MCC857 en vez de Lactococcus lactis subsp. lactis MCC852. La leche fermentada obtenida tenía un pH de 4,74 y contenía 1,2 x 109 UFC/g de bacterias ácido lácticas.
Se obtuvo leche fermentada del mismo modo que en el EJEMPLO 16, excepto en que se usó Lactococcus lactis subsp. lactis MCC859 en vez de Lactococcus lactis subsp. lactis MCC852. La leche fermentada obtenida tenía un pH de 4,70 y contenía 1,6 x 109 UFC/g de bacterias ácido lácticas.
EJEMPLO 24
Se obtuvo leche fermentada del mismo modo que en el EJEMPLO 16, excepto en que se usó Lactococcus lactis
55 subsp. lactis MCC865 en vez de Lactococcus lactis subsp. lactis MCC852. La leche fermentada obtenida tenía un pH de 4,72 y contenía 1,7 x 109 UFC/g de bacterias ácido lácticas.
EJEMPLO 25
Se obtuvo leche fermentada del mismo modo que en el EJEMPLO 16, excepto en que se usó Lactococcus lactis subsp. lactis MCC866 en vez de Lactococcus lactis subsp. lactis MCC852. La leche fermentada obtenida tenía un pH de 4,70 y contenía 1,5 x 109 UFC/g de bacterias ácido lácticas.
Aplicabilidad industrial
65 Las bacterias del género Lactococcus según la presente invención permiten a Bifidobacterium longum en un producto de leche fermentada, tal como yogur, bebida de yogur, bebida de leche ácida o similares, mantener un nivel alto de conteo viable y de tasa de supervivencia durante el almacenamiento y, por lo tanto, las bacterias del género Lactococcus son útiles en términos de control de la salud y la producción de leche fermentada, y pueden aplicarse en el sector de la fabricación de productos de leche fermentada.
Claims (8)
- REIVINDICACIONES1. Bacterias del género Lactococcus que tienen propiedades bacteriológicas de:5 (1) fermentabilidad que cuaja un medio de leche desnatada reconstituida al 10 % (p/p) cuando se cultiva a una temperatura de 25 °C a 37 °C durante 16 horas;(2) propiedades que promueven el crecimiento de Bifidobacterium longum que conducen a un conteo viable deBifidobacterium longum de 5 x 108 UFC/g o superior, cuando se cultiva conjuntamente con Bifidobacterium longum 10 en el medio de leche desnatada reconstituida al 10 % (p/p) hasta un pH del mismo de 4,4 a 4,6; y(3) propiedades que mejoran la superviviencia de Bifidobacterium longum durante el almacenamiento que conducen a una tasa de supervivencia de Bifidobacterium longum del 30 % o superior después de cultivo conjunto con Bifidobacterium longum en el medio de leche desnatada reconstituida al 10 % (p/p) hasta un pH del mismo de 4,4 a15 4,6, enfriamiento rápido y almacenamiento de dos semanas a 10 ºC,seleccionándose dichas bacterias del género Lactococcus del grupo que consiste en Lactococcus lactis subsp. lactis MCC852 (FERM BP-10742), Lactococcus lactis subsp. lactis MCC857 (FERM BP-10757), Lactococcus lactis subsp. lactis MCC859 (FERM BP-10744), Lactococcus lactis subsp. lactis MCC865 (FERM BP-10745) y Lactococcus lactis20 subsp. lactis MCC866 (FERM BP-10746).
- 2. Las bacterias del género Lactococcus según la reivindicación 1, seleccionándose al menos una cepa bacteriana de Bifidobacterium longum del grupo que consiste en Bifidobacterium longum FERM BP-7787 y la cepa de tipo Bifidobacterium longum ATCC 15707.25 3 Las bacterias del género Lactococcus según la reivindicación 1 o 2., siendo las bacterias Lactococcus lactis subsp. lactis MCC852 (FERM BP-10742).
- 4. Las bacterias del género Lactococcus según la reivindicación 1 o 2., siendo las bacterias Lactococcus lactis 30 subsp. lactis MCC857 (FERM BP-10757).
- 5. Las bacterias del género Lactococcus según la reivindicación 1 o 2., siendo las bacterias Lactococcus lactis subsp. lactis MCC859 (FERM BP-10744).35 6. Las bacterias del género Lactococcus según la reivindicación 1 o 2., siendo las bacterias Lactococcus lactis subsp. lactis MCC865 (FERM BP-10745).
- 7. Las bacterias del género Lactococcus según la reivindicación 1 o 2., siendo las bacterias Lactococcus lactissubsp. lactis MCC866 (FERM BP-10746). 40
- 8. Polvo de bacterias que comprenden las bacterias del género Lactococcus de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
- 9. Una composición farmacéutica que comprende las bacterias del género Lactococcus de una cualquiera de las 45 reivindicaciones 1 a 7.
- 10. Un agente de control de la función intestinal que comprende las bacterias de los géneros Lactococcus de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.50 11. Un procedimiento para promover el crecimiento de Bifidobacterium longum y mejorar su supervivencia que comprende usar las bacterias del género Lactococcus de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
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