JP6966275B2 - 乳酸菌の生残性向上方法 - Google Patents

Description

本発明は、乳酸菌の生残性向上方法に関する。詳細には、２０℃〜５０℃の発酵乳ミックス中で乳酸菌を保持する、乳酸菌の生残性向上方法、及び発酵乳の製造方法に関する。

近年、プロバイオティクス機能を有する菌株に注目が集められており、これらの菌の摂取による消化管内の改善・健常化とそれに伴う免疫調整作用による予防医学が盛んになってきている。その中でも特に乳酸菌はプロバイオティクス菌とも称され、古来より様々な飲食品として摂取されている。最近では、さらに以前よりもその機能開発が盛んになり、新規な機能性を盛り込んだ商品としての開発も進んでいる。

このようなプロバイオティクス菌である乳酸菌は、しばしば各種の食品の形態で経口的に摂取される。発酵食品であるヨーグルト等の発酵乳は、経口摂取前において、すでに低ｐＨ環境となっており、このような環境は多くの場合、乳酸菌の生残に適さないことが知られている。発酵乳中での乳酸菌の生残性が向上すると、プロバイオティクスの機能に伴う効果が高まることが期待でき、これは、予防医学の観点からも重要である。

これまでに、食品中で乳酸菌の生残性を向上させる方法がいくつか提案されている。
非特許文献１には、システイン、ホエイ粉末、ＷＰＣ、カゼイン水和物、又はトリプトンを添加することで、ビフィズス菌やアシドフィラス菌を含むヨーグルトで、保存中における菌数維持が改善されたことが報告されている。
また、非特許文献２には、活性酸素除去剤としてのアスコルビン酸を添加することで、プロバイオティクス菌であるアシドフィラス菌の菌数消長が改善されたことが報告されている。

また、特許文献１にはラクトバシルス・ガセリを含む飲食品の製造方法であって、飲食品のｐＨや糖濃度を特定の範囲とし、ラクトバシルス・ガセリと特定の乳酸菌を混合する工程を含む前記製造方法が開示されている。

国際公開第２０１３／０８５００９号

Ｒ．Ｉ．デイブ等（Ｒ．Ｉ．Ｄａｖｅ ａｎｄ Ｎ．Ｐ．Ｓｈａｈ），"Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ Ｙｏｇｕｒｔ"，Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ ８１，２８０４−２８１６（１９９８） Ｒ．Ｉ．デイブ等（Ｒａｊｉｖ Ｉ．Ｄａｖｅ ａｎｄ Ｎｅｇｅｎｄｒａ Ｐ．Ｓｈａｈ），"Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ Ａｓｃｏｒｂｉｃ Ａｃｉｄ ａｓ ａｎ Ｏｘｙｇｅｎ Ｓｃａｖｅｎｇｅｒ ｉｎ Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ Ｙｏｇｈｕｒｔｓ Ｍａｄｅ ｗｉｔｈ Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ Ｓｔａｒｔｅｒ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ"，Ｉｎｔ．Ｄａｉｒｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ７，４３５−４４３（１９９７）

前記非特許文献１及び非特許文献２においては乳タンパク質や活性酸素除去剤などを添加することで乳酸菌の生残性の改良を試みたものである。しかしながら、これらの物質は飲食品の風味や物性への影響が大きく、その使用には限界があった。また、抗酸化剤である活性酸素除去剤では自己酸化によりその効果を発揮することから、所定量の活性酸素除去剤ではその効果の持続性が期待できない。また、乳又は乳素材を用いる場合には、特定の処理が必要となり、その調整に手間がかかり、ひいてはコストアップにもつながる。また、前記特許文献１においても、飲食品のｐＨや糖濃度を特定の範囲とする必要があり、その調整に手間がかるものであった。

そこで本発明は、特別な添加剤を用いることなく、かつ飲食品における各種条件を制限することなく、簡易に発酵乳中の乳酸菌の生残性を向上させることを目的とする。

本発明者らは、発酵乳を製造する際、乳酸菌を発酵乳ミックスに添加後に、発酵乳ミックスを特定温度範囲に調整し、その中で乳酸菌を保持することにより、当該乳酸菌を含有する発酵乳ミックスを発酵処理して製造される発酵乳において、当該乳酸菌の生残性を向上させることができた。本発明は、これら知見に基づくものである。

したがって、本発明は以下に示すとおりである。
１．２０℃〜５０℃の発酵乳ミックス中で乳酸菌を保持する、乳酸菌の生残性向上方法。
２．前記乳酸菌を発酵乳ミックス中で保持後、前記発酵乳ミックスを０℃〜１０℃に冷却する、前記１に記載の乳酸菌の生残性向上方法。
３．前記乳酸菌が、ラクトバシルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）である、前記１または２に記載の乳酸菌の生残性向上方法。
４．前記乳酸菌が、ラクトバシルス・ガセリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）である、前記１または２に記載の乳酸菌の生残性向上方法。
５．前記乳酸菌が、ラクトバシルス・ガセリＯＬＬ２７１６（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ ＯＬＬ２７１６：ＦＥＲＭ ＢＰ−６９９９）である、前記１または２に記載の乳酸菌の生残性向上方法。
６．（１）乳原料を用いて発酵乳ミックスを調製する工程
（２）前記発酵乳ミックスに乳酸菌を添加し、２０℃〜５０℃の発酵乳ミックス中で前記乳酸菌を保持する、保持工程
（３）前記乳酸菌を含有する発酵乳ミックスにスターターを添加して発酵させる、発酵工程
を有する、発酵乳の製造方法。
７．前記保持工程と発酵工程の間に、乳酸菌を含有する発酵乳ミックスを０℃〜１０℃に冷却する冷却工程を含む、前記６に記載の発酵乳の製造方法。

本発明によれば、乳酸菌を含有する発酵乳ミックスを発酵処理して製造される発酵乳において、当該乳酸菌の生残性を向上できる。従って、長期保存後にも高いプロバイオティクス機能を付与しうる発酵乳を提供することができる。

以下、本発明の実施形態について詳細に説明するが、本発明は以下の実施形態に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。

［乳酸菌の生残性向上方法］
本発明は、２０℃〜５０℃の発酵乳ミックス中で乳酸菌を保持する、乳酸菌の生残性向上方法に関する。乳酸菌を２０℃〜５０℃の発酵乳ミックス中で保持することにより、当該発酵乳ミックスを発酵して得られる発酵乳中の乳酸菌の生残性を向上できる。

〈乳酸菌〉
本発明における乳酸菌は、資化した乳糖に対し、乳酸の産生量が５０％以上となるものをいう。その種類は特に制限されるものではないが、プロバイオティクス乳酸菌であることが好ましい。ここで、プロバイオティクス乳酸菌とは、消化管内の細菌叢を改善するなど、宿主に有益な作用をもたらしうる有用な乳酸菌を意味する。
本発明における乳酸菌は、単独あるいは２種以上が組み合わされている場合であってもよい。
本発明において好ましい乳酸菌は、例えば、ラクトバシルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する微生物が例示できる。

ラクトバシルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）としては、例えば、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属の乳酸菌であり、より具体的な例を挙げれば、ラクトバシルス・ガセリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバシルス・アミロボラス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）、ラクトバシルス・ブルガリカス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバシルス・ラクチス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバシルス・ムコサエ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｃｏｓａｅ）、ラクトバシルス・サリバリウス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバシルス・アシドフィルス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバシルス・カウカシクス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｕｃａｓｉｃｕｓ）、ラクトバシルス・サーモフィルス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバシルス・ファーメンタム菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバシルス・クリスパータス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバシルス・ブレビス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバシルス・カゼイ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバシルス・ジェンセニ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、ラクトバシルス・オリス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｏｒｉｓ）、ラクトバシルス・プランタルム菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバシルス・ロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバシルス・ラムノサス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバシルス・ルミニス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｕｍｉｎｉｓ）、ラクトバシルス・ペントーサス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ）等を挙げられる。このうち、好ましい例として、ラクトバシルス・ガセリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）が挙げられる。

ラクトバシルス・ガセリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）としては、例えば、ラクトバシルス・ガセリＯＬＬ２７１６（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ ＯＬＬ２７１６：ＦＥＲＭ ＢＰ−６９９９）株が好適に用いられる。

ラクトバシルス・ガセリＯＬＬ２７１６（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ ＯＬＬ２７１６：ＦＥＲＭ ＢＰ−６９９９）株の寄託に関する情報は以下の通りである。

ラクトバシルス・ガセリＯＬＬ２７１６（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ ＯＬＬ２７１６：ＦＥＲＭ ＢＰ−６９９９）株
（１）寄託機関名：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
（現寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター）
（２）連絡先：〒３０５−８５６６ 茨城県つくば市東１丁目１番３号
電話番号０２９−８６１−６０２９
（現連絡先：〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２０号室
電話番号０４３８−２０−５９１０）
（３）受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６９９９
（４）識別のための表示：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ ＯＬＬ２７１６
（５）原寄託日：平成１１年５月２４日
（６）ブタペスト条約に基づく寄託への移管日：平成１２年１月１４日

また、本発明で用いる乳酸菌は、凍結した乳酸菌を用いてもよいし、凍結していない乳酸菌を用いてもよい。凍結した乳酸菌を用いる場合は、凍結乳酸菌を発酵乳ミックス中に添加し、発酵乳ミックス中で当該乳酸菌を解凍しながら保持してもよいし、凍結した乳酸菌をあらかじめ解凍してから、解凍した乳酸菌を発酵乳ミックス中に添加し、発酵乳ミックス中で当該乳酸菌を保持してもよい。

本発明における乳酸菌は、乳酸菌を培養して得られた乳酸菌培養物であってよい。乳酸菌を培養する培地は、従来公知の乳酸菌を培養するための培地が挙げられ、培地の種類は特に制限されない。すなわち主炭素源のほか窒素源、無機物その他の栄養素を程良く含有する培地ならばいずれの培地も使用可能である。炭素源としては、例えばラクトース、グルコース、スクロース、フルクトース、澱粉加水分解物、及び廃糖蜜などが使用菌の資化性に応じて使用できる。窒素源としては、例えばカゼインの加水分解物、ホエイタンパク質加水分解物、及び大豆タンパク質加水分解物等の有機窒素含有物が使用できる。ほかに増殖促進剤としては、例えば肉エキス、魚肉エキス、及び酵母エキス等が用いられる。

培養は嫌気条件下で行うことが望ましいが、通常用いられる液体静置培養などによる微好気条件下でもよい。嫌気培養には窒素ガス気層下で培養する方法などの公知の手法を適用することができるが、他の方法でもよい。培養温度は一般に３０℃〜４０℃が好ましいが、菌が生育する温度であれば他の温度条件でもよい。培養中の培地のｐＨは６．０〜７．０に維持することが好ましいが、菌が生育するｐＨであれば他のｐＨ条件でもよい。また、バッチ培養条件下で培養することもできる。培養時間は通常１０時間〜２４時間が好ましいが、菌が生育することができる時間であれば、他の培養時間であってもよい。

〈発酵乳ミックス〉
本発明における発酵乳ミックスは、ヨーグルトなどの発酵乳の原料となるもので、乳原料等を用いて調製される。本発明では、公知の発酵乳ミックスを適宜用いることができる。
乳原料は、例えば、生乳（未殺菌乳）、殺菌処理した乳（殺菌乳）、脱脂乳、全脂濃縮乳、脱脂濃縮乳、全脂粉乳、脱脂粉乳、バター（無塩バター）、バターミルク、クリーム、ホエー蛋白質濃縮物（ＷＰＣ）、ホエー蛋白質単離物（ＷＰＩ）、α−ラクトアルブミン（α−Ｌａ）、及びβ−ラクトグロブリン（β−Ｌｇ）などから、実際に製造する発酵乳の種類に応じて、適宜選択することができる。これらは２種以上を組み合わせて用いることができ、例えば、ヨーグルトの場合、エネルギーを低く抑えた状態で、無脂乳固形分を８％以上にするために、生乳及び／又は殺菌処理した乳（殺菌乳）に脱脂乳及び／又は脱脂粉乳を組み合わせることもできる。このとき、乳原料として、風味の良好さなどの観点から、生乳（未殺菌乳）及びその加工物を用いることが好ましい。

発酵乳ミックスは、発酵乳の原料を混合した原料調製物であり、前記の乳原料に、必要に応じて、水、砂糖を始めとする糖類や甘味料などの甘味付与剤、及び香料などを添加（配合）し、必要に応じて、加温しながら溶解して調製される。また、必要に応じて、ゼラチン、寒天、カラギーナン、グアガム、低メトキシペクチン及び高メトキシペクチンなどの安定化剤（ゲル化剤）を添加することもできる。発酵乳ミックスには、殺菌前のものも、殺菌後のものも含まれる。

本発明において、発酵乳ミックスの温度は２０℃〜５０℃の範囲内とする。発酵乳ミックスの温度は２０℃〜５０℃の範囲内であれば、温度が一定であってもよいし、温度が一定ではなく変動しても構わない。２０℃〜５０℃の範囲内で発酵乳ミックスの温度が一定であるとは、発酵乳ミックスが前記温度範囲内のある一定の温度（例えば、２５℃）のまま保持し続けることを指すが、±０．５℃の誤差を含んでもよいものとする。例えば、ある一定温度を２５℃に設定する場合は、２４．５℃〜２５．５℃の範囲をいう。

乳酸菌を発酵乳ミックス中で保持する際の発酵乳ミックスの温度は、好ましくは２５℃以上であり、より好ましくは３０℃以上である。また、好ましくは４５℃以下であり、より好ましくは４０℃以下である。

発酵乳ミックス中で乳酸菌を保持する時間は、特に制限されるものではなく、乳酸菌の菌数や、乳酸菌培養物の体積等に応じて、適宜調整すればよい。また、凍結乳酸菌を用いる場合は、発酵乳ミックス中で乳酸菌が解凍できる時間であればよい。発酵乳ミックス中で乳酸菌を保持する時間は、例えば０．５時間以上、好ましくは０．８時間以上、より好ましくは１時間以上、さらに好ましくは２時間以上、さらに好ましくは３時間以上、特に好ましくは４時間以上である。また、例えば１０時間以下、好ましくは８時間以下、より好ましくは６時間以下である。

発酵乳ミックスに添加する乳酸菌の量は、発酵乳ミックスあたり、０．０１質量％〜０．１０質量％であることが好ましく、０．０１５質量％〜０．０７質量％であることがより好ましく、０．０２質量％〜０．０４質量％であることがさらに好ましい。

発酵乳ミックスに添加する乳酸菌の菌数は、例えば、３×１０^７ｃｆｕ／ｇ以上、好ましくは５×１０^７ｃｆｕ／ｇ以上、より好ましくは１０×１０^７ｃｆｕ／ｇ以上であることが好ましい。生菌数は常法に従い調整できる。

さらに、本発明においては、２０℃〜５０℃の発酵乳ミックス中で乳酸菌を保持後、前記発酵乳ミックスを０℃〜１０℃に冷却する工程を設けることが好ましい。２℃〜８℃に冷却することがより好ましく、４℃〜６℃に冷却することがさらに好ましい。２０℃〜５０℃の発酵乳ミックス中で乳酸菌を保持後、前記発酵乳ミックスを前記範囲にまで冷却することによって、当該発酵乳ミックスを発酵して得られる発酵乳中の乳酸菌の生残性の低下を抑制できる。

また前記発酵乳ミックスを冷却する時間は、特に制限されず、例えば１２時間〜３６時間、好ましくは１８時間〜３０時間である。

［発酵乳の製造方法］
本発明は、また、
（１）乳原料を用いて発酵乳ミックスを調製する工程
（２）前記発酵乳ミックスに乳酸菌を添加し、２０℃〜５０℃の発酵乳ミックス中で前記乳酸菌を保持する、保持工程
（３）前記乳酸菌を含有する発酵乳ミックスにスターターを添加して発酵させる、発酵工程
を有する、発酵乳の製造方法を提供する。前記工程を経て発酵乳を製造することにより、得られる発酵乳中の乳酸菌の生残性を向上できる。

「発酵乳」とは、ヨーグルト、乳等省令で定義される「発酵乳」、「乳製品乳酸菌飲料」、「乳酸菌飲料」の何れであってもよい。いずれも、発酵乳ミックスを発酵させることで製造される。ヨーグルトとしては、具体的には、セットタイプヨーグルト（固形状発酵乳）、ソフトヨーグルト（糊状発酵乳）又はドリンクヨーグルト（液状発酵乳）などのヨーグルトがあげられる。セットタイプヨーグルトには、プレーンヨーグルトなどが挙げられる。一般に、プレーンヨーグルトは、容器に原料を充填させ、その後に発酵させること（後発酵）により製造される。一方、ソフトヨーグルトやドリンクヨーグルトは、発酵させた発酵乳を微粒化処理や均質化処理した後に、容器に充填させること（前発酵）により製造される。本発明においては、前記のいずれの製造方法にも用いることができる。

以下、本発明の製造工程（１）〜（３）を順に説明する。

（１）乳原料を用いて発酵乳ミックスを調製する工程
本工程で使用する「乳原料」は、前述したとおりであり、発酵乳の原料として使用される乳製品を意味し、例えば、生乳（未殺菌乳）、殺菌処理した乳（殺菌乳）、脱脂乳、全脂濃縮乳、脱脂濃縮乳、全脂粉乳、脱脂粉乳、バター（無塩バター）、バターミルク、クリーム、ホエー蛋白質濃縮物（ＷＰＣ）、ホエー蛋白質単離物（ＷＰＩ）、α−ラクトアルブミン（α−Ｌａ）、及びβ−ラクトグロブリン（β−Ｌｇ）などから、実際に製造する発酵乳の種類に応じて、適宜選択することができる。これらは２種以上を組み合わせて用いることができ、例えば、ヨーグルトの場合、エネルギーを低く抑えた状態で、無脂乳固形分を８％以上にするために、生乳及び／又は殺菌処理した乳（殺菌乳）に脱脂乳及び／又は脱脂粉乳を組み合わせることもできる。このとき、乳原料として、風味の良好さなどの観点から、生乳（未殺菌乳）及びその加工物を用いることが好ましい。

「発酵乳ミックス」は、発酵乳の原料を混合した原料調製物であり、前記の乳原料に、必要に応じて、水、砂糖を始めとする糖類や甘味料などの甘味付与剤、及び香料などを添加（配合）し、必要に応じて、加温しながら溶解して調製される。また、必要に応じて、ゼラチン、寒天、カラギーナン、グアガム、低メトキシペクチン及び高メトキシペクチンなどの安定化剤（ゲル化剤）を添加することもできる。

発酵乳ミックスに添加する各原料の割合は、発酵乳の種類に応じて定められている無脂乳固形分の割合（ヨーグルト：８％以上、乳製品乳酸菌飲料：８％未満、乳酸菌飲料：３％未満）を満たしていればよく、その限りにおいて、特に制限されるものではない。ただし、例えばヨーグルトの場合、発酵乳ミックス１００質量％中、脂肪分が通常０質量％〜８質量％、好ましくは０．１質量％〜６質量％、より好ましくは０．５質量％〜４質量％となる範囲で、また、無脂乳固形分が通常５質量％〜２５質量％、好ましくは６質量％〜２０質量％、より好ましくは７質量％〜１５質量％となる範囲で、前記乳原料を適宜組み合わせて用いることができる。なお、発酵乳ミックスを発酵させたものが、本発明の対象とする発酵乳であるため、前記の「発酵乳ミックス１００質量％中」とは「発酵乳１００質量％中」と言い換えることができる。

乳原料は、脂肪分や無脂乳固形分が前記の範囲になるように、適宜組み合わせることができるが、例えば、乳原料として生乳（及び／又は殺菌乳など）と脱脂粉乳を用いる場合、生乳（及び／又は殺菌乳など）の配合割合として０質量％〜１００質量％、好ましくは１０質量％〜９０質量％、より好ましくは２０質量％〜８０質量％、さらに好ましくは４０質量％〜８０質量％；脱脂粉乳の配合割合として０質量％〜２５質量％、好ましくは１質量％〜２０質量％、より好ましくは２質量％〜１５質量％、さらに好ましくは２質量％〜１０質量％を挙げることができる。

（２）前記発酵乳ミックスに乳酸菌を添加し、２０℃〜５０℃の発酵乳ミックス中で前記乳酸菌を保持する、保持工程

（２）の工程は、（１）の工程で調製された発酵乳ミックスに乳酸菌を添加し、２０℃〜５０℃の発酵乳ミックス中で乳酸菌を保持する。２０℃〜５０℃の発酵乳ミックス中で乳酸菌の保持する方法については、前述の乳酸菌の生残性向上方法で説明した内容を適用できる。ここで、２０℃〜５０℃の発酵乳ミックスは、前記乳酸菌を添加する前に２０℃〜５０℃に調整してもよいし、乳酸菌を添加した後に２０℃〜５０℃に調整してもよい。発酵乳ミックスを２０℃〜５０℃の温度の範囲内に調整する方法は特に制限されず、従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、プレートによる熱交換や、タンクのジャケットに水を入れて温度調整する。

なお、（１）の工程で調製された発酵乳ミックスは、本工程で２０℃〜５０℃の温度の範囲内に調整する前に、加熱殺菌処理に供してもよい。加熱殺菌加熱温度と加熱時間は、目的の殺菌ができる条件であれば特に制限されない。例えば、６５℃以上の加熱温度が採用される。好ましくは、少なくとも、発酵乳ミックスそのものの温度が９０℃以上、好ましくは９０℃〜１００℃、より好ましくは９５℃程度になる条件であればよく、例えば、発酵乳ミックスを９０℃〜１００℃にて１分間〜５分間で処理する方法や、９０℃〜９５℃にて１分間〜３分間で処理する方法などを、制限なく挙げることができる。

（３）前記乳酸菌を含有する発酵乳ミックスにスターターを添加して発酵させる、発酵工程
（２）の工程で保持した乳酸菌を含有する発酵乳ミックスは、次いで発酵処理に供される。

「スターター」は、発酵乳ミックスを発酵させるために接種する、乳酸菌や酵母などの種菌を意味する。本発明において「スターター」には、公知のスターターを適宜用いることができるが、好ましくは乳酸菌スターターである。乳酸菌スターターには、ラクトバシルス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・マケドニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｋｅｄｏｎｉｓｕ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、又、ラクトバシルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の他、発酵乳の製造に一般的に用いられる乳酸菌の中から１種又は２種以上を用いることができる。なかでも、コーデックス規格でヨーグルトスターターとして規格化されているラクトバシルス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）とストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の混合スターターをベースとする乳酸菌スターターを好適に用いることができる。

スターターの添加量は、公知の発酵乳の製造方法において採用されている添加量に従って、適宜設定することができる。また、スターターの接種方法も、特に制限されることなく、発酵乳の製造で慣用されている方法を適宜用いることができる。

発酵処理の条件は、発酵乳の種類や所望の風味、使用するスターターの種類などを考慮して、適宜設定することができる。例えば、発酵室内の温度（発酵温度）を３０℃〜５０℃の範囲に維持し、その発酵室内で静置しながら発酵させる方法を挙げることができる。かかる温度条件であれば、一般に乳酸菌が活動しやすいため、効果的に発酵を進めることができる。発酵温度は、通常では３０℃〜５０℃程度、好ましくは３５℃〜４５℃の範囲、より好ましくは３７℃〜４３℃の範囲を挙げることができる。

発酵時間は、発酵乳ミックスの乳酸酸度が所定の割合に到達することを目安に、適宜設定調整することができる。かかる乳酸酸度は、例えば「前発酵タイプ」のヨーグルトの場合、通常０．７％〜１.５％であり、「後発酵タイプ」のヨーグルトの場合、通常０.７％〜０.８％である。発酵時間は、通常１時間〜１２時間、好ましくは２時間〜５時間、より好ましくは３時間〜４時間である。

「前発酵タイプ」のヨーグルトの場合、乳酸酸度が通常１.５％〜２％、また「後発酵タイプ」のヨーグルトの場合、乳酸酸度が通常０.７％〜０.８％に達した時点で、例えば１５℃以下、好ましくは０℃〜１０℃、より好ましくは３℃〜７℃に冷却し、発酵を停止する。

以上で説明した（１）〜（３）の工程を経ることで、本発明が対象とする発酵乳を製造することができる。

さらには、（２）の保持工程と（３）の発酵工程との間に、乳酸菌を含有する発酵乳ミックスを０℃〜１０℃に冷却する冷却工程を含むことが好ましい。２℃〜８℃に冷却することがより好ましく、４℃〜６℃に冷却することがさらに好ましい。２０℃〜５０℃の発酵乳ミックス中で乳酸菌を保持後に、発酵乳ミックスを前記温度範囲にまで冷却することによって、発酵乳中の乳酸菌の生残性の低下を抑制できる。また前記冷却する時間は、特に制限されず、例えば１２時間〜３６時間、好ましくは１８時間〜３０時間である。発酵乳ミックスを冷却した場合は、発酵工程に移る前に、一旦発酵乳ミックスを発酵させる温度付近（例えば、３０℃〜５０℃）に加温することが好ましい。

本発明の製造方法で得られる発酵乳は食品衛生上許容できる配合物、例えば、安定化剤、保存料、着色料、香料、ビタミン等の配合物を前記リン酸化多糖類に適宜添加してもよい。また、定法により、錠剤、粒状、顆粒状、粉末状、カプセル状、液状、ゼリー状、クリーム状、飲料等の剤型とすることができる。

［乳酸菌を含有する発酵乳］
本発明の乳酸菌を含有する発酵乳は、前述の発酵乳の製造方法で得られるものであり、発酵乳中の乳酸菌の生残性が従来よりも向上したものである。

本発明の乳酸菌を含有する発酵乳は、例えば、健康食品、特定保健用食品、栄養補助食品等として使用できる。また、剤型は、定法により、錠剤、粒状、顆粒状、粉末状、カプセル状、液状、ゼリー状、クリーム状、飲料等の食品とすることができる。

本発明において「乳酸菌の生残性」とは、生菌乳酸菌を含有する発酵乳を製造して保存後にどの程度生菌が存在しているかを示すものであり、生菌数は常法に従い求めることができる。なお、ここでいう生菌乳酸菌には、発酵工程において発酵乳ミックスに添加されるスターターのうち、乳酸菌スターターは含まないものとする。
乳酸菌の生残性は、例えば、保存に用いた発酵乳を適宜希釈し、ＢＬ培地に塗沫して、３７℃で７２時間嫌気的に培養した後の培地上のコロニーを測定することによって評価することができる。保存に用いた培養液や発酵乳の保存前の生菌数に対する保存後の生菌数の割合によって、生残率を示すことができる。
具体的には、実施例で後述するように、１２１℃、１５分間のオートクレーブ殺菌したＢＬ培地（栄研化学株式会社）：３８０ｇに馬脱繊維血液（株式会社日本バイオテスト研究所）：２０ｇを混釈し平板培地を作製し、そこに、生菌乳酸菌含有培養液を生理食塩水にて１０^５倍希釈したサンプル１００μｍを表面塗抹し、３７℃で７２時間培養後、出現したラフ型コロニーを生菌乳酸菌として計測できる。

乳酸菌の生残率は、例えば、下記式で表すように、飲食品組成物を製造して１日後の乳酸菌生菌数に対する、飲食品組成物を製造してＸ日後の乳酸菌生菌数の割合を求め評価することができる。
生残率（％）＝｛乳酸菌を含む飲食品組成物の製造Ｘ日後の乳酸菌生残数（ｃｆｕ／ｇ）／乳酸菌を含む飲食品組成物の製造１日後の乳酸菌生残数（ｃｆｕ／ｇ）｝×１００

前記乳酸菌の生残率（％）は、Ｘ＝８のとき、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上である。
前記乳酸菌の生残率（％）は、Ｘ＝１６のとき、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、特に好ましくは８０％以上である。
前記乳酸菌の生残率（％）は、Ｘ＝２５のとき、好ましくは１０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは５０％以上、特に好ましくは７０％以上である。

以下、実施例及び比較例を示して本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。

［実施例１］
（ヨーグルトの作製）
生乳：６１０ｇ、脱脂粉乳：２０ｇ、砂糖：３６ｇ、水道水：１０７ｇを混合して、発酵乳ミックスを調製した。調製した発酵乳ミックスを９５℃、５分間で加熱・殺菌した後に３８℃に冷却した。その後、ラクトバシルス・ガセリＯＬＬ２７１６（ＦＥＲＭ ＢＰ−６９９９）凍結濃縮菌を０．２４ｇ（発酵乳ミックスの合計の０．０３質量％）を１５℃にて流水解凍した後、前記で調製した発酵乳ミックスに添加し、３８℃で５時間保持した。その後、この発酵乳ミックスを４３℃に加温してから、スターター（明治十勝ヨーグルト（商品名）、株式会社明治製から分離した乳酸菌スターター）を２４ｇ（発酵乳ミックスの合計の３質量％）接種した後に、紙カップ容器（容量：１００ｇ）に分注し、４３℃の発酵室に静置して発酵させた。乳酸酸度が０．７％に到達した時点で冷蔵室にて５℃に冷却して発酵を終了し、ヨーグルトが得られた。得られたヨーグルトを５℃の冷蔵庫で保存した。

（ヨーグルト中のラクトバシルス・ガセリＯＬＬ２７１６株の生残性の評価）
前述の方法で作製したヨーグルトを５℃で保存し、製造後の保存日数１日、８日、１６日、２５日の時点でのラクトバシルス・ガセリＯＬＬ２７１６株の菌数を計測した。菌数計測は下記方法で実施した。

［菌数計測］
１２１℃、１５分間のオートクレーブ殺菌したＢＬ培地（栄研化学株式会社）：３８０ｇに馬脱繊維血液（株式会社日本バイオテスト研究所）：２０ｇを混釈し平板培地を作製した。そこに、前記作製したヨーグルトを生理食塩水にて１０^５倍希釈したサンプル１００μＬを表面塗抹し、３７℃で７２時間培養後、出現したラフ型コロニーをラクトバシルス・ガセリＯＬＬ２７１６株として計測した。

［生残率］
前記計測したラクトバシルス・ガセリＯＬＬ２７１６株をもとに、下記式で表される生残率を計算した。
生残率（％）＝｛乳酸菌を含む飲食品組成物の製造Ｘ日後の乳酸菌生残数（ｃｆｕ／ｇ）／乳酸菌を含む飲食品組成物の製造１日後の乳酸菌生残数（ｃｆｕ／ｇ）｝×１００
上記式において、Ｘは、８、１６、２５のいずれかである。
結果を下記表１に示す。

［実施例２］
発酵乳ミックスを４３℃に加温する代わりに、一旦５℃に冷却して１日冷蔵保管後に４３℃に加温したことを除いては実施例１と同様にヨーグルトを作製し、菌数計測及び生残率を計算した。
結果を下記表１に示す。
［実施例３］
発酵乳ミックスを９５℃、５分間で加熱（殺菌）した後に３０℃で５時間保存し、かつ、発酵乳ミックスに濃縮菌を添加後３０℃で５時間保存したことを除いては実施例１と同様にヨーグルトを作製し、菌数計測及び生残率を計算した。
結果を下記表１に示す。
［実施例４］
発酵乳ミックスを４３℃に加温する代わりに、一旦５℃に冷却して１日冷蔵保管後に４３℃に加温したことを除いては実施例３と同様にヨーグルトを作製し、菌数計測及び生残率を計算した。
結果を下記表１に示す。
［実施例５］
発酵乳ミックスを９５℃、５分間で加熱（殺菌）した後に２５℃で５時間保存し、かつ、発酵乳ミックスに濃縮菌を添加後２５℃で５時間保存したことを除いては実施例１と同様にヨーグルトを作製し、菌数計測及び生残率を計算した。
結果を下記表１に示す。
［実施例６］
発酵乳ミックスを４３℃に加温する代わりに、一旦５℃に冷却して１日冷蔵保管後に４３℃に加温したことを除いては実施例５と同様にヨーグルトを作製し、菌数計測及び生残率を計算した。
結果を下記表１に示す。

［比較例１］
（ヨーグルトの作製）
生乳：６１０ｇ、脱脂粉乳：２０ｇ、砂糖：３６ｇ、水道水：１０７ｇを混合して、発酵乳ミックスを調製した。調製した発酵乳ミックスを９５℃、５分間で加熱・殺菌した後に４３℃に冷却した。その後、ラクトバシルス・ガセリＯＬＬ２７１６（ＦＥＲＭ ＢＰ−６９９９）凍結濃縮菌を０．２４ｇ（発酵乳ミックスの合計の０．０３質量％）を１５℃にて流水解凍した。解凍した前記乳酸菌とスターター（明治十勝ヨーグルト（商品名）、株式会社明治製から分離した乳酸菌スターター）２４ｇ（発酵乳ミックスの合計の３質量％）とを、前記発酵乳ミックスに接種後、紙カップ容器（容量：１００ｇ）に分注し、４３℃の発酵室に静置して発酵させた。乳酸酸度が０．７％に到達した時点で冷蔵室にて５℃に冷却して発酵を終了し、ヨーグルトが得られた。得られたヨーグルトを５℃の冷蔵庫で保存した。
作製したヨーグルトについて、実施例１と同様に菌数計測及び生残率を計算した。
結果を下記表１に示す。

上記結果から分かるように、２０℃〜５０℃の発酵乳ミックス中で乳酸菌を保持することで（実施例１〜６）、保持しない場合（比較例１）と比較して、ヨーグルト中の乳酸菌の生残性が顕著に向上することが分かった。
また、２０℃〜５０℃の発酵乳ミックス中で乳酸菌を保持後、発酵乳ミックスを５℃にまで冷却することによって（実施例２、４、６）、ヨーグルト中の乳酸菌の生残性の生残性の低下をより抑制できた。

Claims (5)

1. （１）乳原料を用いて発酵乳ミックスを調製する工程
   （２）前記発酵乳ミックスに乳酸菌を添加し、２０℃〜５０℃の発酵乳ミックス中で前記乳酸菌を保持する、保持工程
   （３）前記乳酸菌を含有する発酵乳ミックスにスターターを添加して発酵させる、発酵工程
   を有し、
   前記（２）保持工程と（３）発酵工程の間に、乳酸菌を含有する発酵乳ミックスを０℃〜１０℃に冷却する冷却工程を含む、
   乳酸菌の生残性向上方法。
2. 前記乳酸菌が、ラクトバシルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）である、請求項１に記載の乳酸菌の生残性向上方法。
3. 前記乳酸菌が、ラクトバシルス・ガセリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）である、請求項１に記載の乳酸菌の生残性向上方法。
4. 前記乳酸菌が、ラクトバシルス・ガセリＯＬＬ２７１６（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ ＯＬＬ２７１６：ＦＥＲＭ ＢＰ−６９９９）である、請求項１に記載の乳酸菌の生残性向上方法。
5. （１）乳原料を用いて発酵乳ミックスを調製する工程
   （２）前記発酵乳ミックスに乳酸菌を添加し、２０℃〜５０℃の発酵乳ミックス中で前記乳酸菌を保持する、保持工程
   （３）前記乳酸菌を含有する発酵乳ミックスにスターターを添加して発酵させる、発酵工程
   を有し、
   前記（２）保持工程と（３）発酵工程の間に、乳酸菌を含有する発酵乳ミックスを０℃〜１０℃に冷却する冷却工程を含む、
   発酵乳の製造方法。