CN101522887A - 新型乳酸菌 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种乳球菌(Lactococcus)属菌，其具有如下性质：(1)发酵性，即，在10％(W/W)复原脱脂乳培养基中，在25～37℃的温度范围内培养16小时的情况下，培养基凝固；(2)促进长双歧杆菌繁殖的性能，即，在上述培养基中，与长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)混合培养的情况下，pH达到4.4～4.6时，长双歧杆菌的菌数在5×108CFU/g以上；以及(3)提高长双歧杆菌保存生存性的性能，即，在上述培养基中，与长双歧杆菌混合培养的情况下，pH达到4.4～4.6时快速冷却，并在10℃保持2周的情况下，长双歧杆菌的存活率在30％以上。

Description

新型乳酸菌
技术领域
本发明涉及属于乳球菌(Lactococcus)属的新型乳酸菌，含有该乳酸菌的菌粉、医药用组合物及肠道功能调整剂，以及使用该乳酸菌促进长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)的繁殖性和生存性的方法。
本申请要求2007年2月13日提交的日本特愿2007-032645号的优先权；在此引用其内容作为参考。
背景技术
已知乳球菌属菌、双歧杆菌(Bifidobacterium)属菌(以下称为“双歧杆菌”)等乳酸菌具有恢复肠内细菌平衡的调整肠道作用、免疫增强作用、抗癌作用等。因此，近年来随着消费者健康意识的提高，乳酸菌在食品中的利用盛行起来。特别地，长双歧杆菌等双歧杆菌是在人肠道内形成的肠道菌群的优势菌种之一，对包含存活的双歧杆菌的发酵乳等食品的需求增加。
双歧杆菌在牛奶培养基中的增殖性差。因此，为了在发酵乳中含有一定量的、例如1×107CFU/mL的双歧杆菌，通常添加各种各样繁殖促进物质。但是，该繁殖促进物质通常价格比较高，并且，风味可能会受损。另外，双歧杆菌难以在酸性条件下保存、易死亡。因此，发酵乳制品等在流通过程中，其中存活的双歧杆菌量急剧减少。
因此，通过改善双歧杆菌的繁殖性、保存生存性，不但可制造出大量含有存活的双歧杆菌的发酵乳，而且期待即使在消费者食用时，也与刚制造完时同样富含存活的双歧杆菌。
已公开了通过与双歧杆菌以外的乳酸菌混合发酵，不添加该繁殖促进物质等也可改善双歧杆菌的繁殖性、保存生存性的种种方法。关于改善发酵乳制造中的双歧杆菌繁殖性的方法，例如(1)公开了酸奶及其制造方法，其特征在于，其含有乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)以及双歧杆菌(例如参照专利文献1。)。
此外，关于改善发酵乳中的双歧杆菌保存生存性的方法，例如(2)公开了双歧杆菌发酵乳的制造方法，其特征在于，在以乳为主成分的培养基中，混合培养短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、以及不生成双乙酰和乙偶姻的乳酸乳球菌乳酸亚种。(例如参照专利文献2。)
专利文献1：日本特许第3364491号公报
专利文献2：日本特许第3068484号公报
发明内容
发明要解决的问题
可是，上述(1)的方法虽可促进双歧杆菌的繁殖、缩短发酵时间，但在专利文献1中，关于双歧杆菌的保存生存性根本没有记载。另一方面，上述(2)的方法通过使用由特定的双歧杆菌和特定的乳酸菌组成的混合菌，虽可以看到促进增殖效果和改善生存性效果，但对于短双歧杆菌以外的双歧杆菌、例如在食品方面广泛应用的长双歧杆菌根本没有记载。
本发明的目的是提供一种乳酸菌，其可改善双歧杆菌，特别是长双歧杆菌的繁殖性、保存生存性。
另外，本发明的目的是提供含有该乳酸菌的菌粉、医药用组合物及肠道功能调整剂，以及使用该乳酸菌促进长双歧杆菌的繁殖性和生存性的方法。
解决问题的方法
本发明人为了解决上述问题进行了深入研究，结果，对在10％(W/W)复原脱脂乳培养基中发酵性优异的乳酸菌的菌株，与长双歧杆菌混合培养来进行发酵试验，发现具有如下性质的乳酸菌，其性质为：促进长双歧杆菌繁殖的性能，即，pH达到4.4～4.6时，长双歧杆菌的菌数在5×108CFU/g以上；提高长双歧杆菌的保存生存性的性能，即，发酵结束后快速冷却并在10℃下保持2周时，长双歧杆菌的存活率在30％以上，从而完成了本发明。
即，本发明提供具有下述菌学性质的乳球菌(Lactococcus)属菌。
(1)发酵性，即，在10％(W/W)复原脱脂乳培养基中，在25～37℃的温度范围内培养16小时的情况下，培养基凝固；(2)促进长双歧杆菌繁殖的性能，即，在10％(W/W)复原脱脂乳培养基中，与长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)混合培养的情况下，pH达到4.4～4.6时，长双歧杆菌的菌数在5×108CFU/g以上；以及(3)提高长双歧杆菌的保存生存性的性能，即，在10％(W/W)复原脱脂乳培养基中，与长双歧杆菌混合培养的情况下，pH达到4.4～4.6时快速冷却，在10℃下保持2周的情况下，长双歧杆菌的存活率在30％以上。
另外，本发明提供一种前述乳球菌属菌，其特征在于，其不具有木糖同化性，并且，不生成双乙酰及乙偶姻。
另外，本发明提供一种前述乳球菌属菌，其为乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)。
另外，本发明提供一种乳球菌属菌，前述长双歧杆菌的菌株为选自由长双歧杆菌FERM BP-7787及长双歧杆菌模式菌株ATCC15707所组成的组中的至少一种。
另外，本发明提供一种乳球菌属菌，菌株为乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852(FERM BP-10742)。
另外，本发明提供一种乳球菌属菌，菌株为乳酸乳球菌乳酸亚种MCC857(FERM BP-10757)。
另外，本发明提供一种乳球菌属菌，菌株为乳酸乳球菌乳酸亚种MCC859(FERM BP-10744)。
另外，本发明提供一种乳球菌属菌，菌株为乳酸乳球菌乳酸亚种MCC865(FERM BP-10745)。
另外，本发明提供一种乳球菌属菌，菌株为乳酸乳球菌乳酸亚种MCC866(FERM BP-10746)。
另外，本发明提供一种菌粉，其含有前述任一项所述的乳球菌属菌。
另外，本发明提供一种医药用组合物，其含有前述任一项所述的乳球菌属菌。
另外，本发明提供前述任一项所述的乳球菌属菌。
另外，本发明提供一种促进长双歧杆菌的繁殖性和生存性的方法，其特征在于，使用前述任一项所述的乳球菌属菌。
发明的效果
通过本发明的乳球菌属菌、以及本发明的促进长双歧杆菌的繁殖性和生存性的方法，可显著地改善长双歧杆菌的繁殖性、保存生存性，因此，可高效制造目前没有的大量含有长双歧杆菌的发酵乳制品。另外，即使在流通过程中，也可充分维持发酵乳制品中存活的长双歧杆菌含量，因此可提供调整肠道的效果更高的发酵乳制品，在健康维护方面也有用。
具体实施方式
本发明的乳球菌属菌，特别是乳酸乳球菌乳酸亚种具有上述(1)、(2)及(3)的特性。
(1)涉及发酵性。在10％(W/W)复原脱脂乳培养基中，在25～37℃的温度范围内培养16小时时，培养基越凝固增殖越快，如果是具有强发酵性的乳酸菌，则在制造发酵乳时，可更有效地改善长双歧杆菌的繁殖性等。在此，“培养基凝固”是指通过酸性发酵，培养基的pH低于乳蛋白质的等电点、乳蛋白质凝聚，培养基凝固的情况。另外，“10％(W/W)复原脱脂乳培养基”可通过将复原脱脂乳(例如，森永乳业公司制)以10质量％浓度溶解在水中来调制。
通常，适合于乳球菌属菌的发酵温度范围为20～30℃，但本发明的乳球菌属菌为在25～37℃的温度范围内具有强发酵性的菌。即，本发明的乳球菌属菌在适合于长双歧杆菌的发酵温度范围(30～40℃)内具有充分的发酵性。
(2)涉及促进长双歧杆菌繁殖的性能。在10％(W/W)复原脱脂乳培养基等乳性培养基中，pH达到4.6左右时，通常，所含的酪蛋白等沉淀，全部培养基凝固，成为具有优异风味、口感及外观的物质。因此，制造发酵乳制品时，通常，在pH达到4.6附近时，通过快速冷却等来停止发酵。因此，在10％(W/W)复原脱脂乳培养基中，与长双歧杆菌混合培养的情况下，如果是具有如下促进繁殖性的性能的乳酸菌，则在制造发酵乳时，就可更有效地改善发酵乳中的长双歧杆菌含量，所述促进繁殖性的性能为在pH达到4.4～4.6时，可使长双歧杆菌的菌数达到5×108CFU/g以上这样的高浓度。
(3)涉及提高长双歧杆菌的保存生存性的性能。通常，在10℃以下的保存条件下，发酵乳制品的保质期为2周左右。因此，在10％(W/W)复原脱脂乳培养基中，与长双歧杆菌混合培养的情况下，如果是具有如下提高保存生存性的性能的乳酸菌，也可制造即使在保质期结束时，仍含有充分量的长双歧杆菌的发酵乳，所述提高保存生存性的性能是在pH达到4.4～4.6时快速冷却，并在10℃保持2周的情况下，长双歧杆菌的存活率达到30％以上。
例如可通过以下的方法得到本发明的乳球菌属菌。首先，从各种样品中分离菌株，从其中选出在10％(W/W)复原脱脂乳培养基中的发酵性优异的菌株，即，选择具有如下发酵性的菌株：在10％(W/W)复原脱脂乳培养基中，在25～37℃的温度范围内培养16小时时，可让培养基凝固。接着，所选择的菌与长双歧杆菌进行混合培养试验，通过选择具有上述(2)及(3)所规定的促进长双歧杆菌繁殖的性能及提高保存生存性的性能的菌株而获得本发明的乳球菌属菌。进一步，优选选择不具有木糖同化性，并且，不生成双乙酰及乙偶姻的菌株。
以下，更详细地说明。
1.菌株的获得
本发明者发明人等尽量为了从自然界获得具有前述性质的菌株，将从日本国内的自然界采集到的样本样品用厌氧性稀释液(“The World of Enterobacteria”published by soubunsha Co.，Ltd.，written by Tomotari Mitsuoka，Page 322，1980：hereinafter，abbreviated to“Reference1”，以下记载为参考文献1)稀释，并涂布在briggs Briggs liver broth(前述参考文献1，319页)的平板上，在30℃下厌氧培养。并且，在得到的菌落中，采集如下的菌：显示链球菌的形态，且通过涂布标本的显微镜观察识别为革兰氏阳性。将该采集到的菌划线涂布在BL琼脂培养基平板上，并用和前述同样的方法反复厌氧培养，得到纯分离的菌株。将这些菌株使用下述的方法：首先，进行10％(W/W)复原脱脂乳培养基中的发酵试验，得到20株具有上述(1)所规定发酵性的菌株。接着，进行与长双歧杆菌的混合培养试验，得到5株具有如下性质的菌株，其性质为：促进繁殖的性能，其在pH达到4.4～4.6时，可使长双歧杆菌的菌数达到5×108CFU/g以上；提高保存生存性的性能，其在pH达到4.4～4.6时快速冷却，并在10℃下保持2周时的长双歧杆菌的存活率达到30％以上。该5株菌株分别命名为MCC852、MCC857、MCC859、MCC865、MCC866。
2.菌学性质
以下所示为前述5株菌株的菌学性质。再者，用于测定菌学性质的试验几乎依照Bergey’sManual of SystematicBacteriology(Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology、PeterH.A.Sneath编、第2卷、Williams and Wilkins Company、1986年)来进行。
(I)菌形(用BL琼脂培养基平板，30℃厌氧培养72小时时用光学显微镜观察时的菌形)
大小：直径1～2μm
形状：链球菌
(II)革兰氏染色性：阳性
(III)石蕊牛奶：凝固
(IV)芽孢的形成：阴性
(V)由葡萄糖产气：无
(VI)运动性：无
(VII)过氧化氢酶活性：阴性
(VIII)精氨酸脱羧酶试验：阳性
(IX)由柠檬酸产气：阴性
(X)温度敏感性(60℃ 30分钟及65℃ 30分钟)：均为敏感性
(XI)葡萄糖降解产物：L-乳酸
表1
Figure A200780004074D00111
Figure A200780004074D00121
上述(I)～(XI)所示的菌学性质方面，前述5株菌株全部相同，并且，与乳酸乳球菌乳酸亚种的模式菌株即ATCC19435相同。关于(XII)繁殖温度、(XIII)耐盐性、(XIV)耐pH性、(XV)耐亚甲基蓝性、(XVI)由精氨酸的氨的产生及(XVII)糖的发酵性分别为表1所示的性质。再者，糖的发酵性使用Mitsuoka的糖发酵性用培养基(Tomotari Mitsuoka，Thebacteriology of lactic acid bacteria”，Clinical Examination 18，Pages 1163 to 1172，1974)对28种糖进行试验。
从以上的结果可看出，前述5株菌株均具有乳酸乳球菌乳酸亚种菌种的菌学性质。即，前述5株菌株可确认为乳酸乳球菌乳酸亚种。另一方面，从上述(XII)～(XVII)所示的菌学性质可看出，前述5株菌株，特别从不具有木糖同化性的方面看，与模式菌株不同。
因此，申请人将前述5株菌株作为新菌株保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(central 6，1-1，Higashi 1-Chome Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，JAPAN(postal codenumber：305-8566))。乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852菌株保藏号为FERM BP-10742、乳酸乳球菌乳酸亚种MCC857菌株保藏号为FERM BP-10757、乳酸乳球菌乳酸亚种MCC859菌株保藏号为FERM BP-10744、乳酸乳球菌乳酸亚种MCC865菌株保藏号为FERM BP-10745、乳酸乳球菌乳酸亚种MCC866菌株保藏号为FERM BP-10746。再者，乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852、859、865、及866菌株的保藏日为2006年12月1日，乳酸乳球菌乳酸亚种MCC857菌株的保藏日为2007年1月10日。
3.在10％(W/W)复原脱脂乳培养基中的发酵性试验
将复原脱脂奶(森永乳业公司制)用水溶解而得到10％(W/W)复原脱脂乳培养基，将该10％(W/W)复原脱脂乳培养基在95℃灭菌30分钟，相对于该复原脱脂乳培养基接种3％(V/V)各菌株的发酵剂，并在25℃、30℃、及37℃各温度下培养16小时。将得到的培养液快速冷却，并测定凝固情况、pH、及所含有的乳酸菌数。乳酸菌数的测定用市售的BCP加计数琼脂培养基平板(荣研机材社制)来进行。测定结果如表2所示。
再者，作为对照株，使用专利文献2记载的乳酸乳球菌乳酸亚种模式菌株ATCC19435菌株。
表2
Figure A200780004074D00131
使用乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852、857、859、865、866的各菌株即本发明的乳球菌属菌的情况下，在所有温度条件下，pH降低到4.4～4.6，培养基凝固。另外，所含有的乳酸菌数在1×109CFU/g左右，具有非常良好的增殖·发酵性。
另一方面，使用乳酸乳球菌乳酸亚种的模式菌株ATCC19435菌株的情况下，在所有温度条件下，pH在5.5以上且培养基不凝固。另外，与本发明的乳球菌属菌比较，特别在30℃以上时，乳酸菌数显著地减少。
4.与长双歧杆菌的混合培养试验
(1)与长双歧杆菌FERM BP-7787菌株的混合培养试验
作为对照株，使用乳酸乳球菌乳酸亚种模式菌株ATCC19435菌株。
首先，用后述实施例1所述的方法，调制乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852、857、859、865、866这5株菌株的各自培养物、及长双歧杆菌FERM BP-7787菌株的培养物。
长双歧杆菌FERM BP-7787菌株在2001年10月31日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(central6，1-1，Higashi 1-Chome Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，JAPAN(postal code number：305-8566))。
另外，将0.2％(W/W)酵母抽提物(Difco公司制)放入1000mL10％(W/W)复原脱脂乳培养基并在90℃灭菌30分钟，接种30mL乳酸乳球菌乳酸亚种的模式菌株ATCC19435菌株的培养物，在30℃培养16小时，并调制乳酸乳球菌乳酸亚种模式菌株ATCC19435菌株的培养物。
将10％(W/W)复原脱脂乳培养基在90℃灭菌10分钟，相对于该复原脱脂乳培养基，接种1％(V/V)如上述调制的乳酸乳球菌乳酸亚种的各菌株的培养物和1％(V/V)长双歧杆菌FERM BP-7787菌株的培养物，并在37℃培养16小时得到发酵乳。将该发酵乳快速冷却并测定pH及所含有的长双歧杆菌的菌数。再在10℃保存2周并测定保存后1周及2周的长双歧杆菌的菌数。长双歧杆菌的菌数的测定用TOS丙酸酯琼脂培养基平板(YAKULT PHARMACEUTICAL INDUSTRY CO.，LTD制造)进行。测定结果如表3所示。
表3
Figure A200780004074D00151
分别使用乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852、857、859、865、866这5株菌株的发酵乳，发酵后pH约为4.5，长双歧杆菌的菌数达到5×108CFU/g以上。另外，将该发酵乳在10℃保存2周时的长双歧杆菌的菌存活率都在80％以上。
另一方面，使用乳酸乳球菌乳酸亚种的模式菌株ATCC19435菌株的发酵乳，发酵不能进行，发酵后pH在5.0以上，不能进行在10℃的保存试验。另外，发酵刚结束后的长双歧杆菌的菌数也在约1×108CFU/g，与本发明的乳球菌属菌比较，显著地少。
即，可明确乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852、857、859、865、及866的5株菌株与其它已知的乳酸乳球菌乳酸亚种的菌株相比，对于长双歧杆菌FERM BP-7787菌株的促进繁殖的性能及提高保存生存性的性能更优异。
另外，也可明确将专利文献2记载的不生成双乙酰和乙偶姻的乳酸乳球菌乳酸亚种与长双歧杆菌混合培养的情况下，与使用短双歧杆菌的情况不同，像专利文献2所记载的那样，得不到长双歧杆菌的增殖促进效果和生存性改善效果的任何效果。
(2)与长双歧杆菌模式菌株ATCC15707菌株的混合培养试验
使用长双歧杆菌FERM BP-7787菌株和长双歧杆菌模式菌株ATCC15707菌株，确认本发明的乳球菌属菌对长双歧杆菌的促进繁殖的性能及提高保存生存性的性能。
首先，用后述实施例1记载的方法，调制乳酸乳球菌乳酸亚种MCC857菌株的培养物、及长双歧杆菌FERM BP-7787菌株的培养物。
另外，用后述实施例21记载的方法，调制嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)及保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)的混合培养物。
再将加入了0.2％(W/W)酵母抽提物的11％(W/W)复原脱脂乳培养基在90℃灭菌30分钟，对该培养基接种10％(V/V)乳酸乳球菌乳酸亚种模式菌株ATCC15707菌株的发酵剂，在37℃培养至pH达到4.6，以调制长双歧杆菌模式菌株ATCC15707菌株的培养物。
将10％(W/W)复原脱脂乳培养基在90℃灭菌10分钟，对该复原脱脂乳培养基接种1％(V/V)如上述调制的乳酸乳球菌乳酸亚种MCC857菌株的培养物和1％(V/V)长双歧杆菌FERMBP-7787菌株的培养物或接种1％(V/V)长双歧杆菌模式菌株ATCC15707菌株的培养物和0.01％(V/V)嗜热链球菌及保加利亚乳杆菌的混合培养物，并在37℃培养至pH达到4.6，得到发酵乳。将该发酵乳快速冷却并测定所含有的长双歧杆菌的菌数。再在10℃保存2周并测定在保存后1周及2周的长双歧杆菌的菌数。
另一方面，作为对照，将10％(W/W)复原脱脂乳培养基在90℃灭菌10分钟，对该复原脱脂乳培养基接种1.5％(V/V)如上述调制的长双歧杆菌FERM BP-7787菌株的培养物或接种1.5％(V/V)长双歧杆菌模式菌株ATCC15707菌株的培养物和0.4％(V/V)嗜热链球菌及保加利亚乳杆菌的混合培养物，并在37℃培养至pH达到4.6，得到发酵乳，同样测定该发酵乳的长双歧杆菌的菌数。测定结果如表4所示。
表4
长双歧杆菌FERM BP-7787菌株和长双歧杆菌模式菌株ATCC15707菌株这2个菌株通过与乳酸乳球菌乳酸亚种MCC857菌株的混合培养，发酵乳中的长双歧杆菌的菌数显著增多。另外，在10℃保存2周后的长双歧杆菌的菌存活率为：用长双歧杆菌FERM BP-7787菌株为71％，用长双歧杆菌模式菌株ATCC15707菌株为31％，都在30％以上。
相对于此，没有与乳酸乳球菌乳酸亚种MCC857菌株混合培养的情况下，在10℃保存2周后的长双歧杆菌的菌存活率为：用长双歧杆菌FERM BP-7787菌株为20％，用长双歧杆菌模式菌株ATCC15707菌株没有检测出存活的长双歧杆菌。
再者，分别使用乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852、859、865或866菌株代替乳酸乳球菌乳酸亚种MCC857的情况下，也可得到同样的结果。
即，可明确乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852、857、859、865、及866各菌株即使对于保存生存性优异的长双歧杆菌FERMBP-7787菌株以外的长双歧杆菌，也具有优异的促进繁殖的性能及提高保存生存性的性能。
5.专利文献1记载的乳酸乳球菌乳酸亚种与乳酸乳球菌乳脂亚种混合物的比较试验
首先，用上述4(2)记载的方法，调制乳酸乳球菌乳酸亚种MCC857菌株的培养物、长双歧杆菌模式菌株ATCC15707菌株的培养物、及嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的混合培养物。
将10％(W/W)复原脱脂乳培养基在90℃灭菌10分钟，对该复原脱脂乳培养基接种1％(V/V)如上述调制的乳酸乳球菌乳酸亚种MCC857菌株的培养物和1％(V/V)长双歧杆菌模式菌株ATCC15707菌株的培养物和0.01％(V/V)嗜热链球菌及保加利亚乳杆菌的混合培养物，并在37℃培养至pH达到4.6得到发酵乳。将该发酵乳快速冷却并测定所含有的长双歧杆菌的菌数。
另一方面，作为对照，将10％(W/W)复原脱脂乳培养基在90℃灭菌10分钟，相对于该复原脱脂乳培养基，接种1％(V/V)如上述调制长双歧杆菌模式菌株ATCC15707菌株的培养物和2％(V/V)乳酸乳球菌乳酸亚种与乳酸乳球菌乳脂亚种的混合物“EZAL MA14”(Rhodia公司制)，并在38℃培养至pH达到4.6得到发酵乳，同样测定该发酵乳的长双歧杆菌的菌数。再者，“EZAL MA14”是相当于专利文献1记载的“EZAL MR014”(Rhodia公司制)的混合物。
在使用乳酸乳球菌乳酸亚种MCC857菌株的发酵乳中，长双歧杆菌的菌数为5.5×108CFU/g。相对于此，将使用“EZALMA14”的发酵乳稀释106倍，从该稀释溶液中完全检测不到长双歧杆菌，认为该发酵乳所含有的长双歧杆菌的菌数在1×106CFU/g以下。
即，可明确将专利文献1记载的乳酸乳球菌乳酸亚种和乳酸乳球菌乳脂亚种与长双歧杆菌混合培养的情况下，如专利文献1所记载的那样，不能得到双歧杆菌的繁殖促进及缩短发酵时间的效果。
如以上所述，本发明的乳球菌属菌在适合于双歧杆菌的发酵温度范围的10％(W/W)复原脱脂乳培养基中，显示出强的发酵性，再者，与长双歧杆菌混合培养的情况下，对于长双歧杆菌的繁殖及保存生存显示出优异的促进效果，具有乳球菌属公知的菌株所看不到的性质。另外，因为具有非常强的发酵性，所以可高效制造发酵乳等发酵物。另外，因为不生成双乙酰和乙偶姻，所以可期待制造出风味良好的发酵物。
特别地，乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852、857、859、865、866菌株这5株菌株是从自然界分离的乳酸菌中，选出发酵性良好、具有促进长双歧杆菌的繁殖的性能及保存生存性的性能的菌株，因此，可安全地利用在以发酵性食品等为首的各种各样的饮食品中。
本发明的乳球菌属菌可以与其它的乳球菌同样地以菌粉的形态使用。该菌粉，例如可添加于食品、饲料中来使用。
另外，本发明的乳球菌属菌也优选作为肠道功能调整剂等医药品组合物。在作为肠道功能调整剂使用的情况下，本发明乳球菌属菌在肠道功能调整剂中的含量、每天的摄取量等，只要为可获得调整肠道效果的量，就没有特别的限定。例如，优选每天摄取1×109CFU左右的乳球菌属菌。
在本发明中，长双歧杆菌与乳球菌属菌的预培养所用的培养基，只要为通常所用的培养基，就没有特别的限定，但优选为乳性培养基。为了处理简便，特别优选为复原脱脂乳培养基。该复原脱脂乳培养基的浓度优选为3％(W/W)以上，特别优选为8％(W/W)以上。其它，在预培养所用的培养基中，可添加酵母抽提物等繁殖促进物质、L-半胱氨酸等还原剂等。特别地，因为双歧杆菌在乳性培养基中的增殖性低，所以优选使用添加繁殖促进物质的培养基。例如，可使用含有0.1～1％(W/W)的酵母抽提物的培养基。另外，预培养所用的培养基使用经过灭菌处理的培养基。该灭菌处理可用通常所用的方法进行，例如，可通过在80～122℃用5～40分钟、优选在85～95℃用5～35分钟的加热处理来进行。
通过本发明的长双歧杆菌的繁殖性和生存性促进方法，可简便且高效地改善长双歧杆菌的繁殖和保存生存性。该方法具体来说，通过将本发明的乳球菌属菌与长双歧杆菌混合培养来进行。对混合培养时长双歧杆菌、本发明乳球菌属菌发酵剂在混合培养用基本培养基中的接种比例没有特别的限定，但优选为100:1～1:10，特别优选为10:1～1:1。另外，对该基本培养基的添加量也没有特别的限定，相对于该基本培养基，长双歧杆菌与乳球菌属菌总计添加量优选为0.01～10(V/V)％，特别优选为0.1～5(V/V)％。
该基本培养基只要为双歧杆菌与乳酸菌混合培养中通常所用的基本培养基，就没有特别的限定，但优选以乳为主成分的基本培养基。这是因为通过本发明的长双歧杆菌的繁殖性和生存性促进方法，即使在不太适合于双歧杆菌繁殖的乳性培养基中，也可改善长双歧杆菌的繁殖性和生存性。该基本培养基例如可在牛奶、脱脂奶、鲜牛奶、黄油、全脂奶粉、脱脂奶粉等中，根据需要配合蔗糖等甜味剂、果胶、果实、果汁、琼胶、明胶、油脂、香料、着色剂、稳定剂、还原剂等，并依照常规方法灭菌、均匀化、冷却等来调制。特别优选在含有长双歧杆菌的发酵乳等制造中使用。
以下示出实施例来更详细地说明本发明，但本发明并不限定于以下的实施例。
实施例1
将1000mL 10％(W/W)复原脱脂乳培养基在90℃灭菌30分钟，接种30mL乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852菌株的种子培养物，并在25℃培养16小时。另一方面，将1000ml加入了0.2％(W/W)酵母抽提物的11％(W/W)脱脂乳培养基在90℃灭菌30分钟，接种100mL长双歧杆菌模式菌株FERM BP-7787菌株的种子培养物，并在37℃培养6小时。
此外，将包含脱脂奶粉、全脂奶粉、果胶、及蔗糖的原料混合溶解，得到50L包含0.5％(W/W)乳脂、8.0％(W/W)非脂乳固体成分、5.0％(W/W)蔗糖、0.2％(W/W)果胶的基本培养基，将该基本培养基在90℃灭菌10分钟并冷却到40℃。在该灭菌的基本培养基中，接种50mL按照前述进行预培养的乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852菌株的培养物与500mL长双歧杆菌FERM BP-7787菌株的培养物，并在37℃培养16小时得到发酵乳。将该发酵乳立即搅拌冷却，将冷却发酵乳用15MPa的压力均匀化，并填充于200mL容积的玻璃容器中、密封，得到酸性乳饮料。得到的酸性乳饮料pH为4.64，含有6.8×108CFU/g的长双歧杆菌。将该酸性乳饮料在10℃保存14天时的长双歧杆菌的菌数为5.8×108CFU/g，存活率为85％。
实施例2
使用乳酸乳球菌乳酸亚种MCC857菌株代替乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852菌株，除此之外，与实施例1同样地得到酸性乳饮料。得到的酸性乳饮料pH为4.62，含有8.5×108CFU/g的长双歧杆菌。将该酸性乳饮料在10℃保存14天时的长双歧杆菌的菌数为7.6×108CFU/g，存活率为89％。
实施例3
使用乳酸乳球菌乳酸亚种MCC859菌株代替乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852菌株，除此之外，与实施例1同样地得到酸性乳饮料。得到的酸性乳饮料pH为4.56，含有7.2×108CFU/g的长双歧杆菌。将该酸性乳饮料在10℃保存14天时的长双歧杆菌的菌数为5.8×108CFU/g，存活率为81％。
实施例4
使用乳酸乳球菌乳酸亚种MCC865菌株代替乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852菌株，除此之外，与实施例1同样地得到酸性乳饮料。得到的酸性乳饮料pH为4.54，含有6.9×108CFU/g的长双歧杆菌。将该酸性乳饮料在10℃保存14天时的长双歧杆菌的菌数为6.6×108CFU/g，存活率为96％。
实施例5
使用乳酸乳球菌乳酸亚种MCC866菌株代替乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852菌株，除此之外，与实施例1同样地得到酸性乳饮料。得到的酸性乳饮料pH为4.55，含有6.5×108CFU/g的长双歧杆菌。将该酸性乳饮料在10℃保存14天时的长双歧杆菌的菌数为6.2×108CFU/g，存活率为95％。
实施例6
将500mL乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852菌株的种子培养物接种到10L与前述培养基组成相同的培养基，并在37℃培养16小时，所述乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852菌株的种子培养物是在由50g肉浸膏、100g酵母浸膏、100g蛋白胨、200g乳糖、50gK2HPO4、10g KH2PO4、4g胱氨酸及9.5L水组成的培养基中37℃预培养MCC852菌株16小时获得的。进一步，在90℃灭菌30分钟的与前述培养基组成相同的200L培养基中，接种全部前述培养液(10.5L)，并在37℃培养16小时。培养后的存活菌数为3.0×109CFU/mL。
接着，使用Sharpless型离心分离机(TOMY SEIKO CO.，LTD.，制造，商品名D-201V)，通过离心分离(15000rpm)收集菌体，在与培养基同量的生理盐水(90℃灭菌30分钟)中再次悬浮，与前述同样离心分离并再次收集菌体。将收集的菌体悬浮在20L由10％(W/W)脱脂奶粉、1％(W/W)蔗糖、1％(W/W)谷氨酸钠组成的溶液(90℃灭菌30分钟后)中，并依照常规方法冷冻干燥，得到约2.2kg包含8.6×1010CFU/g乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852的粉末。
实施例7
使用乳酸乳球菌乳酸亚种MCC857菌株代替乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852菌株，除此之外，与实施例6同样地得到约2.2k包含9.2×1010CFU/g乳酸乳球菌乳酸亚种MCC857的粉末。
实施例8
使用乳酸乳球菌乳酸亚种MCC859菌株代替乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852菌株，除此之外，与实施例6同样地得到约2.2kg包含8.5×1010CFU/g乳酸乳球菌乳酸亚种MCC859的粉末。
实施例9
使用乳酸乳球菌乳酸亚种MCC865菌株代替乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852菌株，除此之外，与实施例6同样地得到约2.2kg包含9.4×1010CFU/g乳酸乳球菌乳酸亚种MCC865的粉末。
实施例10
使用乳酸乳球菌乳酸亚种MCC866菌株代替乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852菌株，除此之外，与实施例6同样地得到约2.2kg包含8.8×1010CFU/g乳酸乳球菌乳酸亚种MCC866的粉末。
实施例11
在干燥灭菌的14kg淀粉及6kg乳糖中，添加20g实施例6得到的包含乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852的粉末并均一地混合，得到约20kg含有乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852的粉末的肠道功能调整剂。
实施例12
在干燥灭菌的14kg淀粉及6kg乳糖中，添加20g实施例7得到的包含乳酸乳球菌乳酸亚种MCC857的粉末并均一地混合，得到约20kg含有乳酸乳球菌乳酸亚种MCC857的粉末的肠道功能调整剂。
实施例13
在干燥灭菌的14kg淀粉及6kg乳糖中，添加20g实施例8得到的包含乳酸乳球菌乳酸亚种MCC859的粉末并均一地混合，得到约20kg含有乳酸乳球菌乳酸亚种MCC859的粉末的肠道功能调整剂。
实施例14
在干燥灭菌的14kg淀粉及6kg乳糖中，添加20g实施例9得到的包含乳酸乳球菌乳酸亚种MCC865的粉末并均一地混合，得到约20kg含有乳酸乳球菌乳酸亚种MCC865的粉末的肠道功能调整剂。
实施例15
在干燥灭菌的14kg淀粉及6kg乳糖中，添加20g实施例10得到的包含乳酸乳球菌乳酸亚种MCC866的粉末并均一地混合，得到约20kg含有乳酸乳球菌乳酸亚种MCC866的粉末的肠道功能调整剂。
实施例16
将1000mL 10％(W/W)复原脱脂乳培养基在90℃灭菌30分钟，接种30mL乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852菌株的种子培养物，并在25℃培养16小时。
此外，将由3.0％(W/W)乳脂、9.5％(W/W)非脂乳固体成分组成的50L原料奶加热到70℃，并用15MPa的压力均匀化后，90℃灭菌10分钟并冷却到40℃。在该灭菌的基本培养基中，接种500mL按照前述进行预培养的乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852菌株的培养物，并填充于500mL容积的树脂容器中、密封，并在37℃培养16小时后立即冷却。得到的发酵乳pH为4.70、含有1.3×109CFU/g的乳酸菌。
实施例17
使用乳酸乳球菌乳酸亚种MCC857菌株代替乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852菌株，除此之外，与实施例16同样地得到发酵乳，得到的发酵乳pH为4.69、含有1.5×109CFU/g的乳酸菌。
实施例18
使用乳酸乳球菌乳酸亚种MCC859菌株代替乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852菌株，除此之外，与实施例16同样地得到发酵乳，得到的发酵乳pH为4.65、含有1.4×109CFU/g的乳酸菌。
实施例19
使用乳酸乳球菌乳酸亚种MCC865菌株代替乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852菌株，除此之外，与实施例16同样地得到发酵乳，得到的发酵乳pH为4.64、含有1.5×109CFU/g的乳酸菌。
实施例20
使用乳酸乳球菌乳酸亚种MCC866菌株代替乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852菌株，除此之外，与实施例16同样地得到发酵乳，得到的发酵乳pH为4.62、含有1.3×109CFU/g的乳酸菌。
实施例21
将1000mL 10％(W/W)复原脱脂乳培养基在90℃灭菌30分钟，接种30mL乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852菌株的种子培养物，并在25℃培养16小时。另外，将1500mL 10％(W/W)复原脱脂乳培养基在90℃灭菌30分钟，接种50mL嗜热链球菌(HANSEN公司产)及保加利亚乳杆菌(HANSEN公司产)的混合培养物，并在37℃培养5小时。
此外，将由3.0％(W/W)乳脂、9.0％(W/W)非脂乳固体成分组成的50L原料奶加热到70℃，并用15MPa的压力均匀化后，90℃灭菌10分钟并冷却到40℃。在该灭菌的基本培养基中，接种500mL按照前述进行预培养的乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852菌株的培养物、及50mL嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌的混合培养物，并填充于500mL容积的树脂容器中、密封，并在37℃培养7小时后立即冷却。得到的发酵乳pH为4.75、含有9.8×108CFU/g的乳酸菌。
实施例22
使用乳酸乳球菌乳酸亚种MCC857菌株代替乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852菌株，除此之外，与实施例21同样地得到发酵乳，得到的发酵乳pH为4.74、含有1.2×109CFU/g的乳酸菌。
实施例23
使用乳酸乳球菌乳酸亚种MCC859菌株代替乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852菌株，除此之外，与实施例16同样地得到发酵乳，得到的发酵乳pH为4.70、含有1.6×109CFU/g的乳酸菌。
实施例24
使用乳酸乳球菌乳酸亚种MCC865菌株代替乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852菌株，除此之外，与实施例16同样地得到发酵乳，得到的发酵乳pH为4.72、含有1.7×109CFU/g的乳酸菌。
实施例25
使用乳酸乳球菌乳酸亚种MCC866菌株代替乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852菌株，除此之外，与实施例16同样地得到发酵乳，得到的发酵乳pH为4.70、含有1.5×109CFU/g的乳酸菌。
工业上的可利用性
本发明的乳球菌属菌可高效地维持酸奶、酸乳饮料、酸性乳饮料等发酵乳制品中的长双歧杆菌的菌数及保存生存性，因此，在健康管理上及发酵乳制品的制造上有用，可利用在发酵乳制品等制造领域。

Claims (13)

1.一种乳球菌(Lactococcus)属菌，其具有如下的菌学性质：
(1)发酵性，即，在10％(W/W)复原脱脂乳培养基中，在25～37℃的温度范围内培养16小时的情况下，培养基凝固；
(2)促进长双歧杆菌繁殖的性能，即，在10％(W/W)复原脱脂乳培养基中，与长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)混合培养的情况下，pH达到4.4～4.6时，长双歧杆菌的菌数在5×108CFU/g以上；以及
(3)提高长双歧杆菌的保存生存性的性能，即，在10％(W/W)复原脱脂乳培养基中，与长双歧杆菌混合培养的情况下，pH达到4.4～4.6时快速冷却，并在10℃保持2周的情况下，长双歧杆菌的存活率在30％以上。
2.根据权利要求1所述的乳球菌属菌，其特征在于，其不具有木糖同化性，并且，不生成双乙酰及乙偶姻。
3.根据权利要求1或2所述的乳球菌属菌，其为乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)。
4.根据权利要求1～3任一项所述的乳球菌属菌，所述长双歧杆菌的菌株为选自由长双歧杆菌FERM BP-7787及长双歧杆菌模式菌株ATCC15707所组成的组中的至少一种。
5.根据权利要求3或4所述的乳球菌属菌，其菌株为乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852(FERM BP-10742)。
6.根据权利要求3或4所述的乳球菌属菌，其菌株为乳酸乳球菌乳酸亚种MCC857(FERM BP-10757)。
7.根据权利要求3或4所述的乳球菌属菌，其菌株为乳酸乳球菌乳酸亚种MCC859(FERM BP-10744)。
8.根据权利要求3或4所述的乳球菌属菌，其菌株为乳酸乳球菌乳酸亚种MCC865(FERM BP-10745)。
9.根据权利要求3或4所述的乳球菌属菌，其菌株为乳酸乳球菌乳酸亚种MCC866(FERM BP-10746)。
10.一种菌粉，其含有权利要求1～9任一项所述的乳球菌属菌。
11.一种医药用组合物，其含有权利要求1～9任一项所述的乳球菌属菌。
12.一种肠道功能调整剂，其含有权利要求1～9任一项所述的乳球菌属菌。
13.一种促进长双歧杆菌的繁殖性和生存性的方法，其特征在于，其使用权利要求1～9任一项所述的乳球菌属菌。
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