JPWO2008099544A1 - 新規乳酸菌 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2007年2月13日に出願された特願2007−032645号に基づいて優先権を主張し、その内容をここに援用する。
そこで、ビフィズス菌の生育性や保存生残性を改善することにより、生きているビフィズス菌を多く含有する発酵乳を製造し得るばかりではなく、生きているビフィズス菌が、製造直後と同様に、消費者が摂食する時点においても豊富に含有されている発酵乳を製造し得ることが期待できる。
また、本発明は、該乳酸菌を含有する菌末、医薬用組成物及び整腸剤、及び、該乳酸菌を用いるビフィドバクテリウム・ロンガムの生育・生残性促進方法を提供することを目的とする。
(1)10%(W/W)還元脱脂粉乳培地で、25〜37℃の温度範囲で16時間培養した場合に、培地が凝固する発酵性、(2)10%(W/W)還元脱脂粉乳培地で、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)と混合培養した場合に、pHが4.4〜4.6に達した時に、ビフィドバクテリウム・ロンガムの菌数を5×108CFU/g以上とする、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生育促進性、及び(3)10%(W/W)還元脱脂粉乳培地で、ビフィドバクテリウム・ロンガムと混合培養した場合に、pHが4.4〜4.6に達した時に急冷して、10℃で2週間保持した場合の、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生残率を30%以上とする、ビフィドバクテリウム・ロンガムの保存生残性促進性。
また、本発明は、キシロース資化性を有さず、かつ、ダイアセチル及びアセトインを生成しないことを特徴とする、前記ラクトコッカス属菌を提供するものである。
また、本発明は、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス(Lactococcus lactis subsp. lactis)である、前記ラクトコッカス属菌を提供するものである。
また、本発明は、前記ビフィドバクテリウム・ロンガムの菌株が、ビフィドバクテリウム・ロンガムFERM BP−7787及びビフィドバクテリウム・ロンガム タイプストレインATCC15707からなる群から選択される少なくとも一種である、ラクトコッカス属菌を提供するものである。
また、本発明は、菌株が、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスMCC852(FERM BP−10742)である、ラクトコッカス属菌を提供するものである。
また、本発明は、菌株が、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスMCC857(FERM BP−10757)である、ラクトコッカス属菌を提供するものである。
また、本発明は、菌株が、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスMCC859(FERM BP−10744)である、ラクトコッカス属菌を提供するものである。
また、本発明は、菌株が、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスMCC865(FERM BP−10745)である、ラクトコッカス属菌を提供するものである。
また、本発明は、菌株が、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスMCC866(FERM BP−10746)である、ラクトコッカス属菌を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載のラクトコッカス属菌を含有する菌末を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載のラクトコッカス属菌を含有する医薬用組成物を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載のラクトコッカス属菌を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載のラクトコッカス属菌を用いることを特徴とする、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生育・生残性促進方法を提供するものである。
(1)は、発酵性に関するものである。10%(W/W)還元脱脂粉乳培地で、25〜37℃の温度範囲で16時間培養した時に、培地を凝固させることができるほど増殖が早く、強い発酵性を有する乳酸菌であれば、発酵乳製造時に、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生育性等をより効果的に改善することができる。ここで、「培地が凝固する」とは、酸発酵により、培地のpHが乳蛋白質の等電点を下まわり、乳蛋白質が凝集し、培地が凝固することを意味する。また、「10%(W/W)還元脱脂粉乳培地」は、還元脱脂粉乳(例えば、森永乳業社製)を10質量%濃度で水に溶解して調製することができる。
1.菌株の取得
本発明者らは、前記の性質を有する菌株を自然界から取得すべく、日本国内の自然界から採集したサンプルを嫌気性希釈液(1980年叢文社発行、光岡知足著「腸内菌の世界」322ページ。以下、参考文献1と記載する。)で希釈し、Briggs liver broth(前記参考文献1、319ページ)の平板に塗布し、30℃で嫌気培養した。そして得られたコロニーの中で連鎖球菌の形態を示し、かつ塗布標本の顕微鏡観察によりグラム陽性である菌を釣菌した。該釣菌した菌を、BL寒天培地平板に画線塗布し、前記と同様の方法で嫌気培養を反復し、純粋単離された菌株を得た。これらの菌株を下記の方法を用いて、まず、10%(W/W)還元脱脂粉乳培地中での発酵試験を行い、上記(1)で規定される発酵性を有する菌株を20株得た。続いて、ビフィドバクテリウム・ロンガムとの混合培養試験を行い、pHが4.4〜4.6に達した時に、ビフィドバクテリウム・ロンガムの菌数を5×108CFU/g以上とすることのできる生育促進性と、pHが4.4〜4.6に達した時に急冷して、10℃で2週間保持した場合の、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生残率を30%以上とすることのできる保存生残性促進性を有する菌株を5株取得した。該5菌株はそれぞれ、MCC852、MCC857、MCC859、MCC865、MCC866と名付けられた。
前記5菌株の菌学的性質を、以下に示す。なお、菌学的性質を測定するための試験は、バージェイズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology、Peter H. A. Sneath編、第2巻、Williams and Wilkins Company、1986年)にほぼ従って行った。
大きさ:直径1〜2μm
形 状:連鎖球菌
(II)グラム染色性:陽性
(III)リトマスミルク:凝固
(IV)芽胞形成:陰性
(V)グルコースからのガス生成:なし
(VI)運動性:なし
(VII)カタラーゼ活性:陰性
(VIII)アルギニンデカルボキシラーゼ試験:陽性
(IX)クエン酸からのガス産生:陰性
(X)温度感受性(60℃30分間及び65℃30分間):何れも感受性
(XI)グルコースの分解産物:L−乳酸
還元脱脂粉乳(森永乳業社製)を水で溶解して得た10%(W/W)還元脱脂粉乳培地を95℃で30分間殺菌し、該還元脱脂粉乳培地に対し、各菌株のスターターを3%(V/V)接種し、25、30、及び37℃の各温度で16時間培養した。得られた培養液を急冷し、凝固状況、pH、及び含有される乳酸菌数を測定した。乳酸菌数の測定は、市販されているBCP加プレートカウント寒天培地(栄研機材社製)平板で行なった。測定結果を表2に示す。
なお、対照株として、特許文献2に記載のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスのタイプストレインATCC19435株を用いた。
一方、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスのタイプストレインATCC19435株を用いた場合には、何れの温度条件においても、pHが5.5以上であり、培地は凝固しなかった。また、本発明のラクトコッカス属菌と比較して、特に30℃以上において、乳酸菌数が顕著に少なかった。
(1)ビフィドバクテリウム・ロンガムFERM BP−7787株との混合培養試験
対照株として、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスのタイプストレインATCC19435株を用いた。
まず、後記実施例1に記載の方法で、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスMCC852、857、859、865、866の5菌株のそれぞれのカルチャー、及び、ビフィドバクテリウム・ロンガムFERM BP−7787株のカルチャーを調製した。
ビフィドバクテリウム・ロンガムFERM BP−7787株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(日本国 茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号 305−8566))に平成13年10月31日に受託されている。
また、0.2%(W/W)酵母エキス(Difco社製)入り10%(W/W)還元脱脂粉乳培地1000mLを90℃で30分間殺菌し、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスのタイプストレインATCC19435株のカルチャーを30mL接種し、30℃で16時間培養して、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスのタイプストレインATCC19435株のカルチャーを調製した。
一方、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスのタイプストレインATCC19435株を用いた発酵乳は、発酵が進まず、発酵後pHが5.0以上であり、10℃での保存試験が不可能であった。また、発酵終了直後のビフィドバクテリウム・ロンガムの菌数もおよそ1×108CFU/gであり、本発明のラクトコッカス属菌と比較して、顕著に少なかった。
また、特許文献2に記載のダイアセチル及びアセトインを生成しないラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスと、ビフィドバクテリウム・ロンガムとを、混合培養した場合には、ビフィドバクテリウム・ブレーベを用いた場合と異なり、特許文献2に記載されているような、ビフィドバクテリウム・ロンガムの増殖促進効果と生残性改善効果の何れの効果も得ることができないことも明らかである。
本発明のラクトコッカス属菌の、ビフィドバクテリウム・ロンガムに対する生育促進性及び保存生残性促進性を、ビフィドバクテリウム・ロンガムFERM BP−7787株とビフィドバクテリウム・ロンガム タイプストレインATCC15707株を用いて確認した。
まず、後記実施例1に記載の方法で、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスMCC857株のカルチャー、及び、ビフィドバクテリウム・ロンガムFERM BP−7787株のカルチャーを調製した。
また、後記実施例21に記載の方法で、ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)及びラクトバチルス・ブルガリクス(Lactobacillus bulgaricus)の混合カルチャーを調製した。
さらに、0.2%(W/W)酵母エキス入り11%(W/W)脱脂粉乳培地を90℃で30分間殺菌し、該脱脂粉乳培地に対し、ビフィドバクテリウム・ロンガム タイプストレインATCC15707株のスターターを10%(V/V)接種し、37℃でpHが4.6になるまで培養して、ビフィドバクテリウム・ロンガム タイプストレインATCC15707株のカルチャーを調製した。
一方、対照として、10%(W/W)還元脱脂粉乳培地を90℃で10分間殺菌し、該還元脱脂粉乳培地に対し、上記のように調製したビフィドバクテリウム・ロンガムFERM BP−7787株のカルチャー1.5%(V/V)若しくはビフィドバクテリウム・ロンガム タイプストレインATCC15707株のカルチャー1.5%(V/V)と、ストレプトコッカス・サーモフィルス及びラクトバチルス・ブルガリクスの混合カルチャー0.4%(V/V)を接種し、37℃でpHが4.6になるまで培養して得た発酵乳のビフィドバクテリウム・ロンガムの菌数を同様に測定した。測定結果を表4に示す。
これに対し、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスMCC857株と混合培養しなかった場合には、10℃で2週間保存後のビフィドバクテリウム・ロンガムの生残率は、ビフィドバクテリウム・ロンガムFERM BP−7787株で20%であり、ビフィドバクテリウム・ロンガム タイプストレインATCC15707株では生きているビフィドバクテリウム・ロンガムは検出されなかった。
なお、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスMCC857株に代えて、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスMCC852、859、865、又は866株をそれぞれ用いた場合にも同様の結果が得られた。
まず、上記4(2)記載の方法で、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスMCC857株のカルチャー、ビフィドバクテリウム・ロンガム タイプストレインATCC15707株のカルチャー、及び、ストレプトコッカス・サーモフィルス及びラクトバチルス・ブルガリクスの混合カルチャーを調製した。
一方、対照として、10%(W/W)還元脱脂粉乳培地を90℃で10分間殺菌し、該還元脱脂粉乳培地に対し、上記のように調製したビフィドバクテリウム・ロンガム タイプストレインATCC15707株のカルチャー1%(V/V)と、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスとラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスの混合物「EZAL MA14」(Rhodia社製)2%(V/V)を接種し、38℃でpHが4.6になるまで培養して得た発酵乳のビフィドバクテリウム・ロンガムの菌数を同様に測定した。なお、「EZAL MA14」は、特許文献1に記載の「EZAL MR014」(Rhodia社製)に相当する混合物である。
また、本発明のラクトコッカス属菌は、整腸剤等の医薬品組成物としても好ましい。整腸剤として用いる場合において、本発明のラクトコッカス属菌の、整腸剤中の含有量や1日あたりの摂取量等は、整腸効果が期待できる量であれば、特に限定されるものではない。例えば、1日あたり、1×109CFU程度のラクトコッカス属菌を摂取することが好ましい。
これとは別に、脱脂粉乳、全粉乳、ペクチン、及び蔗糖からなる原料を混合溶解して得られた、乳脂肪0.5%(W/W)、無脂乳固形分8.0%(W/W)、蔗糖5.0%(W/W)、ペクチン0.2%(W/W)からなるベース50Lを、90℃で10分間殺菌し、40℃に冷却した。該殺菌したベースに、前記の通り前培養を行ったラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスMCC852株のカルチャー50mLとビフィドバクテリウム・ロンガムFERM BP−7787株のカルチャー500mLを接種し、37℃16時間培養して発酵乳を得た。該発酵乳を直ちに攪拌冷却し、冷却発酵乳を15MPaの圧力で均質化し、200mL容のガラス容器に充填し、密封し、ドリンクヨーグルトを得た。得られたドリンクヨーグルトはpH4.64であり、6.8×108CFU/gのビフィドバクテリウム・ロンガムを含有していた。このドリンクヨーグルトを10℃で14日間保存した時のビフィドバクテリウム・ロンガムの菌数は5.8×108CFU/gであり、生残率は85%であった。
次いで、シャープレス型遠心分離機(トミー精工株式会社製、商品名:RD−20IV)を用いて、遠心分離(15,000rpm)により菌体を集め、培地と同量の生理食塩水(90℃30分間殺菌済)に再懸濁し、前記と同様遠心分離して再度集菌した。集めた菌体を、脱脂粉乳10%(W/W)、蔗糖1%(W/W)、グルタミン酸ソーダ1%(W/W)からなる溶液(90℃30分間殺菌済)20Lに懸濁し、常法に従って凍結乾燥し、8.6×1010CFU/gのラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスMCC852を含む粉末約2.2kgを得た。
これとは別に、乳脂肪3.0%(W/W)、無脂乳固形分9.5%(W/W)からなる生乳50Lを70℃に加温し、15MPaの圧力で均質化した後、90℃で10分間殺菌し,40℃に冷却した。該殺菌したベースに、前記の通り前培養を行ったラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスMCC852株のカルチャー500mLを接種し、500mL容の樹脂容器に充填し、密封し、37℃16時間培養した後、直ちに冷却した。得られた発酵乳はpH4.70であり、1.3×109CFU/gの乳酸菌を含有していた。
これとは別に、乳脂肪3.0%(W/W)、無脂乳固形分9.0%(W/W)からなる生乳50Lを70℃に加温し、15MPaの圧力で均質化した後、90℃で10分間殺菌し,40℃に冷却した。該殺菌したベースに、前記の通り前培養を行ったラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスMCC852株のカルチャー500mL、及びストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・ブルガリクスの混合カルチャー50mLを接種し、500mL容の樹脂容器に充填し、密封し、37℃7時間培養した後、直ちに冷却した。得られた発酵乳はpH4.75であり、9.8×108CFU/gの乳酸菌を含有していた。
Claims (13)
- (1)10%(W/W)還元脱脂粉乳培地で、25〜37℃の温度範囲で16時間培養した場合に、培地が凝固する発酵性;
(2)10%(W/W)還元脱脂粉乳培地で、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)と混合培養した場合に、pHが4.4〜4.6に達した時に、ビフィドバクテリウム・ロンガムの菌数を5×108CFU/g以上とする、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生育促進性;および
(3)10%(W/W)還元脱脂粉乳培地で、ビフィドバクテリウム・ロンガムと混合培養した場合に、pHが4.4〜4.6に達した時に急冷して、10℃で2週間保持した場合の、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生残率を30%以上とする、ビフィドバクテリウム・ロンガムの保存生残性促進性、
の菌学的性質を有する、ラクトコッカス(Lactococcus)属菌。 - キシロース資化性を有さず、かつ、ダイアセチル及びアセトインを生成しないことを特徴とする請求項1記載のラクトコッカス属菌。
- ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス(Lactococcus lactis subsp. lactis)である、請求項1又は2記載のラクトコッカス属菌。
- 前記ビフィドバクテリウム・ロンガムの菌株が、ビフィドバクテリウム・ロンガムFERM BP−7787及びビフィドバクテリウム・ロンガム タイプストレインATCC15707からなる群から選択される少なくとも一種である、請求項1〜3のいずれか記載のラクトコッカス属菌。
- 菌株が、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスMCC852(FERM BP−10742)である、請求項3又は4記載のラクトコッカス属菌。
- 菌株が、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスMCC857(FERM BP−10757)である、請求項3又は4記載のラクトコッカス属菌。
- 菌株が、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスMCC859(FERM BP−10744)である、請求項3又は4記載のラクトコッカス属菌。
- 菌株が、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスMCC865(FERM BP−10745)である、請求項3又は4記載のラクトコッカス属菌。
- 菌株が、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスMCC866(FERM BP−10746)である、請求項3又は4記載のラクトコッカス属菌。
- 請求項1〜9のいずれか記載のラクトコッカス属菌を含有する菌末。
- 請求項1〜9のいずれか記載のラクトコッカス属菌を含有する医薬用組成物。
- 請求項1〜9のいずれか記載のラクトコッカス属菌を含有する整腸剤。
- 請求項1〜9のいずれか記載のラクトコッカス属菌を用いることを特徴とする、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生育・生残性促進方法。
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