JP5351113B2 - ビフィドバクテリウム属細菌含有発酵食品の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、ラクトコッカス属細菌とビフィドバクテリウム属細菌とを用いて乳原料を発酵させることにより得られる乳製品発酵食品の製造方法、及びそれに好適に用いられるラクトコッカス属細菌に関する。
ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）等のビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属細菌（以下、「ビフィズス菌（bifidobacteria）」ともいう。）は、ヒトの腸管内で形成される腸内菌叢の優勢菌種の一つである。ビフィズス菌は、腸内細菌のバランスを回復する整腸作用や、免疫増強作用、発ガン抑制作用等を有することが知られている。このため、近年、生活者の健康志向の高まりと共に、ビフィズス菌発酵乳等の、生きているビフィズス菌を含む食品への需要が高まっている。
ビフィズス菌は、乳性培地における増殖性が悪い。このため、例えば１×１０7ＣＦＵ（colony forming unit）／ｍＬのビフィズス菌を含有させるためには、通常、発酵乳中に一定量の様々な生育促進物質を添加することが行われている。
しかし、前記生育促進物質は一般的に高価であり、かつ、風味が損なわれるおそれもある。また、ビフィズス菌は、酸性条件下での保存が難しく、死滅し易い。このため、ビフィズス菌が一旦増殖しても、発酵乳製品等が流通する過程で、発酵乳製品中の生きているビフィズス菌量は加速度的に減少してしまう。
そこで、ビフィズス菌の生育性や保存生残性を改善することにより、生きているビフィズス菌を多く含有する発酵乳を製造するとともに、生きているビフィズス菌が、製造直後と同様に、消費者が摂食する時点においても豊富に含有されている発酵乳を製造することが課題となっている。
ビフィズス菌を、それ以外の乳酸菌と混合発酵させることにより、該生育促進物質等を添加することなく、ビフィズス菌の生育性や保存生残性を改善する種々の方法が開示されている。
発酵乳製造におけるビフィズス菌の生育性を改善させる方法については、例えば、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス（Lactococcuslactis subsp. cremoris）、およびビフィズス菌を含有することを特徴とするヨーグルト及びその製造方法が開示されている（例えば、特許文献１参照）。
その他、発酵乳のビフィズス菌の保存生残性を改善させる方法については、例えば、乳を主成分とする培地で、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）、並びにダイアセチル及びアセトインを生成しないラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスを混合培養することを特徴とするビフィズス菌発酵乳の製造方法が開示されている（例えば、特許文献２参照）。
また、細胞壁局在性タンパク質分解酵素（cell wall-enveloped proteinase, PrtP）を有するラクトコッカス・ラクティスと、ビフィドバクテリウム属菌とを用いて発酵用ベースを発酵させることを特徴とする、発酵乳の製造方法（例えば、特許文献３参照）や、細胞壁局在性タンパク質分解酵素を有する乳酸菌の菌体破砕物又は前記乳酸菌から分画された前記酵素画分を添加した、乳タンパク質を含有する培地に、ビフィドバクテリウム属菌を接種することを特徴とするビフィドバクテリウム属菌含有組成物の製造方法（例えば、特許文献４参照）、さらには、10%還元脱脂粉乳培地における発酵性を有し、且つビフィドバクテリウム・ロンガムに対する増殖促進効果と生残性改善効果を有するラクトコッカスを用いることを特徴とする、発酵乳の製造方法、及び、該製造方法により製造された発酵乳が開示されている（例えば、特許文献５参照）。
前記のように、食品中でのビフィズス菌の生育性や保存生残性を改善する技術が提案されているが、いずれもラクトコッカス・ラクティスの亜種に属する細菌を用いた方法であり、その他のラクトコッカス属に関する知見はこれまで得られていなかった。
ラクトコッカス・ラクティス亜種細菌は、幅広く乳製品の発酵に用いられていることから、これらに感染するファージも世界中に広がっている。製造工程におけるファージ汚染は非常に深刻な問題であり、一度ファージに汚染された工場では、同一のラクトコッカス・ラクティス菌株を用いて製造することは非常に困難となり、別の菌株を使用しなければならない。
しかも、ファージによっては、宿主となる乳酸菌が同一菌種であれば様々な菌株に感染してしまうケースが見受けられるため、幅広く利用されているラクトコッカス・ラクティス亜種菌株を製造に使用する場合は、ファージ汚染の確率が高くなってしまう問題があり、ラクトコッカス・ラクティス亜種以外の、幅広い菌種が求められている。しかしながら、ラクトコッカス・ラクティス亜種以外には、ビフィズス菌の保存生残性を改善させ得るラクトコッカス属細菌は報告されていない。
本発明は、ラクトコッカス・ラクティス亜種のファージに感染しにくく、かつビフィドバクテリウム属細菌の保存生残性を改善させ得る乳酸菌を用いた乳製品の製造方法、及び、該製造方法により製造された乳製品・発酵乳、並びに前記乳酸菌を含むビフィドバクテリウム属細菌入り乳原料発酵用スターターを提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ラクトコッカス・ラフィノラクティスの一部の菌株を、ビフィドバクテリウム属細菌と混合発酵させた場合に、ビフィドバクテリウム属細菌の保存生残性が向上されることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、ラクトコッカス・ラフィノラクティス、及びビフィドバクテリウム属細菌を用いて、乳原料を発酵させることを特徴とする発酵食品の製造方法であって、
前記ラクトコッカス・ラフィノラクティスは、１％（Ｗ／Ｗ）グルコース、及び１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に同細菌を培地１ｍｌ当たり５．０×１０6 〜２．０×１０8 ＣＦＵ及び、ビフィドバクテリウム属細菌を培地１ｍｌ当たり１．０×１０7 〜３．０×１０9 ＣＦＵ、各々接種して培養し、培地のｐＨが４．６〜５．５に達した時点で培地を急冷して、１０℃で２週間保存した場合のビフィドバクテリウム属細菌の生残率を３０％以上に維持する性質を有する、発酵食品の製造方法、である。
また、本発明は、前記方法により製造された発酵食品を提供する。
また、本発明は、ラクトコッカス・ラフィノラクティスからなる乳原料発酵用スターターであって、前記ラクトコッカス・ラフィノラクティスは、１％（Ｗ／Ｗ）グルコース、及び１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に同細菌を培地１ｍｌ当たり５．０×１０6 〜２．０×１０8 ＣＦＵ、及び、ビフィドバクテリウム属細菌を培地１ｍｌ当たり１．０×１０7 〜３．０×１０9 ＣＦＵ、各々接種して培養し、培地のｐＨが４．６〜５．５に達した時点で培地を急冷して、１０℃で２週間保存したときのビフィドバクテリウム属細菌の生残率を３０％以上に維持する性質を有する、ビフィドバクテリウム属細菌入り乳原料発酵用スターターを提供する。
前記ラクトコッカス・ラフィノラクティスは、１％（Ｗ／Ｗ）グルコース、及び１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に同細菌を培地１ｍｌ当たり５．０×１０6 〜２．０×１０8 ＣＦＵ及び、ビフィドバクテリウム属細菌を培地１ｍｌ当たり１．０×１０7 〜３．０×１０9 ＣＦＵ、各々接種して培養し、培地のｐＨが４．６〜５．５に達した時点で培地を急冷して、１０℃で２週間保存した場合のビフィドバクテリウム属細菌の生残率を３０％以上に維持する性質を有する、発酵食品の製造方法、である。
また、本発明は、前記方法により製造された発酵食品を提供する。
また、本発明は、ラクトコッカス・ラフィノラクティスからなる乳原料発酵用スターターであって、前記ラクトコッカス・ラフィノラクティスは、１％（Ｗ／Ｗ）グルコース、及び１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に同細菌を培地１ｍｌ当たり５．０×１０6 〜２．０×１０8 ＣＦＵ、及び、ビフィドバクテリウム属細菌を培地１ｍｌ当たり１．０×１０7 〜３．０×１０9 ＣＦＵ、各々接種して培養し、培地のｐＨが４．６〜５．５に達した時点で培地を急冷して、１０℃で２週間保存したときのビフィドバクテリウム属細菌の生残率を３０％以上に維持する性質を有する、ビフィドバクテリウム属細菌入り乳原料発酵用スターターを提供する。
本発明の発酵食品の製造方法、及び、ビフィドバクテリウム属細菌入り乳原料発酵用スターターは、前記ラクトコッカス・ラフィノラクティスは、１％（Ｗ／Ｗ）グルコース、及び１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に同細菌を培地１ｍｌ当たり５．０×１０6 〜２．０×１０8 ＣＦＵ、及び、ビフィドバクテリウム属菌を培地１ｍｌ当たり１．０×１０7 〜３．０×１０9 ＣＦＵ、各々接種して培養し、培地のｐＨが４．６〜５．５に達した時点で培地を急冷して、１０℃で２週間保存したときの溶存酸素濃度を、２ｐｐｍ以下に維持する性質を有することを好ましい態様としている。
また、本発明は、前記ラクトコッカス・ラフィノラクティスが、ラクトコッカス・ラフィノラクティスLcR21（FERM ABP-11278）、及びラクトコッカス・ラフィノラクティスLcR32（FERM ABP-11279）からなる群より選択されることをことを好ましい態様としている。
また、本発明は、前記ビフィドバクテリウム属菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガムであることを好ましい態様としている。
また、本発明は、前記ビフィドバクテリウム・ロンガムが、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株であることを好ましい態様としている。
また、本発明は、前記ビフィドバクテリウム・ロンガムが、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株であることを好ましい態様としている。
また、本発明は、さらに、ストレプトコッカス・サーモフィラスおよびラクトバチルス・デルブルッキーからなる群より選択される乳酸菌とを発酵に用いることを好ましい態様としている。
また、本発明は、ラクトコッカス・ラフィノラクティスLcR21（FERM ABP-11278）、及びラクトコッカス・ラフィノラクティスLcR32（FERM ABP-11279）からなる群より選択される菌株を提供する。
本発明の発酵食品の製造方法により、ビフィドバクテリウム属細菌、特にビフィドバクテリウム・ロンガムを多く含有する発酵食品を効率よく製造することができる。また、本発明の発酵食品の製造方法により製造された発酵食品は、健康管理上有用なものである。また、本発明により製造される発酵食品は、製造中及び保存中に、ラクトコッカス・ラクティス亜種細菌に感染するファージに感染しにくい。
また、本発明のビフィドバクテリウム属細菌入り乳原料発酵用スターターは、前記発酵食品の製造に使用することができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いる細菌は、ラクトコッカス・ラフィノラクティスであって、１％（Ｗ／Ｗ）グルコース、及び１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に同細菌を培地１ｍｌ当たり５．０×１０6 〜２．０×１０8 ＣＦＵ、及び、ビフィドバクテリウム属細菌を培地１ｍｌ当たり１．０×１０7 〜３．０×１０9 ＣＦＵ、好ましくは１．０×１０7 〜５．０×１０7 ＣＦＵ、各々接種して培養し、培地のｐＨが４．６〜５．５に達した時点で培地を急冷して、１０℃で２週間保存したときのビフィドバクテリウム属細菌の生残率を３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上に維持する性質を有するラクトコッカス・ラフィノラクティスである。
本発明に用いる細菌は、ラクトコッカス・ラフィノラクティスであって、１％（Ｗ／Ｗ）グルコース、及び１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に同細菌を培地１ｍｌ当たり５．０×１０6 〜２．０×１０8 ＣＦＵ、及び、ビフィドバクテリウム属細菌を培地１ｍｌ当たり１．０×１０7 〜３．０×１０9 ＣＦＵ、好ましくは１．０×１０7 〜５．０×１０7 ＣＦＵ、各々接種して培養し、培地のｐＨが４．６〜５．５に達した時点で培地を急冷して、１０℃で２週間保存したときのビフィドバクテリウム属細菌の生残率を３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上に維持する性質を有するラクトコッカス・ラフィノラクティスである。
１％（Ｗ／Ｗ）グルコース、及び１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地は、グルコースが１％（Ｗ／Ｗ）、及び還元脱脂粉乳が１０％（Ｗ／Ｗ）となるように、水に溶解し、殺菌することによって製造することができる。殺菌は、例えば、８０〜１２２℃で４０〜５分間、好ましくは８５〜９５℃で３５〜５分間の加熱処理により行うことができる。
前記細菌の細胞数（ＣＦＵ）は、適当に希釈した菌の懸濁液を、好適な寒天培地、例えばＢＣＰ加プレートカウント寒天培地（栄研化学社製）に広げ、出現するコロニー数によって測定することができる。
生残率は、保存開始時の生菌数に対する保存後の生菌数の割合をいう。
生残率は、保存開始時の生菌数に対する保存後の生菌数の割合をいう。
本発明の一態様では、上記ラクトコッカス・ラフィノラクティスは、１％（Ｗ／Ｗ）グルコース、及び１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に同細菌を培地１ｍｌ当たり５．０×１０6 〜２．０×１０8 ＣＦＵ、及び、ビフィドバクテリウム属細菌を培地１ｍｌ当たり１．０×１０7 〜３．０×１０9 ＣＦＵ、好ましくは１．０×１０7 〜５．０×１０7 ＣＦＵ、各々接種して培養し、培地のｐＨが４．６〜５．５に達した時点で培地を急冷して、１０℃で２週間保存したときの溶存酸素濃度を、２ｐｐｍ以下、好ましくは１ｐｐｍ以下、より好ましくは０．５ｐｐｍ以下に維持する性質を有することが好ましい。ビフィドバクテリウム属細菌は、培地中の溶存酸素濃度が高いと生育し難くなるため、ラクトコッカス・ラフィノラクティスをビフィドバクテリウム属細菌とともに用いて乳原料を発酵させる場合、ラクトコッカス・ラフィノラクティスは、培地中の溶存酸素濃度を高めないものであることが好ましい。
上記のような性質を有するラクトコッカス・ラフィノラクティス菌株は、ビフィドバクテリウム属細菌入り乳原料発酵用スターターとして好適である。本発明の「ビフィドバクテリウム属細菌入り乳原料発酵用スターター」とは、このような、ビフィドバクテリウム属細菌を含有する発酵食品を製造するためのスターター、すなわち、発酵食品を製造するためにビフィドバクテリウム属細菌とともに乳原料に接種される細菌をいう。
上記のような性質を有するラクトコッカス・ラフィノラクティス菌株は、ビフィドバクテリウム属細菌入り乳原料発酵用スターターとして好適である。本発明の「ビフィドバクテリウム属細菌入り乳原料発酵用スターター」とは、このような、ビフィドバクテリウム属細菌を含有する発酵食品を製造するためのスターター、すなわち、発酵食品を製造するためにビフィドバクテリウム属細菌とともに乳原料に接種される細菌をいう。
本発明に用いるラクトコッカス・ラフィノラクティスの具体的菌株としては、ラクトコッカス・ラフィノラクティスLcR21（FERM ABP-11278）、及びラクトコッカス・ラフィノラクティスLcR32（FERM ABP-11279）が挙げられる。これらの菌株は、平成２２年８月１１日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、各々カッコ内に記載された受領番号で、ブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
本発明の方法は、上記のような性質を有するラクトコッカス・ラフィノラクティス（以下、「本発明のラクトコッカス・ラフィノラクティス」と記載することがある。）と、ビフィドバクテリウム属細菌とを用いて、乳原料を発酵させることにより、発酵食品を製造する方法である。
ビフィドバクテリウム属細菌としては、特に制限されないが、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、及び、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスに再分類されている）が挙げられる。これらの中では、ビフィドバクテリウム・ロンガムが好ましい。また、ビフィドバクテリウム・ロンガムとしてより具体的には、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株が挙げられる。同菌株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America）から購入することができる。
乳原料（milk raw material）としては、乳由来の原料であって、本発明のラクトコッカス・ラフィノラクティス、及びビフィドバクテリウム属細菌、並びに必要に応じて他の乳酸菌を用いて発酵させることにより、発酵食品を製造することができるものであれば特に制限されず、乳又はその分画物又は加工品、例えば牛乳、脱脂乳、生クリーム、バター、全粉乳、及び脱脂粉乳、又はこれらを水に混合、溶解または懸濁させたもの等が挙げられる。乳原料は、必要に応じて蔗糖等の甘味料、ペクチン、果実、フルーツジュース、寒天、ゼラチン、油脂、香料、着色料、安定剤、還元剤等を配合されてもよい。乳原料は、発酵前に、常法に従って殺菌、均質化、冷却等を施してもよい。
本発明のラクトコッカス・ラフィノラクティス、及びビフィドバクテリウム属細菌の乳原料への接種量は特に制限されないが、本発明の乳酸菌については好ましくは１０4〜１０8ＣＦＵ／ｍｌ乳原料、より好ましくは１０6〜１０7ＣＦＵ／ｍｌ乳原料、ビフィドバクテリウム属細菌については好ましくは１０5〜１０9ＣＦＵ／ｍｌ乳原料、より好ましくは１０7〜１０8ＣＦＵ／ｍｌ乳原料である。また、本発明のラクトコッカス・ラフィノラクティス、及びビフィドバクテリウム属細菌の接種量の比は特に制限されないが、１０００：１〜１：１０が好ましく、１０：１〜１：１がより好ましい。
乳原料に接種する他の乳酸菌は、単一の菌株であってもよく、複数の菌株であってもよい。また、ビフィドバクテリウム属細菌も、単一の菌株であってもよく、複数の菌株であってもよい。
乳原料に接種する本発明のラクトコッカス・ラフィノラクティス、及びビフィドバクテリウム属細菌、並びに必要に応じて他の乳酸菌は、予め他の培地で種培養又は前培養しておくことが好ましい。培地としては、ラクトコッカス・ラフィノラクティス、及びビフィドバクテリウム属細菌、並びに必要に応じて他の乳酸菌の培養に適した培地であれば特に制限されないが、例えば、還元脱脂粉乳を含む培地が挙げられる。還元脱脂粉乳の濃度は、３％（Ｗ／Ｗ）以上が好ましく、８％（Ｗ／Ｗ）以上が特に好ましい。また種培養又は前培養に用いられる培地には、酵母エキス等の生育促進物質や、Ｌ−システイン等の還元剤等を添加してもよい。特にビフィドバクテリウム属細菌は、還元脱脂粉乳を含む培地での増殖性が低いため、生育促進物質、例えば、０．１〜１％（Ｗ／Ｗ）の酵母エキスを含有する培地を用いることが好ましい。培地の殺菌条件は、前記と同様である。
必要に応じて、乳原料に、本発明のラクトコッカス・ラフィノラクティス、及びビフィドバクテリウム属細菌に加えて、他の乳酸菌を加えて発酵を行ってもよい。他の乳酸菌としては、食品の製造に用いられるものであって、ラクトコッカス・ラフィノラクティス、及びビフィドバクテリウム属細菌の生育を阻害しないものであれば特に制限されないが、例えば発酵食品がヨーグルトの場合、ストレプトコッカス・サーモフィルス、および、ラクトバチルス・デルブルッキー等が挙げられる。これらの乳酸菌は、単一の菌株であってもよく、複数の菌株であってもよい。
本発明のラクトコッカス・ラフィノラクティス、及びビフィドバクテリウム属細菌を用いて乳を発酵させた場合、通常、ｐＨが５付近であり、ドリンクヨーグルトが得られる。さらにストレプトコッカス・サーモフィルスやラクトバチルス・デルブルッキー等の乳酸菌を併用して発酵させると、ｐＨが低下し、よりしっかりとした組織を有したヨーグルト（スプーンで摂取できるヨーグルト）を製造することができる。
本発明のラクトコッカス・ラフィノラクティス及びビフィドバクテリウム属細菌の接種量と、上記他の乳酸菌の接種量の比率は特に制限されないが、１０００：１〜１０：１が好ましい。
本発明のラクトコッカス・ラフィノラクティス、ビフィドバクテリウム属細菌、及び他の乳酸菌を乳原料に接種する順序は特に問わず、全てを同時に投与してもよい。また、これらの細菌のうち任意の細菌を、複数回接種してもよい。
培養温度、培養時間等の発酵条件は、通常の乳原料からの発酵食品の製造と同様の条件を採用することができる。例えば、培養温度は３０℃〜４０℃が好ましく、３６℃〜３８℃がより好ましい。培養時間は、製造する発酵食品の種類によって適宜設定することができるが、通常、５〜１８時間が好ましい。
得られた発酵食品は、通常の乳原料からの発酵食品と同様に適宜加工することができる。例えば、発酵後の発酵食品をそのまま食品としてもよいし、均質化して液状に加工してもよい。さらに、蔗糖等の甘味料、ペクチン、果実、フルーツジュース、寒天、ゼラチン、油脂、香料、着色料、安定剤、還元剤等を添加してもよい。また、発酵食品は、適宜、容器に充填してもよい。
上記のようにして製造される発酵食品は、ビフィドバクテリウム属細菌の保存生残性に優れている。また、本発明により製造される発酵食品に含まれるラクトコッカス・ラフィノラクティスは、該発酵食品の製造中及び保存中に、ラクトコッカス・ラクティス亜種細菌に感染するファージ、例えば、MCCφ223等の９３６タイプファージ等の感染を受けない。
次に、試験例及び実施例を示して本発明をさらに具体的に説明する。
〔試験例１〕ラクトコッカス属細菌の自然界からの単離
ラクトコッカス属細菌を自然界から取得すべく、日本国内の自然界から採集したサンプルを嫌気性希釈液（１９８０年叢文社発行、光岡知足著「腸内菌の世界」３２２ページ。）で希釈し、下記組成のBriggs liver broth（前記文献、３１９ページ）の平板（寒天１５g/Lを含む）に塗布し、３０℃で嫌気培養した。
ラクトコッカス属細菌を自然界から取得すべく、日本国内の自然界から採集したサンプルを嫌気性希釈液（１９８０年叢文社発行、光岡知足著「腸内菌の世界」３２２ページ。）で希釈し、下記組成のBriggs liver broth（前記文献、３１９ページ）の平板（寒天１５g/Lを含む）に塗布し、３０℃で嫌気培養した。
〔嫌気性希釈液〕
塩類溶液I（0.78% K2HPO4溶液） 37.5 ml
塩類溶液II（0.47% KH2PO4、1.18% NaCl、
1.20% (NH4)2SO4、0.12% CaCl2、0.25%
MgSO4・H2O を含む溶液） 37.5 ml
Resazurin （0.1%水溶液） 1 ml
Ｌ−システイン HCl・H2O 0.5 g
Ｌ−アスコルビン酸 （25%水溶液） 2 ml
Na2CO3 （8%溶液） 50 ml
寒天 0.5 g
精製水 860 ml
塩類溶液I（0.78% K2HPO4溶液） 37.5 ml
塩類溶液II（0.47% KH2PO4、1.18% NaCl、
1.20% (NH4)2SO4、0.12% CaCl2、0.25%
MgSO4・H2O を含む溶液） 37.5 ml
Resazurin （0.1%水溶液） 1 ml
Ｌ−システイン HCl・H2O 0.5 g
Ｌ−アスコルビン酸 （25%水溶液） 2 ml
Na2CO3 （8%溶液） 50 ml
寒天 0.5 g
精製水 860 ml
〔Briggs liver broth〕
トマトジュース浸出液 400 ml
ネオペプトン（Difco） 15 g
酵母エキス（Difco） 6 g
肝臓エキス 75 ml
グルコース 20 g
可溶性でんぷん 0.5 g
NaCl 5 g
Tween 80 1 g
Ｌ−システイン HCl・H2O 0.2 g
精製水 525 ml
pH 6.8
トマトジュース浸出液 400 ml
ネオペプトン（Difco） 15 g
酵母エキス（Difco） 6 g
肝臓エキス 75 ml
グルコース 20 g
可溶性でんぷん 0.5 g
NaCl 5 g
Tween 80 1 g
Ｌ−システイン HCl・H2O 0.2 g
精製水 525 ml
pH 6.8
そして、得られたコロニーの中で連鎖球菌の形態を示し、かつ塗布標本の顕微鏡観察によりグラム陽性である菌を釣菌した。これらの菌を、下記組成のＢＬ寒天培地平板に画線塗布し、前記と同様の方法で嫌気培養を反復し、純粋単離された菌株を得た。
〔ＢＬ寒天培地〕
Lab-Lemco powder（Oxoid） 2.4 g
プロテオースペプトン No.3（Difco） 10 g
トリプチケース（Trypticase）（BBL） 5 g
フィトン（Phytone） 3 g
酵母エキス（Difco） 5 g
肝臓エキス 150 ml
グルコース 10 g
可溶性でんぷん 0.5 g
溶液Ａ 10 ml
トーレシリコンSH5535（10%溶液） 5 ml
Tween 80 1 g
寒天 15 g
Ｌ−システイン HCl・H2O 0.5 g
馬血液 50 ml
pH 7.2
肝臓エキス：肝臓末（極東）10gを170mlの精製水で50〜60℃の温浴槽中約１時間浸出した後、100℃で数分間加熱し、pH 7.2に調整してから濾紙で濾過する。
溶液Ａ：MgSO4・7H2O 15g、FeSO4・7H2O 0.5g、NaCl 0.5g、MnSO4 0.337gを精製水250mlに溶解する。
Ｌ−システインと馬血液以外の成分を湯煎して溶解させ、pHを調整し、115℃で20分滅菌後、50℃に冷却し、Ｌ−システインと馬血液を加え、シャーレに分注して平板とする。
Lab-Lemco powder（Oxoid） 2.4 g
プロテオースペプトン No.3（Difco） 10 g
トリプチケース（Trypticase）（BBL） 5 g
フィトン（Phytone） 3 g
酵母エキス（Difco） 5 g
肝臓エキス 150 ml
グルコース 10 g
可溶性でんぷん 0.5 g
溶液Ａ 10 ml
トーレシリコンSH5535（10%溶液） 5 ml
Tween 80 1 g
寒天 15 g
Ｌ−システイン HCl・H2O 0.5 g
馬血液 50 ml
pH 7.2
肝臓エキス：肝臓末（極東）10gを170mlの精製水で50〜60℃の温浴槽中約１時間浸出した後、100℃で数分間加熱し、pH 7.2に調整してから濾紙で濾過する。
溶液Ａ：MgSO4・7H2O 15g、FeSO4・7H2O 0.5g、NaCl 0.5g、MnSO4 0.337gを精製水250mlに溶解する。
Ｌ−システインと馬血液以外の成分を湯煎して溶解させ、pHを調整し、115℃で20分滅菌後、50℃に冷却し、Ｌ−システインと馬血液を加え、シャーレに分注して平板とする。
これらの菌株のゲノムＤＮＡの塩基配列を常法により同定した。ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information、国立バイオテクノロジー情報センター）の国際塩基配列データベース（GenBank）上で、ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool、http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）による16S リボソーマルRNA遺伝子配列の全長についての相同性検索を行い、それぞれのタイプストレインと９８％以上の相同性を有するラクトコッカス・ラフィノラクティス(Lactococcus raffinolactis)を２０株同定した。得られた菌株はすべて無芽胞、非運動性の通性嫌気性グラム陽性球菌で、カタラーゼおよびガス産生はいずれも陰性であった。
〔試験例２〕ビフィドバクテリウム・ロンガムとの混合培養試験
まず、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株を、０．６％（Ｗ／Ｗ）酵母エキス及び１１％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に、培地 1mlあたり1.0×106〜5.0×107CFU接種し、３７℃で１６時間培養して、シードカルチャーを得た。
また、ラクトースおよびグルコースを０．５％添加したDifco（登録商標）M17 Broth（ベクトン・ディッキンソン社製）に、ラクトコッカス各菌株、及び表１に記載の菌株の試験例１で得られた培養液を３％接種し、３０℃で１６時間培養した。各培養菌体を、遠心分離により集菌し、洗浄後、元の培養液と同量の乳性培地（１％グルコース（Ｗ／Ｗ）、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳）に懸濁し、シードカルチャーを得た。菌株名がJCMで始る菌株は、独立行政法人理化学研究所微生物系統保存施設（JCM）（〒351-0198 埼玉県和光市広沢2-1）から入手することができる。
前記と同じ組成の乳性培地（９５℃で１０分間殺菌）に、前記のように調製したラクトコッカスの各菌株のシードカルチャー、又は同様にして調製した各種ラクトコッカス属細菌のシードカルチャーを培地 1mlあたり5.0×106〜2.0×108CFUと、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株のシードカルチャーを培地 1mlあたり1.0〜5.0×107CFU 接種し、３７℃で１６時間培養して発酵乳を得た。
前記発酵乳を急冷し、ｐＨ及び含有されるビフィズス菌数、及び溶存酸素を測定した。ビフィズス菌数の測定は、ＴＯＳプロピオン酸寒天培地（ヤクルト薬品工業社製）平板で行った。また、溶存酸素の測定は、発酵乳の温度を10℃に保ちながら蛍光式酸素計FO-960S (ASR社製)を用いて計測した。測定結果を表１に示す。表１中、「E+N」は、「×10n」を表す。
一部の菌株は、２週間の10℃保存後に、ビフィズス菌を３０％以上生残させていた。これらの菌株はいずれも、２週間保存後の発酵乳中の溶存酸素が2.0ppm以下であった。
〔試験例３〕
試験例で得られた、ビフィドバクテリウム属細菌の生残率を３０％以上に高める菌株について、ファージ感受性試験を実施した。ラクトコッカス・ラクティス FERM BP-10742をはじめ、様々なラクトコッカス・ラクティス菌株に感染する９３６タイプファージ(MCCφ223)を、前記と同じ組成の乳性培地３ｍｌに1.0×105PFU（plaque forming unit）、および前記のように調製したラクトコッカスの各菌株のシードカルチャーを、培地 1mlあたり5.0×106〜2.0×108 添加し、30℃、16時間培養した後の培地の凝固性を確認した。結果を表２に示す。
試験例で得られた、ビフィドバクテリウム属細菌の生残率を３０％以上に高める菌株について、ファージ感受性試験を実施した。ラクトコッカス・ラクティス FERM BP-10742をはじめ、様々なラクトコッカス・ラクティス菌株に感染する９３６タイプファージ(MCCφ223)を、前記と同じ組成の乳性培地３ｍｌに1.0×105PFU（plaque forming unit）、および前記のように調製したラクトコッカスの各菌株のシードカルチャーを、培地 1mlあたり5.0×106〜2.0×108 添加し、30℃、16時間培養した後の培地の凝固性を確認した。結果を表２に示す。
幅広くラクトコッカス・ラクティス菌株に感染するファージも、ラクトコッカス・ラフィノラクティスには感染しなかった。本試験は、ファージMCCφ223に限定されるものではなく、その他公的機関より得られるラクトコッカス・ラクティス菌株に感染するファージを用いても、同様の結果を得ることができる。
〔実施例１〕
１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地１０００ｍＬ（９０℃で３０分間殺菌）に、ラクトコッカス・ラフィノラクティスLcR21株のシードカルチャーを３０ｍＬ接種し、２５℃で１６時間培養した。一方、０．２％（Ｗ／Ｗ）酵母エキス、及び１１％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地１０００ｍＬ（９０℃で３０分間殺菌）に、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株のシードカルチャーを１００ｍＬ接種し、３７℃で４時間培養した。
なお、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株のシードカルチャーは、０．６％（Ｗ／Ｗ）酵母エキス及び１１％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株を1.0×106〜5.0×107CFU接種し、３７℃で１６時間培養して得た。
１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地１０００ｍＬ（９０℃で３０分間殺菌）に、ラクトコッカス・ラフィノラクティスLcR21株のシードカルチャーを３０ｍＬ接種し、２５℃で１６時間培養した。一方、０．２％（Ｗ／Ｗ）酵母エキス、及び１１％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地１０００ｍＬ（９０℃で３０分間殺菌）に、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株のシードカルチャーを１００ｍＬ接種し、３７℃で４時間培養した。
なお、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株のシードカルチャーは、０．６％（Ｗ／Ｗ）酵母エキス及び１１％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株を1.0×106〜5.0×107CFU接種し、３７℃で１６時間培養して得た。
これとは別に、原料として脱脂粉乳、全粉乳、蔗糖及びペクチンを混合溶解し、乳脂肪０．５％（Ｗ／Ｗ）、無脂乳固形分８．０％（Ｗ／Ｗ）、蔗糖８．０％（Ｗ／Ｗ）、ペクチン０．２％（Ｗ／Ｗ）からなる乳原料５０Ｌを、９０℃で１０分間殺菌し、４０℃に冷却した。前記殺菌した乳原料に、前記の通り前培養を行ったラクトコッカス・ラフィノラクティスLcR21株のカルチャー５００ｍＬとビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株のカルチャー５００ｍＬを接種し、３７℃で２０時間培養して発酵乳を得た。
前記発酵乳を直ちに攪拌冷却し、冷却発酵乳を１５ＭＰａの圧力で均質化し、２００ｍＬ容のガラス容器に充填し、密封し、ドリンクヨーグルトを得た。得られたドリンクヨーグルトは乳酸酸度０．６６％、ｐＨ４．９、６．６×１０7ＣＦＵ／mlのビフィズス菌を含有していた。このドリンクヨーグルトを１０℃で１４日間保存した時のビフィズス菌数は４．４×１０7ＣＦＵ／mlであり、生残率は６６％であった。また、この時の溶存酸素濃度は1.49ppmであった。
〔実施例３〕ヨーグルトの製造（Ｉ）
還元脱脂粉乳１０％（Ｗ／Ｗ）を含む培地１０００ｍＬに、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスFERM BP-10758株のシードカルチャーを３０ｍＬ接種し、３７℃、１６時間培養した。一方、酵母エキス０．１％（Ｗ／Ｗ）、及び還元脱脂粉乳１０％（Ｗ／Ｗ）を含む培地（９０℃で３０分間殺菌）１０００ｍＬにストレプトコッカス・サーモフィルスFERM P-17216株のシードカルチャーを３０ｍＬ接種し、３７℃、５時間培養した。
なお、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスFERM BP-10758株のシードカルチャーは、０．１％（Ｗ／Ｗ）酵母エキスおよび１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に、1.0×105〜1.0×107CFU接種し、３７℃で１６時間培養して得た。
なお、ストレプトコッカス・サーモフィルスFERM P-17216株のシードカルチャーは、０．１％（Ｗ／Ｗ）酵母エキスおよび１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に、1.0×105〜1.0×107CFU接種し、３７℃で１６時間培養して得た。
還元脱脂粉乳１０％（Ｗ／Ｗ）を含む培地１０００ｍＬに、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスFERM BP-10758株のシードカルチャーを３０ｍＬ接種し、３７℃、１６時間培養した。一方、酵母エキス０．１％（Ｗ／Ｗ）、及び還元脱脂粉乳１０％（Ｗ／Ｗ）を含む培地（９０℃で３０分間殺菌）１０００ｍＬにストレプトコッカス・サーモフィルスFERM P-17216株のシードカルチャーを３０ｍＬ接種し、３７℃、５時間培養した。
なお、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスFERM BP-10758株のシードカルチャーは、０．１％（Ｗ／Ｗ）酵母エキスおよび１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に、1.0×105〜1.0×107CFU接種し、３７℃で１６時間培養して得た。
なお、ストレプトコッカス・サーモフィルスFERM P-17216株のシードカルチャーは、０．１％（Ｗ／Ｗ）酵母エキスおよび１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に、1.0×105〜1.0×107CFU接種し、３７℃で１６時間培養して得た。
脱脂粉乳、クリーム及び乳タンパク質を混合溶解し、乳脂肪３．０％（Ｗ／Ｗ）、無脂乳固形分１２．０％（Ｗ／Ｗ）からなる乳原料５０Ｌを７０℃に加温し、１５ＭＰａの圧力で均質化した。さらに、９０℃で１０分間殺菌し、４０℃に冷却した。
この殺菌した乳原料に、前記の通り、前培養を行ったラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスFERM BP-10758株のカルチャーを１５０ｍＬ、ストレプトコッカス・サーモフィルスFERM P-17216株のカルチャーを４５０ｍＬ、実施例１のLcC46株と同様の方法にて前培養を行ったラクトコッカス・ラフィノラクティスLcR32株のカルチャー５００ｍＬと、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株のカルチャー５００ｍＬを接種し、３７℃で４時間培養し、直ちに攪拌冷却し、１００ｍＬ容の紙カップ容器に充填し、密封し、ヨーグルトを得た。
得られたヨーグルトは乳酸酸度０．６９％、ｐＨ４．８９、１．０×１０8ＣＦＵ／ｍｌのビフィズス菌を含有していた。このヨーグルトを１０℃で１４日間保存した時のビフィズス菌数は９．３×１０7ＣＦＵ／ｍｌであり、生残率は９３％であった。また、この時の溶存酸素濃度は0.69ppmであった。
Claims (11)
- ラクトコッカス・ラフィノラクティスLcR21（FERM BP-11278）、及びラクトコッカス・ラフィノラクティスLcR32（FERM BP-11279）からなる群より選択されるラクトコッカス・ラフィノラクティス、並びにビフィドバクテリウム属細菌を用いて、乳原料を発酵させることを特徴とする発酵食品の製造方法であって、
前記ラクトコッカス・ラフィノラクティスは、１％（Ｗ／Ｗ）グルコース、及び１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に同細菌を培地１ｍｌ当たり５．０×１０6 〜２．０×１０8 ＣＦＵ、及び、ビフィドバクテリウム属細菌を培地１ｍｌ当たり１．０×１０7 〜３．０×１０9 ＣＦＵ、各々接種して培養し、培地のｐＨが４．６〜５．５に達した時点で培地を急冷して、１０℃で２週間保存した場合のビフィドバクテリウム属細菌の生残率を３０％以上に維持する性質を有する、発酵食品の製造方法。 - 前記ラクトコッカス・ラフィノラクティスは、１％（Ｗ／Ｗ）グルコース、及び１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に同細菌を培地１ｍｌ当たり５．０×１０6 〜２．０×１０8 ＣＦＵ、及び、ビフィドバクテリウム属細菌を培地１ｍｌ当たり１．０×１０7 〜３．０×１０9 ＣＦＵ、各々接種して培養し、培地のｐＨが４．６〜５．５に達した時点で培地を急冷して、１０℃で２週間保存したときの溶存酸素濃度を、２ｐｐｍ以下に維持する性質を有する、請求項１に記載の方法。
- 前記ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガムである請求項１又は２に記載の方法。
- 前記ビフィドバクテリウム・ロンガムが、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株である、請求項３に記載の方法。
- さらに、ストレプトコッカス・サーモフィラスおよびラクトバチルス・デルブルッキーからなる群より選択される乳酸菌とを発酵に用いることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法により製造された発酵食品。
- ラクトコッカス・ラフィノラクティスLcR21（FERM BP-11278）、及びラクトコッカス・ラフィノラクティスLcR32（FERM BP-11279）からなる群から選択されるラクトコッカス・ラフィノラクティスからなる乳原料発酵用スターターであって、
前記ラクトコッカス・ラフィノラクティスは、１％（Ｗ／Ｗ）グルコース、及び１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に同細菌を培地１ｍｌ当たり５．０×１０6 〜２．０×１０8 ＣＦＵ、及び、ビフィドバクテリウム属細菌を培地１ｍｌ当たり１．０×１０7 〜３．０×１０9 ＣＦＵ、各々接種して培養し、培地のｐＨが４．６〜５．５に達した時点で培地を急冷して、１０℃で２週間保存したときのビフィドバクテリウム属細菌の生残率を３０％以上に維持する性質を有する、ビフィドバクテリウム属細菌入り乳原料発酵用スターター。 - 前記ラクトコッカス・ラフィノラクティスは、１％（Ｗ／Ｗ）グルコース、及び１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に同細菌を培地１ｍｌ当たり５．０×１０6 〜２．０×１０8 ＣＦＵ、及び、ビフィドバクテリウム属細菌を培地１ｍｌ当たり１．０×１０7 〜３．０×１０9 ＣＦＵ、各々接種して培養し、培地のｐＨが４．６〜５．５に達した時点で培地を急冷して、１０℃で２週間保存したときの溶存酸素濃度を、２ｐｐｍ以下に維持する性質を有する、請求項７に記載のビフィドバクテリウム属細菌入り乳原料発酵用スターター。
- 前記ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガムである請求項７又は８のいずれか一項に記載のビフィドバクテリウム属細菌入り乳原料発酵用スターター。
- 前記ビフィドバクテリウム・ロンガムが、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株である請求項９に記載のビフィドバクテリウム属細菌入り乳原料発酵用スターター。
- ラクトコッカス・ラフィノラクティスLcR21（FERM BP-11278）、及びラクトコッカス・ラフィノラクティスLcR32（FERM BP-11279）からなる群より選択される菌株。
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