KR20120127634A - 비피더스균 함유 발효 식품의 제조 방법 - Google Patents

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토시타카 오다마키
스미코 요네자와
히로시 마루야마
노리토시 타카하시
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모리나가 뉴교 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은, 세포벽 국재성 단백질 분해 효소를 갖지 않는 락토코커스?락티스, 예를 들면, 1 ％(W/W) 글루코오스, 및 10 ％(W/W) 환원 탈지분유를 포함하는 배지에 동 세균을 배지 1 ㎖ 당 5.0×106 내지 2.0×108 CFU, 및 비피도박테리움속 세균을 배지 1 ㎖ 당 1.0×107 내지 3.0×109 CFU, 각각 접종하여 배양하고, 배지의 pH가 4.6 내지 5.5에 도달한 시점에 배지를 배양 온도에서 10 ℃로 급랭하여, 10 ℃에서 2주간 보존했을 때의 비피도박테리움속 세균의 생잔율을 30 ％ 이상으로 유지하는 성질을 갖는 락토코커스?락티스와, 비피도박테리움속 세균을 이용하여, 밀크 원료를 발효시킨다.

Description

비피도박테리움속 세균 함유 발효 식품의 제조 방법{METHOD FOR PRODUCING FERMENTED FOOD CONTAINING BIFIDOBACTERIUM BACTERIA}
본 발명은 락토코커스?락티스와 비피도박테리움속 세균을 이용하여 밀크(milk) 원료를 발효시킴으로써 얻어지는 발효 식품의 제조 방법, 및 그것에 바람직하게 이용되는 락토코커스?락티스에 관한 것이다.
비피도박테리움?롱검(Bifidobacterium longum) 등의 비피도박테리움(Bifidobacterium)속 세균(이하, 「비피더스균(bifidobacteria)」이라고도 함)은 인간의 장관 내에서 형성되는 장내 균총의 우세균종의 하나이다. 비피더스균은, 장내 세균의 균형을 회복시키는 정장 작용이나, 면역 증강 작용, 발암 억제 작용 등을 갖는 것이 알려져 있다. 이 때문에, 최근에 소비자의 건강 지향이 높아짐과 함께, 비피더스균 발효유 등의, 살아있는 비피더스균을 포함하는 식품에 대한 수요가 높아지고 있다.
비피더스균은, 유성 배지에서의 증식성이 나쁘다. 이 때문에, 예를 들면 1×107 CFU(colony forming unit, 콜로니 형성 단위)/mL의 비피더스균을 함유시키기 위해서는, 통상, 발효유 중에 일정량의 여러 가지 생육 촉진 물질을 첨가하는 것이 행해지고 있다.
그러나, 상기 생육 촉진 물질은 일반적으로 비싸고, 또한 식품의 풍미를 손상시킬 우려도 있다. 또한, 비피더스균은 산성 조건하에서의 보존이 어렵고, 사멸하기 쉽다. 이 때문에, 발효 유제품 등의 제조 중에 비피더스균이 일단 증식하더라도, 발효 유제품 등이 유통되는 과정에서 발효 유제품 중의 살아있는 비피더스균 양은 가속도적으로 감소해 버린다.
따라서, 비피더스균의 생육성이나 보존 생잔성을 개선함으로써, 살아있는 비피더스균을 많이 함유하는 발효유를 제조함과 함께, 살아있는 비피더스균이, 제조직후와 마찬가지로, 소비자가 섭식하는 시점에서도 풍부히 함유되어 있는 발효유를 제조하는 것이 과제로 되어있다.
비피더스균을, 그것 이외의 유산균과 혼합 발효시킴으로써, 상기와 같은 생육 촉진 물질 등을 첨가하는 일 없이, 비피더스균의 생육성이나 보존 생잔성을 개선하는 여러 가지 방법이 개시되어 있다.
발효유 제조에 있어서의 비피더스균의 생육성을 개선시키는 방법에 대해서는, 예를 들면, 락토코커스?락티스?서브스피시즈?락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis), 락토코커스?락티스?서브스피시즈?크레모리스(Lactococcuslactis subsp. cremoris), 및 비피더스균을 함유하는 것을 특징으로 하는 요구르트 및 그 제조 방법이 개시되어 있다(예를 들면, 특허문헌 1 참조).
그 외, 발효유의 비피더스균의 보존 생잔성을 개선시키는 방법에 대해서는, 예를 들면, 밀크를 주성분으로 하는 배지에서, 비피도박테리움?브레브(Bifidobacterium breve), 및 다이아세틸 및 아세토인을 생성하지 않은 락토코커스?락티스?서브스피시즈?락티스를 혼합 배양하는 것을 특징으로 하는 비피더스균 발효유의 제조 방법이 개시되어 있다(예를 들면, 특허문헌 2 참조).
또한, 예를 들면, 세포벽 국재성 단백질 분해 효소(cell wall-enveloped proteinase, PrtP)를 갖는 락토코커스?락티스와, 비피도박테리움속균을 이용하여 발효용 베이스를 발효시키는 것을 특징으로 하는, 발효유의 제조 방법(예를 들면, 특허문헌 3 참조)이나, 세포벽 국재성 단백질 분해 효소를 갖는 유산균의 균체 파쇄물 또는 상기 유산균으로부터 분획된 상기 효소 분획을 첨가한, 유단백질을 함유하는 배지에, 비피도박테리움속균을 접종하는 것을 특징으로 하는 비피도박테리움속균 함유 조성물의 제조 방법(예를 들면, 특허문헌 4 참조), 또한, 10 ％ 환원 탈지분유 배지에 있어서의 발효성을 갖고, 또한 비피도박테리움?롱검에 관한 증식 촉진 효과와 생잔성 개선 효과를 갖는 락토코커스를 이용하는 것을 특징으로 하는, 발효유의 제조 방법, 및 상기 제조 방법에 의해 제조된 발효유가 개시되어 있다(예를 들면, 특허문헌 5 참조).
일본 특허 제3364491호 공보 일본 특허 제3068484호 공보 일본 특허 제4448896호 공보 일본 특허 공개 제2009-296910호 공보 국제 공개 제2008/099543호 공보
상기한 바와 같이, 비피더스균의 생육성이나 보존 생잔성을 개선하는 여러 가지의 방법이 개시되어 있지만, 개선의 여지가 더 있다. 예를 들면, 상기 특허문헌 1의 방법으로서는, 비피더스균의 생육이 촉진되어, 발효 시간을 단축시킬 수 있지만, 비피더스균의 보존 생잔성에 대해서는 일체 기재가 없다.
한편, 상기 특허문헌 2의 방법으로서는, 특정한 비피더스균과 특정한 유산균으로 이루어지는 혼합균을 이용함으로써, 증식 촉진 효과와 생잔성 개선 효과 양쪽이 인정되지만, 비피도박테리움?브레브 이외의 비피더스균, 예를 들면 식품에 범용되어 있는 비피도박테리움?롱검에 대해서는 일체 기재가 없다. 실제로, 후술하는 바와 같이, 특허문헌 2에 나타내어진 균주(FERM BP-6224)를 이용하여 실험한 바, 비피도박테리움?롱검에 대해서는 충분한 생잔성을 얻을 수 없었다.
또한, 상기 특허문헌 3에 기재된 방법으로서는, 세포벽 국재성 단백질 분해 효소(PrtP)를 갖는 락토코커스?락티스를 이용함으로써, 비피더스균의 증식이 촉진된다는 효과가 있지만, PrtP는 단백질로부터 많은 올리고펩티드나 아미노산을 생성하기 때문에, 쓴맛이나 감칠맛이 생겨 버려, 발효유의 풍미에 영향을 미칠 가능성이 있다(예를 들면, 문헌[Pillidge, C.J. et al., Int. Dairy Journal 2003, 13:345-354]). 특허문헌 4에 기재된 방법도 마찬가지이다.
또한, 문헌[Yonezawa S. et al., J. Dairy Sci. 2010, 93:1815-23], 및 특허문헌 3에 따르면, 탈지 분유 배지에 있어서 발효성을 갖는 락토코커스?락티스는 PrtP를 갖고 있는 점에서, 특허문헌 5에 대해서도 특허문헌 3과 마찬가지로 풍미에 관한 과제가 남아 있었다.
한편, PrtP를 갖고 있지 않은 락토코커스?락티스는, 탈지 분유 배지로부터 충분한 영양을 받아들일 수 없기 때문에, 대부분의 균주는 탈지 분유 배지에서 생육할 수 없고, 비피더스균에 관한 증식 촉진 효과와 생잔성 개선 효과는 인정되지 않았다.
본 발명은 비피도박테리움속 세균의 보존 생잔성을 개선시킬 수 있는 유산균을 이용한, 풍미가 좋은 발효 식품의 제조 방법, 및 상기 제조 방법에 의해 제조된 발효 식품, 및 상기 유산균을 포함하는 비피도박테리움속 세균 함유 밀크 원료 발효용 스타터를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구한 결과, 세포벽 국재성 단백질 분해 효소 PrtP를 갖고 있지 않은 락토코커스?락티스와, 비피도박테리움속 세균을 혼합 발효시킨 경우에, 비피도박테리움속 세균의 보존성을 향상할 수 있는 균주가 존재하는 것을 발견하여, 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은 세포벽 국재성 단백질 분해 효소를 갖지 않는 락토코커스?락티스와, 비피도박테리움속 세균을 이용하여, 밀크 원료를 발효시키는 것을 특징으로 하는 발효 식품의 제조 방법이다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 발효 식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 세포벽 국재성 단백질 분해 효소를 갖지 않는 락토코커스?락티스를 포함하는 비피도박테리움속 세균 함유 밀크 원료 발효용 스타터를 제공한다.
본 발명의 발효 식품의 제조 방법, 및 비피도박테리움속 세균 함유 밀크 원료 발효용 스타터는, 상기 락토코커스?락티스는 1 ％(W/W) 글루코오스, 및 10 ％(W/W) 환원 탈지분유를 포함하는 배지에 동 세균을 배지 1 ㎖ 당 5.0×106 내지 2.0×108 CFU 접종하여, 37 ℃에서 4 내지 24 시간 배양했을 때, 해당 배지가 응고되지 않은 성질을 갖는 것을 바람직한 양태라고 하고 있다.
또한, 본 발명은 상기 락토코커스?락티스는 1 ％(W/W) 글루코오스, 및 10 ％(W/W) 환원 탈지분유를 포함하는 배지에 동 세균을 배지 1 ㎖ 당 5.0×106 내지 2.0×108 CFU, 및 비피도박테리움속 세균을 배지 1 ㎖ 당 1.0×107 내지 3.0×109 CFU, 각각 접종하여 배양하고, 배지의 pH가 4.6 내지 5.5에 도달한 시점에 배지를 배양 온도에서 10 ℃로 급랭하고, 10 ℃에서 2 주간 보존했을 때의 용존 산소 농도를 2 ppm 이하로 유지하는 성질을 갖는 것을 바람직한 양태라고 하고 있다.
또한, 본 발명은 상기 락토코커스?락티스는 1 ％(W/W) 글루코오스, 및 10 ％(W/W) 환원 탈지분유를 포함하는 배지에 동 세균을 배지 1 ㎖ 당 5.0×106 내지 2.0×108 CFU, 및 비피도박테리움속 세균을 배지 1 ㎖ 당 1.0×107 내지 3.0×109 CFU, 각각 접종하여 배양하고, 배지의 pH가 4.6 내지 5.5에 도달한 시점에 배지를 배양 온도에서 10 ℃로 급랭하고, 10 ℃에서 2주간 보존했을 때의 비피도박테리움속 세균의 생잔율을 30 ％ 이상으로 유지하는 성질을 갖는 것을 바람직한 양태라고 하고 있다.
또한, 본 발명은 상기 락토코커스?락티스는 1 ％(W/W) 글루코오스, 및 10 ％(W/W) 환원 탈지분유를 포함하는 배지에 동 세균을 배지 1 ㎖ 당 5.0×106 내지 2.0×108 CFU, 비피도박테리움속 세균을 배지 1 ㎖ 당 1.0×107 내지 3.0×109 CFU, 및 스트렙토코커스?써모필러스 및 락토바실러스?델브루에키?서브스피시즈?불가리쿠스를 각각 배지 1 ㎖ 당 2.0×105 내지 9.0×107 CFU 접종하여, 37 ℃에서 3 내지 24 시간 배양했을 때, 해당 배지가 응고되는 성질을 갖는 것을 바람직한 양태라고 하고 있다.
또한, 본 발명은 상기 락토코커스?락티스가 락토코커스?락티스?서브스피시즈?락티스, 및 락토코커스?락티스?서브스피시즈?크레모리스로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 바람직한 양태라고 하고 있다.
또한, 본 발명은 상기 락토코커스?락티스가 락토코커스?락티스?서브스피시즈?락티스LcL13(FERM BP-11276), 락토코커스?락티스?서브스피시즈?락티스LcL26(FERM BP-11277), 및 락토코커스?락티스?서브스피시즈?크레모리스LcC46(FERM BP-11275)로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 바람직한 양태라고 하고 있다.
또한, 본 발명은 상기 비피도박테리움속 세균이 비피도박테리움?롱검인 것을 바람직한 양태라고 하고 있다.
또한, 본 발명은 상기 비피도박테리움?롱검이 비피도박테리움?롱검 ATCC BAA-999주인 것을 바람직한 양태라고 하고 있다.
또한, 본 발명은 스트렙토코커스?써모필러스 및 락토바실러스?델브루에키로 이루어지는 군에서 선택되는 유산균을 발효에 이용하는 것을 바람직한 양태라고 하고 있다.
또한, 본 발명은 락토코커스?락티스?서브스피시즈?락티스LcL13(FERM BP-11276), 락토코커스?락티스?서브스피시즈?락티스LcL26(FERM BP-11277), 및 락토코커스?락티스?서브스피시즈?크레모리스LcC46(FERM BP-11275)으로 이루어지는 군에서 선택되는 균주를 제공한다.
도 1은, 본 발명의 방법에 의해 제조된 요구르트의 미각 평가 결과를 도시한 도면이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 이용하는 세균은, 세포벽 국재성 단백질 분해 효소를 갖지 않는 락토코커스?락티스다. 세포벽 국재성 단백질 분해 효소(cell wall-enveloped proteinase, EC 3.4.21.96. 「PrtP」라고도 기재함)는, 세포막에 존재하고, 세포 표면에 활성 부위가 드러나 있는 효소이다. 락토코커스?락티스 유래의 PrtP 효소에는, PI 형(α-카제인을 너무 분해하지 않고, β-카제인을 C 말단의 근변으로부터 잘 분해함), PIII 형(α-카제인 및 β-카제인을 C 말단 및 N 말단의 양쪽으로부터 잘 분해함), 및 그 중간형(PI/PIII 형)이 알려져 있다(예를 들면, 문헌[Reid, J.R. et al., Applied and Environmental Microbiology, 1994년, 제60권 제3호, 제801 내지 806 페이지]). PrtP로서 구체적으로는, 락토코커스?락티스 유래의 PrtP로서, NCBI에 액세션 번호 AY542690, AY542691 등으로서 유전자 배열이 등록되어 있는 PrtP, 및 그 호몰로그를 들 수 있다. 호몰로그로서는, 상기 유전자 배열에 의해서 코드되는 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 여러 개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 PrtP 활성을 갖는 단백질을 들 수 있다. 1 또는 여러 개란, 바람직하게는 1 내지 20 개, 보다 바람직하게는 1 내지 10 개, 더욱 바람직하게는 1 내지 5 개, 특히 바람직하게는 1 내지 3개이다. 또한, 상기 호몰로그로서, 상기 액세션 번호 AY542690, 또는 AY542691의 염기 서열에 의해서 코드되는 아미노산 서열과 80 ％ 이상, 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질이며, 또한 PrtP 활성을 갖는 단백질을 들 수 있다.
세균이 「PrtP를 갖지 않음」이란, 동 세균이 PrtP가 갖는 효소활성을 갖지 않는 것을 의미하여, PrtP 단백질을 갖지 않거나, PrtP 단백질을 가지고 있더라도 동 단백질이 효소 활성을 갖지 않는 경우에는, 「PrtP를 갖지 않음」에 포함된다. 또한, 세균이 PrtP를 갖고 있더라도, PrtP를 갖는 균주에 비하여, PrtP 단백질의 양 또는 그 활성이 현저히 낮은 경우에는, 실질적으로 「PrtP를 갖지 않음」에 포함된다.
락토코커스?락티스는, 아종(서브스피시즈)은 특별히 제한되지 않지만, PrtP를 갖고 있는 균주와, 갖고 있지 않는 균주가 존재하는 것이 바람직하다. 구체적으로는 예를 들면, 락토코커스?락티스?서브스피시즈?락티스, 및 락토코커스?락티스?서브스피시즈?크레모리스를 들 수 있다. PrtP를 갖지 않는 락토코커스?락티스는, 자연계에서 PrtP 활성을 갖지 않는 균주, 또는 PrtP를 코드하는 유전자를 갖지 않는 균주로서 선택함으로써, 취득할 수 있다.
PrtP는, 세포 밖에 효소 활성 부위를 갖기 때문에, PrtP를 갖는 균주는, 배지 중의 단백질을 분해하여, 자신의 생육에 이용할 수 있지만, PrtP를 갖지 않는 균주는, 배지 중의 단백질을 생육에 이용할 수 없다. 따라서, 단백질을 포함하는 배지, 예를 들면 10 ％(W/W) 환원 탈지분유를 포함하는 배지에서의 생육을 관찰함으로써, PrtP를 갖지 않는 균주를 선택할 수 있다.
또한, PrtP를 코드하는 유전자를 갖지 않는 균주는, 예를 들면 실시예에 기재한 바와 같이, PrtP 유전자 또는 그 일부를 PCR 법에 의해 검출함으로써, 선택할 수 있다. PrtP 유전자를 증폭하기 위한 프라이머로서는, 서열번호 1 및 2의 세트, 및 서열번호 3 및 4의 세트를 들 수 있다.
PrtP를 갖지 않는 균주는, PrtP를 갖는 균주로부터, 돌연 변이법, 또는 유전자 재조합에 의해, PrtP 유전자를 불활화, 또는 파괴 또는 결실시킴으로써도, 취득할 수 있다. 불활화, 또는 파괴 또는 결실시키는 PrtP 유전자가 코드하는 PrtP는, PI형, PIII, 또는 PI/PIII 형 중 어느 것일 수도 있다.
PrtP를 갖지 않는 락토코커스?락티스의 일 양태는, 1 ％(W/W) 글루코오스, 및 10 ％(W/W) 환원 탈지분유를 포함하는 배지에 동 세균을 배지 1 ㎖ 당 5.0×106 내지 2.0×108 CFU 접종하여, 37 ℃에서 4 내지 24 시간, 예를 들면 16 시간 배양했을 때, 해당 배지가 응고되지 않는 성질을 갖는 균주이다.
1 ％(W/W) 글루코오스, 및 10 ％(W/W) 환원 탈지분유를 포함하는 배지는, 글루코오스가 1 ％(W/W), 및 환원 탈지분유가 10 ％(W/W)가 되도록, 물에 용해하여 살균함으로써 제조할 수 있다. 살균은, 예를 들면 80 내지 122 ℃에서 40 내지 5분간, 바람직하게는 85 내지 95 ℃에서 35 내지 5분간의 가열 처리에 의해 행할 수 있다.
상기 세균의 세포수(CFU)는, 적당히 희석한 균의 현탁액을, 바람직한 한천 배지, 예를 들면 BCP 첨가 플레이트 카운트 한천배지(에이켄카가쿠사 제조)에 펼쳐서 배양하여, 출현하는 콜로니수에 의해서 측정할 수 있다.
배지 응고의 유무는, 예를 들면, 시험관 등을 이용한 배양에 의해 판정할 수 있다. 구체적으로는, 시험관을 도치시켜, 배지에 유동성이 없으면 배지는 응고됨, 유동성이 있으면 배지는 응고되지 않음으로 판정된다.
또한, PrtP를 갖지 않는 락토코커스?락티스는 1 ％(W/W) 글루코오스, 및 10 ％(W/W) 환원 탈지분유를 포함하는 배지에 동 세균을 배지 1 ㎖ 당 5.0×106 내지 2.0×108 CFU, 및 비피도박테리움속 세균을 배지 1 ㎖ 당 1.0×107 내지 3.0×109 CFU, 바람직하게는 1.0×107 내지 5.0×107 CFU, 각각 접종하여 배양하고, 배지의 pH가 4.6 내지 5.5에 도달한 시점에 배지를 배양 온도에서 10 ℃로 급랭하고, 10 ℃에서 2 주간 보존했을 때의 용존 산소 농도를, 2 ppm 이하, 바람직하게는 1 ppm이하, 보다 바람직하게는 0.5 ppm 이하로 유지하는 성질을 갖는 것이 바람직하다. 비피도박테리움속 세균은, 배지 중의 용존 산소 농도가 높으면 생육하기 어려워지므로, 락토코커스?락티스를 비피도박테리움속 세균과 동시에 이용하여 밀크 원료를 발효시키는 경우, 락토코커스?락티스는, 배지 중의 용존 산소 농도를 높이지 않는 것인 것이 바람직하다.
배양 온도에서 10 ℃로의 급랭은, 바람직하게는 1 시간 이내, 보다 바람직하게는 30 분 이내, 특히 바람직하게는 10 분이 내에 행하는 것이 바람직하다. 배양 온도로서는 30 ℃ 내지 40 ℃가 바람직하고, 36 ℃ 내지 38 ℃가 보다 바람직하며, 37 ℃가 특히 바람직하다. 이하의 기재에 있어서도 마찬가지이다.
또한, 본 발명의 다른 양태에서는, PrtP를 갖지 않는 락토코커스?락티스는 1 ％(W/W) 글루코오스, 및 10 ％(W/W) 환원 탈지분유를 포함하는 배지에 동 세균을 배지 1 ㎖ 당 5.0×106 내지 2.0×108 CFU, 및 비피도박테리움속 세균을 배지 1 ㎖ 당 1.0×107 내지 3.0×109 CFU, 바람직하게는 1.0×107 내지 5.0×107 CFU, 각각 접종하여 배양하고, 배지의 pH가 4.6 내지 5.5에 도달한 시점에 배지를 배양 온도에서 10 ℃로 급랭하고, 10 ℃에서 2 주간 보존했을 때의 비피도박테리움속 세균의 생잔율을 30 ％ 이상, 바람직하게는 50 ％ 이상, 보다 바람직하게는 80 ％ 이상으로 유지하는 성질을 갖는 균주이다. 생잔율은, 보존 개시시의 생균수에 대한 보존후의 생균수의 비율을 말한다. 이 성질은, 상기 배지 중의 용존 산소 농도를 높이지 않는 성질과 독립될 수도 있지만, 락토코커스?락티스는 양쪽의 성질을 갖는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 다른 양태에서는, PrtP를 갖지 않는 락토코커스?락티스는, 1 ％(W/W) 글루코오스, 및 10 ％(W/W) 환원 탈지분유를 포함하는 배지에 동 세균을 배지 1 ㎖ 당 5.0×106 내지 2.0×108 CFU, 비피도박테리움속 세균을 배지 1 ㎖ 당1.0×107 내지 3.0×109 CFU, 바람직하게는 1.0×107 내지 5.0×107 CFU, 및 스트렙토코커스?써모필러스 및 락토바실러스?델브루에키?서브스피시즈?불가리쿠스를 각각 배지 1 ㎖ 당 2.0×105 내지 9.0×107 CFU 접종하고, 37 ℃에서 3 내지 24 시간, 예를 들면 8 시간 배양했을 때, 해당 배지가 응고되는 성질을 갖는 것이 바람직하다.
PrtP를 갖지 않는 락토코커스?락티스가, 환원 탈지분유를 포함하는 배지를 응고되지 않은 것은, 상기 배지에서 단독으로 발효성을 갖지 않는 것을 뜻하지만, 동 세균을 비피도박테리움속 세균과 동시에 동 배지에서 배양했을 때, 배지 중의 용존 산소 농도를 저하시키는 것, 및 배지를 응고시키는, 즉 배지의 pH를 저하시키는 것, 및 발효 후에 비피도박테리움속 세균의 생잔율을 높이는 것은, 본 발명의 락토코커스?락티스가 밀크 원료로부터 비피도박테리움속 세균을 함유하는 발효 식품의 제조에 바람직함을 나타내고 있다. 따라서, PrtP를 갖지 않는 락토코커스?락티스, 특히 상기한 성질을 갖는 균주는, 비피도박테리움속 세균을 함유하는 발효 식품을 제조하기 위한 스타터로서 바람직하다. 본 발명의 「비피도박테리움속 세균 함유 밀크 원료 발효용 스타터」란, 이러한 비피도박테리움속 세균을 함유하는 발효 식품을 제조하기 위한 스타터, 즉, 발효 식품을 제조하기 위해서 비피도박테리움속 세균과 동시에 밀크 원료에 접종되는 세균을 말한다.
본 발명에 이용하는 락토코커스?락티스의 구체적 균주로서는, 락토코커스?락티스?서브스피시즈?락티스LcL13(FERM BP-11276), 락토코커스?락티스?서브스피시즈?락티스LcL26(FERM BP-11277), 및 락토코커스?락티스?서브스피시즈?크레모리스LcC46(FERM BP-11275)을 들 수 있다.
이들 균주는, 2010년 8월 11일에 독립행정법인 산업 기술종합연구소 특허생물 기탁센터(우:305-8566 일본국 이바라기켄 쯔꾸바시 히가시 1쵸메 1반치 1 츄오 다이6)에, 각각 괄호 내에 기재된 수탁번호로, 부다페스트 조약에 기초하여 국제 기탁되어 있다.
본 발명의 방법은, 상기한 것과 같은 PrtP를 갖지 않는 락토코커스?락티스와, 비피도박테리움속 세균을 이용하여, 밀크 원료를 발효시킴으로써, 발효 식품을 제조하는 방법이다.
비피도박테리움속 세균으로서는 특별히 제한되지 않지만, 비피도박테리움?롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움?비피덤(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움?브레브(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움?어돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis), 및 비피도박테리움?인판티스(Bifidobacterium infantis, 비피도박테리움?롱검?서브스피시즈?인판티스로 재분류되어 있음)를 들 수 있다. 이 중에서는, 비피도박테리움?롱검이 바람직하다. 또한, 비피도박테리움?롱검으로서 보다 구체적으로는, 비피도박테리움?롱검 ATCC BAA-999주를 들 수 있다. 동 균주는, 예를 들면 아메리칸?타입?컬쳐?컬렉션(주소 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America)으로부터 구입할 수 있다.
밀크 원료(milk raw material)로서는, 밀크 유래의 원료로서, PrtP를 갖지 않는 락토코커스?락티스, 및 비피도박테리움속 세균, 및 필요에 따라서 다른 유산균을 이용하여 발효시킴으로써, 발효 식품을 제조 가능한 것이면 특별히 제한되지 않고, 밀크 또는 그 분획물 또는 가공품, 예를 들면 우유, 탈지유, 생크림, 버터, 전분유, 및 탈지분유, 또는 이들을 물에 혼합, 용해 또는 현탁시킨 것 등을 들 수 있다. 밀크 원료는, 필요에 따라서 자당 등의 감미료, 펙틴, 과실, 과일 쥬스, 한천, 젤라틴, 유지, 향료, 착색료, 안정제, 환원제 등을 배합할 수도 있다. 밀크 원료는, 발효 전에 통상법에 따라서 살균, 균질화, 냉각 등을 실시할 수도 있다.
PrtP를 갖지 않는 락토코커스?락티스, 및 비피도박테리움속 세균의 밀크 원료로의 접종량은 특별히 제한되지 않지만, 락토코커스?락티스에 대해서는 바람직하게는 104 내지 108 CFU/㎖ 밀크 원료, 보다 바람직하게는 106 내지 107 CFU/㎖ 밀크 원료, 비피도박테리움속 세균에 대해서는 바람직하게는 105 내지 109 CFU/㎖ 밀크 원료, 보다 바람직하게는 107 내지 108 CFU/㎖ 밀크 원료이다. 또한, 락토코커스?락티스, 및 비피도박테리움속 세균의 접종량의 비율(균수비)은 특별히 제한되지 않지만, 1000:1 내지 1:10이 바람직하고, 10:1 내지 1:1이 보다 바람직하다.
밀크 원료에 접종하는 PrtP를 갖지 않는 락토코커스?락티스는, 단일의 균주일 수도 있고, 복수의 균주일 수도 있다. 또한, 비피도박테리움속 세균도 단일의 균주일 수도 있고, 복수의 균주일 수도 있다.
밀크 원료에 접종하는 락토코커스?락티스, 및 비피도박테리움속 세균, 및 필요에 따라서 다른 유산균은, 미리 다른 배지에서 종배양 또는 전배양해 두는 것이 바람직하다. 배지로서는, 락토코커스?락티스, 및 비피도박테리움속 세균, 및 필요에 따라서 다른 유산균의 배양에 적합한 배지이면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 환원 탈지분유를 포함하는 배지를 들 수 있다. 환원 탈지분유의 농도는, 3 ％(W/W) 이상이 바람직하고, 8 ％(W/W) 이상이 특히 바람직하다. 또한 종배양 또는 전배양에 이용되는 배지에는, 효모 엑기스 등의 생육 촉진 물질이나, L-시스테인 등의 환원제 등을 첨가할 수도 있다. 특히 비피도박테리움속 세균은, 환원 탈지분유를 포함하는 배지에서의 증식성이 낮기 때문에, 생육 촉진 물질, 예를 들면, 0.1 내지 1 ％(W/W)의 효모 엑기스를 함유하는 배지를 이용하는 것이 바람직하다. 배지의 살균 조건은, 상기와 마찬가지이다.
필요에 따라서, 밀크 원료에 PrtP를 갖지 않는 락토코커스?락티스, 및 비피도박테리움속 세균에 더불어, 다른 유산균을 더하여 발효를 행할 수도 있다. 다른 유산균으로서는, 식품의 제조에 이용될 수 있는 것으로서, 락토코커스?락티스 및 비피도박테리움속 세균의 생육을 저해하지 않는 것이면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면 발효 식품이 요구르트인 경우, 스트렙토코커스?서머필러스, 및 락토바실러스?델브루에키 등을 들 수 있다. 이들 유산균은, 단일의 균주일 수도 있고, 복수의 균주일 수도 있다.
PrtP를 갖지 않는 락토코커스?락티스 및 비피도박테리움속 세균을 이용하여 밀크를 발효시킨 경우, 통상 pH가 5 부근이고, 드링크 요구르트가 얻어진다. 또한 스트렙토코커스?서머필러스나 락토바실러스?델브루에키 등의 유산균을 병용하여 발효시키면, pH가 저하되어 보다 견고한 조직을 가진 요구르트(스푼으로 섭취할 수 있는 요구르트)를 제조할 수 있다.
락토코커스?락티스 및 비피도박테리움속 세균의 접종량과, 상기 다른 유산균의 접종량의 비율(균수비)은 특별히 제한되지 않지만, 1000:1 내지 10:1이 바람직하다.
락토코커스?락티스, 비피도박테리움속 세균, 및 다른 유산균을 밀크 원료에 접종하는 순서는 특별히 상관없이, 모두 동시에 투여할 수도 있다. 또한, 이들 세균 중 임의의 세균을 복수회 접종할 수도 있다.
배양 온도, 배양 시간 등의 발효 조건은, 통상의 밀크 원료로부터의 발효 식품의 제조와 마찬가지의 조건을 채용할 수 있다. 예를 들면, 배양 온도는 30 ℃ 내지 40 ℃가 바람직하고, 36 ℃ 내지 38 ℃가 보다 바람직하다. 배양 시간은, 제조하는 발효 식품의 종류에 따라 적절하게 설정할 수 있지만, 통상, 3 내지 18 시간이 바람직하다.
얻어진 발효 식품은, 통상의 밀크 원료로부터의 발효 식품과 같이 적절하게 가공할 수 있다. 예를 들면, 발효 후의 발효 식품을 그대로 식품으로 할 수 있고, 균질화하여 액상으로 가공할 수도 있다. 또한, 자당 등의 감미료, 펙틴, 과실, 과일 쥬스, 한천, 젤라틴, 유지, 향료, 착색료, 안정제, 환원제 등을 첨가할 수도 있다. 또한, 발효 식품은 적절하게 용기에 충전할 수도 있다.
상기한 바와 같이하여 제조되는 발효 식품은, 단백질의 분해에 기인하는 쓴맛이나 감칠맛이 적고, 비피도박테리움속 세균의 보존 생잔성도 우수하다.
실시예
다음으로, 시험예 및 실시예를 나타내어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.
[시험예 1] 락토코커스?락티스 균주의 취득
락토코커스?락티스에 속하고, PrtP 효소를 보유하지 않은 균주를 자연계에서 취득하기 위해, 일본 내의 자연계에서 채집한 샘플을 혐기성 희석액(문헌[미츠오카 토모타리 저 「장내균의 세계」, 소우분사 발행, 1980년, 제322 페이지])으로 희석하여, 하기 조성의 브리그스 리버 브로쓰(Briggs liver broth) (상기 문헌, 319 페이지)의 평판(한천 15 g/L를 포함)에 도포하여, 30 ℃에서 혐기 배양하였다.
[혐기성 희석액]
염류 용액 I(0.78 ％ K2HPO4 용액) 37.5 ㎖
염류 용액 II(0.47 ％ KH2PO4, 1.18 ％ NaCl, 1.20 ％ (NH4)2SO4, 0.12 ％ CaCl2, 0.25 ％ MgSO4?H2O 를 포함하는 용액) 37.5 ㎖
레자주린(Resazurin) (0.1 ％ 수용액) 1 ㎖
L-시스테인 HCl?H2O 0.5 g
L-아스코르브산(25 ％ 수용액) 2 ㎖
Na2CO3(8 ％ 용액) 50 ㎖
한천 0.5 g
정제수 860 ㎖
[브리그스 리버 브로쓰]
토마토 쥬스 침출액 400 ㎖
네오펩톤(디프코(Difco)) 15 g
효모엑기스(디프코) 6 g
간장 엑기스 75 ㎖
글루코오스 20 g
가용성 전분 0.5 g
NaCl 5 g
트윈(Tween) 80 1 g
L-시스테인 HCl?H2O 0.2 g
정제수 525 ㎖
pH 6.8
그리고, 얻어진 콜로니 중에서 연쇄 구균의 형태를 나타내고, 또한 도포 표본의 현미경 관찰에 의해 그램 양성인 균을 조균(釣菌)하였다. 이들 균을, 하기 조성의 BL 한천 배지에 획선 도포하고, 상기와 마찬가지의 방법으로 혐기 배양을 반복하여, 순수 단리된 균주를 얻었다.
[BL 한천배지]
랩-렘코 파우더(Lab-Lemco powder) (옥소이드(Oxoid)) 2.4 g
프로테오스펩톤 제3호 (디프코) 10 g
트립티케이스(Trypticase)(BBL) 5 g
피톤(Phytone) 3 g
효모엑기스(디프코) 5 g
간장 엑기스 150 ㎖
글루코오스 10 g
가용성 전분 0.5 g
용액 A 10 ㎖
토레이 실리콘 SH5535(10 ％ 용액) 5 ㎖
트윈 80 1 g
한천 15 g
L-시스테인 HCl?H2O 0.5 g
말 혈액 50 ㎖
pH 7.2
간장 엑기스: 간 분말(쿄쿠도) 10 g을 170 ㎖의 정제수로 50 내지 60 ℃의 온욕조 중 약 1 시간 침출한 후, 100 ℃에서 몇 분간 가열하여, pH 7.2로 조정하고 나서 여과지로 여과한다.
용액 A: MgSO4?7H2O 15 g, FeSO4?7H2O 0.5 g, NaCl 0.5 g, MnSO4 0.337 g을 정제수 250 ㎖로 용해한다.
L-시스테인과 말 혈액 이외의 성분을 중탕하여 용해시켜, pH를 조정하고, 115 ℃에서 20분 멸균 후, 50 ℃로 냉각하고, L-시스테인과 말 혈액을 가하여, 페트리 접시에 분주(分注)하여 평판으로 한다.
이들 균주의 게놈 DNA의 염기 서열을 통상법에 의해 동정하였다. NCBI(National Center for Biotechnology Information, 국립 생물 공학 정보 센터)의 국제 염기 서열 데이터 베이스(GenBank) 상에서, BLAST(Basic Local Alignment Search Tool, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)에 의한 16S 리보소말 RNA 유전자 배열의 전체 길이에 대한 상동성 검색을 행하고, 각각의 타이프 스트레인과 98 ％ 이상의 상동성을 갖는 락토코커스속 세균을 280주 동정하였다. 락토코커스?락티스와 98 ％ 이상의 상동성을 갖고 있었던 242균주 중, 락토오스를 자화하고, 또한 락토코커스?락티스아종의 타이프 스트레인 중 락토코커스?락티스?서브스피시즈?락티스에 가장 상동성이 높은 군의 균주를 락토코커스?락티스?서브스피시즈?락티스와 동정하였다. 또한, 락토코커스?락티스아종의 타이프 스트레인 중 락토코커스?락티스?서브스피시즈?크레모리스에 가장 상동성이 높은 군의 균주를 락토코커스?락티스?서브스피시즈?크레모리스와 동정하였다. 얻어진 균주는 전부 무아포, 비운동성의 통성 혐기성 그램 양성 구균으로, 카탈라아제 및 가스 생산은 모두 음성이었다.
계속해서, 얻어진 락토코커스?락티스주가, PrtP 효소를 보유하고 있는지 여부를 확인하였다. 구체적으로는, 락토오스 및 글루코오스를 0.5 ％ 첨가한 디프코(등록상표) M17 브로쓰(Broth) (벡톤디킨슨사 제조)에, BL 한천 배지상의 각 균주의 콜로니를 백금이로 접종하고, 30 ℃에서 16 시간 배양하였다. 얻어진 배양액 3 ％를 같은 배지에 접종하여, 30 ℃에서 16 시간 배양하였다. 원심 분리에 의해 균체를 얻어, DNeasy 혈액 및 티슈 키트(Blood and Tissue kit) (키아겐사 제조)를 이용하여 DNA를 추출하고, PCR 법에 의해 PrtP 유전자의 보유성을 확인하였다.
PCR은, 문헌[Journal of Applied Microbiology, 2006년, 제100권, 제1307 내지 1317 페이지]에 기재된 수법에 준하여 행하였다. 프라이머는, 정방향 프라이머 GBf(GCAAATACGGTGACGGCTGCGA, 서열번호 1) 및 역방향 프라이GB2r(TGAGCATTATAATAGGTCTTCTTCC, 서열번호 2)의 프라이머 세트, 또는 정방향 프라이머 GHf(CAAATACGGTGACGGCTGCTAA, 서열번호 3) 및 역방향 프라이머 GH2r(TAGCATTATAATAGGTCTTCGTCA, 서열번호 4)의 프라이머 세트를 이용하였다. 그 결과, 락토코커스?락티스 242주 중 128주에는 PrtP 유전자의 보유가 확인되었다. 한편, 나머지의 114주는 PrtP 유전자를 보유하지 않은 것이 판명되었다.
[시험예 2] 유(milk)성 배지에서의 락토코커스?락티스균주의 발효성 시험
락토오스 및 글루코오스를 0.5 ％ 첨가한 디프코(등록 상표) M17 브로쓰 (벡톤디킨슨사 제조)에, 시험예 1에서 얻어진 각 균주, 및 표 1에 기재된 균주의 배양액을 3 ％ 접종하여, 30 ℃에서 16 시간 배양하였다. 원심 분리에 의해 집균하여 세정한 후, 원래의 배양액과 동량의 유성 배지(1 ％(W/W) 글루코오스, 10 ％(W/W) 환원 탈지분유(모리나가뉴교사 제조))에 균체를 현탁하여 시드컬쳐를 얻었다. NBRC12007 및 NBRC100676은, 독립행정법인 제품평가 기술기반 기구(the National Institute of Technology and Evaluation)(우: 292-0818 치바켄 기사라즈시 카즈사카마타리 2-5-8)로부터 입수할 수 있다. 또한, JCM20101은, 독립행정법인 이화학연구소 미생물계통 보존 시설(JCM)(우: 351-0198 사이타마켄 와코시 히로사와 2-1)로부터 입수할 수 있다. 또한, ATCC 9625는, 아메리칸?타입?컬쳐?컬렉션(주소 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America)로부터 입수할 수 있다.
다음으로, 상기와 동일한 조성의 유성 배지(95 ℃에서 30 분간 살균)에, 상기 각 균주의 시드컬쳐를 배지 1 ㎖ 당 5.0×106 내지 2.0×108 CFU 접종하여, 37 ℃에서 16 시간 배양하였다. 얻어진 배양액을 10 ℃로 급랭하여, 응고 상황, pH 및 함유된 유산균 수를 측정하였다. 유산균 수의 측정은 시판되고 있는 BCP 첨가 플레이트 카운트 한천 배지(에이켄카가쿠사 제조) 평판에서 행하였다. 결과를 표 1에 나타내었다. 표 중, 「E+N」은 「×10n」을 나타낸다.
Figure pct00001
문헌[Yonezawa S. et al., J. Dairy Sci. 2010, 93: 1815-23]에 기재되어 있는 바와 같이, PrtP를 갖고 있지 않은 락토코커스?락티스 아종 균주는, 유성 배지를 고화하지 않았다.
[시험예 3] PrtP를 갖지 않는 락토코커스?락티스와 비피도박테리움?롱검과의 혼합 배양 시험
우선, 비피도박테리움?롱검 ATCC BAA-999주를, 0.6 ％(W/W) 효모 엑기스 및 11 ％(W/W) 환원 탈지분유를 포함하는 배지에, 배지 1 ㎖ 당 1.0×106 내지 5.0×107 CFU 접종하고, 37 ℃에서 16 시간 배양하여 시드컬쳐를 얻었다.
또한, 락토오스 및 글루코오스를 0.5 ％ 첨가한 디프코(등록상표) M17 브로쓰 (벡톤디킨슨사 제조)에, 락토코커스?락티스 각 균주의 시험예 1에서 얻어진 배양액을 3 ％ 접종하여, 30 ℃에서 16 시간 배양하였다. 각 배양 균체를, 원심 분리에 의해 집균하여, 세정 후, 원래의 배양액과 동량의 상기와 동일 조성의 유성배지에 현탁하여, 시드컬쳐를 얻었다.
상기와 동일 조성의 유성 배지(90 ℃에서 10분간 살균)에, 락토코커스?락티스의 각 균주의 시드컬쳐를 배지 1 ㎖ 당 5.0×106 내지 2.0×108 CFU와, 상기 비피도박테리움?롱검 ATCC BAA-999주의 시드컬쳐를 배지 1 ㎖ 당 1.0×107 내지 5.0×107 CFU 접종하고, 37 ℃에서 16 시간 배양하여 발효유를 얻었다.
상기 발효유를 10 ℃로 급랭하여, pH 및 함유되는 비피더스균 수, 및 용존 산소를 측정하였다. 비피더스균 수의 측정은, TOS 프로피온산 한천 배지(야쿠르트야쿠힌고교사 제조)평판에서 행하였다. 또한, 용존 산소의 측정은, 발효유의 온도를 10 ℃로 유지하면서 형광식 산소계 FO-960S(ASR사 제조)를 이용하여 계측하였다. 측정 결과를 표 2에 나타낸다.
Figure pct00002
PrtP를 갖고 있지 않은 주 중에도, PrtP를 갖고 있는 균주(JCM20101, NBRC 100676)와 같이 비피더스균을 생잔시키는 균이 존재하고 있었다. 이들 균주는 모두, 2주간 보존 후의 발효유 중의 용존 산소가 2.0 ppm 이하였다.
[시험예 4]
시험예 3에서 얻어진 비피더스균 함유 발효유는 대부분의 pH가 5 부근이기 때문에, 형태는 드링크 요구르트였다. 보다 견고한 조직을 가진 발효유(스푼으로 섭취할 수 있는 통상의 요구르트)를 제조하기 위해서, 스트렙토코커스?서머필러스 및 락토바실러스?델브루에키?서브스피시즈?불가리쿠스를 배지에 첨가한 것 이외에는, 시험예 3과 마찬가지로 유성 배지의 발효를 행하였다.
시험예 3과 마찬가지로 락토코커스?락티스의 각 균주와 비피도박테리움?롱검 ATCC BAA-999주의 시드컬쳐를, 유성 배지에 시험예 3과 동일 접종량으로 접종하고, 또한 스트렙토코커스?서머필러스와 락토바실러스?델브루에키?서브스피시즈?불가리쿠스를 포함하는 요구르트 스타터(다니스코사 제조)를, 1 ％(W/W) 글루코오스, 및 10 ％(W/W) 환원 탈지분유를 포함하는 배지에, 각각 배지 1 ㎖ 당 2.0×106 CFU, 2.0×105 CFU 접종하여, 37 ℃에서 8 시간 배양하여 발효유를 얻었다. 상기 발효유를 10 ℃로 급랭하여, pH 및 응고 상태를 측정하였다. 결과를 표 3에 나타내었다.
Figure pct00003
락토코커스?락티스가 포함되고 있지 않은 계, 및 PrtP를 갖는 균주를 포함하는 계에서는, 통상의 발효유를 제조할 수 있었지만, 락토코커스?락티스?서브스피시즈?락티스 LcL49 및 락토코커스?락티스?서브스피시즈?크레모리스 LcC 53을 이용한 발효유는, pH가 내려가지 않아 응고되지 않았다.
[시험예 5] 발효유의 평가
후술하는 실시예 3에 기재된 방법으로 발효유(요구르트)를 제작하여, 5명의 전문 패널리스트에게, 감칠맛, 쓴맛에 대해서 10 단계로 평가받았다. 높은 값일수록, 그 맛이 강함을 나타내고 있다. 스코어 5를 초과하는 경우, 발효유으로서는 너무 강한 맛임을 나타내고 있다. 결과를 도 1에 나타내었다.
그 결과, PrtP를 갖고 있는 균주를 이용하여 제작한 발효유는, 감칠맛이나 쓴맛이 강하게 느껴졌다. 한편, PrtP를 갖고 있지 않은 균주를 이용하여 제작한 발효유는, 감칠맛이나 쓴맛을 거의 느끼지 않고, 발효유 본래의 풍미가 손상되지 않았다.
[실시예 1] 락토코커스?락티스?서브스피시즈?락티스를 이용한 드링크 요구르트의 제조
10 ％(W/W) 환원 탈지분유를 포함하는 배지 1000 ㎖(90 ℃에서 30분간 살균)에, 락토코커스?락티스?서브스피시즈?락티스LcL26주의 시드컬쳐를 30 ㎖ 접종하고, 25 ℃에서 16 시간 배양하였다. 한편, 0.2 ％(W/W) 효모엑기스, 및 11 ％(W/W) 환원 탈지분유를 포함하는 배지 1000 ㎖(90 ℃에서 30분간 살균)에, 비피도박테리움?롱검 ATCC BAA-999주의 시드컬쳐를 100 ㎖ 접종하고, 37 ℃에서 4 시간 배양하였다.
또한, 비피도박테리움?롱검 ATCC BAA-999주의 시드컬쳐는, 0.6 ％(W/W) 효모엑기스 및 11 ％(W/W)환원 탈지분유를 포함하는 배지에, 비피도박테리움?롱검 ATCC BAA-999주를 1.0×106 내지 5.0×107 CFU 접종하여, 37 ℃에서 16 시간 배양하여, 시드컬쳐를 얻었다.
이와는 별도로, 원료로서 탈지분유, 전분유, 자당 및 펙틴을 혼합 용해하고, 유지방 0.5 ％(W/W), 무지유 고형분 8.0 ％(W/W), 자당 8.0 ％(W/W), 펙틴 0.2 ％(W/W)로 이루어지는 밀크 원료 50 L를 제조하고, 90 ℃에서 10 분간 살균하여, 40 ℃로 냉각하였다. 상기 살균한 밀크 원료에 상기와 같은 전배양을 행한 락토코커스?락티스?서브스피시즈?락티스LcL26주의 컬쳐 500 ㎖와 비피도박테리움?롱검 ATCC BAA-999주의 컬쳐 500 ㎖를 접종하여, 37 ℃에서 16 시간 배양하여 발효유를 얻었다.
상기 발효유를 15 ㎫의 압력으로 균질화하여, 200 ㎖ 용량의 유리 용기에 충전한 후, 발효유의 온도가 10 ℃가 될 때까지 냉각하고, 또한 밀봉하여, 드링크 요구르트를 얻었다. 얻어진 드링크 요구르트는 락트산 산도 0.64 ％, pH 4.9, 1.6×108 CFU/㎖의 비피더스균을 함유하고 있었다. 이 드링크 요구르트를 10 ℃에서 14일간 보존했을 때의 비피더스균 수는 1.1×108 CFU/㎖이고, 생잔율은 68 ％였다. 또한, 이 때의 용존 산소 농도는 0.93 ppm이었다.
[실시예 2] 락토코커스?락티스?서브스피시즈?크레모리스를 이용한 드링크 요구르트의 제조
10 ％(W/W) 환원 탈지분유를 포함하는 배지 1000 ㎖(90 ℃에서 30 분간 살균)에, 락토코커스?락티스?서브스피시즈?크레모리스LcC46주의 시드컬쳐를 30 ㎖ 접종하고, 25 ℃에서 16 시간 배양하였다. 한편, 0.2 ％(W/W) 효모 엑기스, 및 11 ％(W/W) 환원 탈지분유를 포함하는 배지 1000 ㎖(90 ℃에서 30분간 살균)에, 비피도박테리움?롱검 ATCC BAA-999주의 시드컬쳐를 100 ㎖ 접종하고, 37 ℃에서 4 시간 배양하였다.
또한, 비피도박테리움?롱검 ATCC BAA-999주의 시드컬쳐는, 0.6 ％(W/W) 효모 엑기스 및 11 ％(W/W) 환원 탈지분유를 포함하는 배지에, 비피도박테리움?롱검 ATCC BAA-999주를 1.0×106 내지 5.0×107 CFU 접종하고, 37 ℃에서 16 시간 배양하여, 시드컬쳐를 얻었다.
이것과는 별도로, 원료로서 탈지분유, 전분유, 자당 및 펙틴을 혼합 용해하고, 유지방 0.5 ％(W/W), 무지유 고형분 8.0 ％(W/W), 자당 8.0 ％(W/W), 펙틴 0.2 ％(W/W)로 이루어지는 밀크 원료 50 L를 제조하고, 90 ℃에서 10분간 살균하여, 40 ℃로 냉각하였다. 상기 살균한 밀크 원료에, 상기와 같이 전배양을 행한 락토코커스?락티스?서브스피시즈?크레모리스LcC46주의 컬쳐 500 ㎖와 비피도박테리움?롱검 ATCC BAA-999주의 컬쳐 500 ㎖를 접종하여, 37 ℃에서 16 시간 배양하여 발효유를 얻었다.
상기 발효유를 15 ㎫의 압력으로 균질화하여, 200 ㎖ 용량의 유리 용기에 충전한 후, 발효유의 온도가 10 ℃가 될 때까지 냉각하고, 또한 밀봉하여, 드링크 요구르트를 얻었다. 얻어진 드링크 요구르트는 락트산 산도 0.66 ％, pH 4.8, 9.6×107 CFU/㎖의 비피더스균을 함유하고 있었다. 이 상기 드링크 요구르트를 10 ℃에서 14일간 보존했을 때의 비피더스균 수는 6.9×107 CFU/㎖이고, 생잔율은 71 ％였다. 또한, 이 때의 용존 산소 농도는 0.88 ppm이었다.
[실시예 3]
락토코커스?락티스?서브스피시즈?락티스를 이용한 요구르트의 제조 (I)
환원 탈지분유 10 ％(W/W)를 포함하는 배지(115 ℃, 20분 살균) 1000 mL에, 락토바실러스?델브루에키?서브스피시즈?락티스 FERM BP-10758주의 시드컬쳐를 30 ㎖ 접종하고, 37 ℃, 16 시간 배양하였다. 한편, 효모 엑기스 0.1 ％(W/W), 및 환원 탈지분유 10 ％(W/W)를 포함하는 배지(90 ℃에서 30분간 살균) 1000 ㎖에 스트렙토코커스?서머필러스FERM P-17216주의 시드컬쳐를 30 ㎖ 접종하고, 37 ℃, 5 시간 배양하였다.
또한, 락토바실러스?델브루에키?서브스피시즈?락티스FERM BP-10758주의 시드컬쳐는, 0.1 ％(W/W) 효모 엑기스 및 10 ％(W/W) 환원 탈지분유를 포함하는 배지에 1.0×105 내지 1.0×107 CFU 접종하여, 37 ℃에서 16 시간 배양하여 얻었다.
또한, 스트렙토코커스?서머필러스FERM P-17216주의 시드컬쳐는, 0.1 ％(W/W) 효모 엑기스 및 10 ％(W/W) 환원 탈지분유를 포함하는 배지에 1.0×105 내지 1.0×107 CFU 접종하여, 37 ℃에서 16 시간 배양하여 얻었다.
탈지분유, 크림 및 유단백질 등의 원료를 혼합 용해하고, 유지방 3.0 ％(W/W), 무지유 고형분 12.0 ％(W/W)로 이루어지는 밀크 원료 50 L를 제조하여, 70 ℃로 가온하고, 15 ㎫의 압력으로 균질하여, 90 ℃에서 10 분간 살균하고, 40 ℃로 냉각하였다.
이 살균한 밀크 원료에 상기와 같은 전배양을 행한 락토바실러스?델브루에키?서브스피시즈?락티스FERM BP-10758주의 컬쳐를 50 ㎖, 스트렙토코커스?서머필러스FERM P-17216주의 컬쳐를 450 ㎖, 실시예 1의 LcL26주와 마찬가지 방법으로 전배양을 행한 락토코커스?락티스?서브스피시즈?락티스LcL13주의 컬쳐 500 ㎖와 비피도박테리움?롱검 ATCC BAA-999주의 컬쳐 500 ㎖를 접종하여, 37 ℃에서 4 시간 배양하여 발효유를 얻었다. 얻어진 발효유는, 즉시 발효유의 온도가 10 ℃가 될 때까지 교반 냉각하고, 또한 100 ㎖ 용량의 종이컵 용기에 충전해서 밀봉하여, 요구르트를 얻었다.
얻어진 요구르트는 락트산 산도 0.74 ％, pH 4.69이고, 1.0×108 CFU/㎖의 비피더스균을 함유하고 있었다. 이 요구르트를 10 ℃에서 14 일간 보존했을 때의 비피더스균 수는 9.3×107 CFU/㎖이고, 생잔율은 93 ％였다. 또한, 이 때의 용존 산소 농도는 0.5 ppm 이하였다.
[실시예 4] 락토코커스?락티스?서브스피시즈?락티스를 이용한 요구르트의 제조 (II)
탈지분유, 크림 및 유단백질을 혼합 용해하고, 유지방 3.0 ％(W/W), 무지유 고형분 12.0 ％(W/W)로 이루어지는 밀크 원료 50 L를 제조하여, 70 ℃로 가온하고, 15 ㎫의 압력으로 균질하고, 90 ℃에서 10분간 살균하여, 40 ℃로 냉각하였다.
이 살균한 밀크 원료에, 실시예 1과 동일하게 하여 얻어진 락토코커스?락티스?서브스피시즈?락티스LcL26주의 컬쳐 500 ㎖와, 비피도박테리움?롱검 ATCC BAA-999주의 컬쳐 500 ㎖, 또한 스트렙토코커스?서머필러스와 락토바실러스?델브루에키?서브스피시즈?불가리쿠스를 포함하는 요구르트 스타터(다니스코사 제조) 0.002 ％를 접종하여, 37 ℃에서 8 시간 배양하여 발효유를 얻었다. 얻어진 발효유는 즉시 발효유의 온도가 10 ℃가 될 때까지 교반 냉각하고, 100 ㎖ 용량의 종이컵 용기에 충전해서 밀봉하여, 요구르트를 얻었다.
얻어진 요구르트는, 락트산 산도 0.65 ％, pH 4.84이고, 1.2×108 CFU/㎖의 비피더스균을 함유하고 있었다. 이 요구르트를 10 ℃에서 14 일간 보존했을 때의 비피더스균 수는 1.0×108 CFU/㎖이고, 생잔율은 83 ％였다. 또한, 이 때의 용존 산소 농도는 0.5 ppm 이하였다.
[실시예 5] 락토코커스?락티스?서브스피시즈?락티스를 이용한 요구르트의 제조 (III)
탈지분유, 크림 및 유단백질을 혼합 용해하고, 유지방 3.0 ％(W/W), 무지유 고형분 12.0 ％(W/W)로 이루어지는 밀크 원료 50 L를 제조하여, 70 ℃로 가온하고, 15 ㎫의 압력으로 균질하고, 90 ℃에서 10 분간 살균하여, 40 ℃로 냉각하였다.
이 살균한 밀크 원료에 실시예 1과 동일하게 하여 얻어진 락토코커스?락티스?서브스피시즈?락티스LcL26주의 컬쳐 500 ㎖와, 비피도박테리움?롱검 ATCC BAA-999주의 동결 균체(모리나가뉴교사 제조) 1.5×1014 CFU, 또한 스트렙토코커스?서머필러스와 락토바실러스?델브루에키?서브스피시즈?불가리쿠스를 포함하는 요구르트 스타터(다니스코사 제조) 0.002 ％를 접종하고, 37 ℃에서 4 시간 배양하여 발효유를 얻었다. 얻어진 발효유는 즉시 발효유의 온도가 10 ℃가 될 때까지 교반 냉각하고, 100 ㎖ 용량의 종이컵 용기에 충전해서, 밀봉하여, 요구르트를 얻었다.
얻어진 요구르트는 락트산 산도 0.70 ％, pH 4.74이고, 4.2×109 CFU/㎖의 비피더스균을 함유하고 있었다. 이 요구르트를 10 ℃에서 14일간 보존했을 때의 비피더스균 수는 2.0×109 CFU/㎖이고, 생잔율은 47.6 ％였다. 또한, 이 때의 용존 산소 농도는 1.47 ppm이었다.
본 발명의 발효유 제조 방법에 의해, 비피도박테리움속 세균, 특히 비피도박테리움?롱검을 많이 함유하는 발효 식품을 효율적으로 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 발효 식품의 제조 방법에 의해 제조된 발효 식품은, 건강 관리에 있어서도 유용한 것임은 당연하고, 풍미가 우수한, 기호성이 높은 것이다.
또한, 본 발명의 비피도박테리움속 세균 함유 밀크 원료 발효용 스타터는, 상기 발효 식품의 제조에 사용할 수 있다.
독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터 FERMBP11275 20100811 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터 FERMBP11276 20100811 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터 FERMBP11277 20100811
SEQUENCE LISTING <110> Morinaga Milk Industry Co., Ltd. <120> A method for producing a fermented food containing Bifidobacteria <130> FP218-11174 <150> JP2010-194521 <151> 2010-08-31 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer GBf <400> 1 gcaaatacgg tgacggctgc ga 22 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer GB2r <400> 2 tgagcattat aataggtctt cttcc 25 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer GHf <400> 3 caaatacggt gacggctgct aa 22 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer GH2r <400> 4 tagcattata ataggtcttc gtca 24

Claims (20)

  1. 세포벽 국재성 단백질 분해 효소를 갖지 않는 락토코커스?락티스와, 비피도박테리움속 세균을 이용하여, 밀크 원료를 발효시키는 것을 특징으로 하는 발효 식품의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 락토코커스?락티스는, 1 ％(W/W) 글루코오스, 및 10 ％(W/W) 환원 탈지분유를 포함하는 배지에 동 세균을 배지 1 ㎖ 당 5.0×106 내지 2.0×108 CFU 접종하여, 37 ℃에서 4 내지 24 시간 배양했을 때, 해당 배지가 응고되지 않는 성질을 갖는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 락토코커스?락티스는, 1 ％(W/W) 글루코오스, 및 10 ％(W/W) 환원 탈지분유를 포함하는 배지에 동 세균을 배지 1 ㎖ 당 5.0×106 내지 2.0×108 CFU, 및 비피도박테리움속 세균을 배지 1 ㎖ 당 1.0×107 내지 3.0×109 CFU, 각각 접종하여 배양하고, 배지의 pH가 4.6 내지 5.5에 도달한 시점에 배지를 배양 온도에서 10 ℃로 급랭하여, 10 ℃에서 2주간 보존했을 때의 용존 산소 농도를, 2 ppm 이하로 유지하는 성질을 갖는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 락토코커스?락티스는, 1 ％(W/W) 글루코오스, 및 10 ％(W/W) 환원 탈지분유를 포함하는 배지에 동 세균을 배지 1 ㎖ 당 5.0×106 내지 2.0×108 CFU, 및 비피도박테리움속 세균을 배지 1 ㎖ 당 1.0×107 내지 3.0×109 CFU, 각각 접종하여 배양하고, 배지의 pH가 4.6 내지 5.5에 도달한 시점에 배지를 배양 온도에서 10 ℃로 급랭하여, 10 ℃에서 2주간 보존했을 때의 비피도박테리움속 세균의 생잔율을 30 ％ 이상으로 유지하는 성질을 갖는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 락토코커스?락티스는, 1 ％(W/W) 글루코오스, 및 10 ％(W/W) 환원 탈지분유를 포함하는 배지에 동 세균을 배지 1 ㎖ 당 5.0×106 내지 2.0×108 CFU, 비피도박테리움속 세균을 배지 1 ㎖ 당1.0×107 내지 3.0×109 CFU, 및 스트렙토코커스?써모필러스 및 락토바실러스?델브루에키?서브스피시즈?불가리쿠스를 각각 배지 1 ㎖ 당 1.0×103 내지 9.0×107 CFU 접종하여, 37 ℃에서 3 내지 24 시간 배양했을 때, 해당 배지가 응고되는 성질을 갖는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 락토코커스?락티스가, 락토코커스?락티스?서브스피시즈?락티스, 및 락토코커스?락티스?서브스피시즈?크레모리스로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 락토코커스?락티스가, 락토코커스?락티스?서브스피시즈?락티스LcL13(FERM BP-11276), 락토코커스?락티스?서브스피시즈?락티스LcL26(FERM BP-11277), 및 락토코커스?락티스?서브스피시즈?크레모리스LcC46(FERM BP-11275)으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비피도박테리움속 세균이, 비피도박테리움?롱검인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 비피도박테리움?롱검이, 비피도박테리움?롱검 ATCC BAA-999주인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 스트렙토코커스?써모필러스 및 락토바실러스?델브루에키로 이루어지는 군에서 선택되는 유산균을 추가로 발효에 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조된 발효 식품.
  12. 세포벽 국재성 단백질 분해 효소를 갖지 않는 락토코커스?락티스를 포함하는 비피도박테리움속 세균 함유 밀크 원료 발효용 스타터.
  13. 제12항에 있어서, 상기 락토코커스?락티스는, 1 ％(W/W) 글루코오스, 및 10 ％(W/W) 환원 탈지분유를 포함하는 배지에 동 세균을 배지 1 ㎖ 당 5.0×106 내지 2.0×108 CFU 접종하여, 37 ℃에서 4 내지 24 시간 배양했을 때, 해당 배지가 응고되지 않은 성질을 갖는 것인 비피도박테리움속 세균 함유 밀크 원료 발효용 스타터.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 락토코커스?락티스는, 1 ％(W/W) 글루코오스, 및 10 ％(W/W) 환원 탈지분유를 포함하는 배지에 동 세균을 배지 1 ㎖ 당 5.0×106 내지 2.0×108 CFU, 및 비피도박테리움속 세균을 배지 1 ㎖ 당 1.0×107 내지 3.0×109 CFU, 각각 접종하여 배양하고, 배지의 pH가 4.6 내지 5.5에 도달한 시점에 배지를 배양 온도에서 10 ℃로 급랭하여, 10 ℃에서 2주간 보존했을 때의 비피도박테리움속 세균의 생잔율을 30 ％ 이상으로 유지하는 성질을 갖는 것인 비피도박테리움속 세균 함유 밀크 원료 발효용 스타터.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 락토코커스?락티스는, 1 ％(W/W) 글루코오스, 및 10 ％(W/W) 환원 탈지분유를 포함하는 배지에 동 세균을 배지 1 ㎖ 당 5.0×106 내지 2.0×108 CFU, 비피도박테리움속 세균을 배지 1 ㎖ 당 1.0×107 내지 3.0×109 CFU, 및 스트렙토코커스?써모필러스 및 락토바실러스?델브루에키?서브스피시즈?불가리쿠스를 각각 배지 1 ㎖ 당 2.0×105 내지 9.0×107 CFU 접종하여, 37 ℃에서 3 내지 24 시간 배양했을 때, 해당 배지가 응고되는 성질을 갖는 것인 비피도박테리움속 세균 함유 밀크 원료 발효용 스타터.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 락토코커스?락티스가, 락토코커스?락티스?서브스피시즈?락티스, 및 락토코커스?락티스?서브스피시즈?크레모리스로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 비피도박테리움속 세균 함유 밀크 원료 발효용 스타터.
  17. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 락토코커스?락티스가, 락토코커스?락티스?서브스피시즈?락티스LcL13(FERM BP-11276), 락토코커스?락티스?서브스피시즈?락티스LcL26(FERM BP-11277), 및 락토코커스?락티스?서브스피시즈?크레모리스LcC46(FERM BP-11275)으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 비피도박테리움속 세균 함유 밀크 원료 발효용 스타터.
  18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비피도박테리움속 세균이, 비피도박테리움?롱검인 비피도박테리움속 세균 함유 밀크 원료 발효용 스타터.
  19. 제18항에 있어서, 상기 비피도박테리움?롱검이, 비피도박테리움?롱검 ATCC BAA-999주인 비피도박테리움속 세균 함유 밀크 원료 발효용 스타터.
  20. 락토코커스?락티스?서브스피시즈?락티스LcL13(FERM BP-11276), 락토코커스?락티스?서브스피시즈?락티스LcL26(FERM BP-11277), 및 락토코커스?락티스?서브스피시즈?크레모리스LcC46(FERM BP-11275)으로 이루어지는 군에서 선택되는 균주.
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