MX2012009975A - Un metodo para producir un alimento fermentado que contiene bifidobacterias. - Google Patents

Un metodo para producir un alimento fermentado que contiene bifidobacterias.

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Toshitaka Odamaki
Sumiko Yonezawa
Maruyama Hiroshi
Noritoshi Takahashi
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Morinaga Milk Industry Co Ltd
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Abstract

Se fermenta un material lácteo crudo usando Lactococcus lactis que no tiene célula proteinasa cubierta por una pared y una bacteria Bifidobacterium; la Lactococcus lactis es, por ejemplo, una Lactococcus lactis que tiene la propiedad de que, cuando esta bacteria y la bacteria Bifidobacterium son inoculadas en un medio que contiene 1 % (en peso) de glucosa y 10% (en peso) de leche descremada en polvo reducida en cantidades de 5.0 x 106 a 2.0 x 108 CFU y 1.0 x 107 a 3.0 x 109 CFU por 1 ml del medio, respectivamente, y cultivadas, y el medio es rápidamente enfriado a 10°C de la temperatura de cultivo cuando el pH del medio va de 4.6 a 5.5 y almacenadas a 10°C por 2 semanas, la tasa de supervivencia de la bacteria Bifidobacterium se mantiene en 30% o más.

Description

UN MÉTODO PARA PRODUCIR UN ALIMENTO FERMENTADO QUE CONTIENE BIFIDOBACTERIAS CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere a un método para producir un alimento fermentado obtenible mediante fermentación de un material lácteo crudo usando Lactococcus lactis y una bacteria Bifidobacterium, y Lactococcus lactis usada adecuadamente para el método.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las bacterias Bifidobacterium (de aquí en adelante referidas como "bifidobacterias") como la Bifidobacterium longum constituyen una clase de especies dominantes de la flora intestinal formadas en tracto intestinal humano. Se sabe que las bifidobacterias tienen acción controladora de funciones intestinales para restaurar el balance de enterobacterias, acción mejoradora de inmunidad, acción supresora de carcinogénesis, etcétera. Por lo tanto, las demandas por alimentos que contienen bifidobacterias vivas, como leche fermentada con bifidobacteria se han incrementado en años recientes con el aumento de la conciencia de salud de los consumidores.
Las bifidobacterias muestran baja proliferación en un medio láctico. Por lo tanto, por ejemplo, para obtener un contenido de bifidobacteria de 1 x 107 CFU(unidad formadora de colonia)/mL, una cierta cantidad de varias sustancias promotoras del crecimiento usualmente se agregan a la leche fermentada.
Sin embargo, las sustancias promotoras del crecimiento son caras generalmente, y también pueden degradar los sabores de los alimentos. Además, es difícil almacenar bifidobacterias bajo condiciones de acidez, y son muertas fácilmente bajo dichas condiciones. Por esta razón, incluso si las bifidobacterias proliferan durante la fabricación de un producto lácteo fermentado o similar, la cantidad de bifidobacterias vivas en el producto lácteo fermentado disminuye a paso acelerado durante la distribución del producto lácteo fermentado o similar.
Por lo tanto, un tema recurrente de la investigación es mejorar la viabilidad y la supervivencia en el almacenamiento de bifidobacterias y así producir una leche fermentada que contiene una gran cantidad de bifidobacterias vivas, especialmente, una leche fermentada que contenga bifidobacterias vivas en abundancia incluso al momento de la ingestión por parte de los consumidores a un nivel similar al observado inmediatamente después de la fabricación de las mismas.
Se han descrito varios métodos para mejorar la viabilidad y la supervivencia en el almacenamiento de bifidobacterias mediante la realización de fermentación mixta usando una bifidobacteria y otra bacteria de ácido láctico sin agregar las sustancias promotoras del crecimiento como se describió antes o similares.
En cuanto al método para mejorar la viabilidad de bifidobacterias en la fabricación de leche fermentada, se han mostrado, por ejemplo, yogurt que contiene Lactococcus lactis subespecie lactis, Lactococcus lactis subespecie cremoris, y una bifidobacteria, y un método para producirla (refiérase, por ejemplo, al documento de patente 1).
Además, en cuanto al método para mejorar la supervivencia en el almacenamiento de bifidobacterias en leche fermentada, se ha descrito, por ejemplo, un método para producir leche fermentada con bifidobacteria que comprende un cultivo mixto de Bifidobacterium breve y Lactococcus lactis subespecie lactis sin producir diacetilo y acetoina en un medio que consiste principalmente de leche (refiérase, por ejemplo, al documento de Patente 2).
Además, se han descrito, por ejemplo, un método para producir leche fermentada que comprende fermentación de una base de fermentación usando Lactococcus lactis que tiene una célula proteinasa cubierta por una pared (PrtP, por sus siglas en inglés) y una bacteria Bifidobacterium (refiérase, por ejemplo, al documento de Patente 3), un método para producir una composición que contiene bacterias Bifidobacterium que comprende la inoculación de una bacteria Bifidobacterium en un medio que contiene proteínas lácteas al que se le agregaron células deterioradas de una bacteria de ácido láctico que tiene una célula proteinasa cubierta por una pared o una fracción de la enzima fraccionada de las células de la bacteria de ácido láctico (refiérase, por ejemplo, al documento de Patente 4), un método para producir leche fermentada caracterizado por el uso de una bacteria Lactococcus que tiene habilidad de fermentación en un medio reducido al 10% de leche descremada en polvo, y que tiene un efecto promotor de proliferación y efecto mejorador de la supervivencia sobre Bifidobacterium longum, y la leche fermentada producida mediante este método de producción (refiérase, por ejemplo, al documento de Patente 5).
Referencias de la técnica anterior Documentos de patente Documento de patente 1 : Patente Japonesa No. 3364491 Documento de patente 2: Patente Japonesa No. 3068484 Documento de patente 3: Patente Japonesa No. 4448896 Documento de patente 4: Patente japonesa abierta al público (KOKAI) No. 2009-296910 Documento de patente 5: Publicación de patente internacional WO2008/099543 BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Objetivo que se alcanzará con la invención Aunque se han descrito anteriormente métodos para mejorar la viabilidad y la supervivencia en el almacenamiento de bifidobacterias, aún queda lugar para mejoramiento adicional. Por ejemplo, en el método del documento de Patente 1 mencionado anteriormente, el crecimiento de bifidobacterias es promovido de modo que el tiempo de fermentación puede ser acortado, pero el documento de Patente 1 no se refiere de ninguna manera a la supervivencia en el almacenamiento de las bifidobacterias.
En el método del documento de Patente 2 mencionado anteriormente, el uso de bacterias mezcladas que consiste en una bifidobacteria específica y una bacteria de ácido láctico específica proporciona tanto efecto promotor de la proliferación como efecto mejorador de la supervivencia, pero el documento de Patente 2 no se refiere de ninguna manera a bifidobacterias distintas de Bifidobacterium breve, por ejemplo, Bifidobacterium longum, la cual es ampliamente usada actualmente para productos alimenticios. De hecho, en un experimento usando la cepa mencionada en el documento de Patente 2 (FERM BP-6224), no se pudo obtener suficiente supervivencia de Bifidobacterium longum, como se describe a continuación.
Además, en el método descrito en el documento de Patente 3 mencionado anteriormente, el uso de la Lactococcus lactis que tiene una célula proteinasa cubierta por una pared (PrtP) proporciona un efecto de promoción de la proliferación de bifidobacterias, pero la PrtP produce muchos oligopéptidos y aminoácidos de proteínas para generar amargor y sabor umami, y por lo tanto el sabor de la leche fermentada se puede ver afectado (por ejemplo, Pillidge, C.J. et al., Int. Dairy Journal, 2003, 13:345-354). El método descrito en el documento de Patente 4 tiene el mismo problema.
Además, de acuerdo con Yonezawa S. et al., J. Dairy Sci., 2010, 93:1815-23 y el documento de Patente 3, la Lactococcus lactis que tiene habilidad de fermentación en un medio de leche descremada en polvo tenía PrtP, y por lo tanto el método del documento de Patente 5 también tiene el mismo problema que el del documento de Patente 3, es decir, la PrtP puede afectar el sabor de la leche fermentada.
Por otro lado, debido a que la Lactococcus lactis que no tiene PrtP no es capaz de incorporar suficiente nutrición de un medio de leche descremada en polvo, sustanciaimente todas las cepas de la misma no pudieron crecer en un medio de leche descremada en polvo, y el efecto promotor de la proliferación y efecto mejorador de la supervivencia de la misma no se ha observado.
Un objetivo de la presente invención es proporcionar un método para producir un alimento fermentado que tenga buen sabor mediante el uso de una bacteria de ácido láctico que pueda mejorar la supervivencia en el almacenamiento de bacterias Bifidobacterium, un alimento fermentado producido por dicho método de producción, y un agente de inicio para fermentación de un material lácteo crudo que contenga una bacteria Bifidobacterium y la bacteria de ácido láctico mencionada anteriormente.
Medios para alcanzar el objetivo Los inventores de la presente invención condujeron varias investigaciones para alcanzar el objetivo antes mencionado, como resultado, encontraron que existía una cepa de Lactococcus lactis que no tiene una célula proteinasa cubierta por una pared PrtP que mejoró la propiedad de almacenamiento de una bacteria Bifidobacterium en fermentación mezclada de la cepa y la bacteria Bifidobacterium, y por lo tanto lograron la presente invención.
Así, la presente invención se refiere a un método para producir un alimento fermentado que comprende la fermentación de un material lácteo crudo mediante el uso de Lactococcus lactis que no tiene célula proteinasa cubierta por una pared y una bacteria Bifidobacterium.
La presente invención también proporciona un alimento fermentado producido mediante el método.
La presente invención también proporciona un agente de inicio para la fermentación de un material lácteo crudo que contiene una bacteria Bifidobacterium, la cual comprende Lactococcus lactis que no tiene célula proteinasa cubierta por una pared.
En modalidades preferidas del método para producir un alimento fermentado y el agente de inicio para fermentación de un material lácteo crudo que contiene una bacteria Bifidobacterium de la presente invención, la Lactococcus lactis tiene la propiedad de que, cuando esta bacteria es inoculada en un medio que contiene 1% (en peso) de glucosa y 10% (en peso) de leche descremada en polvo reducida en una cantidad de 5.0 x 106 a 2.0 x 108 CFU por 1 mL del medio, y cultivada a 37°C de 4 a 24 horas, el medio no se coagula.
En una modalidad preferida de la presente invención, la Lactococcus lactis tiene la propiedad de que, cuando esta bacteria y la bacteria Bifidobacterium son inoculadas en un medio que contiene 1 % (en peso) de glucosa y 10% (en peso) de leche descremada en polvo reducida en cantidades de 5.0 x 106 a 2.0 x 108 CFU y 1.0 x 107 a 3.0 x 109 CFU por 1 mL del medio, respectivamente, y cultivadas, y el medio es rápidamente enfriado a 10°C de la temperatura de cultivo cuando el pH del medio se convierte de 4.6 a 5.5 y almacenadas a 10°C por 2 semanas, la concentración de oxígeno disuelto en el medio se mantiene para ser 2 ppm o menor.
En una modalidad preferida de la presente invención, la Lactococcus lactis tiene la propiedad de que, cuando esta bacteria y la bacteria Bifidobacterium son inoculadas en un medio que contiene 1 % (en peso) de glucosa y 10% (en peso) de leche descremada en polvo reducida en cantidades de 5.0 x 106 a 2.0 x 108 CFU y 1.0 x 107 a 3.0 x 109 CFU por 1 mL del medio, respectivamente, y cultivadas, y el medio es rápidamente enfriado a 10°C de la temperatura de. cultivo cuando el pH del medio se convierte de 4.6 a 5.5 y almacenadas a 10°C por 2 semanas, la tasa de supervivencia de bacteria Bifidobacterium se mantiene a 30% o más.
En una modalidad preferida de la presente invención, la Lactococcus lactis tiene la propiedad de que, cuando esta bacteria, la bacteria Bifidobacterium y Streptococcus thermophilus y Lactobacilus delbrueckii subespecie bulgaricus son inoculadas en un medio que contiene 1% (en peso) de glucosa y 10% (en peso) de leche descremada en polvo reducida en cantidades de 5.0 x 106 a 2.0 x 108 CFU y 1.0 x 107 a 3.0 x 109 CFU, 2.0 x 105 a 9.0 x 107 CFU y 2.0 x 105 a 9.0 x 107 CFU por 1 ml_ del medio, respectivamente, y cultivadas a 37°C de 3 a 24 horas, el medio se coagula.
En una modalidad preferida de la presente invención, la Lactococcus lactis es seleccionada del grupo que consiste en Lactococcus lactis subespecie lactis y Lactococcus lactis subespecie cremoris.
En una modalidad preferida de la presente invención, la Lactococcus lactis es seleccionada del grupo que consiste en Lactococcus lactis subespecie lactis LcL13 (FER BP-11276), Lactococcus lactis subespecie lactis LcL26 (FERM BP-11277), y Lactococcus lactis subespecie cremoris LcC46 (FERM BP-1 1275).
En una modalidad preferida de la presente invención, la bacteria Bifidobacterium es Bifidobacterium longum.
En una modalidad preferida de la presente invención, Bifidobacterium longum es la cepa Bifidobacterium longum ATCC BAA-999.
En una modalidad preferida de la presente invención, una bacteria de ácido láctico seleccionada del grupo que consiste en Streptococcus thermophilus y Lactobacilus delbrueckii se usa para la fermentación.
La presente invención también proporciona una cepa bacterial seleccionada del grupo que consiste en Lactococcus lactis subespecie lactis LcL13 (FERM BP-11276), Lactococcus lactis subespecie lactis LcL26 (FERM BP-11277), y Lactococcus lactis subespecie cremoris LcC46 (FERM BP- 11275).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra los resultados de la evaluación del sabor del yogurt producido mediante el método de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN De aquí en adelante, la presente invención se explicará a detalle.
La bacteria usada para la presente invención es Lactococcus lactis que no tiene célula proteinasa cubierta por una pared. La célula proteinasa cubierta por una pared (EC 3.4.21.96, también referida como "PrtP") en una enzima que está presente en la membrana celular, cuyo sitio activo está expuesto sobre la superficie celular. Así como la enzima PrtP de Lactococcus lactis, se conpeen las del tipo Pl (la enzima de este tipo apenas descompone la a-caseína, pero descompone bien la ß-caseína desde la vecindad de la C-terminal), tipo Pili (la enzima de este tipo descompone bien tanto la a-caseína como la ß-caseina desde la C-termínal y la N-terminal), y un tipo intermedio de ellas (tipo PI/PIII) (por ejemplo, Reid, J.R. et al., Applied and Environmental Microbiology, 1994, Vol. 60, No. 3, pp.801-806). Ejemplos específicos de PrtP incluyen, como la PrtP de Lactococcus lactis, PrtP y homólogos de la misma, de las cuales las secuencias de genes están registradas en NCBI con números de acceso de AY542690, AY542691 etc. Ejemplos de los homólogos incluyen proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos codificada por cualquiera de las secuencias de genes antes mencionadas, pero incluyendo sustituciones, deleciones, inserciones o adiciones de uno o varios residuos de aminoácidos, y que tienen actividad PrtP. El número buscado por la expresión de uno o varios es preferiblemente de 1 a 20, más preferiblemente de 1 a 10, aún más preferiblemente de 1 a 5, y particularmente preferible de 1 a 3. Ejemplos de los homólogos además incluyen proteínas que muestran una homología del 80% o más, preferiblemente 90% o más, más preferiblemente 95% o más, con una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos con número de acceso AY542690 o AY542691 , y que tienen actividad PrtP.
La expresión de la bacteria "que no tiene PrtP" quiere decir que la bacteria no tiene la actividad enzimática de PrtP, y este estado incluye un estado en el que la bacteria no tiene ninguna proteína PrtP, y un estado en el que la bacteria tiene una proteína PrtP, pero la proteína PrtP no tiene la actividad enzimática. Además, un estado en el que la bacteria tiene una proteína PrtP, pero la cantidad o actividad de la proteína PrtP es marcadamente más baja que la de aquella de la bacteria que tiene PrtP también se incluye en el estado de "que no tiene PrtP".
Aunque la subespecie (subsp.) de la Lactococcus lactis no está particularmente limitada, se prefiere una subespecie que incluye una cepa que tiene PrtP y una cepa que no tiene PrtP. Los ejemplos específicos incluyen, por ejemplo, Lactococcus lactis subespecie lactis y Lactococcus lactis subespecie cremoris. Una cepa de Lactococcus lactis que no tiene PrtP se puede obtener seleccionando una cepa que no tiene la actividad PrtP, o una cepa que no tiene un gen que codifique para PrtP de la naturaleza.
Debido a que la PrtP tiene un sitio activo enzimático fuera de la célula, una cepa que tiene PrtP puede descomponer proteínas en el medio, y usarlas para crecimiento de la cepa misma. Sin embargo, una cepa que no tiene PrtP no puede usar proteínas en el medio para crecimiento de la cepa. Por lo tanto, una cepa que no tiene PrtP puede ser seleccionada partiendo de la base de observación del crecimiento en un medio que contiene proteínas, por ejemplo, un medio que contiene 10% (en peso) de leche descremada en polvo reducida.
Además, una cepa que no tiene un gen que codifica para PrtP puede ser seleccionada partiendo de la base de detección de un gen PrtP o una parte del mismo mediante PCR por ejemplo, como se describe en los ejemplos. Ejemplos de iniciadores para amplificar un gen PrtP incluyen un grupo de iniciadores de SEQ ID NOS: 1 y 2 y un grupo de iniciadores de SEQ ID NOS: 3 y 4.
Una cepa que no tiene PrtP también puede ser obtenida de una cepa que tiene PrtP mediante la desactivación, deterioro o eliminación de un gen PrtP usando mutagénesis o recombinación de genes. La PrtP codificada mediante un gen PrtP para ser inactivada, deteriorada o eliminada puede ser la enzima de los tipos Pl, Pili o PI/PIII.
Una modalidad de la Lactococcus lactis que no tiene PrtP es una cepa que tiene la propiedad de que, cuando esta bacteria es inoculada en un medio que contiene 1 % (en peso) de glucosa y 10% (en peso) de leche descremada en polvo reducida en una cantidad de 5.0 x 106 a 2.0 x 108 CFU por 1 ml_ del medio, y cultivada a 37°C de 4 a 24 horas, por ejemplo, 16 horas, el medio no se coagula.
El medio que contiene 1% (en peso) de glucosa y 10% (en peso) de leche descremada en polvo reducida puede ser preparado mediante la disolución de la glucosa a 1 % (en peso) y leche descremada en polvo reducido al 10% (en peso) en agua, y esterilizando la solución. La esterilización se puede realizar mediante, por ejemplo, un tratamiento con calor de 80 a 122°C por 40 a 5 minutos, preferiblemente de 85 a 95°C por 35 a 5 minutos.
El conteo celular (CFU, por sus siglas en inglés) de la bacteria puede ser medido esparciendo una suspensión apropiadamente diluida de la bacteria sobre un medio agar apropiado, por ejemplo, un medio agar de conteo con bandeja BCP agregada (producido por EIKEN CHEMICAL CO., LTD.) para realizar cultivo, y contar las colonias que aparecen.
El que el medio se coagule o no puede ser determinado mediante, por ejemplo, la realización de cultivo usando un tubo de ensayo o similar. Específicamente, cuando un tubo de ensayo que contiene el medio se invierte, si el medio no muestra fluidez, se juzga que el medio está coagulado, y si el medio muestra fluidez, se juzga que el medio no está coagulado.
Además, la Lactococcus lactis que no tiene PrtP preferiblemente tiene la propiedad de que cuando, en un medio que contiene 1 % (en peso) de glucosa y 10% (en peso) de leche descremada en polvo reducida, la bacteria es inoculada en una cantidad de 5.0 x 106 a 2.0 x 108 CFU por 1 ml_ del medio, la bacteria Bifidobacterium es inoculada en una cantidad de 1.0 x 107 a 3.0 x 109 CFU, preferiblemente 1.0 X 107 a 5.0 x 107 CFU por 1 mL del medio, son cultivadas, y el medio es rápidamente enfriado a 10°C de la temperatura de cultivo cuando el pH del medio se convierte de 4.6 a 5.5 y almacenadas a 10°C por 2 semanas, la concentración de oxígeno disuelto en el medio se mantiene para ser 2 ppm o menor, preferiblemente 1 ppm o menor, más preferiblemente 0.5 ppm o menor. Si la concentración de oxigeno disuelto en el medio es alta, las bacterias Bifidobacterium apenas crecen. Por lo tanto, cuando un material lácteo crudo es fermentado usando Lactococcus lactis junto con una bacteria Bifidobacterium, la Lactococcus lactis es preferiblemente una Lactococcus lactis que no incrementa la concentración de oxigeno disuelto en el medio.
El enfriamiento rápido a 10°C es realizado preferiblemente en 1 hora, más preferiblemente en 30 minutos, y más particularmente preferible en 10 minutos. La temperatura de cultivo es preferiblemente de 30 a 40°C, más preferiblemente de 36 a 38°C, más particularmente preferible 37°C. Lo mismo aplica a las siguientes descripciones.
Además, en otra modalidad de la presente invención, la Lactococcus lactis que no tiene PrtP preferiblemente tiene la propiedad de que cuando, en un medio que contiene 1 % (en peso) de glucosa y 10% (en peso) de leche descremada en polvo reducida, la bacteria es inoculada en una cantidad de 5.0 x 106 a 2.0 x 108 CFU por 1 mi del medio, la bacteria Bifidobacterium es inoculada en una cantidad de 1.0 x 107 a 3.0 x 109 CFU, preferiblemente 1.0 x 107 a 5.0 x 107 CFU, por 1 mi del medio, son cultivadas, y el medio se enfría rápidamente a 10°C de la temperatura de cultivo cuando el pH del medio se convierte de 4.6 a 5.5 y se almacenan a 10°C por 2 semanas, la tasa de supervivencia de la bacteria Bifidobacterium se mantiene para ser 30% o más, preferiblemente 50% o más, más preferiblemente 80% o más. La tasa de supervivencia se refiere a una tasa de conteo de células vivas después del almacenamiento al conteo de células vivas al momento del inicio del almacenamiento. Aunque esta propiedad y la propiedad mencionada anteriormente de no incrementar la concentración de oxígeno disuelto en el medio puede ser poseída independientemente por la Lactococcus lactis, la Lactococcus lactis tiene preferiblemente ambas propiedades.
Además, en otra modalidad de la presente invención, la Lactococcus lactis que no tiene PrtP preferiblemente tiene la propiedad de que cuando, en un medio que contiene 1 % (en peso) de glucosa y 10% (en peso) de leche descremada en polvo reducida, esta bacteria es inoculada en una cantidad de 5.0 x 106 a 2.0 x 108 CFU por 1 mi del medio, la bacteria Bifidobacterium es inoculada en una cantidad de 1.0 x 107 a 3.0 x 109 CFU, preferiblemente 1.0 x 107 a 5.0 x 107 CFU por 1 mi del medio, Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii subespecie bulgaricus son inoculadas en una cantidad de 2.0 x 105 a 9.0 x 107 CFU por 1 mi del medio, y son cultivadas a 37°C de 4 a 24 horas, por ejemplo, 8 horas, el medio está coagulado.
Aunque el hecho de que la Lactococcus lactis que no tiene PrtP no coagula un medio que contiene leche descremada en polvo reducida quiere decir que la bactena no tiene habilidad de fermentación por si misma en el medio, el hecho de que cuando la bacteria es cultivada con una bacteria Bifidobacterium en el medio, la concentración de oxígeno disuelto en el medio es reducida, así como la tasa de supervivencia de la bacteria Bifidobacterium después de la fermentación es incrementada quiere decir que la Lactococcus lactis de la presente invención es adecuada para la producción de un alimento fermentado que contiene una bacteria Bifidobacterium de un material lácteo crudo. Por lo tanto, la Lactococcus lactis que no tiene PrtP, especialmente una cepa de la misma que tiene las propiedades mencionadas anteriormente, es adecuada como un agente de inicio para producir un alimento fermentado que contiene una bacteria Bifidobacterium. El "agente de inicio para la fermentación de un material lácteo crudo que contiene una bacteria Bifidobacterium" de la presente invención se refiere a un agente de inicio para producir dicho alimento fermentado que contiene una bacteria Bifidobacterium, esto es, una bacteria a ser inoculada en un material lácteo crudo junto con una bacteria Bifidobacterium para producir un alimento fermentado.
Ejemplos específicos de la Lactococcus lactis usada para la presente invención incluyen Lactococcus lactís subespecie lactis LcL 13 (FERM BP-1 1276), Lactococcus lactis subespecie lactis LcL26 (FERM BP-11277) y Lactococcus lactis subespecie cremoris LcC46 (FERM BP-11275).
Estas cepas fueron depositadas en la institución administrativa independiente, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada, Organismo Depositario de Patentes Internacionales (Tsukuba Central 6, 1 -1 , Hígashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japón) el 11 de Agosto de 2010 como depósitos internacionales bajo las provisiones de el Tratado de Budapest con los números de acceso mencionados en los paréntesis, respectivamente.
El método de la presente invención es un método para producir un alimento fermentado que comprende la fermentación de un material lácteo crudo usando Lactococcus lactis que no tiene PrtP y una bacteria Bifídobacterium.
La bacteria Bifidobacteríum no está particularmente limitada, y ejemplos incluyen Bifídobacterium longum, Bifidobacteríum bifídum, Bifidobacteríum breve, Bifidobacteríum adolescentis, y Bifidobacteríum infantis (esta especie está reclasificada como Bifidobacteríum longum subespecie infantis). Entre estas, se prefiere Bifidobacteríum longum. Ejemplos específicos de Bifidobacteríum longum incluyen la cepa Bifidobacteríum longum ATCC BAA-999. Esta cepa se puede comprar de, por ejemplo, la Colección Estadounidense de Cultivos Tipo (Dirección: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Estados Unidos de América).
El material lácteo crudo no está particularmente limitado, siempre y cuando se haya elegido un material derivado de la leche del que se pueda producir un alimento fermentado por fermentación usando Lactococcus lactis que no tiene PrtP y una bacteria Bifidobacterium, así como otro ácido láctico según se requiera. Los ejemplos incluyen, por ejemplo, leche y productos de fraccionamiento y productos procesados de los mismos, como leche de vaca, leche descremada, crema fresca, mantequilla, leche entera seca, leche descremada en polvo, y aquellos obtenidos por mezcla, disolución o suspensión de los siguientes materiales con o en agua. El material lácteo crudo puede contener un edulcorante como la sacarosa, pectina, frutas, jugo de fruta, agar, gelatina, grasa o aceite, sabor, agente colorante, estabilizador, agente reductor, etcétera, como se requiera. El material lácteo crudo puede ser sometido a esterilización, homogeneización, enfriamiento, o similares de una manera convencional antes de usarse en la fermentación.
Aunque las cantidades de la Lactococcus lactis que no tiene PrtP y la bacteria Bifidobacterium a ser inoculadas en el material lácteo crudo no están particularmente limitadas, la Lactococcus lactis es preferiblemente inoculada en una cantidad de 104 a 108 CFU/ml del material lácteo crudo, más preferiblemente en una cantidad de 106 a 107 CFU/ml del material lácteo crudo, y la bacteria Bifidobacterium es preferiblemente inoculada en una cantidad de 105 a 109 CFU/ml del material lácteo crudo, más preferiblemente en una cantidad de 107 a 108 CFU/ml del material lácteo crudo. Además, aunque la relación de las cantidades de inoculación de la Lactococcus lactis que no tiene PrtP con la bacteria Bifidobacterium (relación de conteos bacteriales) tampoco está particularmente limitada, es preferiblemente de 1000:1 a 1 :10, más preferiblemente de 10:1 a 1 :1.
La Lactococcus lactis que no tiene PrtP a ser inoculada en el material lácteo crudo puede consistir en un solo tipo de cepa, o dos o más tipos de cepas. La bacteria Bifidobacterium puede también consistir en un solo tipo de cepa, o dos o más tipos de cepas.
La Lactococcus lactis y la bacteria Bifidobacterium, así como otra bacteria de ácido láctico usada según se requiere, las cuales van a ser inoculadas en el material lácteo crudo, son preferiblemente cultivadas con antelación en otro medio como cultivo de siembra o pre-cultivo. Aunque el medio no está particularmente limitado siempre y cuando se haya usado un medio adecuado para cultivo de la Lactococcus lactis y la bacteria Bifidobacterium, así como otra bacteria de ácido láctico usada según se requiere, ejemplos incluyen, por ejemplo, un medio que contiene leche descremada en polvo reducida. La concentración de la leche descremada en polvo reducida es preferiblemente 3% (en peso) o más alta, particularmente preferible 8% (en peso) o más alta. El medio usado para el cultivo de siembra o pre-cultivo puede contener sustancias promotoras del crecimiento como el extracto de levadura, agentes reductores como la L-cisteína, etcétera. En particular, debido a que la bacteria Bifidobacterium muestra baja proliferación en el medio que contiene leche descremada en polvo reducida, es preferible usar un medio que contenga una sustancia promotora del crecimiento, por ejemplo, de 0.1 a 1 % (en peso) de extracto de levadura. Las condiciones de esterilización del medio son las mismas que aquellas mencionadas anteriormente.
La fermentación se puede llevar a cabo agregando otra bacteria de ácido láctico al material lácteo crudo como se requiera, además de la Lactococcus lactis que no tiene PrtP y la bacteria Bifidobacterium. La otra bacteria de ácido láctico no está particularmente limitada siempre y cuando se haya usado una bacteria de ácido láctico que pueda ser usada para la fabricación de productos alimenticios y que no inhiba el crecimiento de Lactococcus lactis y de la bacteria Bifidobacterium. Los ejemplos incluyen, por ejemplo, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii, etcétera, para el caso en el que el alimento fermentado es yogurt. La bacteria de ácido láctico puede consistir en un solo tipo de cepa, o puede consistir en dos o más tipos de cepas.
Cuando la leche es fermentada usando la Lactococcus lactis que no tiene PrtP y la bacteria Bifidobacterium, el pH del cultivo está usualmente alrededor de 5, y se obtiene usualmente yogurt bebible. Si la fermentación se realiza usando además una bacteria de ácido láctico como Streptococcus thermophilus o Lactobacillus delbrueckii, el pH es reducido, y se puede producir yogurt que tiene una estructura más fuerte (yogurt que puede ser comido con una cuchara).
Aunque la relación (relación de conteos bacteriales) de la cantidad de inoculación de la Lactococcus lactis y la bacteria Bifidobacterium con la cantidad de inoculación de la otra bacteria de ácido láctico no está particularmente limitada, es preferiblemente de 1000:1 a 10:1.
El orden de las inoculaciones de Lactococcus lactis, la bacteria Bifidobacterium y la otra bacteria de ácido láctico en el material lácteo crudo no está particularmente limitado, y se pueden inocular simultáneamente. Además, una bacteria o bacterias arbitrarias entre estas bacterias pueden ser inoculadas dos o más veces.
Las condiciones de fermentación como la temperatura de cultivo y el tiempo de cultivo pueden ser las mismas que aquellas usadas para la fabricación usual de alimentos fermentados de un material lácteo crudo. Por ejemplo, la temperatura de cultivo es preferiblemente de 30 a 40°C, más preferiblemente de 36 a 38°C. El tiempo de cultivo puede ser adecuadamente determinado de acuerdo al tipo de alimento fermentado a producir, y es usualmente preferible de 3 a 18 horas.
El alimento fermentado obtenido puede ser apropiadamente procesado como alimentos fermentados usuales obtenidos de un material lácteo crudo. Por ejemplo, el alimento fermentado como tal después de la fermentación puede ser usado como producto alimenticio, o puede ser homogeneizado y licuado. Adicionalmente, los edulcorantes como la sacarosa, pectina, frutas, jugo de fruta, agar, gelatina, grasa o aceite, agente colorante, estabilizador, agente reductor, etcétera, se pueden agregar. El alimento fermentado puede ser introducido en un contenedor según se requiera.
El alimento fermentado producido como se describe arriba muestra menos amargor y sabor umami que resulta de la descomposición de proteínas, y muestra supervivencia superior en el almacenamiento de la bacteria Bifidobacterium.
EJEMPLOS De aquí en adelante, la presente invención será explicada aún más específicamente con referencia a ejemplos de prueba y ejemplos.
EJEMPLO DE PRUEBA 1 Adquisición de cepas de Lactococcus lactis Para obtener una cepa de Lactococcus lactis que no tiene la enzima PrtP de forma natural, muestras colectadas de la naturaleza en Japón fueron diluidas con un diluyente para bacterias anaeróbicas (Mitsuoka T., "World of Enteric Bacteria", Soubunsha, p.322, 1980), las muestras diluidas fueron aplicadas a bandejas de caldo de hígado de Briggs que tiene la siguiente composición (contiene 15g/L de agar, ibid., p.319), y el cultivo se realizó a 30°C bajo una condición anaeróbica.
Diluyente para bacterias anaeróbicas Solución salina I (solución al 0.78% de K2HPC ) 37.5 mi Solución salina II (solución que contiene 0.47% de KH2PO4. 1.18% de NaCI, 1.20% de (NH4)2S04, 0.12% de CaCI2, y 0.25% de MgS04 H2O) 37.5 mi Resazurina (0.1% solución acuosa) 1 ml L-Cisteína HCI H2O 0.5 g Ácido L-ascórbico (25% solución acuosa) 2 ml Na2CO3 (8% solución) 50 ml Agar 0.5 g Agua purificada 860 ml Caldo de hígado de Briqgs Exudado de jugo de tomate 400 ml Neopeptona (Difco) 15 g Extracto de levadura (Difco) 6 g Extracto de hígado 75 ml Glucosa 20 g Almidón soluble 0.5 g NaCI 5 g Tween 80 1 g L-Cisteina HCI H20 0.2 g Agua purificada 525 ml pH 6.8 Entonces, las bacterias que muestran morfología de estreptococos y determinadas como Gram positivas basándose en observación microscópica de frotis fueron tomadas de las colonias obtenidas. Estas bacterias fueron regadas sobre el medio agar BL que tiene la siguiente composición, y el cultivo anaeróbico se repitió de la misma manera que aquel descrito anteriormente para obtener cepas aisladas puramente.
Medio de aqar BL Polvo de Lab-Lemco (Oxoid) 2.4 g Peptona proteosa No. 3 (Difco) 10 g Tripticasa (BBL) 5 g Fitona 3 g Extracto de levadura (Difco) 5 g Extracto de hígado 150 mi Glucosa 10 g Almidón soluble 0.5 g Solución A 10 mi Silicón Toray SH5535 (10% solución) 5 mi Tween 80 1 9 Agar 15 g L-Cisteína HCI H20 0.5 g Sangre de caballo 50 mi PH 7.2 Extracto de hígado Se extrajo hígado en polvo (10 g Kyokuto) con 170 mi de agua purificada en una baño de agua caliente de 50 a 60°C por aproximadamente 1 hora, y entonces el extracto se calentó a 100°C por varios minutos, se ajustó a pH 7.2, y se filtró a través de papel filtro.
Solución A: Se disolvieron 15 g de MgS04-7H20, 0.5 g de FeS04-7H2O, 0.5 g de NaCI, y 0.337 g de MnSO4 en 250 mi de agua purificada.
Los ingredientes distintos de la L-cisteina y la sangre de caballo son disueltos en un baño de agua, se ajusta el pH de la solución, la solución se somete a esterilización a 115°C por 20 minutos y después enfriada a 50°C, la L-cisteína y la sangre de caballo son agregadas a la solución, y la mezcla es vertida en cajas de Petri para obtener la bandeja de medio.
Las secuencias de nucleótidos de los ADNs genómicos de estas cepas fueron determinados de forma convencional. Se realizó una búsqueda de homología para la totalidad de la secuencia 16S del gen de ARN ribosomal en la base de datos internacional de secuencias de nucleótidos (GenBank) de NCBI (Centro Nacional para Información Biotecnológica) usando BLAST (Herramienta de búsqueda de alineación local básica, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), y 280 cepas de bacterias Lactococcus que muestran una homología del 98% para cada tipo de cepa fueron identificadas como resultado. Entre las 242 cepas que muestran una homología de 98% o más alta con respecto a Lactococcus lactis, las cepas del grupo que asimilan lactosa y que muestran la mayor homología hacia Lactococcus lactis subespecie lactis entre las cepas tipo de subespecies de Lactococcus lactis fueron identificadas como Lactoccocus lactis subespecie lactis. Además, las cepas del grupo que muestran la homología más alta hacia Lactococcus lactis subespecie cremoris de entre las cepas tipo de la subespecie Lactococcus lactis fueron identificadas como Lactococcus lactis subespecie cremoris. Todas las cepas obtenidas fueron cocos no esporulantes, anaeróbicos facultativos no móviles y Gram positivos, y fueron negativos tanto para catalasa como para producción de gas.
Entonces, se confirmó si las cepas de Lactococcus lactis obtenidas tenían la enzima PrtP o no. Específicamente, una colonia de cada cepa sobre el medio agar BL fue inoculada en el Caldo M17 Dífco (marca registrada) (producido por Becton, Dickinson and Company) cada uno conteniendo 0.5% de lactosa y glucosa con un bucle de platino, y cultivado a 30°C por 16 horas. El caldo de cultivo obtenido fue inoculado en el mismo medio a una concentración de 3% y se realizó el cultivo a 30°C por 16 horas. Las células fueron obtenidas por centrifugación, se extrajo el ADN usando el kit DNeasy Blood and Tissue (producido por QIAGEN K.K.), y se confirmó con PCR si el gen PrtP estaba contenido en el ADN.
Se realizó PCR de acuerdo con el método descrito en el Journal of Applied Microbiology, 2006, vol. 100, pp. 1307-1317. Como los iniciadores, un grupo iniciador de un iniciador directo GBf (GCAAATACGGTGACGGCTGCGA, SEQ ID NO: 1) y un iniciador inverso GB2r (TGAGCATTATAATAGGTCTTCTTCC, SEQ ID NO: 2), o un grupo iniciador de un iniciador directo GHf (CAAATACGGTGACGGCTGCTAA, SEQ ID NO: 3) y un iniciador inverso GH2r (TAGCATTATAATAGGTCTTCGTCA, SEQ ID NO: 4) fue usado. Como resultado, se confirmó que 128 cepas de entre las 242 cepas de Lactococcus lactis tenían el gen PrtP. Por otro lado, se encontró que las 114 cepas restantes no tenían el gen PrtP.
EJEMPLO DE PRUEBA 2 Prueba de habilidad de fermentación para cepas de Lactococcus lactis en medio láctico El caldo de cultivo de cada una de las cepas obtenidas en el ejemplo de prueba 1 y las cepas mencionadas en el Cuadro 1 fue inoculado a una concentración de 3% en el Caldo M17 Difco (marca registrada) (producido por Becton, Dickinson and Company) cada uno conteniendo 0.5% de lactosa y glucosa, y se cultivó a 30°C por 16 horas. Se colectaron las células por centrifugación, se lavaron, y después se suspendieron en un medio láctico (1% en peso) de glucosa, 10% (en peso) de leche descremada en polvo reducida (producida por Morinaga Milk Industry Co., Ltd.) del mismo volumen que aquel del medio de cultivo original para obtener cultivo de siembra. Las cepas NBRC12007 y NBRC100676 se pueden obtener de la institución administrativa independiente, Instituto Nacional de Tecnología y Evaluación (2-5-8, Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japón). Además, la cepa JCM20101 se puede obtener de la institución administrativa independiente, Instituto de Investigación Física y Química, Colección de Microorganismos de Japón (JCM, por sus siglas en inglés) (2-1 , Hirosawa, ako-shi, Saitama-ken, 351-0198, Japón). La cepa ATCC 9625 se puede obtener de la Colección Estadounidense de Cultivos Tipo (Dirección: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Estados Unidos de América).
Entonces, el cultivo de siembra de cada una de las cepas mencionadas anteriormente fue inoculado en un medio láctico que tiene la misma composición que se mencionó arriba (esterilizado a 95°C por 30 minutos) en una cantidad de 5.0 x 106 a 2.0 x 108 CFU por mi del medio, y el cultivo se realizó a 37°C por 16 horas. El caldo de cultivo obtenido fue rápidamente enfriado a 10X, y se observaron o midieron el estado de coagulación, el pH y el número de bacterias de ácido láctico contenidas. El número de bacterias de ácido láctico fue medido en una bandeja agar de conteo con bandeja BCP agregada disponible comerciaimente (producida por EIKEN CHEMICAL CO., LTD.). Los resultados se muestran en el Cuadro 1. En el cuadro, "E+N" significa "x 10n".
CUADRO 1 Las cepas de subespecies de Lactococcus lactis que no tienen PrtP no se coagularon en el medio láctico, como se describió en Yonezawa S. et al .J. Dairy Sci., 2010, 93: 1815-23.
EJEMPLO DE PRUEBA 3 Prueba de cultivo mixta con Lactococcus lactis que no tiene PrtP y Bifidobacterium lonqum Primero, la cepa Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 fue inoculada en un medio que contiene 0.6% (en peso) de extracto de levadura y 1 1% (en peso) de leche descremada en polvo reducida en una cantidad de .0 x 106 a 5.0 x 107 CFU por 1 mi del medio, y cultivada a 37°C por 16 horas para obtener el cultivo de siembra.
Además, el medio de cultivo de cada cepa de Lactococcus lactis obtenido en el Ejemplo de Prueba 1 fue inoculado en una cantidad de 3% en el Caldo M17 Difco (marca registrada) (producido por Becton, Dickinson and Company) conteniendo cada uno 0.5% de lactosa y glucosa, y el cultivo se realizó a 30°C por 16 horas. Las células cultivadas de cada cepa se colectaron por centrifugación, se lavaron y se suspendieron en un medio láctico que tiene la misma composición que el mencionado arriba en el mismo volumen que el del medio original para obtener el cultivo de siembra.
A un medio láctico que tiene la misma composición que se describió arriba (esterilizado a 90°C por 10 minutos), se le inocularon los cultivos de siembra de cada cepa de Lactococcus lactis y de la cepa Bifidobacteríum longum ATCC BAA-999 en cantidades de 5.0 x 106 a 2.0 x 108 CFU y 1.0 x 107 a 5.0 x 107 CFU por 1 mi del medio, respectivamente, y el cultivo se realizó a 37°C por 16 horas para obtener leche fermentada.
La leche fermentada obtenida fue rápidamente enfriada a 10°C, y se midieron el pH, el número de bifidobacterias contenidas y el oxígeno disuelto. El número de bifidobacterias fue medido en una bandeja de medio agar propionato TOS (producido por Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.). Además, el oxígeno disuelto fue medido usando un analizador de oxígeno de fluorescencia FO-960S (producido por ASR) manteniendo la temperatura de la leche fermentada en 10°C. Los resultados de la medición se muestran en el Cuadro 2.
CUADRO 2 ND: Menor que el límite de detección Hubo cepas que no tenían PrtP, pero permitieron la supervivencia de las bifidobacterias, como las cepas que tienen PrtP (JCM20101 , NBRC 100676). Las concentraciones de oxígeno disuelto en la leche fermentada observadas con estas cepas después del almacenamiento de dos semanas fueron de 2.0 ppm o menores.
EJEMPLO DE PRUEBA 4 Debido a que la mayoría de las leches fermentadas que contienen bifidobacterias obtenidas en el Ejemplo de Prueba 3 mostraron un pH alrededor de 5, estaban en la forma de yogurt bebible. Para producir leche fermentada con una estructura más fuerte (yogurt ordinario que puede ser comido con una cuchara), se fermentó un medio láctico de la misma manera que aquel del Ejemplo de Prueba 3, pero también se agregaron Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii subespecie bulgaricus al medio.
Como en el Ejemplo de Prueba 3, los cultivos de siembra de cada cepa de Lactococcus lactis y de la cepa Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 fueron inoculados en el medio láctico que contiene 1 % (en peso) de glucosa y 10% (en peso) de leche descremada en polvo reducida en las mismas cantidades de inoculación que aquellas usadas en el Ejemplo de Prueba 3, un agente de inicio de yogurt que contiene Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii subespecie bulgaricus (producido por Danisco) se agregó además al medio láctico en una cantidad tal que las cantidades de Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckü subespecie bulgarícus fueron 2.0 x 106 CFU y 2.0 x 105 CFU por 1 mi del medio, respectivamente, y el cultivo se realizó a 37°C por 8 horas para obtener leche fermentada. La leche fermentada obtenida fue rápidamente enfriada a 10°C, y se midieron u observaron el pH y el estado de coagulación. Los resultados se muestran en el Cuadro 3.
CUADRO 3 Aunque la leche fermentada ordinaria pudo ser producida en el sistema que no contiene Lactococcus lactis y los sistemas que contienen una cepa que tiene PrtP, el pH no disminuyó en las leches fermentadas producidas con Lactococcus lactis subespecie lactis LcL49 y Lactococcus lactis subespecie cremorís LcC53, y no estaban coaguladas.
EJEMPLO DE PRUEBA 5 Evaluación de leche fermentada La leche fermentada (yogurt) fue producida mediante el método descrito en el Ejemplo 3 descrito a continuación, y evaluada para sabor umami y amargor en 10 grados por cinco panelistas. Un puntaje alto indica sabores más fuertes. Un puntaje mayor a 5 indica que la leche fermentada tuvo un sabor excesivamente fuerte como leche fermentada. Los resultados se muestran en la Figura 1.
Como en los resultados, el sabor umami fuerte y el amargor fueron percibidos para la leche fermentada producida usando una cepa que tiene PrtP, pero para la leche fermentada producida usando una cepa que no tiene PrtP, el sabor umami y el amargor fueron escasamente percibidos, y el sabor original de la leche fermentada no se vio afectado.
EJEMPLO 1 Producción de yogurt bebible usando Lactococcus lactis subespecie lactis En 1000 mL de un medio que contiene 10% (en peso) de leche descremada en polvo reducida (esterilizado a 90°C por 30 minutos), se inocularon 30 mL de cultivo de siembra de la cepa Lactococcus lactis subespecie lactis LcL26, y el cultivo se realizó a 25°C por 16 horas. Además, en 1000 mL de un medio que contiene 0.2% (en peso) de extracto de levadura y 1 1% (en peso) de leche descremada en polvo reducida (esterilizado a 90°C por 30 minutos), se inocularon 100 mL de cultivo de siembra de la cepa Bifidobacterium longum ATCC BAA-999, y el cultivo se realizó a 37°C por 4 horas.
El cultivo de siembra de la cepa Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 fue obtenido inoculando 1.0 x 106 a 5.0 x 107 CFU de la cepa Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 en un medio que contiene 0.6% (en peso) de extracto de levadura y 1 1 % (en peso) de leche descremada en polvo reducida, y realizando el cultivo a 37°C por 16 horas.
De forma separada, se mezclaron y disolvieron leche descremada en polvo, leche entera seca, sacarosa y pectina como materiales crudos para preparar 50 L de un material lácteo crudo que contiene 0.5% (en peso) de grasa láctea, 8.0% (en peso) de contenido sólido de leche libre de grasa, 8.0% (en peso) de sacarosa, y 0.2% (en peso) de pectina, y el material lácteo crudo obtenido fue esterilizado a 90°C por 10 minutos, y enfriado a 40°C. En este material lácteo crudo esterilizado se inocularon 500 mL de cultivo de la cepa Lactococcus lactis subespecie lactis LcL26 y 500 mL de cultivo de la cepa Bifidobacterium longum ATCC BAA-999, las cuales se precultivaron como se describió anteriormente, y el cultivo se realizó a 37°C por 16 horas para obtener leche fermentada.
La leche fermentada obtenida fue homogeneizada bajo una presión de 15 MPa, introducida en un contenedor de vidrio de 200 mL de volumen, enfriada hasta que la temperatura de la leche fermentada llegó a los 10°C, y sellada para obtener yogurt bebible. El yogurt bebible obtenido mostró una acidez de ácido láctico de 0.64% y un pH de 4.9, y contenía 1.6 x 108 CFU/ml de bifidobacterias. Después del almacenamiento a 10°C por 14 días, este yogurt bebible contenía 1.1 x 108 CFU/ml de bifidobacterias, y la tasa de supervivencia fue de 68%. Además, la concentración de oxígeno disuelto en este punto fue de 0.93 ppm.
EJEMPLO 2 Producción de yogurt bebible usando Lactococcus lactis subespecie cremorís En 1000 mL de un medio que contiene 10% (en peso) de leche descremada en polvo reducida (esterilizado a 90°C por 30 minutos), se inocularon 30 mL de cultivo de siembra de la cepa Lactococcus lactis subespecie lactis LcC46, y el cultivo se realizó a 25°C por 16 horas, Además, en 1000 mL de un medio que contiene 0.2% (en peso) de extracto de levadura y 1 1 % (en peso) de leche descremada en polvo reducida (esterilizado a 90°C por 30 minutos), se inocularon 100 mL de cultivo de siembra de la cepa Bifidobacterium longum ATCC BAA-999, y el cultivo se realizó a 37°C por 4 horas.
El cultivo de siembra de la cepa Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 fue obtenido inoculando 1.0 x 106 a 5.0 x 107 CFU de la cepa Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 en un medio que contiene 0.6% (en peso) de extracto de levadura y 1 1 % (en peso) de leche descremada en polvo reducida, y realizando el cultivo a 37°C por 16 horas.
De forma separada, se mezclaron y disolvieron leche descremada en polvo, leche entera seca, sacarosa y pectina como materiales crudos para preparar 50 L de un material lácteo crudo que contiene 0.5% (en peso) de grasa láctea, 8.0% (en peso) de contenido sólido de leche libre de grasa, 8.0% (en peso) de sacarosa, y 0.2% (en peso) de pectina, y el material lácteo crudo obtenido fue esterilizado a 90°C por 10 minutos, y enfriado a 40°C. En este material lácteo crudo esterilizado se inocularon 500 ml_ de cultivo de la cepa Lactococcus lactis subespecie cremoris LcC46 y 500 mL de cultivo de la cepa Bifidobacterium longum ATCC BAA-999, las cuales se precultivaron como se describió anteriormente, y el cultivo se realizó a 37°C por 16 horas para obtener leche fermentada.
La leche fermentada obtenida fue homogeneizada bajo una presión de 15 MPa, introducida en un contenedor de vidrio de 200 mL de volumen, enfriada hasta que la temperatura de la leche fermentada llegó a los 10°C, y sellada para obtener yogurt bebible. El yogurt bebible obtenido mostró una acidez de ácido láctico de 0.66% y un pH de 4.8, y contenia 9.6 x 107 CFU/ml de bifidobacterias. Después del almacenamiento a 10°C por 14 días, este yogurt bebible contenía 6.9 x 107 CFU/ml de bifidobacterias, y la tasa de supervivencia fue de 71 %. Además, la concentración de oxígeno disuelto en este punto fue de 0.88 ppm.
EJEMPLO 3 Producción de yogurt usando Lactococcus lactis subespecie lactis l\) En 1000 mL de un medio que contiene 10% (en peso) de leche descremada en polvo reducida (esterilizado a 1 15°C por 20 minutos), se inocularon 30 mL de cultivo de siembra de la cepa Lactobacillus delbrueckii subespecie lactis FERM BP-10758, y el cultivo se realizó a 37°C por 16 horas. Además, en 1000 mL de un medio que contiene 0.1 % (en peso) de extracto de levadura y 10% (en peso) de leche descremada en polvo reducida (esterilizado a 90°C por 30 minutos), se inocularon 30 mL de cultivo de siembra de la cepa Streptococcus thermophilus FERM P-17216, y el cultivo se realizó a 37°C por 5 horas.
El cultivo de siembra de la cepa Lactobacillus delbrueckii subespecie lactis FERM BP-10758 fue obtenido inoculando 1.0 x 105 a 1.0 x 107 CFU de la cepa en un medio que contiene 0.1% (en peso) de extracto de levadura y 10% (en peso) de leche descremada en polvo reducids, y realizando el cultivo a 37°C por 16 horas.
El cultivo de siembra de la cepa Streptococcus thermophilus FERM P-17216 fue obtenido inoculando 1.0 x 105 a 1.0 x 107 CFU de la cepa en un medio que contiene 0.1 % (en peso) de extracto de levadura y 10% (en peso) de leche descremada en polvo reducida, y realizando el cultivo a 37°C por 16 horas.
Los materiales crudos que consisten en leche descremada en polvo, crema, proteínas lácteas, etcétera, fueron mezclados y disueltos para preparar 50 L de un material lácteo crudo que contiene 3.0% (en peso) de grasa láctea y 12.0% (en peso) de contenido sólido de leche libre de grasa, y el material lácteo crudo obtenido fue calentado a 70°C, homogeneizado a una presión de 15 MPa, esterilizado a 90°C por 10 minutos, y enfriado a 40°C.
En este material lácteo crudo esterilizado, se inocularon 50 mL de cultivo de la cepa Lactobacillus delbrueckii subespecie lactis FER BP-10758 y 450 mL de cultivo de la cepa Streptococcus thermophilus FERM P-17216, las cuales fueron precultivadas como se describió anteriormente, asi como 500 mL de cultivo de la cepa Lactococcus lactis subespecie lactis LcL13 y 500 mL de cultivo de la cepa Bifidobacterium longum ATCC BAA-999, las cuales fueron obtenidas mediante precultivo realizado de la misma manera que la que se usó para la cepa LcL26 en el Ejemplo 1 , y el cultivo se realizó a 37°C por 4 horas para obtener leche fermentada. La leche fermentada obtenida fue inmediatamente agitada y enfriada hasta que la temperatura de la leche fermentada llegó a los 10°C, y entonces fue introducida en un contenedor de cono de papel con volumen de 100 mL, y se selló para obtener yogurt.
El yogurt obtenido mostró una acidez de ácido láctico de 0.74% y un pH de 4.69, y contenía 1.0 x 108 CFU/ml de bifidobacterias. Después del almacenamiento a 10°C por 14 días, este yogurt contenía 9.3 x 107 CFU/ml de bifidobacterias, y la tasa de supervivencia fue de 93%. Además, la concentración de oxígeno disuelto en este punto no fue más alta de 0.5 ppm.
EJEMPLO 4 Producción de yogurt usando Lactococcus lactis subespecie lactis (II) La leche descremada en polvo, crema y proteínas lácteas fueron mezcladas y disueltas para preparar 50 L de un material lácteo crudo que contiene 3.0% (en peso) de grasa láctea y 12.0% (en peso) de contenido sólido de leche libre de grasa, y el material lácteo crudo obtenido fue calentado a 70°C, homogeneizado a una presión de 15 MPa, esterilizado a 90°C por 10 minutos, y enfriado a 40°C.
En este material lácteo crudo esterilizado, se inocularon 500 mL de cultivo de la cepa Lactococcus lactis subespecie lactis LcL26 y 500 mL de cultivo de la cepa Bifidobacterium longum ATCC BAA-999, las cuales fueron obtenidas de la misma manera que la del Ejemplo 1 , asi como 0.002% de un agente de inicio de yogurt que contiene Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii subespecie bulgaricus (producida por Danisco), y el cultivo se realizó a 37°C por 8 horas para obtener leche fermentada. La leche fermentada obtenida fue inmediatamente agitada y enfriada hasta que la temperatura de la leche fermentada llegó a los 10°C, y entonces fue introducida en un contenedor de cono de papel con volumen de 100 mL, y se selló para obtener yogurt.
El yogurt obtenido mostró una acidez de ácido láctico de 0.65% y un pH de 4.84, y contenia 1.2 x 108 CFU/ml de bifidobacterias. Después del almacenamiento a 10°C por 14 días, este yogurt contenía 1.0 x 108 CFU/ml de bifidobacterias, y la tasa de supervivencia fue de 83%. Además, la concentración de oxígeno disuelto en este punto no fue más alta de 0.5 ppm.
EJEMPLO 5 Producción de yogurt usando Lactococcus lactis subespecie lactis (III) La leche descremada en polvo, crema y proteínas lácteas fueron mezcladas y disueltas para preparar 50 L de un material lácteo crudo que contiene 3.0% (en peso) de grasa láctea y 12.0% (en peso) de contenido sólido de leche libre de grasa, y el material lácteo crudo obtenido fue calentado a 70°C, homogeneizado a una presión de 15 MPa, esterilizado a 90°C por 10 minutos, y enfriado a 40°C.
En este material lácteo crudo esterilizado se inocularon 500 mide cultivo de la cepa Lactococcus lactis subespecie lactis LcL26 obtenida de la misma manera que la del Ejemplo 1 , 1.5 x 1014 CFU (unidad formadora de colonias) de células congeladas de la cepa Bifídobacteríum longum ATCC BAA-999 (producida por Morinaga Milk Industry Co., Ltd.), y 0.002% de un agente de inicio de yogurt que contiene Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii subespecie bulgarícus (producida por Danisco), y el cultivo se realizó a 37°C por 4 horas para obtener leche fermentada. La leche fermentada obtenida fue inmediatamente agitada y enfriada hasta que la temperatura de la leche fermentada llegó a los 10°C, y entonces fue introducida en un contenedor de cono de papel con volumen de 100 mL, y se selló para obtener yogurt.
El yogurt obtenido mostró una acidez de ácido láctico de 0.70% y un pH de 4.74, y contenía 4.2 x 109 CFU/ml de bifidobacterias. Después del almacenamiento a 10°C por 14 días, este yogurt contenía 2.0 x 109 CFU/ml de bifidobacterias, y la tasa de supervivencia fue de 47.6%. Además, la concentración de oxígeno disuelto en este punto fue de 1.47 ppm.
Aplicación industrial De acuerdo con el método para producir un alimento fermentado de la presente invención, un alimento fermentado que contiene una gran cantidad de bacterias Bifidobacterium, especialmente Bifidobacterium longum, puede ser eficientemente producido. Además, el alimento fermentado producido por el método para producir un alimento fermentado de la presente invención es por supuesto útil para el cuidado de la salud, y es un alimento fermentado preferido que muestra sabor superior.
Además, el agente de inicio de la fermentación de un material lácteo crudo que contiene una bacteria Bifidobacterium de la presente invención se puede usar para la producción del alimento fermentado.

Claims (26)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1. - Una cepa bacterial seleccionada del grupo que consiste en Lactococcus lactis subespecie lactis LcL13 (FERM BP-1 1276), Lactococcus lactis subespecie lactis LcL26 (FERM BP-1 1277), y Lactococcus lactis subespecie cremoris LcC46 (FERM BP-11275).
2. - Un agente de inicio para la fermentación de un material lácteo crudo que comprende una bacteria Bifidobacterium, la cual comprende una cepa bacterial seleccionada del grupo que consiste en Lactococcus lactis subespecie lactis LcL13 (FERM BP-11276), Lactococcus lactis subespecie lactis LcL26 (FERM BP-1 1277), y Lactococcus lactis subespecie cremoris LcC46 (FERM BP-11275).
3. - El agente de inicio para la fermentación de un material lácteo crudo que comprende una bacteria Bifidobacterium de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque la bacteria Bifidobacterium es la cepa Bifidobacterium longum ATCC BAA-999.
4. - Un método para producir un alimento fermentado, el cual comprende la fermentación de un material lácteo crudo usando una cepa bacterial seleccionada del grupo que consiste en Lactococcus lactis subespecie lactis LcL13 (FERM BP-1 1276), Lactococcus lactis subespecie lactis LcL26 (FERM BP-1 1277), y Lactococcus lactis subespecie cremoris LcC46 (FERM BP-11275) y una bacteria Bifidobacterium.
5. - El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque una bacteria de ácido láctico seleccionada del grupo que consiste en Streptococcus thermophilus y Lactobacilus delbrueckii se usa además para la fermentación.
6. - El método de conformidad con la reivindicación 4 ó 5, caracterizado además porque la bacteria Bifidobacterium es la cepa Bifidobacterium longum ATCC BAA-999.
7. - Un alimento fermentado producido mediante el método de la reivindicación 4 ó 6.
8. - Un método para producir un alimento fermentado, el cual comprende la fermentación de un material lácteo crudo usando Lactococcus lactis que no tiene célula proteinasa cubierta por una pared y una bacteria Bifidobacterium.
9.- El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque la Lactococcus lactis tiene la propiedad de que, cuando dicha bacteria es inoculada en un medio que contiene 1 % (en peso) de glucosa y 10% (en peso) de leche descremada en polvo reducida en una cantidad de 5.0 x 106 a 2.0 x 108 CFU por 1 mi del medio, y cultivada a 37°C de 4 a 24 horas, el medio no está coagulado.
10.- El método de conformidad con la reivindicación 8 ó 9, caracterizado además porque la Lactococcus lactis tiene la propiedad de que, cuando dicha bacteria y la bacteria Bifidobacterium son inoculadas en un medio que contiene 1% (en peso) de glucosa y 10% (en peso) de leche descremada en polvo reducida en cantidades de 5.0 x 106 a 2.0 x 108 CFU y 1.0 x 107 a 3.0 x 109 CFU por 1 mi del medio, respectivamente, y cultivadas, y el medio es rápidamente enfriado a 10°C de la temperatura de cultivo cuando el pH del medio va de 4.6 a 5.5, y almacenadas a 10°C por 2 semanas, la concentración de oxígeno disuelto en el medio se mantiene en 2 ppm o más baja.
11 . - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizado además porque la Lactococcus lactis tiene la propiedad de que, cuando dicha bacteria y la bacteria Bifidobacteríum son inoculadas en un medio que contiene 1 % (en peso) de glucosa y 10% (en peso) de leche descremada en polvo reducida en cantidades de 5.0 x 106 a 2.0 x 108 CFU y 1.0 x 107 a 3.0 x 109 CFU por 1 mi del medio, respectivamente, y cultivadas, y el medio es rápidamente enfriado a 10°C de la temperatura de cultivo cuando el pH del medio va de 4.6 a 5.5 y almacenadas a 10°C por 2 semanas, la tasa de supervivencia de la bacteria Bifidobacteríum se mantiene en 30% o más.
12. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 , caracterizado además porque la Lactococcus lactis tiene la propiedad de que, cuando dicha bacteria, la bacteria Bifidobacteríum, Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii subespecie bulgaricus son inoculadas en un medio que contiene 1 % (en peso) de glucosa y 10% (en peso) de leche descremada en polvo reducida en cantidades de 5.0 x 106 a 2.0 x 108 CFU, 1.0 x 107 a 3.0 x 109 CFU, 1.0 x 103 a 9.0 x 107 CFU y 1.0 x 103 a 9.0 x 107 CFU por 1 mL del medio, respectivamente, y cultivadas a 37°C de 3 a 24 horas, el medio está coagulado.
13 - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, caracterizado además porque la Lactococcus lactis es seleccionada del grupo que consiste en Lactococcus lactis subespecie lactis y Lactococcus lactis subespecie cremoris.
14 - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, caracterizado además porque la Lactococcus lactis es seleccionada del grupo que consiste en Lactococcus lactis subespecie lactis LcL13 (FERM BP-1 1276), Lactococcus lactis subespecie lactis LcL26 (FERM BP-1 1277), y Lactococcus lactis subespecie cremoris LcC46 (FERM BP-11275).
15. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14, caracterizado además porque la bacteria Bifidobacterium es Bifidobacterium longum.
16. - El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque la Bifidobacterium longum es la cepa Bifidobacterium longum ATCC BAA-999.
17.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 16, caracterizado además porque la bacteria de ácido láctico seleccionada del grupo que consiste en Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii se usa además para la fermentación.
18. - Un alimento fermentado producido mediante el método de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 17.
19. - Un agente de inicio para la fermentación de un material lácteo crudo que contiene una bacteria Bifidobacterium, la cual comprende Lactococcus lactis que no tiene célula proteinasa cubierta por una pared.
20. - El agente de inicio para la fermentación de un material lácteo crudo que comprende una bacteria Bifidobacterium de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque la Lactococcus lactis tiene la propiedad de que, cuando dicha bacteria es inoculada en un medio que contiene 1 % (en peso) de glucosa y 10% (en peso) de leche descremada en polvo reducida a 5.0 x 106 a 2.0 x 108 CFU por 1 mi del medio, y cultivada a 37°C de 4 a 24 horas, el medio no está coagulado.
21. - El agente de inicio para la fermentación de un material lácteo crudo que comprende una bacteria Bifidobacterium de conformidad con la reivindicación 19 ó 20, caracterizado además porque la Lactococcus lactis tiene la propiedad de que, cuando dicha bacteria y la bacteria Bifidobacterium son inoculadas en un medio que contiene 1% (en peso) de glucosa y 0% (en peso) de leche descremada en polvo reducida en cantidades de 5.0 x 106 a 2.0 x 108 CFU y 1.0 x 107 a 3.0 x 109 CFU por 1 mi del medio, respectivamente, y cultivadas, y el medio es rápidamente enfriado a 10°C de la temperatura de cultivo cuando el pH del medio va de 4.6 a 5.5 y almacenadas a 10°C por 2 semanas, la tasa de supervivencia de la bacteria Bifidobacterium se mantiene en 30% o más.
22. - El agente de Inicio para la fermentación de un material lácteo crudo que comprende una bacteria Bifidobacterium de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21 , caracterizado además porque la Lactococcus lactis tiene la propiedad de que, cuando dicha bacteria, la bacteria Bifidobacterium, Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii subespecie bulgaricus son inoculadas en un medio que contiene 1% (en peso) de glucosa y 10% (en peso) de leche descremada en polvo reducida en cantidades de 5.0 x 106 a 2.0 x 108 CFU y 1.0 x 107 a 3.0 x 109 CFU, 2.0 x 105 a 9.0 x 107 CFU y 2.0 x 105 a 9.0 x 107 CFU por 1 ml_ del medio, respectivamente, y cultivadas a 37°C de 3 a 24 horas, el medio está coagulado.
23. - El agente de inicio para la fermentación de un material lácteo crudo que comprende una bacteria Bifidobacterium de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, caracterizado además porque la Lactococcus lactis es seleccionada del grupo que consiste en Lactococcus lactis subespecie lactis y Lactococcus lactis subespecie cremoris.
24. - El agente de inicio para la fermentación de un material lácteo crudo que comprende una bacteria Bifidobacterium de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23, caracterizado además porque la Lactococcus lactis es seleccionada del grupo que consiste en Lactococcus lactis subespecie lactis LcL13 (FERM BP-11276), Lactococcus lactis subespecie lactis LcL26 (FERM BP-11277), y Lactococcus lactis subespecie cremoris LcC46 (FERM BP-11275).
25.- El agente de inicio para la fermentación de un material lácteo crudo que comprende una bacteria Bifidobacterium de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 24, caracterizado además porque la bacteria Bifidobacterium es Bifidobacterium longum.
26.- El agente de inicio para la fermentación de un material lácteo crudo que comprende una bacteria Bifidobacterium de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque la Bifidobacterium longum es la cepa Bifidobacterium longum ATCC BAA-999.
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