JP6832619B2 - 発酵物の製造方法 - Google Patents
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Landscapes
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Description
本発明は、ジアセチルを生成するラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）を用いた発酵物の製造方法に関する。特に、ブルガリクス菌（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）およびサーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus)と混合培養することによりジアセチルおよび／またはアセトインの生成を促進した製造方法に関する。また、ジアセチル生成能の高いラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）の新規な株に関する。
ジアセチルやアセトインは、発酵乳、発酵バター及びチーズなどの乳製品の重要な香気成分であり、これらの香気成分は乳酸菌の発酵によって作られる。特に、ジアセチルは発酵乳の主要フレーバーの１つともされている（非特許文献１）。
一方、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）やロイコノストック（Leuconostoc）属の一部の菌株では、クエン酸からジアセチルを生成しており、菌体内に取り込まれたクエン酸はピルビン酸からα-アセト乳酸またはアセトアルデヒト三リン酸を経てジアセチルが生成され、さらにアセトイン、2, 3-ブタンジオールに代謝されていく。これらの菌株の高産生のキーは、プラスミド上にコードされているクエン酸菌体内輸送タンパク質の遺伝子（citrate permease gene, citP）であることが知られている（非特許文献２，３，４）。
本出願人らは、これまでに、プラスミド上のcitP遺伝子を特異的に検出するPCR法を確立し、乳酸菌７株（Lactococcus. lactis subsp. lactis ５株、Lactococcus. lactis subsp. cremoris ２株）より、citP遺伝子保有株を５株（Lactococcus. lactis subsp. lactis ４株、Lactococcus. lactis subsp. cremoris １株）得た。強いジアセチル・アセトイン産生が認められた株は全てcitP遺伝子保有株であったことから、citP遺伝子の検出によりジアセチル・アセトイン産生能が高い株を効率的にスクリーニングすることができることを確認した（特許文献１）。
また、ジアセチルおよびアセトイン生成能の高い乳酸菌としては例えば、ストレプトコッカス属のＭ３７Ｗ株（微工研菌寄第１１４８７号）や、ラクトバチルス・ラムノーサスに属する菌株（ＤＳＭ２４６１６）が知られている（特許文献２、３）。
一方、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）やロイコノストック（Leuconostoc）属の一部の菌株では、クエン酸からジアセチルを生成しており、菌体内に取り込まれたクエン酸はピルビン酸からα-アセト乳酸またはアセトアルデヒト三リン酸を経てジアセチルが生成され、さらにアセトイン、2, 3-ブタンジオールに代謝されていく。これらの菌株の高産生のキーは、プラスミド上にコードされているクエン酸菌体内輸送タンパク質の遺伝子（citrate permease gene, citP）であることが知られている（非特許文献２，３，４）。
本出願人らは、これまでに、プラスミド上のcitP遺伝子を特異的に検出するPCR法を確立し、乳酸菌７株（Lactococcus. lactis subsp. lactis ５株、Lactococcus. lactis subsp. cremoris ２株）より、citP遺伝子保有株を５株（Lactococcus. lactis subsp. lactis ４株、Lactococcus. lactis subsp. cremoris １株）得た。強いジアセチル・アセトイン産生が認められた株は全てcitP遺伝子保有株であったことから、citP遺伝子の検出によりジアセチル・アセトイン産生能が高い株を効率的にスクリーニングすることができることを確認した（特許文献１）。
また、ジアセチルおよびアセトイン生成能の高い乳酸菌としては例えば、ストレプトコッカス属のＭ３７Ｗ株（微工研菌寄第１１４８７号）や、ラクトバチルス・ラムノーサスに属する菌株（ＤＳＭ２４６１６）が知られている（特許文献２、３）。
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上記スクリーニング方法によって得られたcitP遺伝子を保有するLactococcus. lactis subsp. lactisの数種類の菌株を用いて各単菌で培養することにより、ジアセチルを含む発酵風味の強い発酵乳を製造することができたものの、いずれの菌株も一般的な発酵乳（４〜５時間）と比べて大幅に長い発酵時間を要するという問題点があった。
そこで、本発明は、ジアセチルを生成するラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus. lactis subsp. lactis）を用いた発酵物の製造方法において、短時間でより多くのジアセチルおよび／またはアセトインを生成する製造方法を提供することを課題とする。
また、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus. lactis subsp. lactis）のうちでもジアセチルの高産生株を得ることを課題とする。
また、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus. lactis subsp. lactis）のうちでもジアセチルの高産生株を得ることを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、ブルガリクス菌（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）およびサーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus)とラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）とを混合培養することにより、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）のジアセチルおよび／またはアセトインの生成量が著しく増強されることを見出し本発明を完成するに至った。
また、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）においてジアセチル高産生菌株であるSBT1557（NITE P-02038）を見出し本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の構成を有する。
（１）ジアセチル産生能を有するラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）を用いた発酵物の製造方法であって、ブルガリクス菌（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）およびサーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus)とともに培養することを特徴とする発酵物の製造方法。
（２）ジアセチル産生能を有するラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）をブルガリクス菌（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）およびサーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus)とともに培養することによりジアセチルおよび／またはアセトインの産生を増強する方法。
（３）ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）SBT1557（NITE P-02038）株。
（４）ジアセチル産生能を有するラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）と、ブルガリクス菌（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）およびサーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus)を含む発酵物。
また、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）においてジアセチル高産生菌株であるSBT1557（NITE P-02038）を見出し本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の構成を有する。
（１）ジアセチル産生能を有するラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）を用いた発酵物の製造方法であって、ブルガリクス菌（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）およびサーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus)とともに培養することを特徴とする発酵物の製造方法。
（２）ジアセチル産生能を有するラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）をブルガリクス菌（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）およびサーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus)とともに培養することによりジアセチルおよび／またはアセトインの産生を増強する方法。
（３）ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）SBT1557（NITE P-02038）株。
（４）ジアセチル産生能を有するラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）と、ブルガリクス菌（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）およびサーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus)を含む発酵物。
本発明によれば、ジアセチルおよび／またはアセトインを含む発酵風味の強い発酵物を短時間で製造することができる。
本発明は、ジアセチル産生能を有するラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）を用いた発酵物の製造方法であって、ブルガリクス菌（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）およびサーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus）とともに培養することを特徴とする発酵物の製造方法に関する。
本発明のジアセチル産生能を有するラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）とは、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）であって、ジアセチルを産生する株をいう。
ジアセチルの産生は、直接的には、培養物中のジアセチル産生有無を検出することにより確認できる。例えば、グルコースの代謝産物のジアセチルおよびアセトインを検出するVoges-Proskauerテスト（以下、ＶＰテストという）により、ジアセチルおよびアセトインの産生によって発色が確認できるため、この発色が確認できた場合をジアセチル産生有とすることができる。また、ガスクロマトグラフィーで培養物中のジアセチル量が０．０１ｐｐｍ以上検出できる場合もジアセチル産生有とすることができる。
本発明のジアセチル産生能を有するラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）とは、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）であって、ジアセチルを産生する株をいう。
ジアセチルの産生は、直接的には、培養物中のジアセチル産生有無を検出することにより確認できる。例えば、グルコースの代謝産物のジアセチルおよびアセトインを検出するVoges-Proskauerテスト（以下、ＶＰテストという）により、ジアセチルおよびアセトインの産生によって発色が確認できるため、この発色が確認できた場合をジアセチル産生有とすることができる。また、ガスクロマトグラフィーで培養物中のジアセチル量が０．０１ｐｐｍ以上検出できる場合もジアセチル産生有とすることができる。
本発明で特に、ジアセチルを高産生する株とは、ＶＰテストにより、強い発色（赤色）が確認できる、または、ガスクロマトグラフィーで培養物中のジアセチル量が０．５ｐｐｍ以上、好ましくは１．０ｐｐｍ以上検出される株のことをいう。
本発明では、ジアセチル産生能を有するラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）のうちでも、ジアセチルの産生能の高い株が望ましく、例えば、SBT1557（NITE P-02038）が挙げられる。
なお、本菌株は新菌株であり同定方法、菌学的性質等については、実施例に記載のとおりである。
本発明では、ジアセチル産生能を有するラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）のうちでも、ジアセチルの産生能の高い株が望ましく、例えば、SBT1557（NITE P-02038）が挙げられる。
なお、本菌株は新菌株であり同定方法、菌学的性質等については、実施例に記載のとおりである。
本発明のブルガリクス菌とは、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）であり、サーモフィルス菌とは、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptcoccus thermophilus）をいう。これらに属する菌であり、酸生成スターターとしての役割を果たす菌株であればいずれでもよい。
本発明において「発酵物」とは、乳酸菌の作用により発酵される培養物をいい、脱脂乳の培養物のほか、そのまま食品となる発酵乳、発酵バター、チーズ、キムチ、味噌、糠漬け、メンマ、ピクルス等が挙げられる。このうちでも、発酵乳、発酵バター、チーズが好ましく、本発明では発酵物の代表例として脱脂乳培養物を例に以下説明し、試験例で効果を確認した。また、実施例で「発酵乳」、「発酵バター」及び「チーズ」の作成例を示した。
本発明において「発酵物」とは、乳酸菌の作用により発酵される培養物をいい、脱脂乳の培養物のほか、そのまま食品となる発酵乳、発酵バター、チーズ、キムチ、味噌、糠漬け、メンマ、ピクルス等が挙げられる。このうちでも、発酵乳、発酵バター、チーズが好ましく、本発明では発酵物の代表例として脱脂乳培養物を例に以下説明し、試験例で効果を確認した。また、実施例で「発酵乳」、「発酵バター」及び「チーズ」の作成例を示した。
「発酵乳」、「チーズ」、「発酵バター」とは、牛乳等の獣乳またはこれと同等以上の無脂乳固形分を含む乳等を、本発明の乳酸菌の組み合わせにより発酵させたものである。
「発酵乳」は、例えば以下のように製造される。ただし、以下の製法は一例であり、「発酵乳」を作る事の出来るどのような製法を用いても構わない。まず、乳、乳製品、ショ糖、安定剤等の原材料を混合・溶解して調製した発酵ミックスを均質化、殺菌、冷却した後、乳酸菌スターターを接種し、容器に充填して密封してから培養室や発酵トンネル内で発酵させ、適度な酸度になった時点で直ちに５℃に冷却して発酵を終了させ、最終製品とする。
「チーズ」は、例えば以下のように製造される。ただし、以下の製法は一例であり、「チーズ」を作る事の出来るどのような製法を用いても構わない。まず、原料乳を凝固させ、ホエーを分離してカードを調製し、カード調製工程で得られたカードに溶融塩および塩を添加して加熱混練し、加熱混練工程で得られたカードを成型し、最終製品とする。
「発酵バター」は、例えば以下のように製造される。ただし、以下の製法は一例であり、「発酵バター」を作る事の出来るどのような製法を用いても構わない。まず生乳をクリームと脱脂乳に分離する。次に殺菌したクリームに乳酸菌を添加し、半日以上をかけて発酵させる。その後、チャーニング工程でクリームを攪拌することで、米粒状のバター粒を形成する。この粒々を凝集させて、最終製品とする。
本発明では、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス、ブルガリクス菌、サーモフィルス菌を３菌種混合培養するが、前記３種の乳酸菌は最初から全て混合して発酵させる以外に、１種または２種以上で先に発酵させた後に残りを混合しても良い。
[実施例１]
以下に、本発明の実施例等をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）SBT1557（NITE P-02038）の性状
（１）菌学的性質
Ａ．形態的性状
細胞形態：球菌
運動性：なし
胞子の有無：なし
グラム染色性：陽性
Ｂ．培地上の生育状態
寒天培地上のコロニー形態：表面が滑らかな白色球状（Ｍ１７培地、Difco、３０℃７２時間培養）
Ｃ．生理学的性質
・糖の発酵性 (＋は発酵性あり、−は発酵性なしを示す。)
1. アラビノース −
2. キシロース −
3. リボース ＋
4. グルコース ＋
5. マンノース ＋
6. フラクトース ＋
7. ガラクトース ＋
8. シュクロース −
9. マルトース ＋
10. セロビオース ＋
11. ラクトース ＋
12. トレハロース ＋
13. メリビオース −
14. ラフィノース −
15. メレジトース −
16. デンプン ＋
17. グリコーゲン −
18. イヌリン −
19. エスクリン ＋
20. サリシン ＋
21. アミグダリン −
Ｄ．ＤＮＡ相同性試験
渡辺らの文献(「腸内フローラの分子生態学」p129-154、学会出版センター、1998年)に基づき、Lactococcus lactis subsp. lactis特異的プライマーであるＬｃＬ１およびＬｃＣ２を用いてＰＣＲした結果、特異的な増幅が認められたことから、Lactococcus lactis subsp. lactisであると同定された。
以下に、本発明の実施例等をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）SBT1557（NITE P-02038）の性状
（１）菌学的性質
Ａ．形態的性状
細胞形態：球菌
運動性：なし
胞子の有無：なし
グラム染色性：陽性
Ｂ．培地上の生育状態
寒天培地上のコロニー形態：表面が滑らかな白色球状（Ｍ１７培地、Difco、３０℃７２時間培養）
Ｃ．生理学的性質
・糖の発酵性 (＋は発酵性あり、−は発酵性なしを示す。)
1. アラビノース −
2. キシロース −
3. リボース ＋
4. グルコース ＋
5. マンノース ＋
6. フラクトース ＋
7. ガラクトース ＋
8. シュクロース −
9. マルトース ＋
10. セロビオース ＋
11. ラクトース ＋
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13. メリビオース −
14. ラフィノース −
15. メレジトース −
16. デンプン ＋
17. グリコーゲン −
18. イヌリン −
19. エスクリン ＋
20. サリシン ＋
21. アミグダリン −
Ｄ．ＤＮＡ相同性試験
渡辺らの文献(「腸内フローラの分子生態学」p129-154、学会出版センター、1998年)に基づき、Lactococcus lactis subsp. lactis特異的プライマーであるＬｃＬ１およびＬｃＣ２を用いてＰＣＲした結果、特異的な増幅が認められたことから、Lactococcus lactis subsp. lactisであると同定された。
（２）ジアセチルおよびアセトインの産生能
Lactococcus lactis subsp. lactisの基準株（JCM5805）及び、ｃｉｔＰ遺伝子を保有するLactococcus lactis subsp. lactis５菌株の合計６菌株を３０℃１０時間、１０%脱脂乳培地にて静置培養し、培養物中のジアセチルおよびアセトインの生成量を測定した。
脱脂乳培養物中のジアセチル量およびアセトイン量の測定は、Kieronczykらの方法（A. Kieronczyk et al, Int Dairy J, 14:227-235）に準じて、ガスクロマトグラフィー(GC/MS)を用いて行った。検量線用のサンプルは、脱脂乳培地にジアセチル（SIGMA-ALDRICH製）０，０．１，１，５，１０，２０ｐｐｍ、アセトイン（SIGMA-ALDRICH製）０，１，１０，５０，１００，２００ｐｐｍを入れ、内部標準液として終濃度１ｐｐｍのシクロヘキサノンを添加し調製した。内部標準としたシクロヘキサノンのピーク面積との比率をもとに、ジアセチル、アセトインの検量線を作成し、脱脂乳培養物中のジアセチル量およびアセトイン量の濃度を求めた。
結果を図１に示す。Lactococcus lactis subsp. lactisのほとんどの菌株で１〜２ｐｐｍ程度のジアセチルしか検出されなかったところ、SBT1557（NITE P-02038）では１０ｐｐｍ程度のジアセチルが検出されたことから、SBT1557（NITE P-02038）はジアセチルの産生能が非常に高い株であることから新菌株と同定した。
上記６菌株は以下のとおりである。
SBT2516（基準株JCM5805）
SBT1178（FERM P-16429）
SBT1255
SBT1520
SBT1557（NITE P-02038）
SBT1689（FERM P-16430）
Lactococcus lactis subsp. lactisの基準株（JCM5805）及び、ｃｉｔＰ遺伝子を保有するLactococcus lactis subsp. lactis５菌株の合計６菌株を３０℃１０時間、１０%脱脂乳培地にて静置培養し、培養物中のジアセチルおよびアセトインの生成量を測定した。
脱脂乳培養物中のジアセチル量およびアセトイン量の測定は、Kieronczykらの方法（A. Kieronczyk et al, Int Dairy J, 14:227-235）に準じて、ガスクロマトグラフィー(GC/MS)を用いて行った。検量線用のサンプルは、脱脂乳培地にジアセチル（SIGMA-ALDRICH製）０，０．１，１，５，１０，２０ｐｐｍ、アセトイン（SIGMA-ALDRICH製）０，１，１０，５０，１００，２００ｐｐｍを入れ、内部標準液として終濃度１ｐｐｍのシクロヘキサノンを添加し調製した。内部標準としたシクロヘキサノンのピーク面積との比率をもとに、ジアセチル、アセトインの検量線を作成し、脱脂乳培養物中のジアセチル量およびアセトイン量の濃度を求めた。
結果を図１に示す。Lactococcus lactis subsp. lactisのほとんどの菌株で１〜２ｐｐｍ程度のジアセチルしか検出されなかったところ、SBT1557（NITE P-02038）では１０ｐｐｍ程度のジアセチルが検出されたことから、SBT1557（NITE P-02038）はジアセチルの産生能が非常に高い株であることから新菌株と同定した。
上記６菌株は以下のとおりである。
SBT2516（基準株JCM5805）
SBT1178（FERM P-16429）
SBT1255
SBT1520
SBT1557（NITE P-02038）
SBT1689（FERM P-16430）
[試験例１]
１．試験方法
以下、脱脂乳培養物を例に本発明の効果について確認を行った。
１−１．供試菌株
ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）は、SBT1178（FERM P-16429），SBT1312，SBT1557（NITE P-02038）の３株を用いた。
ブルガリクス菌およびサーモフィルス菌は、以下を用いた。
ブルガリクス菌（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus SBT0164）
サーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus SBT10137）
１．試験方法
以下、脱脂乳培養物を例に本発明の効果について確認を行った。
１−１．供試菌株
ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）は、SBT1178（FERM P-16429），SBT1312，SBT1557（NITE P-02038）の３株を用いた。
ブルガリクス菌およびサーモフィルス菌は、以下を用いた。
ブルガリクス菌（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus SBT0164）
サーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus SBT10137）
１−２．培養条件
ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）は、各菌株の−８０℃凍結菌体を１０％脱脂乳培地（１１５℃、２０分間滅菌）で３０℃１６時間培養し、３％接種で継代した。ブルガリクス菌およびサーモフィルス菌は、１１．５５％脱脂乳培地＋０．５％酵母エキス（１１５℃、２０分間滅菌）で３７℃１６時間培養し、３％接種で継代した。
１０％脱脂乳培地に、ブルガリクス菌とサーモフィルス菌の脱脂乳培養物各３％とラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）の脱脂乳培養物３％を３菌種混合接種し、３０℃で４，７，１０，２０時間培養した。また前記３菌種混合接種した培養物との比較のため、ブルガリクス菌とサーモフィルス菌の脱脂乳培養物各３％を２菌種混合接種、またはラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）の各菌株の脱脂乳培養物３％を単菌接種して、同様に３０℃で４，７，１０，２０時間（SBT1178、SBT1312については２０時間の培養を行っていない）培養した。
ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）は、各菌株の−８０℃凍結菌体を１０％脱脂乳培地（１１５℃、２０分間滅菌）で３０℃１６時間培養し、３％接種で継代した。ブルガリクス菌およびサーモフィルス菌は、１１．５５％脱脂乳培地＋０．５％酵母エキス（１１５℃、２０分間滅菌）で３７℃１６時間培養し、３％接種で継代した。
１０％脱脂乳培地に、ブルガリクス菌とサーモフィルス菌の脱脂乳培養物各３％とラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）の脱脂乳培養物３％を３菌種混合接種し、３０℃で４，７，１０，２０時間培養した。また前記３菌種混合接種した培養物との比較のため、ブルガリクス菌とサーモフィルス菌の脱脂乳培養物各３％を２菌種混合接種、またはラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）の各菌株の脱脂乳培養物３％を単菌接種して、同様に３０℃で４，７，１０，２０時間（SBT1178、SBT1312については２０時間の培養を行っていない）培養した。
１−３．ＧＣ／ＭＳによる脱脂乳培養物中のジアセチルとアセトイン量の測定
実施例１と同様、脱脂乳培養物中のジアセチルとアセトインの量をＧＣ／ＭＳを用いて測定した。
実施例１と同様、脱脂乳培養物中のジアセチルとアセトインの量をＧＣ／ＭＳを用いて測定した。
１−４．試験結果
ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）を脱脂乳培地で単菌培養した場合と、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）とブルガリクス菌（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus SBT0164）とサーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus SBT10137）（図３，４ではSBT0164をＢ、SBT10137をＴと表す）を脱脂乳培地で混合培養した場合の、各培養時間におけるジアセチルおよびアセトインの生成量をそれぞれ図３、図４に示す。
ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）をブルガリクス菌とサーモフィルス菌との混合培養する事によって、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）単菌培養時よりもジアセチル生成量が増加した。特にSBT1557は、短時間で単菌培養時のジアセチル生成量が２倍近くにまで増加した。またアセトインの生成量も、ブルガリクス菌とサーモフィルス菌との混合培養によって単菌培養時よりも増加した。
したがって、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）と、ブルガリクス菌およびサーモフィルス菌との間に、ジアセチルおよび／またはアセトインの生成に関する増加効果があることがわかった。
ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）を脱脂乳培地で単菌培養した場合と、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）とブルガリクス菌（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus SBT0164）とサーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus SBT10137）（図３，４ではSBT0164をＢ、SBT10137をＴと表す）を脱脂乳培地で混合培養した場合の、各培養時間におけるジアセチルおよびアセトインの生成量をそれぞれ図３、図４に示す。
ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）をブルガリクス菌とサーモフィルス菌との混合培養する事によって、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）単菌培養時よりもジアセチル生成量が増加した。特にSBT1557は、短時間で単菌培養時のジアセチル生成量が２倍近くにまで増加した。またアセトインの生成量も、ブルガリクス菌とサーモフィルス菌との混合培養によって単菌培養時よりも増加した。
したがって、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）と、ブルガリクス菌およびサーモフィルス菌との間に、ジアセチルおよび／またはアセトインの生成に関する増加効果があることがわかった。
[試験例２]
２−１. 供試菌株
ブルガリクス菌およびサーモフィルス菌の下記基準株を用いて、他の株でも同様の効果が得られるか試験を行った。
ブルガリクス菌（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 基準株ATCC11842）
サーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus 基準株ATCC19258）
ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）は、試験例１同様、SBT1178（FERM P-16429），SBT1312，SBT1557（NITE P-02038）の３株を用いた。
２−１. 供試菌株
ブルガリクス菌およびサーモフィルス菌の下記基準株を用いて、他の株でも同様の効果が得られるか試験を行った。
ブルガリクス菌（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 基準株ATCC11842）
サーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus 基準株ATCC19258）
ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）は、試験例１同様、SBT1178（FERM P-16429），SBT1312，SBT1557（NITE P-02038）の３株を用いた。
２−２．培養条件
試験例１と同様、１０％脱脂乳培地に、ブルガリクス菌とサーモフィルス菌の脱脂乳培養物各３％とラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）の脱脂乳培養物３％を３菌種混合接種し、３０℃で４，７，１０，２０時間培養した。また前記３菌種混合接種した培養物との比較のため、ブルガリクス菌とサーモフィルス菌の脱脂乳培養物各３％を２菌種混合接種、またはラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）の各菌株の脱脂乳培養物３％を単菌接種して、同様に３０℃で４，７，１０，２０時間培養した。
試験例１と同様、１０％脱脂乳培地に、ブルガリクス菌とサーモフィルス菌の脱脂乳培養物各３％とラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）の脱脂乳培養物３％を３菌種混合接種し、３０℃で４，７，１０，２０時間培養した。また前記３菌種混合接種した培養物との比較のため、ブルガリクス菌とサーモフィルス菌の脱脂乳培養物各３％を２菌種混合接種、またはラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）の各菌株の脱脂乳培養物３％を単菌接種して、同様に３０℃で４，７，１０，２０時間培養した。
２−３．ＶＰテストによる脱脂乳培養物中のジアセチルとアセトイン量の測定
脱脂乳培養物中のジアセチルとアセトインの濃度を、ＶＰテストにより測定した。脱脂乳培養物の遠心上清を適当な濃度に希釈したもの１ｍｌに、α−ナフトール溶液（５％α−ナフトールを無水エタノールに溶解）０．６ｍｌ、４０％ＫＯＨ ０．２ｍｌ、１％クレアチン溶液５０ｕｌを加えた。試験管を十分攪拌した後、傾斜させて１時間静置し、吸光度計Ultrospec 2100 pro（GE Healthcare）で５３０ｎｍの吸光度を測定した。アセトイン（SIGMA-ALDRICH製）を０，５，１０，５０，１００，２５０ｐｐｍの濃度に希釈した溶液を同様に反応させ、アセトイン濃度が０−２５０ｐｐｍの範囲で呈色液の吸光度との間に直線性が得られることを確認した。
脱脂乳培養物中のジアセチルとアセトインの濃度を、ＶＰテストにより測定した。脱脂乳培養物の遠心上清を適当な濃度に希釈したもの１ｍｌに、α−ナフトール溶液（５％α−ナフトールを無水エタノールに溶解）０．６ｍｌ、４０％ＫＯＨ ０．２ｍｌ、１％クレアチン溶液５０ｕｌを加えた。試験管を十分攪拌した後、傾斜させて１時間静置し、吸光度計Ultrospec 2100 pro（GE Healthcare）で５３０ｎｍの吸光度を測定した。アセトイン（SIGMA-ALDRICH製）を０，５，１０，５０，１００，２５０ｐｐｍの濃度に希釈した溶液を同様に反応させ、アセトイン濃度が０−２５０ｐｐｍの範囲で呈色液の吸光度との間に直線性が得られることを確認した。
２．試験結果
２−２．脱脂乳培養物中のジアセチルとアセトインの生成量
ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）を脱脂乳培地で単菌培養した場合と、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）とブルガリクス菌（ATCC11842）とサーモフィルス菌（ATCC19258）（図５ではブルガリクス菌（ATCC11842）をＢ’、サーモフィルス菌（ATCC19258）をＴ’と表す）を脱脂乳培地で３菌種混合培養した場合の、各培養時間におけるジアセチルとアセトインの合計量を図５に示す。
試験例１同様、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）、ブルガリクス菌及びサーモフィルス菌を３菌種混合培養することで、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）単菌培養時と比較し、ジアセチルとアセトインの産生量が増加した。
したがって、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）と、ブルガリクス菌およびサーモフィルス菌との間に、ジアセチルおよび／またはアセトインの生成に関する増加効果があることがわかった。
２−２．脱脂乳培養物中のジアセチルとアセトインの生成量
ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）を脱脂乳培地で単菌培養した場合と、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）とブルガリクス菌（ATCC11842）とサーモフィルス菌（ATCC19258）（図５ではブルガリクス菌（ATCC11842）をＢ’、サーモフィルス菌（ATCC19258）をＴ’と表す）を脱脂乳培地で３菌種混合培養した場合の、各培養時間におけるジアセチルとアセトインの合計量を図５に示す。
試験例１同様、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）、ブルガリクス菌及びサーモフィルス菌を３菌種混合培養することで、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）単菌培養時と比較し、ジアセチルとアセトインの産生量が増加した。
したがって、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）と、ブルガリクス菌およびサーモフィルス菌との間に、ジアセチルおよび／またはアセトインの生成に関する増加効果があることがわかった。
[実施例２]
発酵物の例として、以下に「発酵乳」、「発酵バター」、「チーズ」の製造例を記載する。
「発酵乳」の製造
温水８９６５．５ｇ、脱脂乳９００ｇ、無塩バター１００ｇ、ゼラチン４ｇ、ペクチン０．５ｇを入れて攪拌し、溶解して原料ミックスとした。この原料ミックスを均質機で処理後、殺菌し、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp.lactis）SBT1557とブルガリクス菌とサーモフィルス菌の脱脂乳培養物を各３％添加して発酵ミックスを調製した。対照として、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp.lactis）SBT1557の脱脂乳培養物のみを３％添加して発酵ミックスを調製した。これらの発酵ミックスを、それぞれ３０℃で酸度０．８％になるまで発酵させた。
４℃で保存後、製造した発酵乳について、７名のパネラーで官能評価を行った。「発酵風味の強さ」（−２：弱い、−１：やや弱い、０：どちらともいえない、＋１：やや強い、＋２：強い）「風味の好ましさ」（−２：好ましくない、−１：やや好ましくない、０：どちらともいえない、＋１：やや好ましい、＋２：好ましい）「おいしさ」（−２：おいしい、−１：ややおいしい、０：どちらともいえない、＋１：ややおいしくない、＋２：おいしくない）について、５段階で評価を行った。
発酵物の例として、以下に「発酵乳」、「発酵バター」、「チーズ」の製造例を記載する。
「発酵乳」の製造
温水８９６５．５ｇ、脱脂乳９００ｇ、無塩バター１００ｇ、ゼラチン４ｇ、ペクチン０．５ｇを入れて攪拌し、溶解して原料ミックスとした。この原料ミックスを均質機で処理後、殺菌し、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp.lactis）SBT1557とブルガリクス菌とサーモフィルス菌の脱脂乳培養物を各３％添加して発酵ミックスを調製した。対照として、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp.lactis）SBT1557の脱脂乳培養物のみを３％添加して発酵ミックスを調製した。これらの発酵ミックスを、それぞれ３０℃で酸度０．８％になるまで発酵させた。
４℃で保存後、製造した発酵乳について、７名のパネラーで官能評価を行った。「発酵風味の強さ」（−２：弱い、−１：やや弱い、０：どちらともいえない、＋１：やや強い、＋２：強い）「風味の好ましさ」（−２：好ましくない、−１：やや好ましくない、０：どちらともいえない、＋１：やや好ましい、＋２：好ましい）「おいしさ」（−２：おいしい、−１：ややおいしい、０：どちらともいえない、＋１：ややおいしくない、＋２：おいしくない）について、５段階で評価を行った。
［実施例３］
「発酵バター」の製造
脂肪率４５％のクリーム（９５℃４５分間殺菌）に、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）SBT1557の脱脂乳培養物８％と、ブルガリクス菌とサーモフィルス菌の脱脂乳培養物各３％を添加した。対照として、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）SBT1557の脱脂乳培養物のみを８％添加した。３０℃で８時間培養後、１０℃に冷却して６時間以上エージングを行った。その後、定法に従って、チャーニングおよびワーキングの工程を経て、発酵バターを製造した。
製造した発酵バターについて、７名のパネラーで官能評価を行った。「発酵風味の強さ」（−２：弱い、−１：やや弱い、０：どちらともいえない、＋１：やや強い、＋２：強い）「風味の好ましさ」（−２：好ましくない、−１：やや好ましくない、０：どちらともいえない、＋１：やや好ましい、＋２：好ましい）「おいしさ」（−２：おいしい、−１：ややおいしい、０：どちらともいえない、＋１：ややおいしくない、＋２：おいしくない）について、５段階で評価行った。
「発酵バター」の製造
脂肪率４５％のクリーム（９５℃４５分間殺菌）に、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）SBT1557の脱脂乳培養物８％と、ブルガリクス菌とサーモフィルス菌の脱脂乳培養物各３％を添加した。対照として、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）SBT1557の脱脂乳培養物のみを８％添加した。３０℃で８時間培養後、１０℃に冷却して６時間以上エージングを行った。その後、定法に従って、チャーニングおよびワーキングの工程を経て、発酵バターを製造した。
製造した発酵バターについて、７名のパネラーで官能評価を行った。「発酵風味の強さ」（−２：弱い、−１：やや弱い、０：どちらともいえない、＋１：やや強い、＋２：強い）「風味の好ましさ」（−２：好ましくない、−１：やや好ましくない、０：どちらともいえない、＋１：やや好ましい、＋２：好ましい）「おいしさ」（−２：おいしい、−１：ややおいしい、０：どちらともいえない、＋１：ややおいしくない、＋２：おいしくない）について、５段階で評価行った。
［実施例４］
「チーズ」（カッテージチーズ）の製造
殺菌した脱脂乳を３２℃まで冷却後、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp.lactis）SBT1557の脱脂乳培養物５％と、ブルガリクス菌とサーモフィルス菌の脱脂乳培養物各３％を添加した。対照として、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp.lactis）SBT1557の脱脂乳培養物のみを５％添加した。レンネット０．１％を添加し、３０℃で６時間発酵させた。ｐＨ４．６に下がったカードをカッティングし、２０分静置後、お湯を入れて徐々に温度を上げた。５０℃になったところで２０分間おき、ホエーを排除後、水洗したものにドレッシングクリームを混合した。
製造したカッテージチーズについて、７名のパネラーで官能評価を行った。「発酵風味の強さ」（−２：弱い、−１：やや弱い、０：どちらともいえない、＋１：やや強い、＋２：強い）「風味の好ましさ」（−２：好ましくない、−１：やや好ましくない、０：どちらともいえない、＋１：やや好ましい、＋２：好ましい）「おいしさ」（−２：おいしい、−１：ややおいしい、０：どちらともいえない、＋１：ややおいしくない、＋２：おいしくない）について、５段階で評価行った。
「チーズ」（カッテージチーズ）の製造
殺菌した脱脂乳を３２℃まで冷却後、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp.lactis）SBT1557の脱脂乳培養物５％と、ブルガリクス菌とサーモフィルス菌の脱脂乳培養物各３％を添加した。対照として、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp.lactis）SBT1557の脱脂乳培養物のみを５％添加した。レンネット０．１％を添加し、３０℃で６時間発酵させた。ｐＨ４．６に下がったカードをカッティングし、２０分静置後、お湯を入れて徐々に温度を上げた。５０℃になったところで２０分間おき、ホエーを排除後、水洗したものにドレッシングクリームを混合した。
製造したカッテージチーズについて、７名のパネラーで官能評価を行った。「発酵風味の強さ」（−２：弱い、−１：やや弱い、０：どちらともいえない、＋１：やや強い、＋２：強い）「風味の好ましさ」（−２：好ましくない、−１：やや好ましくない、０：どちらともいえない、＋１：やや好ましい、＋２：好ましい）「おいしさ」（−２：おいしい、−１：ややおいしい、０：どちらともいえない、＋１：ややおいしくない、＋２：おいしくない）について、５段階で評価行った。
本発明によれば、ジアセチルおよび／またはアセトインを含む発酵風味の強い発酵物を短時間で製造することができる。
[寄託生物材料への言及]
（１）SBT1557
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号305-8566）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成２７年４月２３日
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
NITE P-02038
（２）SBT1178
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号305-8566）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成９年９月１７日
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
FERM P-16429
（１）SBT1557
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号305-8566）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成２７年４月２３日
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
NITE P-02038
（２）SBT1178
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号305-8566）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成９年９月１７日
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
FERM P-16429
Claims (4)
- ｃｉｔＰ遺伝子を有しジアセチル及びアセトイン産生能を有するラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）を用いた発酵物の製造方法であって、ブルガリクス菌およびサーモフィルス菌とともに培養することを特徴とする発酵物の製造方法。
- ｃｉｔＰ遺伝子を有しジアセチル及びアセトイン産生能を有するラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）をブルガリクス菌およびサーモフィルス菌とともに培養することによりジアセチル及びアセトインの産生を増強する方法。
- ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis sub
sp. lactis）ＳＢＴ１５５７（NITE P-02038）株。 - ｃｉｔＰ遺伝子を有しジアセチル及びアセトイン産生能を有するラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）と、ブルガリクス菌およびサーモフィルス菌を含む発酵物。
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