WO2024095989A1 - ラクトコッカス・ラクティス及びストレプトコッカス・サーモフィラスを含む発酵組成物におけるラクトコッカス・ラクティスの菌数測定方法 - Google Patents

ラクトコッカス・ラクティス及びストレプトコッカス・サーモフィラスを含む発酵組成物におけるラクトコッカス・ラクティスの菌数測定方法 Download PDF

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WO2024095989A1
WO2024095989A1 PCT/JP2023/039175 JP2023039175W WO2024095989A1 WO 2024095989 A1 WO2024095989 A1 WO 2024095989A1 JP 2023039175 W JP2023039175 W JP 2023039175W WO 2024095989 A1 WO2024095989 A1 WO 2024095989A1
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WO
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bacteria
component
fermentation composition
bacterium
milk
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PCT/JP2023/039175
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Inventor
一馬 植田
淳 藤田
秀夫 桑平
Original Assignee
小岩井乳業株式会社
キリンホールディングス株式会社
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A23C9/123—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06—Quantitative determination

Definitions

  • the innate immune system is primarily responsible for the primary response to bacterial or viral infections, and dendritic cells are a powerful and important component of the innate immune system.
  • dendritic cells plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are major producers of various interferons (IFNs), such as type I interferon, which exhibits growth inhibitory activity against viruses, and play an extremely important role in antiviral biological defense (Patent Document 1).
  • IFNs interferons
  • the present invention relates to a method for measuring the number of bacteria capable of activating plasmacytoid dendritic cells in a fermentation composition containing bacteria capable of activating plasmacytoid dendritic cells (preferably, Lactococcus lactis subsp.
  • lactis (herein also referred to as "Lactococcus lactis”) JCM5805 strain (herein also referred to as “JCM5805 strain”)) and bacteria belonging to Streptococcus salivarius subsp. thermophilus (herein also referred to as “Streptococcus thermophilus”) (hereinafter also referred to as "Thermophilus bacteria”), and a fermentation composition containing bacteria capable of activating plasmacytoid dendritic cells and Thermophilic bacteria.
  • Thermophilus bacteria a fermentation composition containing bacteria capable of activating plasmacytoid dendritic cells and Thermophilic bacteria.
  • Foods often contain bacteria such as lactic acid bacteria.
  • bacteria such as lactic acid bacteria.
  • lactis JCM5805 strain is known as a bacterium that can activate plasmacytoid dendritic cells (Patent Document 1).
  • Patent Document 1 it is important from the standpoint of efficacy and safety of the food to detect the number of bacteria that can activate plasmacytoid dendritic cells, such as lactic acid bacteria, contained in the food.
  • Non-Patent Document 1 As a means for detecting the number of bacteria, for example, the bleed method (direct individual microscopy method) is known (Non-Patent Document 1).
  • the bleed method is a method in which food is smeared on a slide glass, dried, and then the number of bacteria stained with a staining solution is measured under a microscope.
  • the breeding method has the advantages of simple operation and low cost (Non-Patent Document 2), but has the disadvantage that it is difficult to selectively measure the number of specific bacteria when two or more types of bacteria with similar morphology such as size or shape are included, since it involves observation of bacterial morphology.
  • Patent Document 2 a method has been reported for measuring the number of bacteria by distinguishing between other components such as soy milk components and bacteria when the other components are present in addition to bacteria.
  • Patent Document 2 the other components are decomposed, and only the bacteria are filtered, extracted, and collected using a filter, making it possible to measure the number of bacteria.
  • Patent Document 2 when two or more types of bacteria are contained, it is difficult to selectively decompose or eliminate bacteria other than the specific bacteria so as to capture only the specific bacteria, and when two or more types of bacteria are contained, there still remain problems in that it is difficult to selectively measure the number of specific bacteria.
  • the object of the present invention is to provide a method for selectively measuring the number of bacteria capable of activating plasmacytoid dendritic cells (e.g., lactic acid bacteria such as JCM5805 strain) in a fermentation composition containing bacteria capable of activating plasmacytoid dendritic cells (e.g., lactic acid bacteria such as JCM5805 strain) and thermophilic bacteria, which does not require skilled techniques, and is low-cost and easy to use, and to provide a fermentation composition suitable for such a method.
  • bacteria capable of activating plasmacytoid dendritic cells e.g., lactic acid bacteria such as JCM5805 strain
  • thermophilic bacteria e.g., lactic acid bacteria such as JCM5805 strain
  • the objective more specifically, is to provide a method for selectively measuring the number of JCM5805 strain bacteria in a fermentation composition containing JCM5805 strain bacteria and thermophilic bacteria which are similar to each other in terms of morphology such as size or shape, in a manner that does not require skilled techniques, is low-cost and easy to use, and to provide a fermentation composition suitable for such a method.
  • the inventors conducted extensive research to solve the problems of the present invention, and discovered that by diluting a fermentation composition containing bacteria capable of activating plasmacytoid dendritic cells (e.g., lactic acid bacteria such as JCM5805 strain) and Thermophilic bacteria and incubating the resulting dilution at 35-50°C, it becomes possible to utilize the difference in the degree of enlargement or proliferation between bacteria capable of activating plasmacytoid dendritic cells (e.g., lactic acid bacteria such as JCM5805 strain) and Thermophilic bacteria, thereby making it significantly easier to visually distinguish between the two bacteria using a microscope or the like, and thus completing the present invention.
  • bacteria capable of activating plasmacytoid dendritic cells e.g., lactic acid bacteria such as JCM5805 strain
  • Thermophilic bacteria e.g., lactic acid bacteria such as JCM5805 strain
  • Component (A) a bacterium capable of activating plasmacytoid dendritic cells, and A fermentation composition comprising a bacterium belonging to Streptococcus salivarius subsp. thermophilus as component (B),
  • a method for measuring the number of bacteria in the component (A), comprising the steps of: Step (1): adding a diluent to the fermentation composition; step (2): incubating the diluted solution obtained in the step (1) at a temperature of 35 to 50° C.; and step (3): measuring the number of bacteria of the component (A) in the diluted solution incubated in the step (2).
  • the method comprising: [2] Component (A) Lactococcus lactis subsp.
  • a method for measuring the number of bacteria in the component (A), comprising the steps of: Step (1): adding a diluent to the fermentation composition; Step (2): Incubating the diluted solution obtained in step (1) at a temperature of 35 to 50° C.; and Step (3): measuring the number of bacteria of the component (A) in the diluted solution incubated in the step (2); the method comprising: [3] The method according to [1] or [2] above, wherein the diluent is any one of (i) an aqueous solution containing a medium in which bacteria (e.g., lactic acid bacteria) can grow, (ii) a buffer solution, and (iii) a buffer solution containing a medium in which bacteria (e.g., lactic acid bacteria) can grow; [4] The method according to [3] above, wherein the medium is soybean
  • lactis JCM5805 strain capable of activating plasmacytoid dendritic cells; [13] The method according to any one of [1] to [12] above, wherein the dilution solution contains a medium in which bacteria (e.g., lactic acid bacteria) can grow, and the difference in growth rate between the component (A) and the component (B) is 0.5 x 10 9 cells/(g hour) or more when incubation is performed at 43°C for 60 to 120 minutes; [14] The method according to any one of the above-mentioned [1] to [13], wherein the measurement of the number of bacteria in the component (A) utilizes the difference in the enlargement rate and/or proliferation rate between the component (A) and the component (B); [15] A fermentation composition comprising component (A) a bacterium capable of activating plasmacytoid dendritic cells, and component (B) a bacterium belonging to Streptococcus salivarius subsp.
  • bacteria e.g., lactic acid bacteria
  • thermophilus Step (1): adding a diluent to the fermentation composition; and Step (2): Incubating the diluted solution obtained in step (1) at 35 to 50°C; In When incubation is performed at 43° C. for 60 to 120 minutes, the difference in proliferation rate between the component (A) and the component (B) is 0.5 ⁇ 10 9 cells/(g hour) or more.
  • the fermentation composition [16] A fermentation composition comprising component (A) Lactococcus lactis subsp. lactis JCM5805 strain and component (B) Streptococcus salivarius subsp.
  • thermophilus bacteria Step (1): adding a diluent to the fermentation composition; and Step (2): Incubating the diluted solution obtained in step (1) at 35 to 50°C; In When incubation is performed at 43° C. for 60 to 120 minutes, the difference in proliferation rate between the component (A) and the component (B) is 0.5 ⁇ 10 9 cells/(g hour) or more.
  • the fermentation composition ;
  • a fermentation composition containing bacteria capable of activating plasmacytoid dendritic cells (e.g., lactic acid bacteria such as JCM5805 strain) and thermophilic bacteria, it is possible to provide a method for selectively measuring the number of bacteria capable of activating plasmacytoid dendritic cells (e.g., lactic acid bacteria such as JCM5805 strain) easily and at low cost without requiring skilled techniques, and a fermentation composition suitable for such a method.
  • bacteria capable of activating plasmacytoid dendritic cells e.g., lactic acid bacteria such as JCM5805 strain
  • thermophilic bacteria thermophilic bacteria
  • bacterium capable of activating plasmacytoid dendritic cells is the JCM5805 strain
  • a fermentation composition containing the JCM5805 strain and thermophilic bacteria which are similar to each other in terms of morphology such as size or shape it is possible to provide a method for selectively measuring the number of the JCM5805 strain bacteria in a simple manner, at low cost, without requiring skilled techniques, and a fermentation composition suitable for such a method, etc.
  • FIG. 1 is a diagram showing the relationship between Lactococcus lactis subsp. lactis JCM5805 strain and strains equivalent to said strain (strains derived from said strain and strains from which said strain is derived).
  • FIG. 2 is a diagram showing how 16 fields of view are taken in direct microscopy.
  • FIG. 3 shows a microscopic image obtained by observing Test Example 1, in which the fermentation composition was diluted with a phosphate buffer solution (pH 7.2), by a direct microscopic examination method.
  • FIG. 4 shows a microscopic image obtained by observing, by direct microscopy, Test Example 2 in which the fermentation composition was diluted with an SCD medium (pH 8.0) supplemented with 0.1 M Tris-HCl buffer.
  • FIG. 5 shows a microscopic image obtained by observing Test Example 3, in which the fermentation composition was diluted with SCD medium (pH 7.2), by direct microscopy.
  • the present invention relates to [1] Component (A) a bacterium capable of activating plasmacytoid dendritic cells, and A fermentation composition comprising a bacterium belonging to Streptococcus salivarius subsp. thermophilus as component (B), A method for measuring the number of bacteria in the component (A), comprising the steps of: Step (1): adding a diluent to the fermentation composition; Step (2): Incubating the diluted solution obtained in step (1) at a temperature of 35 to 50° C.; and Step (3): measuring the number of bacteria of the component (A) in the diluted solution incubated in the step (2);
  • the method (hereinafter also referred to as "the measurement method of the present invention") includes the steps of: [2] Component (A) Lactococcus lactis subsp.
  • a fermentation composition comprising a bacterium belonging to Streptococcus salivarius subsp. thermophilus as component (B),
  • a method for measuring the number of bacteria in the component (A), comprising the steps of: Step (1): adding a diluent to the fermentation composition; and Step (2): Incubating the diluted solution obtained in step (1) at 35 to 50°C;
  • the method (hereinafter also referred to as "a preferred embodiment of the measurement method of the present invention") comprising: [3] A fermentation composition comprising component (A) a bacterium capable of activating plasmacytoid dendritic cells, and component (B) a bacterium belonging to Streptococcus salivarius subsp.
  • thermophilus Step (1): adding a diluent to the fermentation composition; and Step (2): Incubating the diluted solution obtained in step (1) at 35 to 50°C; In When incubation is performed at 43° C. for 60 to 120 minutes, the difference in proliferation rate between the component (A) and the component (B) is 0.5 ⁇ 10 9 cells/(g hour) or more.
  • the fermentation composition hereinafter also referred to as "the fermentation composition of the present invention”
  • a fermentation composition comprising component (A) Lactococcus lactis subsp. lactis JCM5805 strain and component (B) Streptococcus salivarius subsp.
  • thermophilus bacteria Step (1): adding a diluent to the fermentation composition; and Step (2): Incubating the diluted solution obtained in step (1) at 35 to 50°C; In the above, when incubation is performed at 43° C. for 60 to 120 minutes, the difference in proliferation rate between the component (A) and the component (B) is 0.5 ⁇ 10 9 cells/(g hour) or more.
  • the fermentation composition hereinafter also referred to as "a preferred embodiment of the fermentation composition of the present invention”);
  • the present invention includes embodiments such as the above.
  • the "bacteria capable of activating pDC” (hereinafter also referred to as “bacteria in the present invention”) is not particularly limited, and refers to, for example, lactic acid bacteria, acetic acid bacteria, bacteria of the genus Escherichia, bacteria of the genus Bacillus, cyanobacteria, etc., capable of activating pDC.
  • the bacteria may be either “live bacteria”, “dead bacteria”, or “both live bacteria and dead bacteria”, but from the viewpoint of enjoying the full significance of the present invention, it is preferable that the bacteria are “live bacteria” or "both live bacteria and dead bacteria”.
  • the "bacteria capable of activating pDC" in the present invention can induce the production of IFN.
  • the IFN is preferably at least one of Type I IFN (type I interferon), Type II IFN (type II interferon) and Type III IFN (type III interferon).
  • Type I IFN refers to a cytokine that is effective against viral infection, and includes, for example, IFN- ⁇ (including subtypes such as 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 13, 14, 16, 17 or 21) or IFN- ⁇ .
  • Type II IFN includes IFN- ⁇
  • Type III IFN includes IFN- ⁇ .
  • the "bacteria capable of activating pDC" in the present invention is preferably one that has at least the activity of inducing the production of Type I IFN.
  • the IFN that can be induced to be produced by the "bacteria capable of activating pDC" of the present invention is not particularly limited as long as it is an IFN belonging to any of Type I IFN, Type III IFN, and Type III IFN, but is preferably one or more types selected from the group consisting of IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , and IFN- ⁇ , more preferably at least one type of IFN is IFN- ⁇ , even more preferably at least one type of IFN is IFN- ⁇ and two or more types selected from the group consisting of IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , and IFN- ⁇ , and particularly preferably at least two of the two or more types of IFN are IFN- ⁇ and IFN- ⁇ .
  • Whether or not bacteria can activate pDC can be confirmed by observing whether, when bacteria are provided to pDC, pDC phagocytose the bacteria, whether cell processes appear on the surface of pDC that have phagocytosed the bacteria, or whether pDC that have phagocytosed the bacteria produce IFN (Type I IFN and/or Type III IFN, etc.).
  • PDC phagocytosis or the appearance of cell protrusions on the surface of pDC can be confirmed, for example, by observation using a microscope or flow cytometry, and it is preferable to observe the pDC after providing bacteria modified with a fluorescent dye to the pDC.
  • IFN such as Type I IFN and/or Type III IFN
  • Production of IFN can be confirmed, for example, by culturing bacteria in the presence of pDCs induced from bone marrow cells of mammals such as mice, and measuring the amount or concentration of IFN such as IFN- ⁇ or IFN- ⁇ in the culture system.
  • the IFN concentration can be confirmed by measuring the concentration according to the following procedures (i) to (iv).
  • (i) Mouse-derived bone marrow cells from which red blood cells have been removed are suspended in RPMI medium prepared to the composition described below to a concentration of 1 x 10 6 cells/mL to prepare a cell suspension.
  • ⁇ Medium composition 10% by volume FBS 100 U/mL penicillin/streptomycin 1 mM sodium pyruvate 2.5 mM HEPES 1% by mass MEM NEAA 50 ⁇ M ⁇ -mercaptoethanol 100 ng/mL Flt-3L (ii) 1 mL of the prepared cell suspension is seeded and cultured in a CO2 incubator at 37°C and 5% CO2 by volume for 1 week to induce pDCs.
  • Bone marrow cells containing induced pDCs are suspended to a concentration of 2 ⁇ 105 cells/mL, and 200 ⁇ L each is seeded into a 96-well plate, and 2 ⁇ L each of a lactobacillus suspension adjusted to a concentration of 1 mg/mL with PBS is added.
  • the culture supernatant is collected and the IFN- ⁇ concentration is measured by ELISA using an IFN- ⁇ measurement kit.
  • the "bacteria capable of activating pDC” in the present invention refers to "the bacteria having a final concentration of 10 ⁇ g/mL" and "a final concentration of 2 ⁇ 10
  • the culture medium can be expressed by an indicator of producing 30 pg/mL (preferably 50 pg/mL, more preferably 60 pg/mL, more preferably 70 pg/mL, 80 pg/mL, 90 pg/mL, 100 pg/mL, 150 pg/mL, even more preferably 200 pg/mL, 210 pg/mL, 220 pg/mL, 230 pg/mL, 240 pg/mL, 250 pg/mL, even more preferably 300 pg/mL, 400 pg/mL, 500 pg/mL, 600 pg/mL, 700 pg/m
  • the pDC activation by the "bacteria capable of activating pDC" of the present invention can promote the expression of activation markers such as CD80, CD86, or MHC class II.
  • bacteria capable of activating pDC are bacteria other than "bacteria belonging to Streptococcus salivarius subsp. thermophilus” (Thermophilus bacteria) and are capable of activating pDC, and are not particularly limited, but may include one or more types of bacteria selected from the group consisting of lactic acid bacteria, acetic acid bacteria, and Bacillus bacteria.
  • lactic acid bacteria capable of activating pDC are not particularly limited, but include, for example, bacteria of the genus Oenococcus, Bifidobacterium, Lentilactobacillus, Weissella, Tetragenococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Enterococcus, Lactobacillus, and Lactipranchibacillus.
  • bacteria examples include bacteria of the genus Lactiplantibacillus, and preferred examples of bacteria include bacteria of the genus Oenococcus, Bifidobacterium, Lentilactobacillus, Weissella, Tetragenococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Enterococcus, Lactobacillus, and Lactiplantibacillus.
  • Oenococcus genus bacteria include, for example, Oenococcus oeni.
  • Oenococcus oeni JCM6125 A specific example of the Oenococcus genus bacteria is Oenococcus oeni JCM6125.
  • Bifidobacterium genus examples include Bifidobacterium animalis subsp. lactis and Bifidobacterium longum subsp. infantis. Specific examples of the Bifidobacterium genus include Bifidobacterium animalis subsp. lactis JCM10602 and Bifidobacterium longum subsp. infantis JCM1222.
  • the above-mentioned lentilactobacillus bacteria include, for example, Lactiplantibacillus parakefiri.
  • a specific example of the lentilactobacillus bacteria is Lactiplantibacillus parakefiri JCM8573.
  • Weissella genus bacteria examples include Weissella paramesenteroides and Weissella viridescens. Specific examples of Weissella genus bacteria include Weissella paramesenteroides JCM9890 and Weissella viridescens JCM1174.
  • Tetragenococcus bacteria include, for example, Tetragenococcus halophilus.
  • Tetragenococcus bacteria is Tetragenococcus halophilus NRIC0098.
  • Lactococcus genus bacteria examples include Lactococcus lactis, Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus garvieae, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. hordniae, and Lactococcus plantarum.
  • Lactococcus genus bacteria include Lactococcus lactis subsp. lactis JCM5805, Lactococcus lactis subsp. lactis NBRC12007, Lactococcus lactis subsp. lactis NRIC1150, Lactococcus lactis subsp. lactis JCM20101, Lactococcus lactis subsp. lactis JCM7638, Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC11454, Lactococcus garvieae NBRC100934, Lactococcus lactis subsp. cremoris JCM16167, Lactococcus lactis subsp. cremoris NBRC100676, Lactococcus lactis subsp. holdoniae JCM1180, Lactococcus lactis subsp. holdoniae JCM11040, and Lactococcus plantarum JCM11056.
  • Leuconostoc genus bacteria examples include Leuconostoc carnosum and Leuconostoc lactis. Specific examples of Leuconostoc genus bacteria include Leuconostoc carnosum JCM9695 and Leuconostoc lactis NBRC12455.
  • Examples of the Pediococcus genus bacteria include Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus cellicola, Pediococcus claussenii, Pediococcus damnosus, Pediococcus ethanolidurans, Pediococcus inopinatus, Pediococcus parvulus, and Pediococcus stilesii.
  • Specific examples of Pediococcus include Pediococcus acidilactici JCM8797, Pediococcus acidilactici K15, and Pediococcus damnosus JCM5886.
  • Streptococcus genus is Streptococcus thermophilus.
  • Enterococcus genus is Enterococcus alcedinis.
  • Lactobacillus bacteria examples include Lactobacillus paracasei, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus acidophilus, and Lactobacillus bulgaricus.
  • Lactobacillus bacteria include Lactobacillus paracasei KW3110, Lactobacillus paracasei MCC1849, Lactobacillus rhamnosus GG, Lactobacillus rhamnosus GG, Lactobacillus rhamnosus CRL1505, Lactobacillus gasseri SBT2055, Lactobacillus acidophilus L-92, and Lactobacillus bulgaricus OLL1073R-1.
  • Lactiplantibacillus genus bacteria examples include Lactiplantibacillus plantarum and Lactiplantibacillus pentosus. Specific examples of Lactiplantibacillus genus bacteria include Lactiplantibacillus plantarum L-137 and Lactiplantibacillus pentosus ONRICb0240. Note that Lactiplantibacillus plantarum and Lactiplantibacillus pentosus were previously classified as Lactobacillus plantarum and Lactiplantibacillus pentosus, respectively.
  • acetic acid bacteria capable of activating pDC are not particularly limited, but examples thereof include bacteria of the genus Gluconacetobacter, Acetobacter, and Gluconobacter, preferably bacteria of the genus Gluconacetobacter, more preferably Gluconacetobacter hansenii, and even more preferably Gluconacetobacter hansenii GK-1.
  • Bacillus bacteria capable of activating pDC is not particularly limited, but examples thereof include Bacillus coagulans.
  • Bacillus bacteria include Bacillus coagulans SANK70258 strain.
  • JCM5805 strain A preferred embodiment of the measurement method of the present invention is to use Lactococcus lactis subsp. lactis JCM5805 strain as the "lactic acid bacteria capable of activating pDC".
  • the "JCM5805 strain” used in the present invention may be any of “live bacteria”, “killed bacteria”, or “both live and killed bacteria” as long as it is a JCM5805 strain bacterial body, but from the viewpoint of enjoying the full significance of the present invention, it is preferably “live bacteria” or "both live and killed bacteria”.
  • the "JCM5805 strain” in the present invention includes strains equivalent to the JCM5805 strain.
  • the equivalent strain refers to a strain derived from the JCM5805 strain (strain A), a strain from which the JCM5805 strain is derived (strain B), or a descendant strain of the aforementioned strain A or strain B.
  • Equivalent strains may be stored in other strain collection institutions.
  • Figure 1 shows strains derived from the JCM5805 strain and strains from which the JCM5805 strain is derived. Even strains equivalent to the JCM5805 strain shown in Figure 1 can be used as the "JCM5805 strain" in the present invention.
  • the method for preparing the bacterial cells of the present invention is not particularly limited, and examples of the method for preparing live bacterial cells of the present invention, such as JCM5805 strain, include a method of collecting the bacterial cells from a medium in which live bacterial cells of the present invention, such as JCM5805 strain, are cultured by filtration, centrifugation, etc.
  • examples of the method for preparing the killed bacterial cells of the present invention include a method of sterilizing a medium in which live bacterial cells of the present invention, such as JCM5805 strain, are cultured, and then collecting the bacterial cells by filtration, centrifugation, etc., and a method of collecting live bacterial cells of the present invention, such as JCM5805 strain, from a medium in which live bacterial cells of the present invention, such as JCM5805 strain, are cultured, and then sterilizing the bacterial cells, and further drying or crushing can be performed as necessary.
  • the means of sterilization is not particularly limited, and any conventional means for killing bacteria, such as heating, ultraviolet light, gamma-ray irradiation, etc., can be used.
  • the bacteria of the present invention such as the JCM5805 strain, in the fermentation composition may be killed by a sterilization treatment during preparation of the fermentation composition.
  • thermophilus bacteria The "bacteria belonging to Streptococcus salivarius subsp. thermophilus” (Thermophilus bacteria) used in the present invention may, from the viewpoint of enjoying the full significance of the present invention, be “viable bacteria” or “both viable and dead bacteria” of Thermophilus bacteria, with “viable bacteria” being preferred.
  • the method for preparing the cells of Thermophilus bacteria is not particularly limited, and an example of a method for preparing live cells of Thermophilus bacteria is a method in which live cells of Thermophilus bacteria are cultured in a medium and then collected by filtration, centrifugation, or the like.
  • bacteria such as JCM5805 strain and other bacteria such as lactic acid bacteria other than Thermophilic bacteria may be used in combination as long as the effects of the present invention are not hindered.
  • the bacteria of the present invention such as the lactic acid bacteria used in the present invention, and thermophilic bacteria can be obtained from known depository institutions.
  • the bacterial strains such as the lactic acid bacteria strains
  • the JCM strains can be obtained from the Microorganism Materials Development Laboratory, Bioresource Center, RIKEN (1-1 Takanodai 3-chome, Tsukuba, Ibaraki Prefecture)
  • the NBRC strains can be obtained from the Biological Resources Division, National Institute of Technology and Evaluation (5-8 Kazusa Kamatari 2-chome, Kisarazu, Chiba Prefecture)
  • the NRIC strains can be obtained from the Tokyo University of Agriculture and Technology Strain Preservation Room (1-1 Sakuragaoka 1-chome, Setagaya-ku, Tokyo)
  • the ATCC strains can be obtained from the American Type Culture Collection (USA).
  • the JCM5805 strain can be obtained from the Microbial Materials Development Laboratory of the Bioresource Center of the Institute of Physical and Chemical Research, but in the present invention, the same strain of the JCM5805 strain stored in a preservation institution other than the Microbial Materials Development Laboratory of the Bioresource Center of the Institute of Physical and Chemical Research can be used.
  • the same strain of the JCM5805 strain can be obtained from the Biological Genetic Resources Division of the National Institute of Technology and Evaluation (2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture), the Strain Preservation Room of Tokyo University of Agriculture (1-1-1 Sakuragaoka, Setagaya-ku, Tokyo), the American Type Culture Collection (USA), etc.
  • a commercially available starter culture may be used as the live lactic acid bacteria used in the present invention.
  • the term “fermented composition” refers to a composition whose production process includes a step of fermenting a dairy raw material with live lactic acid bacteria.
  • the "fermented composition” in this specification includes, but is not limited to, for example, “fermented milk,””dairy lactic acid bacteria beverage,””lactic acid bacteria beverage,””foods using milk as the main ingredient,” and the like defined in the “Ministerial Ordinance on the Ingredient Standards, etc. of Milk and Dairy Products” (hereinafter referred to as the "Milk, etc. Ministerial Ordinance”).
  • “fermented milk” defined in the Milk, etc.
  • Ministerial Ordinance refers to milk, such as raw milk, cow's milk, special cow's milk, raw goat's milk, pasteurized goat's milk, raw sheep's milk, ingredient-adjusted milk, low-fat milk, non-fat milk, and processed milk; dairy products such as cream, butter, cheese, and condensed milk; and foods using milk, etc. as the main ingredient; fermented with lactic acid bacteria or yeast and made into a solid (hard type), pasty (soft type), or liquid (drink type), or frozen form of these, but the "fermented composition" in this specification is not limited to fermented milk defined in the Milk, etc.
  • Ministerial Ordinance refers to milk, such as raw milk, cow's milk, special cow's milk, raw goat's milk, pasteurized goat's milk, raw sheep's milk, ingredient-adjusted milk, low-fat milk, non-fat milk, and processed milk; dairy products such as cream, butter, cheese, and condensed milk; and foods using milk, etc
  • "foods made primarily from milk, etc.” are not limited to "foods made primarily from milk, etc.” as defined in the Ministerial Ordinance on Milk, etc., so long as they include a process in the manufacturing process that ferments the milk raw material with live lactic acid bacteria, but also include foods made primarily from “milk” and/or "dairy products such as cream, butter, cheese, condensed milk, milk powder, and fermented milk.” Examples of such "foods made primarily from milk, etc.” include sour cream.
  • fermented milk etc. in the Milk and Dairy Products Ordinance are as follows:
  • the Ministerial Ordinance on Milk, etc. defines fermented milk as "milk or milk containing an equivalent or greater amount of nonfat milk solids fermented with lactic acid bacteria or yeast into a paste or liquid form, or frozen form.
  • Its ingredient specifications are "nonfat milk solids 8% or more, lactic acid bacteria or yeast count (per mL) 10 million or more, coliform bacteria negative.”
  • dairy lactobacillus beverages as "beverages (excluding fermented milk) that are processed or whose main ingredient is milk, etc., fermented with lactic acid bacteria or yeast.” Its ingredient specifications are "non-fat milk solids of 3% or more, lactobacillus or yeast count (per mL) of 10 million or more, and coliform bacteria negative.” In addition, the Ministerial Ordinance on Milk, etc.
  • lactobacillus beverages which are foods that use milk as the main ingredient, as "beverages (excluding fermented milk) that are processed or whose main ingredient is milk, etc., fermented with lactic acid bacteria or yeast.”
  • the ingredient specifications are "less than 3% nonfat milk solids, 1 million or more lactobacillus or yeast counts (per mL), and negative for coliform bacteria.”
  • the “fermented composition” of the present invention may contain, as optional components, stabilizers, sweeteners, dietary fiber, vitamins, minerals, flavorings, etc.
  • stabilizers are not particularly limited and examples thereof include carrageenan, xanthan gum, etc.
  • the sweeteners are not particularly limited and examples thereof include sugars, sugar alcohols, high-intensity sweeteners, etc., and these sweeteners can be used alone or in combination of two or more kinds.
  • the concentration of the sweetener is not particularly limited, but it may be difficult to distinguish between the bacteria of the present invention, such as the JCM5805 strain, and thermophilic bacteria when observed under a microscope. From the viewpoint of being able to fully enjoy the significance of the present invention, the concentration of the sweetener (preferably sugar, and more preferably sucrose) is preferably 6% by mass or less, more preferably 3% by mass or less, and even more preferably 1% by mass or less.
  • the "fermented composition" of the present invention preferably includes a non-fat milk solids concentration of, for example, 1 to 18% by weight, preferably 2 to 16% by weight, more preferably 2 to 14% by weight, even more preferably 4 to 12% by weight, 6 to 10% by weight, or 7 to 9% by weight, and/or a milk fat concentration of, for example, 0 to 8% by weight, preferably 0.1 to 7% by weight, more preferably 0.5 to 4% by weight, or 1 to 3% by weight.
  • a non-fat milk solids concentration of, for example, 1 to 18% by weight, preferably 2 to 16% by weight, more preferably 2 to 14% by weight, even more preferably 4 to 12% by weight, 6 to 10% by weight, or 7 to 9% by weight
  • a milk fat concentration of, for example, 0 to 8% by weight, preferably 0.1 to 7% by weight, more preferably 0.5 to 4% by weight, or 1 to 3% by weight.
  • the pH of the fermented composition of the present invention is not particularly limited, but may be, for example, 6 or less, or 3.5 to 6.
  • the pH of the fermented composition can be measured at 20° C. according to a known method, for example, using a pH meter (product name: pH meter F-52, manufactured by Horiba, Ltd.).
  • milk ingredient in this specification typically includes "milk” as defined in the Ministerial Ordinance on Milk, etc., i.e., raw milk, cow's milk, special cow's milk, raw goat's milk, pasteurized goat's milk, raw sheep's milk, ingredient-adjusted milk, low-fat milk, non-fat milk, and processed milk, or milk containing an equivalent or higher non-fat milk solids (i.e., 8% or more), but is not particularly limited as long as it is a composition containing a milk component.
  • milk as defined in the Ministerial Ordinance on Milk, etc., i.e., raw milk, cow's milk, special cow's milk, raw goat's milk, pasteurized goat's milk, raw sheep's milk, ingredient-adjusted milk, low-fat milk, non-fat milk, and processed milk, or milk containing an equivalent or higher non-fat milk solids (i.e., 8% or more), but is not particularly limited as long as it is a composition containing
  • milk component in this specification includes one or more types selected from the group consisting of milk fat derived from “milk” as defined in the Ministerial Ordinance on Milk, etc., and non-fat milk solids derived from the “milk” (for example, proteins derived from the "milk” and/or sugars derived from the “milk”).
  • the “dairy ingredients” in this specification can be prepared using milk, dairy products, etc.
  • milk and/or dairy products are used as the "dairy ingredients", more specifically, they can be prepared using one or more selected from the group consisting of cow's milk, buffalo milk, sheep's milk, goat's milk, horse's milk, concentrated milk, skim milk, skim concentrated milk, skim milk powder, whole milk powder, cream, butter, buttermilk, condensed milk, lactose, milk protein concentrate, whey protein concentrate, and water.
  • the term "dairy ingredients” refers to those having a milk component solids concentration of, for example, 1-18% by weight, preferably 2-16% by weight, more preferably 4-12% by weight, and/or those having a non-fat milk solids concentration of, for example, 1-18% by weight, preferably 2-16% by weight, more preferably 2-14% by weight, even more preferably 4-12% by weight, 6-10% by weight, or 7-9% by weight, and/or those having a milk fat concentration of, for example, 0-8% by weight, preferably 0.1-7% by weight, more preferably 0.5-4% by weight, or 1-3% by weight.
  • the step (1) of adding a diluent to the fermentation composition is not particularly limited as long as it is a step of adding a diluent to the fermentation composition.
  • the "diluent" in the present invention is not particularly limited as long as it is a liquid that can be added to the fermentation composition to dilute the fermentation composition, and examples thereof include water and aqueous solutions. Of these, aqueous solutions are preferred. Of these, aqueous solutions with a pH of 6 to 9 are more preferred, and of these, aqueous solutions with a pH of 7 to 9 are even more preferred, from the viewpoint that the curds of the fermentation composition are more easily dissolved when added to the fermentation composition, and the background image in the field of view becomes lighter when the diluted product is observed under a microscope.
  • the aqueous solution having a pH of 6 to 9 is not particularly limited as long as it is an aqueous solution having a pH of 6 to 9, and examples thereof include an aqueous solution containing an alkaline substance such as sodium hydroxide or ammonia, an aqueous solution containing an acidic substance such as an organic acid, and an aqueous solution containing an alkaline substance and an acidic substance.
  • an alkaline substance such as sodium hydroxide or ammonia
  • an aqueous solution containing an acidic substance such as an organic acid
  • an aqueous solution containing an alkaline substance and an acidic substance an alkaline substance and an acidic substance.
  • a buffer solution having a pH of 6 to 9 is preferable, and a buffer solution having a pH of 7 to 9 is more preferable.
  • Specific examples of the buffer solution having a pH of 6 to 9 or a buffer solution having a pH of 7 to 9 include Tris buffer (preferably Tris-HCl buffer), citrate buffer, phosphate buffer, glycine buffer, citrate buffer, histidine buffer, acetamidoglycine buffer, ACES (N-(2-acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid) buffer, ADA (N-(2-acetamido)iminodiacetic acid) buffer, BES (N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid) buffer, Bicine (N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine) buffer, Bis-Tris (Bis(2-hydroxyethyl)iminotris(hydroxyethyl))
  • the buffer preferably contains a chelating agent of 6% by mass or less, more preferably 3% by mass or less, even more preferably 1% by mass or less, and even more preferably 0.5% by mass or less, and more preferably includes a buffer that does not contain a chelating agent.
  • the chelating agent is not particularly limited, and examples thereof include phosphates (e.g., orthophosphates such as trisodium phosphate, disodium phosphate, and tripotassium phosphate; polymeric phosphates such as tetrasodium pyrophosphate, sodium polyphosphate, sodium metaphosphate, and potassium metaphosphate), citrates (e.g., sodium citrate, potassium citrate, etc.), tartrates (e.g., sodium tartrate, potassium tartrate, etc.), malates (e.g., sodium malate, potassium malate, etc.), and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), with EDTA being preferred.
  • phosphates e.g., orthophosphates such as trisodium phosphate, disodium phosphate, and tripotassium phosphate
  • polymeric phosphates such as tetrasodium pyrophosphate, sodium polyphosphate, sodium metaphosphate, and potassium metaphosphate
  • the aqueous solution with a pH of 6 to 9 or the buffer solution with a pH of 6 to 9 may be a commercially available aqueous solution or buffer solution, or may be prepared by dissolving a commercially available reagent in water.
  • the "dilution liquid" of the present invention does not have to contain a medium (also referred to simply as “medium” in this specification) in which the bacteria of the present invention, such as lactic acid bacteria, can grow.
  • a medium also referred to simply as “medium” in this specification
  • the dilution liquid it is preferable for the dilution liquid to contain a medium from the viewpoint of further promoting the enlargement and growth of thermophilic bacteria and making it easier to distinguish them from the bacteria of the present invention, such as the JCM5805 strain, when observed under a microscope.
  • the dilution liquid is an aqueous solution containing a medium and having a pH of 6 to 9 (preferably a pH of 7 to 9), and even more preferable for the dilution liquid to be a buffer solution containing a medium and having a pH of 6 to 9 (preferably a pH of 7 to 9).
  • the concentration of the culture medium components in the dilution solution is not particularly limited, but may be, for example, 0.1 to 15 w/v%, preferably 0.5 to 10 w/v%, more preferably 1 to 9 w/v%, and even more preferably 2 to 6 w/v%, in terms of the ratio of the dry weight of the culture medium components to the total volume of the dilution solution.
  • the "culture medium” in the present invention is not particularly limited as long as it is capable of growing bacteria (preferably lactic acid bacteria) in the present invention, such as lactic acid bacteria, under appropriate conditions, and includes at least a carbon source such as sugars, and preferably includes a nitrogen source such as amino acids and/or inorganic salts.
  • bacteria preferably lactic acid bacteria
  • lactic acid bacteria such as lactic acid bacteria
  • Specific examples of such media include soybean casein digest medium (SCD medium) and M17 broth medium, and known media can be used.
  • SCD medium and M17 broth medium include the following compositions. ⁇ Composition per 1L of SCD medium> Casein peptone 17.0g Soy peptone 3.0g Glucose 2.5g Dipotassium phosphate 2.5g Sodium chloride 5.0g Water Remaining amount ⁇ Composition per 950 mL of M17 broth medium> Casein peptone 5.0g Soy peptone 5.0g Beef extract 5.0g Yeast extract 2.5g Ascorbic acid 0.5g Magnesium sulfate 0.25g Disodium ⁇ -glycerophosphate 19.0g Water remaining
  • a preferred embodiment of the "diluent" of the present invention is one selected from the group consisting of (i) an aqueous solution containing a culture medium (e.g., an aqueous solution containing a culture medium and not a buffer solution), (ii) a buffer solution, and (iii) a buffer solution containing a culture medium in which the bacteria of the present invention, such as lactic acid bacteria (preferably lactic acid bacteria), can grow.
  • a culture medium e.g., an aqueous solution containing a culture medium and not a buffer solution
  • a buffer solution e.g., a buffer solution
  • a buffer solution containing a culture medium in which the bacteria of the present invention such as lactic acid bacteria (preferably lactic acid bacteria), can grow.
  • an aqueous solution containing a culture medium preferably having a pH of 6 to 9, more preferably 7 to 9 and (iii) a buffer solution containing a culture medium (preferably having a pH of 6 to 9, more preferably 7 to 9) are preferred, and (iii) a buffer solution containing a culture medium (preferably having a pH of 6 to 9, more preferably 7 to 9) is even more preferred.
  • dilution solution is a dilution solution that contains a medium in which the bacteria of the present invention, such as lactic acid bacteria (preferably lactic acid bacteria), can grow, and in which the difference in growth rate between the component (A) and the component (B) is 0.5 x 109 cells/(g hour) or more when incubated at 43°C for 60 to 120 minutes.
  • a dilution solution is preferred from the viewpoints of further promoting the enlargement and growth of thermophilic bacteria and making it easier to distinguish them from the bacteria of the present invention, such as the JCM5805 strain, when observed under a microscope.
  • the amount of diluent added to the fermentation composition is not particularly limited, and may be, for example, 2 mL or more, preferably 4 mL or more, more preferably 7 mL or more, and even more preferably 9 mL or more per gram of the fermentation composition.
  • the upper limit of the amount of diluent added is not particularly limited, and may be, for example, 100 mL or less, or 50 mL or less per gram of the fermentation composition.
  • the step (2) of incubating the diluted solution obtained in the step (1) at 35 to 50°C is not particularly limited as long as it is a step of incubating the diluted solution at 35 to 50°C.
  • incubating means placing the diluted material under conditions of 35 to 50°C.
  • the JCM5805 strain does not swell or grow significantly, whereas the Thermophilic bacteria do swell and grow, making it significantly easier to visually distinguish between the two bacteria using a microscope.
  • the difference in the degree of swelling or growth between the bacteria in the present invention and the Thermophilic bacteria can be utilized to make it significantly easier to visually distinguish between the two bacteria using a microscope or the like.
  • the incubation temperature is preferably 38 to 50°C, more preferably 38 to 48°C, even more preferably 40 to 46°C, even more preferably 41 to 45°C, even more preferably 42 to 44°C, and most preferably 43°C.
  • the humidity in the atmosphere during incubation is preferably in the range of 85 to 100%, more preferably 90 to 98%, and even more preferably 92 to 97%.
  • the carbon dioxide concentration in the atmosphere during incubation is preferably in the range of 1 to 20%, more preferably 3 to 15%, and even more preferably 5 to 10%.
  • the oxygen concentration in the atmosphere during incubation is preferably in the range of 1 to 30%, more preferably 3 to 25%, and even more preferably 5 to 20%.
  • the incubation time may be, for example, 15 to 120 minutes, preferably 15 to 75 minutes, and more preferably 20 to 75 minutes or 30 to 60 minutes, from the viewpoint of balancing between making it easier to visually distinguish between the bacteria of the present invention, such as JCM5805 bacteria, and thermophilic bacteria and performing measurements in a shorter period of time.
  • the step (3) of measuring the number of bacteria of the component (A) in the diluted solution incubated in the step (2) is not particularly limited as long as it is a step of measuring the number of bacteria of the component (A) in the diluted solution incubated in the step (2).
  • the number of bacteria of the component (A) in the diluted solution incubated in the step (2) may be measured, or the diluted solution may be further diluted with a diluent and then the number of bacteria of the component (A) may be measured.
  • the diluent when a diluent is further used in the step (3), the diluent may be the same as the diluent used in the step (1) or may be a different diluent.
  • An example of such a different diluent is sterilized water containing 1 to 10 v/v % sterilized milk.
  • step (2) As a method for measuring the number of bacteria of component (A) in the diluted solution incubated in step (2) (i.e., the number of bacteria of the present invention, such as the JCM5805 strain), a measurement method using a microscope is preferred, and a direct microscopic examination is more preferred.
  • Measurement methods using a microscope can be performed using known methods.
  • a specific example of a direct microscopy method is preferably the method described in Example 10 below.
  • the number of bacteria measured by the present invention is preferably 1.0 ⁇ 10 6 to 1.0 ⁇ 10 11 , more preferably 1.0 ⁇ 10 8 to 1.0 ⁇ 10 10 , and even more preferably 5.0 ⁇ 10 8 to 5.0 ⁇ 10 9 per gram of fermentation composition.
  • the fermentation composition of the present invention includes: A fermentation composition comprising component (A) a bacterium capable of activating plasmacytoid dendritic cells, and component (B) a bacterium belonging to Streptococcus salivarius subsp. thermophilus, Step (1): adding a diluent to the fermentation composition; and Step (2): Incubating the diluted solution obtained in step (1) at 35 to 50°C; In When incubation is performed at 43° C. for 60 to 120 minutes, the difference in proliferation rate between the component (A) and the component (B) is 0.5 ⁇ 10 9 cells/(g hour) or more. There are no particular limitations as long as it is the fermentation composition.
  • a preferred embodiment of the fermentation composition of the present invention is A fermentation composition comprising component (A) Lactococcus lactis subsp. lactis JCM5805 strain and component (B) Streptococcus salivarius subsp. thermophilus bacteria, Step (1): adding a diluent (preferably a diluent containing a medium in which lactic acid bacteria can grow) to the fermentation composition; and Step (2): Incubating the diluted solution obtained in step (1) at 35 to 50°C; In When incubation is performed at 43° C. for 60 to 120 minutes, the difference in proliferation rate between the component (A) and the component (B) is 0.5 ⁇ 10 9 cells/(g hour) or more. There is no particular limitation as long as it is the fermentation composition.
  • the upper limit of the difference in the growth rate is not particularly limited, but examples thereof include 1 ⁇ 10 10 cells/(g hour) and 7 ⁇ 10 9 cells/(g hour).
  • “g” represents the unit of gram
  • “hour” represents the unit of time.
  • a general method for producing fermented compositions such as fermented milk can be used, except that the bacteria and thermophilic bacteria of the present invention, such as the JCM5805 strain, are used.
  • General methods for producing fermented milk include, for example, a method in which a container is filled with milk raw materials and then fermented with lactic acid bacteria (so-called post-fermentation type), and a method in which the milk raw materials are fermented with lactic acid bacteria, the resulting curd is crushed, and this is filled into a container (so-called pre-fermentation type).
  • the fermentation time can be, for example, 1 to 96 hours, preferably 2 to 72 hours, and more preferably 3 to 48 hours.
  • the extent to which the pH of the fermented composition is fermented varies depending on the type of fermented composition and the product design, and cannot be stated in general terms, but when the fermented composition is fermented milk, it is preferable to ferment until the pH of the fermented milk is, for example, 5 or less, preferably 4.8 to 4.5.
  • the pH of the fermented composition can be measured by a conventional method.
  • the fermented composition of the present invention does not have to be packaged in a container, but is preferably packaged in a container.
  • "Packaged in a container” means that the fermented composition is filled and sealed in a container.
  • Preferred containers include containers that are commonly used in the production of fermented milk and the like, such as plastic, glass, and paper containers.
  • the number of bacteria capable of activating plasmacytoid dendritic cells contained in the fermentation composition of the present invention is preferably 1.0 x 10 to 1.0 x 10, more preferably 1.0 x 10 to 1.0 x 10 , and even more preferably 5.0 x 10 to 5.0 x 10 .
  • sample Fermented milk containing JCM5805 strain and thermophilic bacteria
  • the fermented milk sample was prepared by the following method.
  • milk milk fat content 3% or more by weight, non-fat milk solids content 8% or more by weight
  • cream and skim milk powder
  • live bacteria of Streptococcus salivarius subsp. thermophilus and live bacteria of the JCM5805 strain were prepared.
  • Milk, cream, and skim milk powder were mixed to a milk fat content of 2.5% and non-fat milk solids of 12.0%, dispersed, and homogenized at 15 MPa, then heat-sterilized at 95°C and cooled. Live thermophilic bacteria and live JCM5805 strain bacteria were added to this milk raw material, and fermentation was carried out at 36°C until the pH reached 4.6. The resulting fermented composition was used as the sample. These samples obtained correspond to "fermented milk" as defined in the "Ministry Ordinance on the Compositional Standards of Milk and Dairy Products.”
  • Phosphate buffer pH 7.2: 34.0 g of potassium dihydrogen phosphate (anhydrous) was dissolved in ion-exchanged water, and then about 175 mL of 1 mol/L sodium hydroxide solution was added to adjust the pH to 7.2, 5 g of polysorbate 80 (Tween 80) was added and dissolved, and ion-exchanged water was added to make 1000 mL.
  • the obtained phosphate buffer solution was sterilized by heating at 121° C. for 15 minutes in an autoclave.
  • 1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0) was prepared by dissolving 12.1 g of trishydroxymethylaminomethane (Tris, Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., special grade) in 80 mL of ion-exchanged water, adjusting the pH to 8.0 using 5
  • SCD medium (pH 7.2): Ion-exchanged water was added to 30 g of tryptosoy broth medium (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.) to make up to 1000 mL. The obtained SCD medium was sterilized by heating in an autoclave at 121° C. for 15 minutes.
  • the obtained dilution is a dilution diluted with a diluent so as to contain the specimen at a concentration of 1% w/v.
  • This dilution was used as Test Example 1.
  • the dilution was incubated for a certain period of time (0, 30, 60, and 90 minutes) in a thermostatic water bath heated to 43°C, and then stirred again.
  • 1 mL of the dilution was taken with a micropipette and stirred and dissolved in 9 mL of smear dilution solution to dilute again to obtain a dilution.
  • the obtained dilution is a dilution diluted with a dilution solution so as to contain the specimen at a concentration of 1% w/v.
  • This dilution was used as Test Example 2.
  • the JCM5805 strain did not swell or grow significantly, whereas the thermophilic bacteria did swell and grow.
  • Table 1 shows the diluents used in Test Examples 1 to 3 described above and the incubation times before observation.
  • the slide was stained with Newman's staining solution (manufactured by Sigma-Aldrich Japan LLC) for a few seconds, the excess liquid was gently removed, and it was dried.
  • the slide was immersed in a container filled with water for a few seconds to wash away excess staining solution. This washing operation was performed until it was confirmed that excess staining solution no longer bleeds, and then the slide was dried.
  • the drying process was all performed using a drying device (thermostat or hot plate), and the slide was dried at 40 to 45 °C. At that time, the slide glass was placed in a place in the drying apparatus where the level had been confirmed using a spirit level.
  • the diameter (in the case of a circular field) or the vertical and horizontal dimensions (in the case of a rectangular field) of the field of view of the optical microscope used (product name: NIKON Eclipse Ni-U, manufactured by Nikon Corporation) was measured using an objective micrometer (manufactured by Shibuya Optical Co., Ltd.), and the microscopic field area (mm 2 ) was calculated.
  • the number of bacteria in 16 fields of view in the stained area (1 cm2 100 mm2 ) was measured, and the microscopic field area ( mm2 ) and the average number of bacteria in the 16 fields of view were calculated.
  • the starting point of the measurement was approximately 2 mm inward from the top and left ends of the smear surface, and an inverted S-shaped pattern was used to observe evenly in order to average out any bias in the smear surface (Figure 2).
  • the measurement range of the 16 visual fields was within an area surrounded by approximately 2 mm inward from the edge of the smear surface ( Figure 2).
  • FIG. 3 shows a microscopic image obtained by observing Test Example 1 by the direct microscopic examination method described in 10. above.
  • JCM5805 strain bacteria and Thermophilic bacteria have similar morphology such as size and shape. Therefore, when a fermentation composition contains both JCM5805 strain bacteria and Thermophilic bacteria, it was shown that it is difficult to visually identify each lactic acid bacteria and selectively measure the number of bacteria of one of them by the method described in 4. above using phosphate buffer (pH 7.2).
  • the color of the background image in the image observed by a microscope is darker than the color in Test Examples 2 and 3 described below, so it is more difficult to visually identify the lactic acid bacteria, which reduces the work efficiency in the observation work.
  • a fermentation composition containing bacteria capable of activating plasmacytoid dendritic cells (e.g., lactic acid bacteria such as JCM5805 strain) and thermophilic bacteria, it is possible to provide a method for selectively measuring the number of bacteria capable of activating plasmacytoid dendritic cells (e.g., lactic acid bacteria such as JCM5805 strain) easily and at low cost without requiring skilled techniques, and a fermentation composition suitable for such a method.
  • bacteria capable of activating plasmacytoid dendritic cells e.g., lactic acid bacteria such as JCM5805 strain
  • thermophilic bacteria thermophilic bacteria
  • bacterium capable of activating plasmacytoid dendritic cells is the JCM5805 strain

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Abstract

本発明の課題は、プラズマサイトイド樹状細胞を活性化し得る細菌（例えば、ＪＣＭ５８０５株菌等の乳酸菌）とサーモフィラス菌とを含む発酵組成物において、熟練した技術を必要とせず、低コストで、かつ、簡便に、プラズマサイトイド樹状細胞を活性化し得る細菌（例えば、ＪＣＭ５８０５株菌等の乳酸菌）の菌数を選択的に測定する方法、及び、かかる方法に適した発酵組成物を提供すること等にある。　本発明の好適な態様（プラズマサイトイド樹状細胞を活性化し得る細菌がＪＣＭ５８０５株菌である態様）である場合の課題として、より詳細には、大きさ又は形状等の形態が互いに類似しているＪＣＭ５８０５株菌とサーモフィラス菌とを含む発酵組成物において、熟練した技術を必要とせず、低コストで、かつ、簡便に、ＪＣＭ５８０５株菌の菌数を選択的に測定する方法、及び、かかる方法に適した発酵組成物を提供すること等にある。　本発明は、 成分（Ａ）プラズマサイトイド樹状細胞を活性化し得る細菌（例えば、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスJCM5805株菌）、 及び、 成分（Ｂ）ストレプトコッカス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サーモフィラスに属する細菌 を含む発酵組成物において、 前記成分（Ａ）の菌数を測定する方法であって、 工程（１）：前記発酵組成物に希釈液を添加する工程；及び、 工程（２）：前記工程（１）で得られた希釈物を３５～５０℃でインキュベートする工程； を含む、前記方法等に関する。

Description

ラクトコッカス・ラクティス及びストレプトコッカス・サーモフィラスを含む発酵組成物におけるラクトコッカス・ラクティスの菌数測定方法
　自然免疫系は主として細菌感染またはウイルス感染におけるプライマリーレスポンスを担い、中でも樹状細胞は強力かつ重要な構成細胞である。また、樹状細胞のうち、プラズマサイトイド樹状細胞（形質細胞様樹状細胞、ｐＤＣ：ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌ）は、ウイルスに対して増殖阻害活性を示すＩ型インターフェロン（ｔｙｐｅ　Ｉ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）等の様々なインターフェロン（ＩＦＮ）の主要な産生細胞であり、抗ウイルス生体防御において極めて重要な役割を有する（特許文献１）。
　本発明は、プラズマサイトイド樹状細胞を活性化し得る細菌（好ましくは、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（本明細書において「ラクトコッカス・ラクティス」とも表示する。）ＪＣＭ５８０５株菌（本明細書において、「ＪＣＭ５８０５株菌」とも表示する。））及びストレプトコッカス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サーモフィラス（本明細書において「ストレプトコッカス・サーモフィラス」とも表示する。）に属する細菌（以下、「サーモフィラス菌」とも表示する。）を含む発酵組成物におけるプラズマサイトイド樹状細胞を活性化し得る細菌の菌数測定方法、並びに、プラズマサイトイド樹状細胞を活性化し得る細菌及びサーモフィラス菌を含む発酵組成物等に関する。
　食品には、しばしば乳酸菌等の細菌が含まれる。乳酸菌には多くの種類が存在し、その性質は様々であるが、例えば、プラズマサイトイド樹状細胞を活性化し得る細菌として、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスＪＣＭ５８０５株菌などが知られている（特許文献１）。ここで、当該食品中に含まれる乳酸菌等の、プラズマサイトイド樹状細胞を活性化し得る細菌の細菌数を検出することは、食品における有効性及び安全性等の観点から、重要である。
　細菌数を検出する手段として、例えば、ブリード法（直接個体鏡検法）が知られている（非特許文献１）。ブリード法とは、スライドガラスに食品を塗抹して乾燥させた後、染色液で染色された細菌の数を顕微鏡で測定する方法である。
　ここで、ブリード法には、操作が単純であり、経費が少なくて済む（非特許文献２）という利点があるものの、細菌の形態観察を伴うため、大きさ又は形状等の形態が類似した二種類以上の細菌を含む場合においては、特定の細菌の数を選択的に測定することは難しいという欠点があった。
　一方で、細菌以外に、豆乳成分等の他成分を含む場合において、当該他成分と細菌を判別し、細菌数を計測する方法が報告されている（特許文献２）。特許文献２に係る方法では、当該他成分を分解することにより、細菌のみをフィルタにてろ過抽出して捕集し、細菌数の測定を可能とする。
　しかしながら、特許文献２に係る方法をもってしても、二種類以上の細菌を含む場合において、特定の細菌のみを捕集できるよう、それ以外の菌を選択的に分解又は消滅させることは難しく、二種類以上の細菌を含む場合においては、特定の細菌の数を選択的に測定することは難しいという課題が依然として存在していた。
日畜会報,　５９（４）：３７６－３７８ 日畜会報,　５８（１２）：１０４８－１０５３
国際公開２０１２／０９１０８１パンフレット 特開２００９－２４７３３１号公報
　本発明の課題は、プラズマサイトイド樹状細胞を活性化し得る細菌（例えば、ＪＣＭ５８０５株菌等の乳酸菌）とサーモフィラス菌とを含む発酵組成物において、熟練した技術を必要とせず、低コストで、かつ、簡便に、プラズマサイトイド樹状細胞を活性化し得る細菌（例えば、ＪＣＭ５８０５株菌等の乳酸菌）の菌数を選択的に測定する方法、及び、かかる方法に適した発酵組成物を提供すること等にある。
　本発明の好適な態様（プラズマサイトイド樹状細胞を活性化し得る細菌がＪＣＭ５８０５株菌である態様）である場合の課題として、より詳細には、大きさ又は形状等の形態が互いに類似しているＪＣＭ５８０５株菌とサーモフィラス菌とを含む発酵組成物において、熟練した技術を必要とせず、低コストで、かつ、簡便に、ＪＣＭ５８０５株菌の菌数を選択的に測定する方法、及び、かかる方法に適した発酵組成物を提供すること等にある。
　本発明者らは、本発明の課題を解決すべく、鋭意検討した結果、プラズマサイトイド樹状細胞を活性化し得る細菌（例えば、ＪＣＭ５８０５株菌等の乳酸菌）とサーモフィラス菌とを含む発酵組成物を希釈し、得られた希釈物を３５～５０℃でインキュベートすることにより、プラズマサイトイド樹状細胞を活性化し得る細菌（例えば、ＪＣＭ５８０５株菌等の乳酸菌）と、サーモフィラス菌との間の、肥大化または増殖の程度の差を利用することで、顕微鏡等を用いて両菌を視覚的に区別することが顕著に容易になること等を見いだし、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明によれば以下の発明等が提供される。
〔１〕成分（Ａ）プラズマサイトイド樹状細胞を活性化し得る細菌、及び、
成分（Ｂ）ストレプトコッカス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サーモフィラスに属する細菌
を含む発酵組成物において、
前記成分（Ａ）の菌数を測定する方法であって、
工程（１）：前記発酵組成物に希釈液を添加する工程；
工程（２）：前記工程（１）で得られた希釈物を３５～５０℃のいずれかの温度でインキュベートする工程；及び
工程（３）：前記工程（２）でインキュベートした希釈物中の前記成分（Ａ）の菌数を測定する工程；
を含む、前記方法；
〔２〕成分（Ａ）ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスＪＣＭ５８０５株菌、及び、
成分（Ｂ）ストレプトコッカス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サーモフィラスに属する細菌
を含む発酵組成物において、
前記成分（Ａ）の菌数を測定する方法であって、
工程（１）：前記発酵組成物に希釈液を添加する工程；
工程（２）：前記工程（１）で得られた希釈物を３５～５０℃のいずれかの温度でインキュベートする工程；及び、
工程（３）：前記工程（２）でインキュベートした希釈物中の前記成分（Ａ）の菌数を測定する工程；
を含む、前記方法；
〔３〕前記希釈液が、（i）細菌（例えば乳酸菌）が増殖可能な培地を含む水溶液、（ii）緩衝液、（iii）細菌（例えば乳酸菌）が増殖可能な培地を含む緩衝液、のいずれかである、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法；
〔４〕前記培地が、ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト培地（ＳＣＤ培地）又はＭ１７ブロス培地である、上記〔３〕に記載の方法；
〔５〕前記緩衝液が、トリス塩酸緩衝液である、上記〔３〕に記載の方法；
〔６〕前記希釈物のｐＨが６～９である、上記〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕前記希釈液の添加量が、前記発酵組成物１ｇあたり４ｍＬ以上である、上記〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の方法；
〔８〕前記インキュベートの時間が、１５～７５分間である、上記〔１〕～〔７〕のいずれかに記載の方法；
〔９〕前記発酵組成物中のショ糖の含有量が６質量％以下である、上記〔１〕～〔８〕のいずれかに記載の方法；
〔１０〕前記成分（Ａ）の菌数を測定することが、前記成分（Ａ）の菌数を顕微鏡観察により測定することである、上記〔１〕～〔９〕のいずれかに記載の方法；
〔１１〕前記顕微鏡観察が、直接鏡検法による顕微鏡観察である、上記〔１０〕に記載の方法；
〔１２〕前記成分（Ａ）が、プラズマサイトイド樹状細胞を活性化し得る細菌（例えば、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスＪＣＭ５８０５株菌等の乳酸菌）の生菌及び／又は死菌を含む、上記〔１〕～〔１１〕のいずれかに記載の方法；
〔１３〕前記希釈液が、細菌（例えば乳酸菌）が増殖可能な培地を含有し、かつ、インキュベートが、４３℃で６０～１２０分間である場合において、前記成分（Ａ）と前記成分（Ｂ）との間の増殖率の差が０．５×１０９個／（ｇ・ｈｏｕｒ）以上である、上記〔１〕～〔１２〕のいずれかに記載の方法；
〔１４〕前記成分（Ａ）の菌数の測定が、前記成分（Ａ）と前記成分（Ｂ）との間の肥大化率及び／又は増殖率の違いを利用することによるものである、上記〔１〕～〔１３〕のいずれかに記載の方法；
〔１５〕成分（Ａ）プラズマサイトイド樹状細胞を活性化し得る細菌、及び
成分（Ｂ）ストレプトコッカス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サーモフィラスに属する細菌
を含む発酵組成物であって、
工程（１）：前記発酵組成物に希釈液を添加する工程；及び、
工程（２）：前記工程（１）で得られた希釈物を３５～５０℃でインキュベートする工程；
において、
インキュベートが、４３℃で６０～１２０分間である場合において、前記成分（Ａ）と前記成分（Ｂ）との間の増殖率の差が０．５×１０９個／（ｇ・ｈｏｕｒ）以上である、
前記発酵組成物；
〔１６〕成分（Ａ）ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスＪＣＭ５８０５株菌、及び成分（Ｂ）ストレプトコッカス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サーモフィラスに属する細菌
を含む発酵組成物であって、
工程（１）：前記発酵組成物に希釈液を添加する工程；及び、
工程（２）：前記工程（１）で得られた希釈物を３５～５０℃でインキュベートする工程；
において、
インキュベートが、４３℃で６０～１２０分間である場合において、前記成分（Ａ）と前記成分（Ｂ）との間の増殖率の差が０．５×１０９個／（ｇ・ｈｏｕｒ）以上である、
前記発酵組成物；
　本発明によれば、プラズマサイトイド樹状細胞を活性化し得る細菌（例えば、ＪＣＭ５８０５株菌等の乳酸菌）とサーモフィラス菌とを含む発酵組成物において、熟練した技術を必要とせず、低コストで、かつ、簡便に、プラズマサイトイド樹状細胞を活性化し得る細菌（例えば、ＪＣＭ５８０５株菌等の乳酸菌）の菌数を選択的に測定する方法、及び、かかる方法に適した発酵組成物等を提供することができる。
　より詳細には、本発明の好適な態様（プラズマサイトイド樹状細胞を活性化し得る細菌がＪＣＭ５８０５株菌である態様）によれば、大きさ又は形状等の形態が互いに類似しているＪＣＭ５８０５株菌とサーモフィラス菌とを含む発酵組成物において、熟練した技術を必要とせず、低コストで、かつ、簡便に、ＪＣＭ５８０５株菌の菌数を選択的に測定する方法、及び、かかる方法に適した発酵組成物等を提供することができる。
図１は、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスＪＣＭ５８０５株菌と、該株と同等の株（該株に由来する株及び該株が由来する株）との間の関係を示す図である。 図２は、直接鏡検法における１６視野の取り方を表す図である。 図３は、発酵組成物をリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で希釈した試験例１を、直接鏡検法により観察して得られた顕微鏡画像を表す。 図４は、発酵組成物を０．１Ｍトリス塩酸緩衝液加ＳＣＤ培地（ｐＨ８．０）で希釈した試験例２を、直接鏡検法により観察して得られた顕微鏡画像を表す。 図５は、発酵組成物をＳＣＤ培地（ｐＨ７．２）で希釈した試験例３を、直接鏡検法により観察して得られた顕微鏡画像を表す。
　本発明は、
［１］成分（Ａ）プラズマサイトイド樹状細胞を活性化し得る細菌、及び、
成分（Ｂ）ストレプトコッカス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サーモフィラスに属する細菌
を含む発酵組成物において、
前記成分（Ａ）の菌数を測定する方法であって、
工程（１）：前記発酵組成物に希釈液を添加する工程；
工程（２）：前記工程（１）で得られた希釈物を３５～５０℃のいずれかの温度でインキュベートする工程；及び、
工程（３）：前記工程（２）でインキュベートした希釈物中の前記成分（Ａ）の菌数を測定する工程；
を含む、前記方法（以下、「本発明の測定方法」とも表示する。）；
［２］成分（Ａ）ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスＪＣＭ５８０５株菌、及び、
成分（Ｂ）ストレプトコッカス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サーモフィラスに属する細菌
を含む発酵組成物において、
前記成分（Ａ）の菌数を測定する方法であって、
工程（１）：前記発酵組成物に希釈液を添加する工程；及び、
工程（２）：前記工程（１）で得られた希釈物を３５～５０℃でインキュベートする工程；
を含む、前記方法（以下、「本発明の測定方法の好適な態様」とも表示する。）；
［３］成分（Ａ）プラズマサイトイド樹状細胞を活性化し得る細菌、及び
成分（Ｂ）ストレプトコッカス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サーモフィラスに属する細菌
を含む発酵組成物であって、
工程（１）：前記発酵組成物に希釈液を添加する工程；及び、
工程（２）：前記工程（１）で得られた希釈物を３５～５０℃でインキュベートする工程；
において、
インキュベートが、４３℃で６０～１２０分間である場合において、前記成分（Ａ）と前記成分（Ｂ）との間の増殖率の差が０．５×１０９個／（ｇ・ｈｏｕｒ）以上である、
前記発酵組成物（以下、「本発明の発酵組成物」とも表示する。）；
［４］成分（Ａ）ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスＪＣＭ５８０５株菌、及び
成分（Ｂ）ストレプトコッカス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サーモフィラスに属する細菌
を含む発酵組成物であって、
工程（１）：前記発酵組成物に希釈液を添加する工程；及び、
工程（２）：前記工程（１）で得られた希釈物を３５～５０℃でインキュベートする工程；
において、インキュベートが、４３℃で６０～１２０分間である場合において、前記成分（Ａ）と前記成分（Ｂ）との間の増殖率の差が０．５×１０９個／（ｇ・ｈｏｕｒ）以上である、
前記発酵組成物（以下、「本発明の発酵組成物の好適な態様」とも表示する。）；
などの実施態様を含んでいる。
　本発明における「ｐＤＣを活性化し得る細菌」（以下、「本発明における細菌」とも表示する。）とは、特に限定されず、例えば、ｐＤＣを活性化し得る乳酸菌、酢酸菌、エシェリヒア属菌、バチルス属菌又は藍色細菌などをいう。ここで、細菌は、「生菌体」、「死菌体」、又は、「生菌体及び死菌体の両方」のいずれであってもよいが、本発明の意義をより多く享受する観点から、「生菌体」又は「生菌体及び死菌体の両方」であることが好ましい。
　本発明における「ｐＤＣを活性化し得る細菌」は、ＩＦＮの産生を誘導し得る。ＩＦＮとしては、Ｔｙｐｅ　Ｉ　ＩＦＮ（Ｉ型インターフェロン）、Ｔｙｐｅ　ＩＩ　ＩＦＮ（ＩＩ型インターフェロン）またはＴｙｐｅ　ＩＩＩ　ＩＦＮ（ＩＩＩ型インターフェロン）の少なくとも１以上であることが好ましい。Ｔｙｐｅ　Ｉ　ＩＦＮはウイルス感染に有効とされるサイトカインをいい、例えば、ＩＦＮ－α（例えば、１、２、４、５、６、７、８、１０、１３、１４、１６、１７または２１等のサブタイプを含む）またはＩＦＮ－β等が含まれる。Ｔｙｐｅ　ＩＩ　ＩＦＮにはＩＦＮ－γが含まれ、Ｔｙｐｅ　ＩＩＩ　ＩＦＮにはＩＦＮ－λが含まれる。本発明における「ｐＤＣを活性化し得る細菌」は、少なくともＴｙｐｅ　Ｉ　ＩＦＮの産生誘導活性を有するものが好ましい。
　本発明における「ｐＤＣを活性化し得る細菌」が産生を誘導し得るＩＦＮは、Ｔｙｐｅ　Ｉ　ＩＦＮ、Ｔｙｐｅ　ＩＩ　ＩＦＮまたはＴｙｐｅ　ＩＩＩ　ＩＦＮのいずれかに属するＩＦＮであれば特に限定されないが、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－βおよびＩＦＮ－λからなる群から選択される一種以上であることが好ましく、ＩＦＮの内の少なくとも一種がＩＦＮ－αであることがより好ましく、ＩＦＮの内の少なくとも一種がＩＦＮ－αであり、かつ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－βおよびＩＦＮ－λからなる群から選択される二種以上であることがさらに好ましく、二種以上のＩＦＮの内の少なくとも二種がＩＦＮ－αおよびＩＦＮ－βであることが特に好ましい。
　細菌が、ｐＤＣを活性化し得るか否かは、細菌をｐＤＣに供したときに、ｐＤＣが細菌を貪食するか、細菌を貪食したｐＤＣ表面に細胞突起が出現するか、又は細菌を貪食したｐＤＣがＩＦＮ（Ｔｙｐｅ　Ｉ　ＩＦＮおよび／またはＴｙｐｅ　ＩＩＩ　ＩＦＮ等）を産生するかによって、確認することができる。
　ｐＤＣの貪食又はｐＤＣ表面の細胞突起の出現については、例えば、顕微鏡観察又はフローサイトメトリーなどによる観察によって確認することができ、好ましくは、蛍光色素を修飾した細菌をｐＤＣに供したあとで、当該ｐＤＣを観察することが好ましい。
　ＩＦＮ（Ｔｙｐｅ　Ｉ　ＩＦＮおよび／またはＴｙｐｅ　ＩＩＩ　ＩＦＮ等）の産生については、例えば、細菌をマウス等の哺乳類の骨髄細胞から誘導したｐＤＣの共存下で培養した場合に、培養系内のＩＦＮ－αまたはＩＦＮ－β等のＩＦＮ量または濃度を測定することにより確認できる。
　ＩＦＮ濃度は、具体的には、下記（i）～（iv）の手順で測定することにより確認できる。
（i）赤血球除去したマウス由来骨髄細胞を、下記の組成に調製したＲＰＭＩ培地に１×１０６個／ｍＬとなるように懸濁し、細胞懸濁液を調製する。
＜培地の組成＞
・１０体積％ＦＢＳ
・１００Ｕ／ｍＬ　ペニシリン／ストレプトマイシン
・１ｍＭ　ピルビン酸ナトリウム
・２．５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ
・１質量％ＭＥＭ　ＮＥＡＡ
・５０μＭ　β－メルカプトエタノール
・１００ｎｇ／ｍＬ　Ｆｌｔ－３Ｌ
（ii）調製した細胞懸濁液を１ｍＬずつ播種し、ＣＯ２インキュベータ内で３７℃、５体積％ＣＯ２にて１週間培養してｐＤＣを誘導する。
（iii）誘導されたｐＤＣを含む骨髄細胞を、２×１０５個／ｍＬとなるように懸濁し、２００μＬずつ９６ウェルプレートに播種し、ＰＢＳで１ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調整した乳酸菌懸濁液を２μＬずつ添加する。
（iv）２４時間後に培養上清を回収し、ＩＦＮ－α測定キットを用いてＥＬＩＳＡ法によりＩＦＮ－α濃度を測定する。
　本発明における「ｐＤＣを活性化し得る細菌」は、「終濃度が１０μｇ／ｍＬの該細菌」と、「マウスの骨髄から回収して１００ｎｇ／ｍＬ　Ｆｌｔ３－Ｌを含む細胞培養培地で７日間培養して得られる、ｐＤＣを含む、終濃度が２×１０５個／ｍＬの骨髄細胞」とを２４時間共培養することで３０ｐｇ／ｍＬ（好ましくは５０ｐｇ／ｍＬ、より好ましくは６０ｐｇ／ｍＬ、より好ましくは７０ｐｇ／ｍＬ、８０ｐｇ／ｍＬ、９０ｐｇ／ｍＬ、１００ｐｇ／ｍＬ、１５０ｐｇ／ｍＬ、さらに好ましくは２００ｐｇ／ｍＬ、２１０ｐｇ／ｍＬ、２２０ｐｇ／ｍＬ、２３０ｐｇ／ｍＬ、２４０ｐｇ／ｍＬ、２５０ｐｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは３００ｐｇ／ｍＬ、４００ｐｇ／ｍＬ、５００ｐｇ／ｍＬ、６００ｐｇ／ｍＬ、７００ｐｇ／ｍＬ、特に好ましくは８００ｐｇ／ｍＬ）以上のＩＦＮ－αを産生する指標で表されるものとすることができる。
　本発明の「ｐＤＣを活性化し得る細菌」におけるｐＤＣ活性化としては、ＣＤ８０、ＣＤ８６またはＭＨＣ　ｃｌａｓｓＩＩ等の活性化マーカーの発現を促進し得ることが挙げられる。
　本発明の「ｐＤＣを活性化し得る細菌」としては、「ストレプトコッカス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サーモフィラスに属する細菌」（サーモフィラス菌）以外の細菌であって、ｐＤＣを活性化し得る細菌である限り、特に制限されないが、乳酸菌、酢酸菌、及び、バチルス属菌からなる群から選択される１種又は２種以上の細菌が挙げられる。
　上記の「ｐＤＣを活性化し得る乳酸菌」としては、特に限定されないが、例えば、オエノコッカス（Oenococcus）属菌、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属菌、レンチラクトバチルス（Lentilactobacillus）属菌、ワイセラ（Weissella）属菌、テトラジェノコッカス（Tetragenococcus）属菌、ラクトコッカス（Lactococcus）属菌、ロイコノストック（Leuconostoc）属菌、ペディオコッカス（Pediococcus）属菌、ストレプトコッカス（Streptococcus）属菌、エンテロコッカス（Enterococcus）属菌、ラクトバチルス（Lactobacillus）属菌、及び、ラクチプランチバチルス（Lactiplantibacillus）属菌が挙げられ、オエノコッカス（Oenococcus）属菌、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属菌、レンチラクトバチルス（Lentilactobacillus）属菌、ワイセラ（Weissella）属菌、テトラジェノコッカス（Tetragenococcus）属菌、ラクトコッカス（Lactococcus）属菌、ロイコノストック（Leuconostoc）属菌、ペディオコッカス（Pediococcus）属菌、エンテロコッカス（Enterococcus）属菌、ラクトバチルス（Lactobacillus）属菌、及び、ラクチプランチバチルス（Lactiplantibacillus）属菌が好ましく挙げられる。
　上記のオエノコッカス属菌としては、例えば、オエノコッカス・オエニ（Oenococcus oeni）等が挙げられる。オエノコッカス属菌の具体例としては、オエノコッカス・オエニＪＣＭ６１２５等が挙げられる。
　上記のビフィドバクテリウム属菌としては、例えば、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・ラクティス（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）およびビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス（Bifidobacterium longum subsp. infantis）等が挙げられる。ビフィドバクテリウム属菌の具体例としては、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・ラクティスＪＣＭ１０６０２およびビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＪＣＭ１２２２等が挙げられる。
　上記のレンチラクトバチルス属菌としては、例えば、レンチラクトバチルス・パラケフィリ（Lactiplantibacillus parakefiri）等が挙げられる。レンチラクトバチルス属菌の具体例としては、レンチラクトバチルス・パラケフィリＪＣＭ８５７３等が挙げられる。
　上記のワイセラ属菌としては、例えば、ワイセラ・パラメセンテロイデス（Weissella paramesenteroides）およびワイセラ・ビリデスセンス（Weissella viridescens）等が挙げられる。ワイセラ属菌の具体例としては、ワイセラ・パラメセンテロイデスＪＣＭ９８９０およびワイセラ・ビリデスセンスＪＣＭ１１７４等が挙げられる。
　上記のテトラジェノコッカス属菌としては、例えば、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Tetragenococcus halophilus）等が挙げられる。テトラジェノコッカス属菌の具体例としては、テトラジェノコッカス・ハロフィルスＮＲＩＣ００９８等が挙げられる。
　上記のラクトコッカス属菌としては、例えば、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）、ラクトコッカス・ガルビエアエ（Lactococcus garvieae）、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris）、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ホールドニアエ（Lactococcus lactis subsp. hordniae）およびラクトコッカス・プランタラム（Lactococcus plantarum）等が挙げられる。
　上記のラクトコッカス属菌の具体例としては、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスＪＣＭ５８０５、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスＮＢＲＣ１２００７、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスＮＲＩＣ１１５０、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスＪＣＭ２０１０１、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスＪＣＭ７６３８、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスＡＴＣＣ１１４５４、ラクトコッカス・ガルビエアエＮＢＲＣ１００９３４、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリスＪＣＭ１６１６７、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ホールドニアエＪＣＭ１１８０およびラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ホールドニアエＪＣＭ１１０４０およびラクトコッカス・プランタラムＪＣＭ１１０５６等が挙げられる。
　上記のロイコノストック属菌としては、例えば、ロイコノストック・カーノサム（Leuconostoc carnosum）およびロイコノストック・ラクティス（Leuconostoc lactis）等が挙げられる。ロイコノストック属菌の具体例としては、ロイコノストック・カーノサムＪＣＭ９６９５およびロイコノストック・ラクティスＮＢＲＣ１２４５５等が挙げられる。
　上記のペディオコッカス属菌としては、例えば、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus）、ペディオコッカス・セリコーラ（Pediococcus cellicola）、ペディオコッカス・クラウッセニー（Pediococcus claussenii）、ペディオコッカス・ダムノサス（Pediococcus damnosus）、ペディオコッカス・エタノーリデュランス（Pediococcus ethanolidurans）、ペディオコッカス・イノピナタス（Pediococcus inopinatus）、ペディオコッカス・パルヴルス（Pediococcus parvulus）、ペディオコッカス・スティレッシー（Pediococcus stilesii）等が挙げられる。ペディオコッカス属菌の具体例としては、例えば、ペディオコッカス・アシディラクティシＪＣＭ８７９７、ペディオコッカス・アシディラクティシＫ１５およびペディオコッカス・ダムノサスＪＣＭ５８８６等が挙げられる。
　上記のストレプトコッカス属菌としては、例えば、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）等が挙げられる。
　上記のエンテロコッカス属菌としては、例えば、エンテロコッカス・アルセディニス（Enterococcus alcedinis）等が挙げられる。
　上記のラクトバチルス属菌としては、例えば、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、ラクトバチルス・デルブルエッキ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・フルクティヴォランス（Lactobacillus fructivorans）、ラクトバチルス・ヒルガルディー（Lactobacillus hilgardii）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）およびラクトバチルス・ブルガリクス（Lactobacillus bulgaricus）が挙げられる。
　ラクトバチルス属菌の具体例としては、ラクトバチルス・パラカゼイＫＷ３１１０、ラクトバチルス・パラカゼイＭＣＣ１８４９、ラクトバチルス・ラムノサスＧＧ、ラクトバチルス・ラムノサスＧＧ、ラクトバチルス・ラムノサスＣＲＬ１５０５、ラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５、ラクトバチルス・アシドフィルスＬ－９２、ラクトバチルス・ブルガリクスＯＬＬ１０７３Ｒ－１等が挙げられる。
　上記のラクチプランチバチルス属菌としては、例えば、ラクチプランチバチルス・プランタラム（Lactiplantibacillus plantarum）、ラクチプランチバチルス・ペントーサス（Lactiplantibacillus pentosus）等が挙げられる。ラクチプランチバチルス属菌の具体例としては、ラクチプランチバチルス・プランタラムＬ－１３７、ラクチプランチバチルス ペントーサス　ＯＮＲＩＣｂ０２４０等が挙げられる。なお、ラクチプランチバチルス・プランタラム、ラクチプランチバチルス・ペントーサスはそれぞれ、旧分類では、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ペントーサスに分類されていたものである。
　上記の「ｐＤＣを活性化し得る酢酸菌」としては、特に限定されないが、例えば、グルコンアセトバクター（Gluconacetobacter）属菌、アセトバクター（Acetobacter）属菌、グルコノバクター（Gluconobacter）属菌などが挙げられ、好ましくはグルコンアセトバクター属菌が挙げられ、より好ましくはグルコンアセトバクター・ハンゼニイが挙げられ、さらに好ましくはグルコンアセトバクター・ハンゼニイGK-1が挙げられる。
　上記の「ｐＤＣを活性化し得るバチルス属菌」としては、特に限定されないが、例えば、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）等が挙げられる。バチルス属細菌の具体例としては、例えば、バチルス・コアグランスＳＡＮＫ７０２５８株等が挙げられる。
（ＪＣＭ５８０５株菌）
　本発明の測定方法の好適な態様としては、「ｐＤＣを活性化し得る乳酸菌」として、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスＪＣＭ５８０５株菌を用いる態様が挙げられる。本発明に用いる「ＪＣＭ５８０５株菌」としては、ＪＣＭ５８０５株の菌体である限り、「生菌体」、「死菌体」、又は、「生菌体及び死菌体の両方」のいずれであってもよいが、本発明の意義をより多く享受する観点から、「生菌体」又は「生菌体及び死菌体の両方」であることが好ましい。
　本発明における「ＪＣＭ５８０５株」には、ＪＣＭ５８０５株と同等の菌株も、該菌株に含まれる。ここで、同等の菌株とは、ＪＣＭ５８０５株から由来している菌株（菌株Ａ）、ＪＣＭ５８０５株が由来する菌株（菌株Ｂ）、又は、前述の菌株Ａ若しくは菌株Ｂの子孫菌株をいう。同等の菌株は他の菌株保存機関に保存されている場合もある。図１に、ＪＣＭ５８０５株に由来する菌株、及び、ＪＣＭ５８０５株が由来する菌株を示す。図１に記載のＪＣＭ５８０５株の同等の菌株であっても、本発明における「ＪＣＭ５８０５株」として用いることができる。
　ＪＣＭ５８０５株等の本発明における細菌の菌体の調製方法は特に制限されず、ＪＣＭ５８０５株等の本発明における細菌の生菌体の調製方法としては、例えば、ＪＣＭ５８０５株等の本発明における細菌の生菌体を培養した培地から、ろ過、遠心分離等により菌体を集菌する方法を挙げることができる。また、ＪＣＭ５８０５株等の本発明における細菌の死菌体の調製方法としては、例えば、ＪＣＭ５８０５株等の本発明における細菌の生菌体を培養した培地を殺菌してから、ろ過、遠心分離等により菌体を集菌する方法や、ＪＣＭ５８０５株等の本発明における細菌の生菌体を培養した培地から、ろ過、遠心分離等により菌体を集菌してから、殺菌する方法などを挙げることができ、必要に応じてさらに乾燥処理や破砕処理を行うことができる。
　なお、殺菌の手段は特に制限されず、加熱のみならず、紫外線やγ線照射など、菌を死滅させる常套手段を用いることができる。また、発酵組成物の調製時の殺菌処理にて、発酵組成物中のＪＣＭ５８０５株菌等の本発明における細菌を死滅させてもよい。
（サーモフィラス菌）
　本発明に用いる「ストレプトコッカス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サーモフィラスに属する細菌」（サーモフィラス菌）としては、本発明の意義をより多く享受する観点から、サーモフィラス菌の「生菌体」又は「生菌体及び死菌体の両方」が挙げられ、「生菌体」が好ましく挙げられる。
　サーモフィラス菌の菌体の調製方法は特に制限されず、サーモフィラス菌の生菌体の調製方法としては、例えば、サーモフィラス菌の生菌体を培養した培地から、ろ過、遠心分離等により菌体を集菌する方法を挙げることができる。
　本発明において、本発明の効果を妨げない限りは、ＪＣＭ５８０５株菌等の本発明における細菌とサーモフィラス菌以外のその他の乳酸菌等の細菌もさらに併用してもよいが、本発明の意義をより多く享受する観点から、本発明において、ＪＣＭ５８０５株菌等の本発明における細菌とサーモフィラス菌以外には、その他の乳酸菌等の細菌を用いないことが好ましい。
　本発明に用いる乳酸菌等の本発明における細菌や、サーモフィラス菌は、公知の寄託機関等から入手することができる。上記の乳酸菌株等の細菌株のうち、ＪＣＭ菌株は、理化学研究所・バイオリソースセンター・微生物材料開発室（茨城県つくば市高野台３丁目１番地の１）から、ＮＢＲＣ菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門（千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番８号）から、ＮＲＩＣ菌株は、東京農業大学・菌株保存室（東京都世田谷区桜丘１丁目１番１号）から、ＡＴＣＣ菌株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ　ｔｙｐｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（米国）から、それぞれ入手することができる。
　ＪＣＭ５８０５菌株は上記の通り理化学研究所・バイオリソースセンター・微生物材料開発室から入手することができるが、本発明では理化学研究所・バイオリソースセンター・微生物材料開発室以外の保存機関に保存された、ＪＣＭ５８０５菌株の同一菌株を使用することができる。具体的には、ＪＣＭ５８０５菌株の同一菌株を、独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門（千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番８号）、東京農業大学・菌株保存室（東京都世田谷区桜丘１丁目１番１号）およびＡｍｅｒｉｃａｎ　ｔｙｐｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（米国）等から入手することができる。また、本発明に用いる乳酸菌の生菌として、市販のスターターカルチャーを用いてもよい。
（発酵組成物）
　本明細書における「発酵組成物」とは、製造工程のいずれかに、乳酸菌の生菌で乳原料を発酵させる工程を含むものを意味する。
　本明細書における「発酵組成物」には、例えば、「乳及び乳製品の成分規格等に関する省令」（以下、「乳等省令」という。）で定義される「発酵乳」、「乳製品乳酸菌飲料」、「乳酸菌飲料」、「乳等を主要原料とする食品」等を包含するがこれらに限定されない。例えば、乳等省令で定義される「発酵乳」とは、生乳、牛乳、特別牛乳、生山羊乳、殺菌山羊乳、生めん羊乳、成分調整牛乳、低脂肪牛乳、無脂肪牛乳および加工乳などの乳；や、クリーム、バター、チーズ、練乳などの乳製品；や、乳等を主要原料とする食品；などの乳等を、乳酸菌または酵母で発酵させ、固形状（ハードタイプ）、糊状（ソフトタイプ）または液状（ドリンクタイプ）にしたもの、または、これらを凍結したものをいうが、本明細書における「発酵組成物」は、このような乳等省令で定義される発酵乳に限定されない。また、本明細書における「乳等を主要原料とする食品」には、製造工程のいずれかに、乳酸菌の生菌で乳原料を発酵させる工程を含むものである限り、乳等省令に規定される「乳等を主要原料とする食品」等に限られず、「乳」及び／又は「クリーム、バター、チーズ、練乳、粉乳、発酵乳等の乳製品」を主要原料とする食品も含まれる。かかる「乳等を主要原料とする食品」として、サワークリーム等が挙げられる。
　乳等省令における発酵乳などの定義や成分規格は以下のとおりである。
　乳等省令において、発酵乳とは「乳又はこれと同等以上の無脂乳固形分を含む乳等を乳酸菌又は酵母で発酵させ、糊状又は液状にしたもの又はこれらを凍結したもの」と定義されている。その成分規格は「無脂乳固形分８％以上、乳酸菌数又は酵母数（１ｍＬ当たり）１，０００万以上、大腸菌群陰性」とされている。
　また、乳等省令において、乳製品乳酸菌飲料とは「乳等を乳酸菌又は酵母で発酵させたものを加工し、又は主要原料とした飲料（発酵乳を除く。）」と定義されている。その成分規格は「無脂乳固形分３％以上、乳酸菌数又は酵母数（１ｍＬ当たり）１，０００万以上、大腸菌群陰性」とされている。
　また、乳等省令において、乳等を主要原料とする食品の乳酸菌飲料とは「乳等を乳酸菌又は酵母で発酵させたものを加工し、又は主要原料とした飲料（発酵乳を除く。）」と定義されている。その成分規格は「無脂乳固形分３％未満、乳酸菌数又は酵母数（１ｍＬ当たり）１００万以上、大腸菌群陰性」とされている。
　本発明における「発酵組成物」は、任意成分として、安定剤、甘味料、食物繊維、ビタミン、ミネラル、香料等を含有していてもよい。上記の安定剤としては特に限定されず、例えば、カラギーナン、キサンタンガム等が挙げられる。また、上記の甘味料としては特に限定されず、例えば、糖類、糖アルコール類、高甘味度甘味料等が挙げられ、これらの甘味料を１種又は２種以上組み合わせて用いることができる。
　発酵組成物が甘味料を含有する場合、甘味料の含有濃度は特に制限されないが、顕微鏡観察した際のＪＣＭ５８０５株菌等の本発明における細菌とサーモフィラス菌との識別が難しくなる場合があり、本発明の意義をより多く享受し得る観点から、甘味料（好ましくは糖、さらに好ましくはショ糖）の含有濃度は好ましくは６質量％以下、より好ましくは３質量％以下、さらに好ましくは１質量％以下であることが挙げられる。
　本発明における「発酵組成物」には、無脂乳固形分の濃度が例えば１～１８重量％、好ましくは２～１６重量％、より好ましくは２～１４重量％、さらに好ましくは４～１２重量％、６～１０重量％若しくは７～９重量％であり、及び／又は、乳脂肪分の濃度が例えば０～８重量％、好ましくは０．１～７重量％、より好ましくは０．５～４重量％又は１～３重量％であるものが好適に含まれる。
（ｐＨ）
　本発明における発酵組成物のｐＨとしては、特に制限されないが、例えば６以下、３．５～６などが挙げられる。発酵組成物のｐＨは、公知の方法にしたがって、例えばｐＨメーター（製品名：pHメータ F-52、株式会社堀場製作所製）などを用いて２０℃にて測定することができる。
（乳原料）
　本明細書における「乳原料」には、典型的には、乳等省令に定義される「乳」、すなわち、生乳、牛乳、特別牛乳、生山羊乳、殺菌山羊乳、生めん羊乳、成分調整牛乳、低脂肪牛乳、無脂肪牛乳および加工乳などの乳またはこれと同等以上の無脂乳固形分（すなわち８％以上）を含むものが挙げられるが、乳成分を含む組成物である限り特に制限されない。本明細書における「乳成分」としては、乳等省令に定義される「乳」由来の乳脂肪、及び、該「乳」由来の無脂乳固形分（例えば、該「乳」由来のタンパク質及び／又は該「乳」由来の糖）からなる群から選択される１種又は２種以上が挙げられる。
　本明細書における「乳原料」は、乳、乳製品等を用いて調製することができる。「乳原料」として、乳及び／又は乳製品を用いる場合は、より具体的には、牛乳、水牛乳、羊乳、山羊乳、馬乳、濃縮乳、脱脂乳、脱脂濃縮乳、脱脂粉乳、全脂粉乳、クリーム、バター、バターミルク、練乳、乳糖、乳タンパク質濃縮物、ホエイタンパク質濃縮物、及び、水からなる群から選択される１種又は２種以上を用いて調製することができる。
　本明細書における「乳原料」としては、乳成分の固形分の濃度が例えば１～１８重量％、好ましくは２～１６重量％、より好ましくは４～１２重量％であるものが挙げられ、及び／又は、無脂乳固形分の濃度が例えば１～１８重量％、好ましくは２～１６重量％、より好ましくは２～１４重量％、さらに好ましくは４～１２重量％、６～１０重量％若しくは７～９重量％であるものが挙げられ、及び／又は、乳脂肪分の濃度が例えば０～８重量％、好ましくは０．１～７重量％、より好ましくは０．５～４重量％又は１～３重量％であるものが挙げられる。
（希釈液を添加する工程）
　本発明の測定方法における、前記発酵組成物に希釈液を添加する工程（１）としては、発酵組成物に希釈液を添加する工程である限り特に制限されない。
　本発明における「希釈液」としては、発酵組成物に添加して発酵組成物を希釈することができる液体である限り特に制限されず、水や、水溶液が挙げられ、中でも、水溶液が好ましく挙げられ、中でも、発酵組成物に添加した際に発酵組成物のカードをより溶解し易く、希釈物を顕微鏡観察した場合に視野のバックグラウンド像の色彩がより薄くなる観点から、ｐＨ６～９の水溶液がより好ましく挙げられ、中でも、ｐＨ７～９の水溶液がさらに好ましく挙げられる。
　ｐＨ６～９の水溶液としては、ｐＨ６～９の水溶液である限り特に制限されず、例えば、水酸化ナトリウムやアンモニア等のアルカリ性物質を含む水溶液、有機酸などの酸性物質を含む水溶液、アルカリ性物質と酸性物質を含む水溶液などが挙げられる。
　ｐＨ６～９の水溶液としては、好ましくはｐＨ６～９の緩衝液、より好ましくはｐＨ７～９の緩衝液が挙げられる。ｐＨ６～９の緩衝液や、ｐＨ７～９の緩衝液として、具体的には、トリス緩衝液（好ましくはトリス塩酸緩衝液）、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、クエン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、アセトアミドグリシン緩衝液、ＡＣＥＳ（Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸）緩衝液、ＡＤＡ（Ｎ－（２－アセトアミド）イミノ二酢酸）緩衝液、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸）緩衝液、ビシン（Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン）緩衝液、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ビス（２－ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン）緩衝液、コラミン塩酸緩衝液、ＥＰＰＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンプロパンスルホン酸）緩衝液、グリシンアミド緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４－２－ヒドロキシエチル－１－ピペラジンエタンスルホン酸）緩衝液、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ－（ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝液、ＭＥＳ（２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸）緩衝液、ＭＯＰＳ（３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸）緩衝液、ＭＯＰＳＯ（２－ヒドロキシ－３－モルホリノプロパンスルホン酸）緩衝液、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸））緩衝液、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン－１，４－ビス（２－ヒドロキシプロパンスルホン酸））緩衝液、ＴＡＰＳ（Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－３－アミノプロパンスルホン酸）緩衝液、ＴＡＰＳＯ（３－［Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝液、ＴＥＳ（Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－アミノエタンスルホン酸）緩衝液、トリシン（Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン）緩衝液、ＡＭＰＳＯ（Ｎ－（１，１－ジメチル－２－ヒドロキシエチル）－３－アミノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝液、ＣＡＢＳ（４－（シクロヘキシルアミノ）－１－ブタンスルホン酸）緩衝液、ＣＡＰＳ（Ｎ－シクロヘキシル－３－アミノプロパンスルホン酸）緩衝液、ＣＨＥＳ（Ｎ－シクロヘキシル－２－アミノエタンスルホン酸）緩衝液、ＣＡＰＳＯ（Ｎ－シクロヘキシル－２－ヒドロキシル－３－アミノプロパンスルホン酸）緩衝液、及び、ＤＩＰＳＯ（３－（Ｎ，Ｎ－ビス［２－ヒドロキシエチル］アミノ）－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝液からなる群から選択される１種又は２種以上が挙げられ、トリス緩衝液が好ましく挙げられ、トリス塩酸緩衝液がより好ましく挙げられる。なお、緩衝液としては、サーモフィラス菌の生育を阻害しない観点から、キレート剤の含有量は６質量％以下、より好ましくは３質量％以下、さらに好ましくは１質量％以下、さらにより好ましくは０．５質量％以下であることが好ましく、キレート剤を含まない緩衝液がさらに好ましく挙げられる。キレート剤としては、特に制限されず、例えば、リン酸塩（例えば、リン酸三ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸三カリウム等の正リン酸塩；ピロリン酸四ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、メタリン酸カリウム等の重合リン酸塩）、クエン酸塩（例えば、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム等）、酒石酸塩（例えば、酒石酸ナトリウム、酒石酸カリウム等）、リンゴ酸塩（例えば、リンゴ酸ナトリウム、リンゴ酸カリウム等）及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等が挙げられるが、ＥＤＴＡであることが好ましい。
　ｐＨ６～９の水溶液や、ｐＨ６～９の緩衝液は、市販されている水溶液や緩衝液を用いてもよいし、市販されている試薬を水に溶解して製造してもよい。
　本発明における「希釈液」は、乳酸菌等の本発明における細菌が増殖可能な培地（本明細書において、単に「培地」とも表示する。）を含んでいなくてもよいが、サーモフィラス菌の肥大化や増殖をより促進し、顕微鏡観察した際のＪＣＭ５８０５株菌等の本発明における細菌との識別をより容易にするなどの観点から、培地を含んでいることが好ましく、顕微鏡観察した際のＪＣＭ５８０５株菌等の本発明における細菌との識別をより容易にし、かつ、視野のバックグラウンド像の色彩をより薄くする観点から、希釈液は、培地を含む、ｐＨ６～９（好ましくはｐＨ７～９）の水溶液であることがより好ましく、培地を含む、ｐＨ６～９（好ましくはｐＨ７～９）の緩衝液であることがさらに好ましい。
　希釈液が培地を含む場合、希釈液中の培地成分の濃度は特に制限されないが、希釈液全量に対する、培地成分の乾燥重量の割合で、例えば０．１～１５ｗ／ｖ％、好ましくは０．５～１０ｗ／ｖ％、より好ましくは１～９ｗ／ｖ％、さらに好ましくは２～６ｗ／ｖ％が挙げられる。
　本発明における「培地」としては、適切な条件下で、その培地中で乳酸菌等の本発明における細菌（好ましくは乳酸菌）が増殖可能なものである限り特に制限されず、少なくとも、糖類などの炭素源を含むものが挙げられ、好ましくは、アミノ酸などの窒素源、及び／又は、無機塩を含むものが好ましく挙げられる。かかる培地として、具体的には、ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト培地（ＳＣＤ培地）、Ｍ１７ブロス培地が挙げられ、これらは公知のものを用いることができる。
なお、ＳＣＤ培地及びＭ１７ブロス培地としては、一例として、以下の組成が挙げられる。
＜ＳＣＤ培地１Ｌあたりの組成＞
カゼイン製ペプトン　17.0g
ソイペプトン　3.0g
ブドウ糖　2.5g
リン酸二カリウム　2.5g
塩化ナトリウム　5.0g
水　残量
＜Ｍ１７ブロス培地９５０ｍＬあたりの組成＞
カゼイン製ペプトン　5.0g
ソイペプトン　5.0g
牛肉エキス　5.0g
酵母エキス　2.5g
アスコルビン酸　0.5g
硫酸マグネシウム　0.25g
β-グリセロリン酸二ナトリウム　19.0g
水　残量
　本発明における「希釈液」の好適な実施形態の一つとして、（i）培地を含む水溶液（例えば、培地を含み、かつ、緩衝液ではない、水溶液）、（ii）緩衝液、（iii）乳酸菌等の本発明における細菌（好ましくは乳酸菌）が増殖可能な培地を含む緩衝液からなる群から選択されるものを挙げることができ、中でも、（i）培地を含む水溶液（好ましくはそのｐＨは６～９、より好ましくは７～９）や、（iii）培地を含む緩衝液（好ましくはそのｐＨは６～９、より好ましくは７～９）を好ましく挙げることができ、中でも、（iii）培地を含む緩衝液（好ましくはそのｐＨは６～９、より好ましくは７～９）をより好ましく挙げることができる。
　本発明における「希釈液」の好適な実施形態の一つとして、乳酸菌等の本発明における細菌（好ましくは乳酸菌）が増殖可能な培地を含有し、かつ、インキュベートが、４３℃で６０～１２０分間である場合において、前記成分（Ａ）と前記成分（Ｂ）との間の増殖率の差が０．５×１０９個／（ｇ・ｈｏｕｒ）以上となるような希釈液が挙げられる。かかる希釈液は、サーモフィラス菌の肥大化や増殖をより促進し、顕微鏡観察した際のＪＣＭ５８０５株菌等の本発明における細菌との識別をより容易にするなどの観点から好ましい。
　発酵組成物への希釈液の添加量としては、特に制限されず、発酵組成物１ｇあたり、例えば２ｍＬ以上、好ましくは４ｍＬ以上、より好ましくは７ｍＬ以上、さらに好ましくは９ｍＬ以上が挙げられる。
　希釈液の添加量の上限は特に制限されず、発酵組成物１ｇあたり、例えば１００ｍＬ以下、５０ｍＬ以下が挙げられる。
（インキュベートする工程）
　本発明の測定方法における、前記工程（１）で得られた希釈物を３５～５０℃でインキュベートする工程（２）としては、その希釈物を３５～５０℃でインキュベートする工程である限り特に制限されない。
　本発明における「インキュベートする」とは、希釈物を３５～５０℃の条件下に置くことを意味する。かかるインキュベートする工程において、ＪＣＭ５８０５株菌はそれほど肥大化や増殖しないのに対し、サーモフィラス菌は肥大化や増殖するため、顕微鏡を用いて両菌を視覚的に区別することが顕著に容易になる。また、本発明における細菌として、ＪＣＭ５８０５株菌以外の細菌を用いた場合、本発明における細菌と、サーモフィラス菌との間の、肥大化または増殖の程度の差を利用することで、顕微鏡等を用いて両菌を視覚的に区別することが顕著に容易になる。
　インキュベートするときの温度としては、その温度帯として、好ましくは３８～５０℃、より好ましくは３８～４８℃、さらに好ましくは４０～４６℃、より好ましくは４１～４５℃、さらに好ましくは４２～４４℃、最も好ましくは４３℃が挙げられる。
　インキュベートするときの雰囲気中の湿度としては、その湿度帯として、好ましくは８５～１００％、より好ましくは９０～９８％、さらに好ましくは９２～９７％が挙げられる。
　インキュベートするときの雰囲気中の二酸化炭素濃度としては、その濃度帯として、好ましくは１～２０％、より好ましくは３～１５％、さらに好ましくは５～１０％が挙げられる。
　インキュベートするときの雰囲気中の酸素濃度としては、その濃度帯として、好ましくは１～３０％、より好ましくは３～２５％、さらに好ましくは５～２０％が挙げられる。
　インキュベートする時間としては、ＪＣＭ５８０５菌等の本発明における細菌とサーモフィラス菌とを視覚的により識別しやすくすることと、より短時間で測定することとのバランスの観点から、例えば１５～１２０分間、好ましくは１５～７５分間、より好ましくは２０～７５分間又は３０～６０分間が挙げられる。
（菌数の測定法）
　本発明の測定方法における、前記工程（２）でインキュベートした希釈物中の前記成分（Ａ）の菌数を測定する工程（３）としては、前記工程（２）でインキュベートした希釈物中の前記成分（Ａ）の菌数を測定する工程である限り特に制限されず、前記工程（２）でインキュベートした希釈物中の前記成分（Ａ）の菌数を測定してもよいし、かかる希釈物をさらに希釈液で希釈してから前記成分（Ａ）の菌数を測定してもよい。このように、工程（３）でさらに希釈液を用いる場合、その希釈液は工程（１）で用いた希釈液と同じ希釈液であってもよいし、異なる希釈液であってもよい。かかる異なる希釈液として、例えば、滅菌済みの牛乳を１～１０ｖ／ｖ％含む滅菌水が挙げられる。
　工程（２）でインキュベートした希釈物中の成分（Ａ）の菌数（すなわち、ＪＣＭ５８０５株菌等の本発明における細菌の菌数）を測定する方法としては、顕微鏡観察による測定方法が好ましく挙げられ、直接鏡検法がより好ましく挙げられる。
　直接鏡検法などの、顕微鏡観察による測定方法は、公知の方法を用いることができる。直接鏡検法として具体的には、後述の実施例の１０．に記載の方法を好ましく挙げることができる。
　本発明により測定される菌数は、測定精度の観点から、発酵組成物１ｇあたり、１．０×１０６～１．０×１０１１であることが好ましく、１．０×１０８～１．０×１０１０であることがより好ましく、５．０×１０８～５．０×１０９であることがさらに好ましい。
（本発明の発酵組成物）
　本発明の発酵組成物としては、
成分（Ａ）プラズマサイトイド樹状細胞を活性化し得る細菌、及び
成分（Ｂ）ストレプトコッカス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サーモフィラスに属する細菌
を含む発酵組成物であって、
工程（１）：前記発酵組成物に希釈液を添加する工程；及び、
工程（２）：前記工程（１）で得られた希釈物を３５～５０℃でインキュベートする工程；
において、
インキュベートが、４３℃で６０～１２０分間である場合において、前記成分（Ａ）と前記成分（Ｂ）との間の増殖率の差が０．５×１０９個／（ｇ・ｈｏｕｒ）以上である、
前記発酵組成物である限り特に制限されない。
　また、本発明の発酵組成物の好適な態様としては、
成分（Ａ）ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスＪＣＭ５８０５株菌、及び
成分（Ｂ）ストレプトコッカス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サーモフィラスに属する細菌
を含む発酵組成物であって、
工程（１）：前記発酵組成物に希釈液（好ましくは、乳酸菌が増殖可能な培地を含有する希釈液）を添加する工程；及び、
工程（２）：前記工程（１）で得られた希釈物を３５～５０℃でインキュベートする工程；
において、
インキュベートが、４３℃で６０～１２０分間である場合において、前記成分（Ａ）と前記成分（Ｂ）との間の増殖率の差が０．５×１０９個／（ｇ・ｈｏｕｒ）以上である、
前記発酵組成物である限り特に制限されない。前述の増殖率の差の上限は特に制限されないが、例えば、１×１０１０個／（ｇ・ｈｏｕｒ）や、７×１０９個／（ｇ・ｈｏｕｒ）などが挙げられる。なお、（ｇ・ｈｏｕｒ）における「ｇ」はグラムという単位を、「ｈｏｕｒ」は時間という単位を表す。
　本発明の発酵組成物の製造方法としては、ＪＣＭ５８０５株菌等の本発明における細菌及びサーモフィラス菌を用いること以外は、発酵乳などの発酵組成物の一般的な製造方法を用いることができる。発酵乳の一般的な製造方法としては、例えば、発酵乳の製造方法としては、容器に乳原料を充填してから乳酸菌で発酵させる方法（いわゆる後発酵タイプ）であってもよいし、乳原料を乳酸菌で発酵させ、生じたカードを砕いて、これを容器に充填する方法（いわゆる前発酵タイプ）などを挙げることができる。発酵時間としては、例えば１～９６時間、好ましくは２～７２時間、より好ましくは３～４８時間が挙げられる。発酵組成物ｐＨがどの程度以下になるまで発酵を行うかは、発酵組成物の種類や商品設計等により異なるため一概に述べることはできないが、発酵組成物が発酵乳である場合は、発酵乳のｐＨが例えば５以下、好ましくは４．８～４．５になるまで行うことが好ましい。発酵組成物のｐＨは常法により測定することができる。
　本発明における発酵組成物は、容器詰めされていなくてもよいが、容器詰めされていることが好ましい。「容器詰めされた」とは、発酵組成物が容器内に充填され密封されたことをいう。容器は、発酵乳等の製造において一般的に用いられる容器が好ましく挙げられ、例えば、プラスチック製、ガラス製及び紙製等の容器が挙げられる。
　本発明の発酵組成物中に含まれるプラズマサイトイド樹状細胞を活性化し得る細菌の菌数は、測定精度の観点から、１．０×１０８～１．０×１０１４であることが好ましく、１．０×１０９～１．０×１０１３であることがより好ましく、５．０×１０９～５．０×１０１２であることがさらに好ましい。
　以下に、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
１．検体（ＪＣＭ５８０５株菌及びサーモフィラス菌を含有する発酵乳）の調製
　検体である発酵乳を以下の方法で調製した。
　乳原料として、牛乳（乳脂肪分３重量％以上、無脂乳固形分８重量％以上）及びクリーム、脱脂粉乳を用意した。また、ストレプトコッカス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サーモフィラスの生菌、及び、ＪＣＭ５８０５株菌の生菌を用意した。
　牛乳及びクリーム、脱脂粉乳を、乳脂肪分２．５％、無脂乳固形分１２．０％となるように混合し、分散させて、１５ＭＰａで均質化してから、９５℃で加熱殺菌した後、冷却した。この乳原料に、サーモフィラス菌の生菌、及び、ＪＣＭ５８０５株菌の生菌を添加し、ｐＨが４．６になるまで、３６℃で発酵を行った。得られた発酵組成物を検体とした。なお、得られたこれらの検体は、「乳及び乳製品の成分規格等に関する省令」で定められる「発酵乳」に該当する。
２．希釈液の調製
　検体の希釈に用いる希釈液を３種類調製した。
希釈液（１）リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）：
　３４．０ｇのリン酸二水素カリウム（無水）をイオン交換水に溶解後、１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液を約１７５ｍＬ加えてｐＨ７．２に調整し、５ｇのポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を加えて溶解させ、イオン交換水を加えて１０００ｍＬとした。得られたリン酸緩衝液を、オートクレーブにて１２１℃で１５分間加熱して滅菌した。
希釈液（２）０．１Ｍトリス塩酸緩衝液加ＳＣＤ培地（ｐＨ８．０）：
　まず始めに、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を調製した。具体的には、１２．１ｇのトリスヒドロキシメチルアミノメタン（トリス、富士フィルム和光純薬株式会社製・特級）をイオン交換水８０ｍＬに溶かし、５Ｎまたは１Ｎ希塩酸（富士フィルム和光純薬株式会社製・特級）を用いてｐＨを８．０に調整後、イオン交換水で１００ｍＬとすることによって、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を調製した。
　次に、３０ｇのトリプトソイブイヨン培地（栄研化学株式会社製）に、１００ｍＬの上記１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、さらにイオン交換水を加えて１０００ｍＬとした。得られた０．１Ｍトリス塩酸緩衝液加ＳＣＤ培地を、オートクレーブにて１２１℃で１５分間加熱して滅菌した。
希釈液（３）ＳＣＤ培地（ｐＨ７．２）：
　３０ｇのトリプトソイブイヨン培地（栄研化学株式会社製）にイオン交換水を加えて１０００ｍＬとした。得られたＳＣＤ培地を、オートクレーブにて１２１℃で１５分間加熱して滅菌した。
３．塗抹用希釈液の調製
　牛乳（常温保存可能品）５ｍＬを滅菌水に溶解して１００ｍＬとした。
４．［試験例１］希釈液（１）（リン酸緩衝液：ｐＨ７．２）による検体の希釈
　上記１．の方法で製造した検体をよく撹拌したのち、１．０ｇを秤量した。１．０ｇの検体を、マイクロピペットで採取した９ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に撹拌及び溶解することによって検体を希釈して、希釈物を得た。すなわち、得られた希釈物は、１０％ｗ／ｖの濃度で検体を含むように希釈液で希釈された希釈物である。かかる希釈物を常温（約２０～２５℃）で３０分間静置して、発酵乳の凝固物（カード）を溶解させた後、再度撹拌した。次いで、その希釈物１ｍＬをマイクロピペットで採取して塗抹用希釈液９ｍＬに撹拌及び溶解することによって、再度希釈して希釈物を得た。すなわち、得られた希釈物は、１％ｗ／ｖの濃度で検体を含むように希釈液で希釈された希釈物である。この希釈物を試験例１とした。
５．［試験例２］希釈液（２）０．１Ｍトリス塩酸緩衝液加ＳＣＤ培地（ｐＨ８．０）による検体の希釈
　上記１．の方法で製造した検体をよく撹拌したのち、１．０ｇを秤量した。１．０ｇの検体を、マイクロピペットで採取した９ｍＬの０．１Ｍトリス塩酸緩衝液加ＳＣＤ培地（ｐＨ８．０）に撹拌及び溶解することによって検体を希釈して、希釈物を得た。すなわち、得られた希釈物は、１０％ｗ／ｖの濃度で検体を含むように希釈液で希釈された希釈物である。かかる希釈物を、４３℃に加温した恒温水槽にて、一定時間（０、３０、６０及び９０分間）、インキュベートした後、再度撹拌した。次いで、その希釈物１ｍＬをマイクロピペットで採取して塗抹用希釈液９ｍＬに撹拌及び溶解することによって、再度希釈して希釈物を得た。すなわち、得られた希釈物は、１％ｗ／ｖの濃度で検体を含むように希釈液で希釈された希釈物である。この希釈物を試験例２とした。
　なお、上記インキュベートにおいて、ＪＣＭ５８０５株菌はそれほど肥大化や増殖しないのに対し、サーモフィラス菌は肥大化や増殖する。
６．［試験例３］希釈液（３）ＳＣＤ培地（ｐＨ７．２）による検体の希釈
　０．１Ｍトリス塩酸緩衝液加ＳＣＤ培地（ｐＨ８．０）に代えて、ＳＣＤ培地（ｐＨ７．２）を用いたこと以外は、試験例２の調製法と同じ調製法にて希釈物を得た。この希釈物を試験例３とした。
７．試験例１～３で用いた希釈液と、観察までのインキュベート時間のまとめ
　前述の試験例１～３で用いた希釈液と、観察までのインキュベート時間を表１に記載する。
８．塗抹・乾燥・染色方法
　マイクロピペットで各試験例を正確に０．０１ｍＬ採取し、その全量を誘導板（１ｃｍ２の正方形がついたもの）（株式会社長嶋製作所製）に載せたスライドガラス上にゆっくりと滴下し、その試験例の滴を、塗抹針（有柄針）を用いて１ｃｍ２の面積に均一に広げ、乾燥させた。そのスライドガラスを、９９．５％エタノール（富士フィルム和光純薬株式会社製・特級）に数秒浸漬した後、乾燥させた。次に、そのスライドガラスをニューマン染色液（シグマアルドリッチジャパン合同会社製）で数秒間染色し、余液を静かに落とし、乾燥させた。そのスライドガラスを、水を溜めた容器に数秒間浸漬し、余分な染色液を洗い流した。この洗浄操作を、余分な染色液が滲まなくなったことを確認するまで行った後、スライドガラスを乾燥させた。なお、乾燥作業はすべて乾燥装置（恒温機又はホットプレート）を用いて、スライドガラスを４０～４５℃で乾燥させた。その際、スライドガラスは、乾燥装置のうち、水準器で水平を確認した場所に置いた。
９．顕微鏡視野面積の算出
　使用した光学顕微鏡（製品名：NIKON Eclipse Ni-U、株式会社ニコン製）の視野の直径（円形視野の場合）、もしくは縦横の寸法（四角形視野の場合）を、対物ミクロメーター（株式会社渋谷光学製）を用いて計測し、顕微鏡視野面積（ｍｍ２）を算出した。
１０．直接鏡検法による菌数の測定方法
　光学顕微鏡を用いて、観察を行い、ＪＣＭ５８０５株菌の菌数を測定した。双球菌は２個と測定した。ＪＣＭ５８０５株菌は鏡検でやや色調が薄い小双球菌として確認されるため、ＪＣＭ５８０５株菌の菌数を測定する際は、そのような菌体のみを測定した。なお、試験例２や試験例３において、一定時間以上インキュベートした場合は、後述するように、サーモフィラス菌の肥大化及び増殖が確認されたのに対し、ＪＣＭ５８０５株菌においては肥大化及び増殖のいずれも確認されなかったため、サーモフィラス菌からＪＣＭ５８０５株菌を顕著に容易に識別することが可能となった。
　染色した面積（１ｃｍ２＝１００ｍｍ２）の中の１６視野の菌数を測定し、顕微鏡視野面積（ｍｍ２）と１６視野の平均菌数を算出した。検体希釈倍率（１０倍）、塗抹用希釈倍率（１０倍）、塗抹量（０．０１ｍＬ）を下記の計算式に代入し、検体中のＪＣＭ５８０５菌数（個／ｇ）を算出した。
＜ＪＣＭ５８０５菌数(個/g)の計算式＞
ＪＣＭ５８０５菌数（個／ｇ）＝１６視野の平均菌数×（染色した面積（１００ｍｍ２）／顕微鏡視野面積（ｍｍ２））×検体希釈倍率（１０）×塗抹用希釈倍率（１０）／塗抹量（０．０１ｍＬ）
＜１６視野の取り方＞
　測定の起点は、塗抹面の上端・左端から各々約２ｍｍ内側とし、塗抹面の偏りを平均化するために逆Ｓ字型を用いて満遍なく観察を行った（図２）。１６視野の測定範囲は、塗抹面の端から約２ｍｍ内側で囲まれたエリア内（図２）とした。
１１．試験例１（比較例）についての結果
　試験例１を上記１０．記載の直接鏡検法により観察して得られた顕微鏡画像を図３に示す。ＪＣＭ５８０５株菌及びサーモフィラス菌の両方が映っている図３から分かるように、ＪＣＭ５８０５株菌及びサーモフィラス菌は、大きさ及び形状等の形態が類似している。したがって、発酵組成物がＪＣＭ５８０５株菌及びサーモフィラス菌の両方を含む場合に、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を用いた上記４．に記載の方法で、それぞれの乳酸菌を視覚的に識別し、一方の菌数を選択的に測定することは、難しいことが示された。また、試験例１は顕微鏡観察した場合の画像中のバックグラウンド像の色彩が、後述の試験例２や試験例３におけるその色彩よりも濃いことからも、乳酸菌を視覚的に識別することがより難しく、観察作業における作業効率を低下させることも示された。
１２．試験例２（実施例）についての結果
　試験例２を上記１０．記載の直接鏡検法により観察して得られた顕微鏡画像を図４に示す。図４において、実線の円で囲まれた乳酸菌がＪＣＭ５８０５株菌であり、破線の円で囲まれた乳酸菌がサーモフィラス菌である。
　図４から分かるように、希釈物のインキュベート時間が長くなるにしたがって、サーモフィラス菌の肥大化及び増殖が確認されたのに対し、ＪＣＭ５８０５株菌においては肥大化及び増殖のいずれも確認されなかった。その結果、長年の経験によって熟練した者でなくとも、ＪＣＭ５８０５菌とサーモフィラス菌とを視覚的にきわめて容易に識別することができるようになり、希釈前の発酵組成物中のＪＣＭ５８０５株菌の菌数を、直接鏡検法によって、顕著に容易に測定することができた（表２）。
　また、試験例２の顕微鏡画像（図４）におけるバックグラウンド像の色彩は、試験例１の場合（図３）や後述の試験例３の場合（図５）と比べて薄く、乳酸菌を視覚的に識別することがより容易となり、観察作業における作業効率がさらに向上した。
１３．試験例３（実施例）についての結果
　試験例３を上記１０．記載の直接鏡検法により観察して得られた顕微鏡画像を図５に示す。図５において、実線の円で囲まれた乳酸菌がＪＣＭ５８０５株菌であり、破線の円で囲まれた乳酸菌がサーモフィラス菌である。
　図５から分かるように、希釈物のインキュベート時間が長くなるにしたがって、サーモフィラス菌の肥大化及び増殖が確認されたのに対し、ＪＣＭ５８０５株菌においては肥大化及び増殖のいずれも確認されなかった。その結果、長年の経験によって熟練した者でなくとも、ＪＣＭ５８０５菌とサーモフィラス菌とを視覚的にきわめて容易に識別することができるようになり、希釈前の発酵組成物中のＪＣＭ５８０５株菌の菌数を、直接鏡検法によって、顕著に容易に測定することができることが示された（表３）。
　また、試験例３の顕微鏡画像（図５）におけるバックグラウンド像の色彩は、試験例２の場合（図４）と比べるとやや濃いものの、試験例１の場合（図３）と比べて薄く、乳酸菌を視覚的に識別することがより容易となり、観察作業における作業効率が向上した。
　本発明によれば、プラズマサイトイド樹状細胞を活性化し得る細菌（例えば、ＪＣＭ５８０５株菌等の乳酸菌）とサーモフィラス菌とを含む発酵組成物において、熟練した技術を必要とせず、低コストで、かつ、簡便に、プラズマサイトイド樹状細胞を活性化し得る細菌（例えば、ＪＣＭ５８０５株菌等の乳酸菌）の菌数を選択的に測定する方法、及び、かかる方法に適した発酵組成物等を提供することができる。
　より詳細には、本発明の好適な態様（プラズマサイトイド樹状細胞を活性化し得る細菌がＪＣＭ５８０５株菌である態様）によれば、大きさ又は形状等の形態が互いに類似しているＪＣＭ５８０５株菌とサーモフィラス菌とを含む発酵組成物において、熟練した技術を必要とせず、低コストで、かつ、簡便に、ＪＣＭ５８０５株菌の菌数を選択的に測定する方法、及び、かかる方法に適した発酵組成物を提供すること等を提供することができる。

Claims (16)

  1. 成分（Ａ）プラズマサイトイド樹状細胞を活性化し得る細菌、及び、
    成分（Ｂ）ストレプトコッカス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サーモフィラスに属する細菌
    を含む発酵組成物において、
    前記成分（Ａ）の菌数を測定する方法であって、
    工程（１）：前記発酵組成物に希釈液を添加する工程；
    工程（２）：前記工程（１）で得られた希釈物を３５～５０℃のいずれかの温度でインキュベートする工程；及び
    工程（３）：前記工程（２）でインキュベートした希釈物中の前記成分（Ａ）の菌数を測定する工程；
    を含む、前記方法。
  2. 成分（Ａ）の細菌が、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスＪＣＭ５８０５株菌である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記希釈液が、（i）細菌が増殖可能な培地を含む水溶液、（ii）緩衝液、（iii）細菌が増殖可能な培地を含む緩衝液、のいずれかである、請求項１に記載の方法。
  4. 前記培地が、ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト培地（ＳＣＤ培地）又はＭ１７ブロス培地である、請求項３に記載の方法。
  5. 前記緩衝液が、トリス塩酸緩衝液である、請求項３に記載の方法。
  6. 前記希釈物のｐＨが６～９である、請求項１に記載の方法。
  7. 前記希釈液の添加量が、前記発酵組成物１ｇあたり４ｍＬ以上である、請求項１に記載の方法。
  8. 前記インキュベートの時間が、１５～７５分間である、請求項１に記載の方法。
  9. 前記発酵組成物中のショ糖の含有量が６質量％以下である、請求項１に記載の方法。
  10. 前記成分（Ａ）の菌数を測定することが、前記成分（Ａ）の菌数を顕微鏡観察により測定することである、請求項１に記載の方法。
  11. 前記顕微鏡観察が、直接鏡検法による顕微鏡観察である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記成分（Ａ）が、プラズマサイトイド樹状細胞を活性化し得る細菌の生菌及び／又は死菌を含む、請求項１に記載の方法。
  13. 前記希釈液が、細菌が増殖可能な培地を含有し、かつ、インキュベートが、４３℃で６０～１２０分間である場合において、前記成分（Ａ）と前記成分（Ｂ）との間の増殖率の差が０．５×１０９個／（ｇ・ｈｏｕｒ）以上である、請求項１に記載の方法。
  14. 前記成分（Ａ）の菌数の測定が、前記成分（Ａ）と前記成分（Ｂ）との間の肥大化率及び／又は増殖率の違いを利用することによるものである、請求項１に記載の方法。
  15. 成分（Ａ）プラズマサイトイド樹状細胞を活性化し得る細菌、及び
    成分（Ｂ）ストレプトコッカス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サーモフィラスに属する細菌
    を含む発酵組成物であって、
    工程（１）：前記発酵組成物に希釈液を添加する工程；及び、
    工程（２）：前記工程（１）で得られた希釈物を３５～５０℃でインキュベートする工程；
    において、
    インキュベートが、４３℃で６０～１２０分間である場合において、前記成分（Ａ）と前記成分（Ｂ）との間の増殖率の差が０．５×１０９個／（ｇ・ｈｏｕｒ）以上である、
    前記発酵組成物。
  16. 成分（Ａ）の細菌が、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスＪＣＭ５８０５株菌である、請求項１５に記載の発酵組成物。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101948904A (zh) * 2010-09-21 2011-01-19 烟台喜旺科技发展有限公司 一种耐热菌复合培养基及耐热菌的检测方法
JP2016005452A (ja) * 2014-05-30 2016-01-14 キリン株式会社 乳酸菌免疫賦活作用増強組成物及び乳酸菌免疫賦活作用増強方法
JP2017006097A (ja) * 2015-06-26 2017-01-12 雪印メグミルク株式会社 発酵物の製造方法
JP2017085975A (ja) * 2015-11-10 2017-05-25 キリン株式会社 乳酸菌の免疫賦活作用を増強する方法
CN106906304A (zh) * 2017-04-27 2017-06-30 光明乳业股份有限公司 一种乳制品中耐热菌的检测方法
JP2022136018A (ja) * 2021-03-04 2022-09-15 小岩井乳業株式会社 保形性が改善された発酵組成物、及びその製造方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101948904A (zh) * 2010-09-21 2011-01-19 烟台喜旺科技发展有限公司 一种耐热菌复合培养基及耐热菌的检测方法
JP2016005452A (ja) * 2014-05-30 2016-01-14 キリン株式会社 乳酸菌免疫賦活作用増強組成物及び乳酸菌免疫賦活作用増強方法
JP2017006097A (ja) * 2015-06-26 2017-01-12 雪印メグミルク株式会社 発酵物の製造方法
JP2017085975A (ja) * 2015-11-10 2017-05-25 キリン株式会社 乳酸菌の免疫賦活作用を増強する方法
CN106906304A (zh) * 2017-04-27 2017-06-30 光明乳业股份有限公司 一种乳制品中耐热菌的检测方法
JP2022136018A (ja) * 2021-03-04 2022-09-15 小岩井乳業株式会社 保形性が改善された発酵組成物、及びその製造方法

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