CN105349614A - 植物乳杆菌特异性培养基及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物乳杆菌特异性培养基，该培养基配置方便，成本低，培养基中含有林可霉素和碳源等物质，林可霉素和碳源配合使用后，该培养基可对发酵乳、乳酸菌饮料或菌粉中植物乳杆菌进行培养和特异性的计数；本发明还提供了利用上述的植物乳杆菌特异性培养基的一种应用，它用于对植物乳杆菌进行活菌计数，是将菌种在所述培养基上进行培养后，再对培养后的菌株进行平板计数，该计数方法简单，特异性高，相对于PCR的计数方法来说，对操作人员的要求降低，成本降低。本发明适用于配置能对植物乳杆菌活菌数进行特异性计数的培养基。
Description
技术领域
本发明属于领域微生物检测领域，涉及一种培养基及其对菌株进行活菌计数的方法，具体地说是一种植物乳杆菌特异性培养基及其应用。
背景技术
植物乳杆菌是乳酸杆菌中的一种，常存在于发酵的蔬菜和果汁中，多数是从植物中分离得到，因此命名为植物乳杆菌。根据我国《可用于食品的菌种名单》，植物乳杆菌是可用于食品的益生菌菌种之一，能够良好地耐受人体的胃酸和胆汁，发挥调节肠道菌群平衡的作用。
研究表明，植物乳杆菌具有增强机体免疫力、降低胆固醇、预防心血管疾病、调节肠道菌群等益生保健功能。因此，植物乳杆菌已经被广泛的应用于食品中，特别是在酸奶（乳饮料）、发酵香肠、面包和泡菜等食品中添加一定数量的植物乳杆菌，以使其对人体发挥有益作用。为此，需要在成品（特别是酸奶、乳饮料）中检测植物乳杆菌的数量。
我国国标中未规定植物乳杆菌的检测和计数方法，目前，对植物乳杆菌的鉴定或定量检测方法主要为分子生物学的PCR或荧光定量PCR方法，如申请号为201210594264.5名称为“一种植物乳杆菌定量检测方法及其检测组分盒和应用”的中国发明专利申请，公开了对植物乳杆菌进行定量检测的方法，是一种PCR检测技术，具体是提取待检样品总RNA反转录为cDNA，采用特异性引物进行荧光定量PCR，通过比较待检样品的Ct值和定量外标准品的标准曲线测定其中植物乳杆菌数量，该方法虽然出具结果较快，缺点是该方法需要精密的仪器、昂贵的组分和高要求的操作人员。
发明内容
本发明要解决的技术问题，是提供一种植物乳杆菌特异性培养基，它含有林可霉素和碳源等物质，能够对发酵乳、乳酸菌饮料或菌粉中植物乳杆菌进行培养和特异性的计数；
本发明还提供了利用上述植物乳杆菌特异性培养基的一种应用，用于对植物乳杆菌进行活菌计数，计数方法简单，特异性高，相对于PCR的计数方法来说，对操作人员的要求降低，成本降低。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
一种植物乳杆菌特异性培养基，按照重量份数计包含如下成分：
蛋白胨5-15份；
牛肉膏5-15份；
酵母浸粉2-10份；
碳源10-30份；
林可霉素0.03×10-3-30×10-3份
乙酸钠3-10份；
柠檬酸二胺1-5份；
吐温-800.5-2份；
K2HPO41-3份；
MgSO4·7H2O0.02-0.07份；
MnSO4·7H200.1-0.3份；
琼脂10-20份；
蒸馏水1000份。
作为限定：
所述碳源为山梨醇或甘露醇；
所述林可霉素的添加量为0.3×10-3-30×10-3重量份；
所述培养基于115-122℃下灭菌15-20min，培养基的pH为6.2-6.4。
本发明还提供了前述植物乳杆菌特异性培养基的一种应用，它用于对植物乳杆菌进行活菌计数，是将菌种在所述培养基上进行培养后，再对培养后的菌株进行平板计数。
作为限定，培养温度为35-37℃培养时间为46-50h。
由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
本发明提供了一种植物乳杆菌特异性培养基，具有配置方便，成本低的特点，它含有林可霉素和特定碳源等物质，林可霉素和特定碳源配合使用后，该培养基可对发酵乳、乳酸菌饮料或菌粉中植物乳杆菌进行培养和特异性的计数；
本发明还提供了该植物乳杆菌特异性培养基的一种应用，用于对植物乳杆菌进行活菌计数，计数方法简单，特异性高，相对于PCR的计数方法来说，对操作人员的要求降低，成本降低。
本发明适用于配置能对植物乳杆菌活菌数进行特异性计数的培养基，该培养基进一步对添加有植物乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌中的一种或几种菌种的饮料或奶制品中的植物乳杆菌活菌数进行特异性检测。
具体实施方式
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、组分等，如无特殊说明，均可从商业渠道得到。
实施例1-6一种植物乳杆菌特异性培养基
实施例1-6分别为一种植物乳杆菌特异性培养基，各自的组分和含量如表1所示，各自的制备条件如表2所示。
表1植物乳杆菌特异性培养基中所含的组分及其含量
表2植物乳杆菌特异性培养基的制备条件
上述实施例1-6中所提供的植物乳杆菌特异性培养基在培养基配制的过程中，除林可霉素外的其它组分一起加入，在使用培养基时，先将培养基融化，待温度降至37-50℃时，再添加林可霉素。
上述植物乳杆菌特异性培养基配置方便，成本低，培养基中含有林可霉素和碳源等物质，通过林可霉素和碳源配合使用，可对发酵乳、乳酸菌饮料或菌粉中植物乳杆菌进行培养和特异性的计数。
实施例7一种对植物乳杆菌进行活菌计数的方法
实施例7是提供实施例1-6所提供植物乳杆菌特异性培养基的应用，也就是将不同菌种（包含植物乳杆菌）分别在实施例1-6分别为所提供的植物乳杆菌特异性培养基上进行培养，对培养后的菌株进行平板计数。
检测样品为含有保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、乳双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌的酸奶、乳酸菌饮料，具体的实验步骤如下：
（1）样品稀释
液体样品：液体样品摇匀用无菌吸管吸取样品25ml，置于225ml生理盐水中混匀，制成1：10的样品稀释液；
（2）取上述1:10的样品稀释液（样品匀液）1ml，注入9ml生理盐水中，充分混匀，依次逐级稀释至合适浓度；
（3）吸取上述不同浓度的样品0.1ml置于已凝固的平皿中，用涂布棒进行涂布。至36℃培养箱中培养48h，计数平板上的所有菌落。
本实施例所提供的计数方法简单，相对于PCR的计数方法来说，对操作人员的要求降低，成本降低。
实施例8-10对植物乳杆菌进行活菌计数的方法
实施例8-10所提供的对植物乳杆菌进行活菌计数的方法与实施例7相同，不同之处仅在于步骤（3）中培养箱中培养的温度和时间均与实施例７不同，具体是：
实施例8培养的温度为37℃，培养时间为46h；
实施例9培养的温度为35℃，培养时间为50h；
实施例10培养的温度为36℃，培养时间为49h。
实施例8-10所提供的计数方法简单，相对于PCR的计数方法来说，对操作人员的要求降低，成本降低。
实施例8-10中不同菌种计数的结果如表3所示。
表3不同菌种的计数结果
注：B：保加利亚乳杆菌，S：嗜热链球菌，G：干酪乳杆菌，Z：植物乳杆菌，SQ：乳双歧杆菌，SS：嗜酸乳杆菌，SL：鼠李糖乳杆菌。
由表3可知，本发明所提供的植物乳杆菌特异性培养基可以对植物乳杆菌进行培养和特异性的计数，计数过程简单，结果精确。
实施例11不同菌株对不同糖利用实验探究
发酵乳中添加的菌株主要有保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、乳双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌中的一种或几种，本实施例对发酵乳中的不同菌种对不同糖利用进行实验，比较不同菌中糖发酵特性，其中，菌种的糖利用实验过程均为现有技术，比较结果如表4。
表4不同菌株的糖利用结果
注：+：阳性反应；-：阴性反应；d：某些菌株阳性。
从上表可以看出，本实验中未发现只有植物乳杆菌利用而其他菌株均不利用的糖，发现6种菌中植物乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌同时利用的糖有山梨醇、甘露醇、核糖；植物乳杆菌（某些菌株）、鼠李糖乳杆菌（某些菌株）、乳双歧杆菌同时利用的糖有阿拉伯糖；除保加利亚乳杆菌外其余菌株均可以利用纤维二糖和果糖。
实施例12不同菌株对不同抗生素敏感性实验探究
本实施例在实施例11的基础上对干酪乳杆菌、植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌进行抗生素敏感性实验，实验的过程为现有技术，具体实验结果如表5所示。
表5不同菌株、不同抗生素敏感性试验结果
注：S：敏感；R：抗性
从上表可以看出，通过对上述33种抗生素的筛选，发现植物乳杆菌只对一种抗生素不敏感，即林可霉素，而干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌对其敏感。因此，选择林可霉素作为植物乳杆菌特异性培养基筛选因子之一。
实施例13培养基组分中碳源和抗生素的筛选实验
本实施例对不同的培养基进行了筛选实验，其中，选取了四种培养基进行实验，具体为MRS培养基、山梨醇-MRS培养基、林可霉素-MRS培养基和山梨醇-林可霉素-MRS培养基。上述培养基的组分含量如表6-表9所示，这4种培养基pH为6.2，均于121℃下灭菌15min，其中，林可霉素-MRS培养基和山梨醇-林可霉素-MRS培养基使用时先将培养基融化，待温度降至37-50℃时,每1000g培养基中添加3mg林可霉素。
表6为MRS培养基配方
表7山梨醇-MRS培养基配方
表8林可霉素-MRS培养基配方
表9山梨醇-林可霉素-MRS培养基配方
利用上述的4种培养基对检测样品中的菌种进行计数，检测样品为含有保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、乳双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌的酸奶、乳酸菌饮料，计数过程与实施例1相同，计数的单位是cfu/ml，结果如表10所示。
表10不同培养基不同菌株计数结果
注：B：保加利亚乳杆菌，S：嗜热链球菌，G：干酪乳杆菌，Z：植物乳杆菌，SQ：乳双歧杆菌，SS：嗜酸乳杆菌，SL：鼠李糖乳杆菌；
S-MRS培养基：将葡萄糖等量替换为山梨醇的MRS培养基；
L-MRS培养基：每100g培养基中添加0.3mg林可霉素的MRS培养基；S-L-MRS培养基：将葡萄糖等量替代为山梨醇，使用时每100g培养基中添加0.3mg林可霉素；
从上表可以看出，含有山梨醇的MRS培养基可以抑制保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、乳双歧杆菌、嗜酸乳杆菌的生长，但对干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌无抑制作用；MRS和S-MRS培养基在计数植物乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌时不存在差异性；添加有林可霉素的MRS培养基抑制了干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌的生长，对保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌也有抑制作用，但抑制作用效果达不到植物乳杆菌活菌计数要求；含有林可霉素-山梨醇的MRS培养基中，保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳双歧杆菌生长均受到抑制，与MRS培养基相比，植物乳杆菌不存在差异性。
实施例14不同菌种在含有不同浓度林可霉素的培养基培养的计数实验
表7为山梨醇-MRS培养基所含组分及含量，将该培养基调节pH为6.2，于121℃下灭菌15min。
按照上述条件配置五个相同的培养基，分别在这五个培养基中按照1000g培养基加入0.3mg、3mg和30mg林可霉素，分别记为：1-S-L-MRS、2-S-L-MRS、3-S-L-MRS、培养基。
将含有保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、乳双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌的样品（可以为酸奶、乳酸菌饮料）按实施例7中的所示的检测步骤对其进行检测计数，计数单位是cfu/ml，实验结果如表11所示。
表11不同浓度林可霉素培养基不同菌株计数结果
注：B：保加利亚乳杆菌，S：嗜热链球菌，G：干酪乳杆菌，Z：植物乳杆菌；SQ：乳双歧乳杆菌，SS：嗜酸乳杆菌，SL：鼠李糖乳杆菌；
从上表可以看出，向每1000g山梨醇-MRS培养基中分别添加0.3mg、3mg和30mg林可霉素后，对干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌均具有很好的抑制作用，并且与不添加林可霉素的培养基相比，植物乳杆菌计数不存在差异性。
实施例1-10，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明所作的其它形式的限定，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述技术内容作为启示加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但凡是未脱离本发明权利要求的技术实质，对以上实施例所作出的简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明权利要求保护的范围。
Claims (6)
1.一种植物乳杆菌特异性培养基，其特征在于按照重量份数计包含如下成分：
蛋白胨5-15份；
牛肉膏5-15份；
酵母浸粉2-10份；
碳源10-30份；
林可霉素0.03×10-3-30×10-3份
乙酸钠3-10份；
柠檬酸二胺1-5份；
吐温-800.5-2份；
K2HPO41-3份；
MgSO4·7H2O0.02-0.07份；
MnSO4·7H200.1-0.3份；
琼脂10-20份；
蒸馏水1000份。
2.根据权利要求1所述的植物乳杆菌特异性培养基，其特征在于：所述碳源为山梨醇或甘露醇。
3.根据权利要求1所述的植物乳杆菌特异性培养基，其特征在于：所述林可霉素的添加量为0.3×10-3-30×10-3重量份。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的植物乳杆菌特异性培养基，其特征在于：所述培养基于115-122℃下灭菌15-20min，培养基的pH为6.2-6.4。
5.权利要求1-4中任意一项所述的植物乳杆菌特异性培养基的一种应用，其特征在于：它用于对植物乳杆菌进行活菌计数，是将菌种在所述培养基上进行培养后，再对培养后的菌株进行平板计数。
6.根据权利要求５所述的植物乳杆菌特异性培养基的应用，其特征在于：培养温度为35-37℃，培养时间为46-50h。
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