CN106222240A - 发酵乳杆菌特异性培养基及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种发酵乳杆菌特异性培养基，它含有蛋白胨、酵母粉、吐温80、磷酸氢二钾、乙酸钠、柠檬酸三铵、硫酸镁、硫酸锰、碳源、新霉素、琼脂和蒸馏水等组分，该培养基配制方便、成本低廉，多种碳源和新霉素的配伍合理，该培养基能够培养发酵乳杆菌并对其进行特异性计数；本发明还公开了上述发酵乳杆菌特异性培养基的一种应用，用于对发酵乳杆菌进行活菌计数，计数方法简单，特异性高，相对于其它方法来说，操作简便、成本低廉。本发明适用于配制能对发酵乳杆菌活菌数进行特异性计数的培养基。
Description
技术领域
本发明属于微生物检测领域领域，涉及一种培养基，具体地说是一种发酵乳杆菌特异性培养基及其应用。
背景技术
发酵乳杆菌CECT5716(Lactobacillus fermentum) 属于乳杆菌属，该菌种已列入欧盟安全资格认定（QPS）推荐的生物制剂列表中，并列入国际乳业联盟（IDF）“具有在食品中安全使用记录史的微生物清单”。2011年发酵乳杆菌列入我国《可用于食品的菌种名单》。发酵乳杆菌CECT5716分离自健康母乳，经接种、发酵培养、浓缩、冷冻干燥制得。
研究表明，发酵乳杆菌作为益生菌，能够耐受动物肠道低酸、高胆盐环境，在胃肠道环境中适应能力强。发酵乳杆菌的抑菌能力强，对单增李斯特菌、大肠杆菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌等都表现出很强的抑菌作用，同时能降解胆固醇，起到免疫调节、抗氧化的作用。为此，需要在乳制品中检测发酵乳杆菌的数量。
我国国家标准、地方标准、行业标准中均未规定发酵乳杆菌的检测和计数方法，目前，对发酵乳杆菌的定性和定量检测方法主要为分子生物学的PCR、荧光定量PCR或者培养基平板计数检测方法。申请号为200910177905.5、名称为“益生菌乳制品中发酵乳杆菌的快速定性、定量测定方法”的中国发明专利申请，公开了一种对发酵乳杆菌定量检测方法，该方法通过设计发酵乳杆菌的 16S rRNA 基因序列的种属特异性引物，应用此引物进行种属特异性 PCR 和实时荧光定量 PCR反应，通过琼脂糖凝胶电泳图谱分析和实时荧光定量PCR 图谱分析，建立益生菌乳制品中发酵乳杆菌的简便、快速、准确的定性和定量测定方法。该方法能够快速出具结果，但对人员、仪器要求高，难以实施。
在培养基上通过培养不同的菌种进行平板计数检测，这在操作上和检测手段上比分子生物学的PCR或荧光定量PCR简便许多。然而，由于所需要检测的菌种不同，所针对的培养基则大不相同，因此，研究者对不同的菌种进行平板计数时，培养基成为了技术成功与否的关键。例如，植物乳杆菌与发酵乳杆菌，虽然都属于益生菌，但二者之间也有一些差别，如糖利用情况不同，对不同抗生素的敏感性也不一致，因此，对于二者的培养基来说更是有较大的区别。
发明内容
本发明要解决的技术问题，是提供一种发酵乳杆菌特异性培养基，它含有多种碳源、新霉素等物质，能够培养发酵乳杆菌并对其进行特异性计数；
本发明的另外一个目的，是提供了上述发酵乳杆菌特异性培养基的一种应用，用于对发酵乳杆菌进行活菌计数，计数方法简单，特异性高，相对于其它方法来说，操作简便、成本低廉。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
一种发酵乳杆菌特异性培养基，其特征在于按照重量份数计包含如下成分：
蛋白胨 8.0-15.0份，
酵母粉 2.0-6.0份，
牛肉膏 8.0-15.0份，
吐温80 1.0-1.5份，
磷酸氢二钾 1.0-2.0份，
乙酸钠 4.0-6.0 份，
柠檬酸三铵 2.0-4.0 份，
硫酸镁 0.2-0.4 份，
硫酸锰 0.05-0.20份，
碳源 15-30份，
新霉素 5×10-3-10×10-3份，
琼脂 15.0-20.0份，
蒸馏水 1000份。
作为本发明的限定，
所述碳源为按重量比1:1:1混合的氨基葡萄糖盐酸盐、蜜二糖和棉籽糖；
所述新霉素的添加量为6×10-3-9×10-3重量份；
所述培养基于118-125℃下灭菌15-20min，培养基的PH为6.0-6.2。
本发明还提供了发酵乳杆菌特异性培养基的一种应用，它用于对发酵乳杆菌进行计数，是将菌种于所述培养基上进行培养后，再对培养后的菌株进行平板计数。
作为本发明的限定，培养温度为34-36℃，培养时间为46-50h。
由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
本发明提供的发酵乳杆菌特异性培养基，具有配制方便、成本低廉、操作简便的优点，该培养基包含多种碳源和新霉素，多种碳源与新霉素的配伍可对发酵乳杆菌进行培养和特异性计数；
本发明提供的发酵乳杆菌特异性培养基的应用，技术方法简单，特异性高，相对于其它检测方法来说，对操作人员要求降低，检测成本降低。
本发明适用于配制能对发酵乳杆菌的活菌进行特异性计数的培养基，该培养基进一步对添加有发酵乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、罗伊氏乳杆菌等菌种中的一种或几种菌种的乳制品中的发酵乳杆菌活菌数进行特异性检测。
本发明下面将结合具体实施例作进一步详细说明。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、组分等，如无特殊说明，均可从商业渠道购买。
具体实施方式
实施例1-6 发酵乳杆菌特异性培养基
实施例1-6分别为一种发酵乳杆菌特异性培养基，各自的组分和含量如表1所示，各自的制备条件如表2所示。
表1 发酵乳杆菌特异性培养基中所含组分及含量
表2 发酵乳杆菌特异性培养基的制备条件
上述实施例1-6中所提供的发酵乳杆菌特异性培养基在配制过程中，除了新霉素外，其它组分一起加入，在使用培养基时，先将培养基融化，待温度降至50℃以下时，再添加新霉素。
上述实施例提供的发酵乳杆菌特异性培养基具有配制方便，成本低廉的特点，可对乳制品中的发酵乳杆菌进行培养和特异性计数。
实施例7 一种对发酵乳杆菌进行活菌计数的方法
实施例7是提供实施例1-6所提供的发酵乳杆菌特异性培养基的应用，也就是将不同菌种（包含发酵乳杆菌）分别在实施例1-6所提供的培养基上进行培养，并对培养后的菌种进行平板计数。
检测样品为含有发酵乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌的乳制品（酸奶或者乳饮料），具体的实验步骤如下：
（1）样品稀释
液体样品：液体样品摇匀用无菌吸管吸取样品25mL，置于225mL生理盐水中混匀，制成1：10的样品稀释液；
（2）取上述1:10的样品稀释液（样品匀液）1mL，注入9mL生理盐水中，充分混匀，依次逐级稀释至合适浓度；
（3）吸取上述不同浓度的样品0.1mL置于已凝固的平皿中，用涂布棒进行涂布。至36±1℃培养箱中培养48±1h，计数平板上的所有菌落。
本实施例所提供的计数方法简单，相对于PCR的计数方法来说，对操作人员的要求降低，成本降低。
实施例8-10 发酵乳杆菌进行活菌计数的方法
实施例8-10所提供的发酵乳杆菌进行活菌计数的方法与实施例7相似，不同之处在于步骤（3）中培养箱中培养的温度和时间均与实施例7不同，具体见下表。
表3 培养温度时间表
上述实施例所提供的计数方法简单，相对于PCR的计数方法来说，对操作人员的要求降低，成本降低。
将实施例7-10中对不同菌种的计数结果见下表。
表4 不同菌种的计数结果
注：B：保加利亚乳杆菌，S：嗜热链球菌，G：干酪乳杆菌，LP：植物乳杆菌，BB：乳双歧杆菌，SS：嗜酸乳杆菌，SL：鼠李糖乳杆菌， LR：罗伊氏乳杆菌，F：发酵乳杆菌
由表4可知，本发明所提供的发酵乳杆菌特异性培养基可以对发酵乳杆菌进行培养和特异性计数，计数过程简单，结果精确。
实施例11 不同菌株对不同碳源的利用结果探究
本实施例对发酵乳中不同菌种（每种发酵乳中只含有一种菌种）对不同的碳源利用进行了实验，比较不同菌种中糖发酵特性，其中，菌种的糖利用实验过程均为现有技术，具体结果见下表。
表5 不同菌种的糖利用结果
（续表）
由结果可知，保加利亚亚种、嗜酸乳杆菌、瑞氏乳杆菌、乳双歧杆菌不能利用氨基葡萄糖盐酸盐，干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌不能利用棉籽糖和蜜二糖，只有植物乳杆菌、发酵乳杆菌和罗伊氏乳杆菌能同时利用氨基葡萄糖盐酸盐、棉籽糖和蜜二糖，通过糖利用的不同，可以将植物乳杆菌、发酵乳杆菌和罗伊氏乳杆菌从其他乳酸菌中分来开来。
实施例12 不同菌株对不同抗生素敏感性实验
本实施例是在实施例11的基础上对发酵乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和植物乳杆菌进行了抗生素敏感性实验，实验过程均为现有技术，具体的结果见表6。
表6 不同菌株、不同抗生素敏感性实验结果
注：S-敏感，R-抗性
从上表可以看出，通过对上述 17 种抗生素的筛选，发现只有新霉素能同时抑制罗伊氏乳杆菌和植物乳杆菌，而且不能抑制发酵乳杆菌。因此，选择新霉素作为发酵乳杆菌特异性培养基筛选因子之一。
实施例13 培养基组分中碳源和抗生素的筛选实验
本实施例对不同的培养基进行了筛选实验，其中，选取了以下培养基进行实验，具体为：MRS培养基、氨基葡萄糖盐酸盐-MRS培养基、蜜二糖-MRS培养基、棉籽糖-MRS培养基、新霉素-MRS培养基、氨基葡萄糖盐酸盐-新霉素-MRS培养基、蜜二糖-新霉素-MRS培养基、棉籽糖-新霉素-MRS培养基、氨基葡萄糖盐酸盐-蜜二糖-新霉素-MRS培养基、氨基葡萄糖盐酸盐-棉籽糖-新霉素-MRS培养基、蜜二糖-棉籽糖-新霉素-MRS培养基、氨基葡萄糖盐酸盐-蜜二糖-棉籽糖-新霉素-MRS培养基、山梨醇-林可霉素-MRS培养基、山梨醇-新霉素- MRS培养基、氨基葡萄糖盐酸盐-蜜二糖-棉籽糖-林可霉素-MRS培养基。
上述培养基的组分含量见表7- 21，这些培养基的PH为6.0，均置于121下灭菌15min，其中带有抗生素的培养基在使用时先将培养基融化，待温度降至50℃以下时，每1000g培养基中添加5mg抗生素。
表7 MRS培养基组分含量
表8 氨基葡萄糖盐酸盐-MRS培养基
表9 蜜二糖-MRS培养基
表10 棉籽糖-MRS培养
表11 新霉素-MRS培养基
表12 氨基葡萄糖盐酸盐-新霉素-MRS培养基
表13 蜜二糖-新霉素-MRS培养基
表14 棉籽糖-新霉素-MRS培养基
表15 氨基葡萄糖盐酸盐-蜜二糖-新霉素-MRS培养基
表16 氨基葡萄糖盐酸盐-棉籽糖-新霉素-MRS培养基
表17 蜜二糖-棉籽糖-新霉素-MRS培养基
表18 氨基葡萄糖盐酸盐-蜜二糖-棉籽糖-新霉素-MRS培养基
表19 山梨醇-林可霉素-MRS培养基
表20 山梨醇-新霉素- MRS培养基
表21 氨基葡萄糖盐酸盐-蜜二糖-棉籽糖-林可霉素-MRS培养
利用上述的 15 种培养基对检测样品中的菌种进行计数，检测样品为含有保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、乳双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、发酵乳杆菌，计数过程与实施例 1 相同，计数的单位是 cfu/mL，其中上述的表7-表21的培养基编号依次记为1-15，具体结果如表22所示。
表22 不同菌株不同培养基的计数结果
B：保加利亚乳杆菌，S：嗜热链球菌，G：干酪乳杆菌，LP：植物乳杆菌，BB：乳双歧杆菌，SS：嗜酸乳杆菌，SL：鼠李糖乳杆菌， LR：罗伊氏乳杆菌，F：发酵乳杆菌
由表22可以看出，山梨醇-林可霉素-MRS培养基、山梨醇-新霉素- MRS培养基和氨基葡萄糖盐酸盐-蜜二糖-棉籽糖-林可霉素-MRS培养基均抑制发酵乳杆菌的生长；氨基葡萄糖盐酸盐-MRS培养基可以抑制保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、乳双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的生长，但无法抑制干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和罗伊氏乳杆菌的生长；蜜二糖-MRS培养基和棉籽糖-MRS培养基能够抑制保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌的生长，但无法完全抑制植物乳杆菌、乳双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和罗伊氏乳杆菌；新霉素-MRS培养基不能完全抑制住嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的生长；氨基葡萄糖盐酸盐-新霉素-MRS培养基对干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌无明显的抑制作用；蜜二糖-新霉素-MRS培养基、蜜二糖-棉籽糖-新霉素-MRS培养基和棉籽糖-新霉素-MRS培养基对嗜酸乳杆菌无明显的抑制作用，对发酵乳杆菌的计数有较明显的影响差异；氨基葡萄糖盐酸盐-蜜二糖-新霉素-MRS培养基、氨基葡萄糖盐酸盐-棉籽糖-新霉素-MRS培养基和氨基葡萄糖盐酸盐-蜜二糖-棉籽糖-新霉素-MRS培养基能完全抑制保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、乳双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌的生长，但氨基葡萄糖盐酸盐-蜜二糖-新霉素-MRS培养基、氨基葡萄糖盐酸盐-棉籽糖-新霉素-MRS培养基对发酵乳杆菌的计数有一定的影响，达不到准确计数的要求；氨基葡萄糖盐酸盐-蜜二糖-棉籽糖-新霉素-MRS培养基与MRS培养基相比，发酵乳杆菌的计数不存在差异，对发酵乳杆菌的准确计数无影响。
实施例14 不同菌种在含有不同浓度的新霉素的培养基培养的计数实验
表23为氨基葡萄糖盐酸盐-蜜二糖-棉籽糖-MRS培养基所含的组分及含量，将该培养基调节PH为6.0，于121℃下灭菌15min。
表23 氨基葡萄糖盐酸盐-蜜二糖-棉籽糖-MRS培养基组分含量
按照上述条件配制6个相同的培养基，分别在这5个培养基中按照1000g培养基加入5.0mg、6.0mg、7.0mg、8.0mg、9.0mg、10.0mg新霉素，分别记为1#、2#、3#、4#、5#和6#；将含有发酵乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、罗伊氏乳杆菌菌种的样品（乳酸菌饮料）按照实施例7的步骤进行检测计数，计数单位是cfu/mL，下表中的MRS培养基成分见表7，具体实验结果见下表。
表24 含有不同浓度的新霉素培养基对不同菌株的计数结果
注：B：保加利亚乳杆菌，S：嗜热链球菌，G：干酪乳杆菌，LP：植物乳杆菌，BB：乳双歧杆菌，SS：嗜酸乳杆菌，SL：鼠李糖乳杆菌， LR：罗伊氏乳杆菌，F：发酵乳杆菌
由上表可以看出，向每1000g氨基葡萄糖盐酸盐-蜜二糖-棉籽糖-MRS培养基中分别加入5.0mg、6.0mg、7.0mg、8.0mg、9.0mg、10.0mg新霉素后，对罗伊氏乳杆菌和植物乳杆菌均具有很好的抑制作用，并且与不添加新霉素的MRS培养基相比，发酵乳杆菌计数不存在差异性。
实施例1-10，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明所作的其它形式的限定，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述技术内容作为启示加以或改型为等同变化的等效实施例。但凡是未脱离本发明权利要求的技术实质，对以上实施例所作出的简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明权利要求保护的范围。
Claims (6)
1.一种发酵乳杆菌特异性培养基，其特征在于按照重量份数计包含如下成分：
蛋白胨 8.0-15.0份，
酵母粉 2.0-6.0份，
牛肉膏 8.0-15.0份，
吐温80 1.0-1.5份，
磷酸氢二钾 1.0-2.0份，
乙酸钠 4.0-6.0 份，
柠檬酸三铵 2.0-4.0 份，
硫酸镁 0.2-0.4 份，
硫酸锰 0.05-0.20份，
碳源 15-30份，
新霉素 5×10-3-10×10-3份，
琼脂 15.0-20.0份，
蒸馏水 1000份。
2.根据权利要求1所述的发酵乳杆菌特异性培养基，其特征在于：所述碳源为以重量比1:1:1混合的氨基葡萄糖盐酸盐、蜜二糖和棉籽糖。
3.根据权利要求1所述的发酵乳杆菌特异性培养基，其特征在于：所述新霉素的添加量为6×10-3-9×10-3重量份。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的发酵乳杆菌特异性培养基，其特征在于：所述发酵乳杆菌特异性培养基于118-125℃下灭菌15-20min， 其PH为6.0-6.2。
5.权利要求1-4中任意一项所述的发酵乳杆菌特异性培养基的一种应用，其特征在于：它用于对发酵乳杆菌进行计数，是将发酵乳杆菌菌种于所述发酵乳杆菌特异性培养基上进行培养后，将所得到的培养后的菌种进行平板计数。
6.根据权利要求5所述的发酵乳杆菌特异性培养基的一种应用，其特征在于：发酵乳杆菌菌种的培养温度为34-36℃，培养时间为46-50h。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20161214 |