CN109777758B - 一种具有广谱抑菌活性的地衣芽胞杆菌hyt-9及其菌剂制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有广谱抑菌活性的地衣芽胞杆菌HYT‑9及其菌剂制备方法和应用。所述地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis命名为HYT‑9，其保藏编号为CGMCC NO.17225。本发明通过抑菌试验表明，所述地衣芽胞杆菌对多种病原菌，尤其是金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌、溶藻弧菌、灿烂弧菌、假单胞菌等具有显著的抑菌活性，可以作为抗生素的替代产品，用于饲料添加剂、抗菌药物制剂、保健品、防腐剂等领域的应用。本发明通过15L罐发酵后，以大肠杆菌为指示菌，以盐酸多西环素为对照，地衣芽胞杆菌的发酵液抑菌效价达到10万ppm。具有广阔的市场应用前景。

Description

一种具有广谱抑菌活性的地衣芽胞杆菌HYT-9及其菌剂制备 方法和应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种具有广谱抑菌活性的地衣芽胞杆菌HYT-9及其菌剂制备方法和应用。

背景技术

随着抗生素的滥用和误用，耐药菌株不断增加，导致了许多药物无法治疗的超级细菌。以对甲氧西林耐药的葡萄球菌(MRSA)为例，20世纪80年代初，它对95 %的患者有效；到1996年，72 %的患者无效；而现在已基本无效。并且，耐药性金黄色葡萄球菌(MRSA、VRSA等)能在畜禽和人之间实现交叉感染，很多引起人类感染的MRSA菌株最终发现均来源于动物体内。由于在畜牧业生产中长期大量的滥用抗生素已造成了严重的危害：导致动物机体免疫力下降，加速耐药菌株的产生，诱发各种疫病的发生与流行，抗生素防治作用大大减弱，甚至无疗效；造成抗生素在畜禽产品中严重残留，通过食物链进入人体，严重危害人体的健康；污染生态环境，破坏生态环。病原菌耐药性问题已被世界卫生组织(WHO)列为未来人类健康面临的主要威胁和挑战之一，所以研制抗生素的安全替代产品成为重中之重。

使用微生态制剂可以解决抗生素问题：有益微生物在其生长代谢过程中，会产生多种抑菌物质，例如乳酸菌类生成的细菌素、芽孢杆菌类产生的杆菌肽、抗菌肽等。通过这些抑菌活性代谢物不仅可以抑制大肠杆菌、沙门氏菌等病原菌的生长，还可以为益生菌自身的活化、定植提供有利条件。

地衣芽胞杆菌是工业微生物中常用的生产菌株，并且地衣芽胞杆菌微生态制剂可以调理人、动物肠道，对致病菌有拮抗作用，对益生菌有促进生长的作用，地衣芽胞杆菌代谢物具有抑制一些革兰氏阳性菌，不产生耐药性，无残留，不污染环境等优点，因此，可以作为抗生素的替代品，其研究和开发意义重大。目前，现有的地衣芽孢杆菌存在以下缺陷：一是抑菌活性代谢物的产量不高，二是抑菌谱较窄。所以，迫切需要研究和寻找广谱抑菌活性的地衣芽胞杆菌，并进一步提高其抑菌活性代谢物产量。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种具有广谱抑菌活性的地衣芽胞杆菌HYT-9及其菌剂制备方法和应用。所述地衣芽胞杆菌对多种病原菌具有显著的抑菌活性，可以作为抗生素的替代产品，用于饲料添加剂、抗菌药物制剂、保健品、防腐剂等领域。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供了一种具有广谱抑菌活性的地衣芽胞杆菌HYT-9，其分类命名为地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为CGMCC NO.: 17225。

进一步的：地衣芽胞杆菌HYT-9的菌落形态为：大菌落、乳白色、边缘不规则，隆突、产生液泡，周边半透明湿润、具有流动性。

本发明提供了含有所述的地衣芽胞杆菌HYT-9的菌剂。

进一步的：所述菌剂包括液体制剂和固体制剂，所述液体菌剂中地衣芽胞杆菌HYT-9的含菌量为1×10⁸ ~ 7×10⁸ cfu/g；所述固体制剂中地衣芽胞杆菌HYT-9的含菌量为3.5×10⁹ cfu/g以上。

本发明提供了所述的地衣芽胞杆菌HYT-9的发酵制剂，所述发酵制剂是通过以下制备方法获得的：将地衣芽孢杆菌接种于种子培养基制备种子液，过夜培养；将种子液接种于发酵培养基，发酵36-40h；发酵液离心后，再将上清液经无菌膜过滤，即获得发酵制剂。

本发明提供了所述的地衣芽胞杆菌HYT-9的菌剂或发酵制剂在制备饲料添加剂、抗菌制剂和防腐剂中的应用。

进一步的：所述地衣芽胞杆菌HYT-9对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌、溶藻弧菌、灿烂弧菌、假单胞菌有明显抑制作用。

进一步的：所述地衣芽胞杆菌HYT-9对胃蛋白酶和胰蛋白酶具有耐受性。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明提供了的具有广谱抑菌活性的地衣芽孢杆菌HYT-9，其代谢产物具有较高的抑菌活性，可以抑制多种致病菌，对益生菌如植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽胞杆菌等不具有抑制作用；并且性质稳定，100℃下加热5min，抑菌活性几乎没有损失；对胃蛋白酶和胰蛋白酶具有较强的耐受性，可以作为微生态产品，抗生素的替代产品，具有广阔的应用价值，本发明为提高抑菌活性物质产量及微生态产品的开发提供了技术支持。

附图说明

图1是所述地衣芽胞杆菌HYT-9的平板菌落形态。

图2是所述地衣芽胞杆菌HYT-9的光学显微镜下形态。

图3是所述地衣芽胞杆菌HYT-9的15L罐发酵过程抑菌活性结果。

图4是所述地衣芽胞杆菌HYT-9的抑菌效果图；其中指示菌依次是溶藻弧菌、链球菌、金黄色葡萄球菌、灿烂弧菌、大肠杆菌、假单胞菌。

图5是所述地衣芽胞杆菌HYT-9的抑菌效价；其中编号6是盐酸多西环素1万ppm；编号7是HYT-9 15L罐发酵液稀释10倍。

图6是所述地衣芽胞杆菌HYT-9的抑菌活性物质的耐受性；其中编号“80℃、85℃、100℃”是分别于80℃、85℃、100℃加热处理5min后的效果；编号“胃2h”、“胃对”分别是pH2时加入胃蛋白酶37℃处理2h和pH2时未加胃蛋白酶37℃处理2h；编号“胰4h”、“胰对”分别是pH6.8时加入胰蛋白酶37℃处理4h和pH6.8时未加胰蛋白酶37℃处理4h；编号“对”未做处理，为对照组。

图7是所述地衣芽胞杆菌HYT-9的进化树。

具体实施方式

为了便于理解本发明，以下将结合附图及实施例对本文发明做更全面、详细地说明，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，可以参照《分子克隆实验指南》(第三版)J .萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。具体实施例中使用的试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。

实施例1：HYT-9菌株的筛选、分离和纯化

将采集到的腐败牛奶样品加入到50 mL无菌水中，80℃ 120min处理后，取5 mL接种到新鲜LB培养自富集培养，重复该过程4-5次，将最终得到的富集培养液涂布到含有大肠杆菌指示菌的LB固体培养基平板上，置于37℃恒温培养箱中过夜培养，选取具有抑菌圈的不同形态特征的单菌落接种新鲜LB培养基中，进行多种致病菌株的抑菌验证，选出抑菌圈较大且谱最广的菌落，其中抑菌效果较好的一株命名为HYT-9，将其保藏于甘油管和LB固体斜面培养基中。

实施例2：HYT-9菌株的鉴定

1、菌株的形态学和生理生化特征

菌株HYT-9在LB固体平板上的菌落形态如图1所示：大菌落、乳白色、边缘不规则，隆突、产生液泡，周边半透明湿润、具有流动性。光学显微镜下观察其形态均呈短杆状，为革兰氏阳性菌，芽胞中生，如图2所示。以LB为培养基时，最适培养温度为37℃，培养30h后开始产生芽胞。属于好氧菌，可利用蛋白质、淀粉及多种糖。

2、菌株16S rDNA鉴定

（1）提取地衣芽孢杆菌HYT-9的基因组，采用引物（27F ：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG ；1492R ： TACGGYTACCTTGTTACG ACTT ）进行16s rDNA扩增：

反应体系为：PCR上游引物（25pmol/µL）1µL；PCR下游引物（25pmol/µL）1µL；dNTP混合液 4µL；PCR Buffer 5µL；模板DNA 1µL；Taq DNA聚合酶 0.5µL；加双蒸水至总体积50µL。

反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min30sec，循环30次，72℃，后延伸10min，15℃保存。

（2）将PCR产物经过纯化后，与T载体进行连接（按照试剂盒说明步骤进行），并转化大肠杆菌DH5α ；

（3）提取重组质粒，以质粒为模板，采用引物（M13F(-47)：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC M13R(-48)：AGCGGATAACAATTTCACACAGGA）进行PCR验证，选取16s rDNA成功克隆入T-载体的重组质粒，测序。

（4）测序结果如下所示（SEQ ID No:1）：

GGTTACCTTGTTACGACTTCACCCCAATCATCTGTCCCACCTTCGGCGGCTGGCTCCAAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAGCCTCGCGGCTTCGCTGCCCTTTGTTCTGCCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGAAGCCCTATCTCTAGGGTTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTTGCTGCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTACCGCCCTATTCGAACGGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGTTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCTAAAAGCCACCTTTTATAATTGAACCATGCGGTTCAATCAAGCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTGACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTTGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGCGTTCGTCCTGAGCCAGGATCAAACTCT。

通过与GenBank中已有的ITS序列进行Blast相似性比较确定菌株的种属。结合菌株的形态学特征和ITS比对结果，最终将菌株确定为地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis。

将筛选到的地衣芽胞杆菌HYT-9菌株进行菌种保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所；保藏日期：2019年01月23日；HYT-9菌株的保藏编号为：CGMCC No.17225。

实施例3：菌株的培养

1、菌株和载体

地衣芽孢杆菌HYT-9（以下简称HYT-9）；T-载体，大肠杆菌DH5α，购自Invitrogen公司。

引物序列如下：

27F ： 5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’；

1492R ： 5’-TACGGYTACCTTGTTACG ACTT-3’；

M13F(-47)：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’；

M13R(-48)：5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’。

2、试剂与培养基

质粒提取试剂盒，片段纯化回收试剂盒，限制性内切酶等购自宝生物工程(大连)有限公司；氨苄青霉素购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

芽孢杆菌发酵培养基：豆粕粉50-80 g/L，玉米淀粉60-100 g/L，磷酸氢二钠2-4g/L，碳酸钠1-2 g/L，pH自然。

以上培养基为固体时加入2 %的琼脂粉。

3、培养方法

菌株培养条件：地衣芽孢杆菌37℃培养。液体培养时摇床转速为200 rpm。

细菌基因组提取：按照基因组提取试剂盒说明进行操作。

质粒提取：按照质粒提取试剂盒说明进行操作。

大肠杆菌转化（热激法）：

（1）取10µL连接反应产物加到100µL新制备的JM109感受态细胞悬浮液中混合均匀。

（2）冰上放置20min。

（3）42℃水浴中热激1.5min，迅速放回冰上冷却5min。

（4）向1.5mL离心管中加入0.8mLLB液体培养基，混匀后37℃培养1h，使细胞恢复正常生长状态。

（5）8000rpm，离心5min收集菌液，剩余约150μL左右LB液体培养基重悬菌体。

（6）将菌体均匀涂于含氨苄青霉素（100µg/mL）的选择培养基筛选平板上，正面向上放置0.5h；待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，37℃培养，至长出菌落。

实施例4：地衣芽孢杆菌HYT-9抑菌活性实验

一、地衣芽孢杆菌发酵

（1）将地衣芽孢杆菌HYT-9接种于LB培养基制备种子液，37℃，200 rpm，过夜培养；

（2）将种子液按照10 %的接种量，接种于发酵培养基，37℃，200 rpm，发酵约36-40h；

（3）发酵液经过5000 rpm离心5 min后，再将上清液过滤0.22 μm，即获得抑菌物质发酵液。

发酵过程曲线如图3所示：每隔4h取样，将发酵液稀释10倍后，以大肠杆菌为指示菌验证发酵液抑菌活性，发酵36h后抑菌活性达到最高点。

二、抑菌活性评价：

（1）选取指示菌：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌、溶藻弧菌、灿烂弧菌、假单胞菌，接种于LB培养基，37℃，200 rpm，过夜培养；

（2）将指示菌进行适当稀释后，加入约45℃的LB固体培养基，快速混匀，倒平板；

（3）待平板凝固后，用打孔器在平板中打孔；

（4）平板上的每个孔可以加入50-70 μL发酵液；

（5）将带有指示菌的平板放入37℃培养箱，过夜培养；

（6）观察抑菌效果，以抑菌圈直径（cm）大小评价抑菌效果。

如图4所示，通过观察发酵液上清液的抑菌效果，地衣芽孢杆菌HYT-9的发酵液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌、溶藻弧菌、灿烂弧菌、假单胞菌都有较好的抑菌效果。

三、抑菌效价

以大肠杆菌为指示菌株时，参照盐酸多西环素，通过抑菌圈大小对比，地衣芽孢杆菌HYT-9 15L罐发酵液稀释10倍后的抑菌效果和盐酸多西环素1万ppm的抑菌效果相当（抑菌直径约2.10cm），即HYT-9的效价约为10万ppm，如图5所示。

四、抑菌活性物质耐受性

温度耐受性：选取地衣芽孢杆菌HYT-9的发酵液，分别于80℃、85℃、100℃加热处理5min后，再取适量处理后的发酵液点种于含有指示菌的平板上；最后，以未加热处理组作为对照。

胃蛋白酶及胰蛋白酶抗性测定步骤：

酶液(pH 2.0)：胃蛋白酶液=4:1，将混合好的胃蛋白酶液环境酶液37℃ 环境下保温2h。

酶液(pH 6.8)：胰蛋白酶液=4:1，将混合好的胰蛋白酶液环境在37℃ 环境下保温4h。

保温结束，酶液置于室温，用相对应缓冲液进行稀释同时根据需要调节到所需的测定pH 值，进行酶活的检测。通过观测结果，分析其对胃蛋白酶及胰蛋白酶的耐受性。

结果：指示菌株为大肠杆菌，如图6所示，该抑菌活性物质的耐受性很稳定，经过100℃、胃蛋白酶及胰蛋白酶处理后，抑菌圈和未处理时的抑菌圈大小相当，说明经过处理后，抑菌效果基本没有减弱。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 青岛红樱桃生物技术有限公司

<120> 一种具有广谱抑菌活性的地衣芽胞杆菌HYT-9及其菌剂制备方法和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1511

<212> DNA

<213> 地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)

<400> 1

ggttaccttg ttacgacttc accccaatca tctgtcccac cttcggcggc tggctccaaa 60

aggttacctc accgacttcg ggtgttacaa actctcgtgg tgtgacgggc ggtgtgtaca 120

aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc tgatccgcga ttactagcga ttccagcttc 180

acgcagtcga gttgcagact gcgatccgaa ctgagaacag atttgtggga ttggcttagc 240

ctcgcggctt cgctgccctt tgttctgccc attgtagcac gtgtgtagcc caggtcataa 300

ggggcatgat gatttgacgt catccccacc ttcctccggt ttgtcaccgg cagtcacctt 360

agagtgccca actgaatgct ggcaactaag atcaagggtt gcgctcgttg cgggacttaa 420

cccaacatct cacgacacga gctgacgaca accatgcacc acctgtcact ctgcccccga 480

aggggaagcc ctatctctag ggttgtcaga ggatgtcaag acctggtaag gttcttcgcg 540

ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg cttgtgcggg cccccgtcaa ttcctttgag 600

tttcagtctt gcgaccgtac tccccaggcg gagtgcttaa tgcgtttgct gcagcactaa 660

agggcggaaa ccctctaaca cttagcactc atcgtttacg gcgtggacta ccagggtatc 720

taatcctgtt cgctccccac gctttcgcgc ctcagcgtca gttacagacc agagagtcgc 780

cttcgccact ggtgttcctc cacatctcta cgcatttcac cgctacacgt ggaattccac 840

tctcctcttc tgcactcaag ttccccagtt tccaatgacc ctccccggtt gagccggggg 900

ctttcacatc agacttaaga aaccgcctgc gcgcgcttta cgcccaataa ttccggacaa 960

cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc tggcacgtag ttagccgtgg ctttctggtt 1020

aggtaccgtc aaggtaccgc cctattcgaa cggtacttgt tcttccctaa caacagagtt 1080

ttacgatccg aaaaccttca tcactcacgc ggcgttgctc cgtcagactt tcgtccattg 1140

cggaagattc cctactgctg cctcccgtag gagtctgggc cgtgtctcag tcccagtgtg 1200

gccgatcacc ctctcaggtc ggctacgcat cgttgccttg gtgagccgtt acctcaccaa 1260

ctagctaatg cgccgcgggt ccatctgtaa gtggtagcta aaagccacct tttataattg 1320

aaccatgcgg ttcaatcaag catccggtat tagccccggt ttcccggagt tatcccagtc 1380

ttacaggcag gttacccacg tgttactcac ccgtccgccg ctgacatcag ggagcaagct 1440

cccatctgtc cgctcgactt gcatgtatta ggcacgccgc cagcgttcgt cctgagccag 1500

gatcaaactc t 1511

Claims (5)

1.一种具有广谱抑菌活性的地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）HYT-9，所述菌株的保藏编号为CGMCC NO.17225。

2.含有权利要求1所述的地衣芽胞杆菌HYT-9的菌剂。

3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂包括液体制剂和固体制剂，所述液体菌剂中地衣芽胞杆菌HYT-9的含菌量为1×10⁸ ~ 7×10⁸ cfu/g；所述固体制剂中地衣芽胞杆菌HYT-9的含菌量为3.5×10⁹ cfu/g以上。

4.权利要求1所述的地衣芽胞杆菌HYT-9的发酵制剂，其特征在于：所述发酵制剂是通过以下制备方法获得的：将地衣芽孢杆菌接种于种子培养基制备种子液，过夜培养；将种子液接种于发酵培养基，发酵36-40h；发酵液离心后，再将上清液经无菌膜过滤，即获得发酵制剂。

5.根据权利要求2或4所述的地衣芽胞杆菌HYT-9的菌剂或发酵制剂在制备饲料添加剂、抗菌制剂和防腐剂中的应用。

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