CN116179440A - 一株鸡源贝莱斯芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一株鸡源贝莱斯芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株鸡源贝莱斯芽孢杆菌及其应用。所述贝莱斯芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，其菌株号为CML532，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.24752，其16S rRNA基因序列含有序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA分子。该菌株能显著提高肉鸡的生产性能，并能增强肉鸡空肠消化吸收的能力，提高机体抗氧化能力；可作为一种安全、抗逆性强、能分泌消化酶且能调节家禽肠道菌群平衡的饲用微生物添加剂在肉鸡养殖业中应用。

Description

一株鸡源贝莱斯芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株鸡源贝莱斯芽孢杆菌及其应用。
背景技术
家禽业是世界上最大的肉类产业之一。人类对禽类产品的巨大需求，使得家禽业产生了巨大的经济效益，这迫使家禽生产向着更高效和更高密度发展。在这种压力下，家禽会更容易出现生长变缓、疾病甚至死亡的情况。自欧盟于上世纪五六十年代开始允许在动物饲料中添加抗生素类生长促进剂以来，畜牧业开始大规模在动物生产中使用抗生素类促生长剂，主要用于防控和治疗畜禽肠道疾病、促进动物生长并提高畜禽生产性能。但随着研究的逐渐深入，人们意识到滥用抗生素会导致药物残留，并且促使病原菌产生耐药性，这些都对人类的健康造成潜在的威胁，同时抗生素的过度使用也给环境带来不利影响。由于抗生素在畜禽生产中的使用越来越严格，绿色、高效的抗生素替代物成为了目前畜牧行业的研究热点。其中益生菌因其抗疾病、促生长、不易产生抗性、对环境友好且无毒副作用等优点，成为替抗产品的研究热点之一。特别是芽孢杆菌属的益生菌，因为可以形成孢子这一独特的生物学特性，在实际应用生产中比传统的益生菌具有更大的优势。
芽孢杆菌是部分严格好氧，部分兼性厌氧的革兰氏阳性细菌，广泛分布在自然界的各种环境中，空气、土壤、河流中都能分离出芽孢杆菌，但在动物肠道中含量较少。芽孢杆菌具有许多益生特性，可以抑制病原菌生长、分泌多种消化酶，能调节肠道菌群平衡、促进消化和吸收、增强机体免疫力。同时芽孢杆菌在一定条件下可以形成芽孢，能耐高温、耐酸、耐胆盐，能通过胃进入肠道，在体外可以也能长期稳定保存。因此，芽孢杆菌比其他传统益生菌具有更大的优势，也是目前在畜牧业中研究最多和应用生产最为广泛的益生菌之一。
研究发现，即使是同一物种的不同株的益生菌也具有一定的差异性，在动物机体内发挥的益生作用也有差异。微生物饲料添加剂具有特定的宿主范围，超出宿主范围添加剂的作用效果不明显。所以，从宿主肠道来源的芽孢能具有更好地适应宿主体内环境和抵抗肠道不利环境的能力。但目前市场上使用的芽孢杆菌制剂大多来源不清晰或者来源于自然界中，很少从动物自身肠道分离的。因此，从鸡肠道分离筛选益生芽孢杆菌并将其用于提高肉鸡生产性能具有重大的应用意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何获得抗逆性强、能分泌消化酶且能调节家禽肠道菌群平衡的来源于家禽的益生菌。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了贝莱斯芽孢杆菌。所述贝莱斯芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，其菌株号为CML532，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.24752。
上述贝莱斯芽孢杆菌的16S rRNA的基因含有序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA分子。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述贝莱斯芽孢杆菌的培养物。所述培养物是将上述的贝莱斯芽孢杆菌在微生物培养基中培养得到的物质(如含有贝莱斯芽孢杆菌CML532和分泌到液体培养基内的物质即发酵液，或如含有贝莱斯芽孢杆菌CML532和分泌到固体培养基内的物质)。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种菌剂。所述菌剂可含有上述的贝莱斯芽孢杆菌或/和上述的贝莱斯芽孢杆菌的代谢物或/和上述的培养物。
上述菌剂的活性成分可为贝莱斯芽孢杆菌CML532或/和贝莱斯芽孢杆菌CML532的代谢物，上述菌剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述菌剂的其他活性成分本领域技术人员可根据菌剂的效果确定。
所述菌剂还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体为矿物材料、生物材料；所述矿物材料可为草炭、粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述生物材料为各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生壳、玉米粉、豆粉、淀粉、草炭和动物的粪便中的至少一种；所述液体载体可为水；所述菌剂中，贝莱斯芽孢杆菌CML532或/和贝莱斯芽孢杆菌CML532的代谢物可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。
上文中，所述贝莱斯芽孢杆菌CML532的代谢物可为贝莱斯芽孢杆菌CML532的发酵液。贝莱斯芽孢杆菌CML532的发酵液可按照如下方法制备：在液体发酵培养基中培养贝莱斯芽孢杆菌CML532，收集发酵液(含有贝莱斯芽孢杆菌CML532和分泌到液体培养基内的物质)，该发酵液即为贝莱斯芽孢杆菌CML532的代谢物。
上述菌剂具有下述至少一种特性：
A1)耐受高胆盐环境；
A2)耐低pH值环境；
A3)耐高温环境；
A4)产蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶；
A5)提高家禽生产性能和/或提高家禽体重；
A6)增强家禽空肠消化吸收能力；
A7)提高家禽机体抗氧化能力；
A8)抑制病原菌生长。
上述高胆盐环境的胆盐含量可为0.30％或0.40％(质量百分含量)，如0.30％(质量百分含量)或0.40％(质量百分含量)。所述高温环境的温度可为85℃-90℃，如85℃或90℃。所述低pH值环境的pH值可为2-3，如pH＝3和/或pH＝2。上述病原菌可为产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述的贝莱斯芽孢杆菌的下述至少一种应用：
B1)上述的贝莱斯芽孢杆菌在制备提高家禽生产性能和/或提高家禽体重的产品中的应用；
B2)上述的贝莱斯芽孢杆菌在制备增强家禽空肠消化吸收能力的产品中的应用；
B3)上述的贝莱斯芽孢杆菌在制备提高家禽机体抗氧化能力的产品中的应用；
B4)上述的贝莱斯芽孢杆菌在制备提高家禽抗病原菌能力的产品中的应用；
B5)上述的贝莱斯芽孢杆菌在制备饲用微生物添加剂中的应用；
B6)上述的贝莱斯芽孢杆菌在制备家禽饲料中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述菌剂的下述至少一种应用：
C1)上述的菌剂在制备提高家禽生产性能和/或提高家禽体重的产品中的应用；
C2)上述的菌剂在制备增强家禽空肠消化吸收能力的产品中的应用；
C3)上述的菌剂在制备提高家禽机体抗氧化能力的产品中的应用；
C4)上述的菌剂在制备提高家禽抗病原菌能力的产品中的应用；
C5)上述的菌剂在制备饲用微生物添加剂中的应用；
C6)上述的菌剂在制备家禽饲料中的应用。
上文所述菌剂和/或上文所述的应用中，所述家禽可为鸡。所述病原菌可为产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)。
上文所述菌剂和/或上文所述的应用中，所述产品可为饲料或药物。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了制备上述菌剂的方法，包括将上文所述的贝莱斯芽孢杆菌在微生物培养基中培养的步骤。所述微生物培养基可为LB液体培养基。
本发明提供一株安全、抗逆性强、能分泌消化酶且能调节家禽肠道菌群平衡的可用作微生物饲料添加剂的鸡源贝莱斯芽孢杆菌。本发明根据筛选目标和益生菌的生理生化特性及遗传特性，以现代分子生物学方法，从健康散养的地方品种鸡盲肠食糜中，经过大量特异性分选，从山中鲜公鸡盲肠食糜中分离筛选得到一株抗逆性强、能分泌消化酶且能抑制家禽病原菌生长的贝莱斯芽孢杆菌菌株CML532。
该菌株为兼性厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌，菌体呈直杆状。在LB固体培养基上37℃培养24h形成较大的白色圆形菌落，表面粗糙有褶皱，中间凸起，形成菌膜，菌膜下有黏液。采用细菌的16S rRNA基因扩增通用引物序列对其进行PCR扩增反应并测序，测序结果在EZ biocloud数据组中进行序列比对，分析菌株同源性，发现其16SrRNA与贝莱斯芽孢杆菌的序列同源性最高，相似度为100％。该菌株在酸性和高胆盐环境中有较强的生存能力。在pH 2～3孵育两小时后，其活菌数没有下降甚至还有升高，在0.30％和0.40％胆盐中孵育两小时后，其活菌数的数量级没有下降。由此推测，该菌株能够抵抗胃酸和小肠中高浓度胆盐的不利环境，能在肠道中存活下来发挥益生作用，这也在动物试验中得到证实。同时由于该菌株能产芽孢，因此对高温也有较强的耐受能力。将其置于85℃和90℃水浴10min后，其活菌数也几乎没有变化，表明该菌株可以耐受饲料熟化和制粒的高温，为将其开发成饲料添加剂应用于动物生产奠定了良好的基础。该菌对家禽危害较大的肠道致病菌产气荚膜梭菌有明显的抑菌作用。同时还能分泌蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶等消化酶，促进动物消化吸收，从而促进动物的生长。
将该菌通过液体发酵，离心烘干后制得菌粉，并将其应用于饲料添加剂，进行了肉仔鸡饲喂试验以研究其益生特性。结果表明，贝莱斯芽孢杆菌CML532可以促进肉仔鸡采食，促进肉仔鸡的生长发育，并且能提高肉鸡中小肠消化能力和血清抗氧化能力，可作为一种新型有效的益生菌应用于家禽养殖领域。
保藏说明
菌种名称：贝莱斯芽孢杆菌
拉丁名：Bacillus velezensis
菌株编号：CML532
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2022年04月22日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.24752
附图说明
图1为本发明分离的贝莱斯芽孢杆菌CML532在LB固体培养基上的生长状态。
图2为本发明分离的贝莱斯芽孢杆菌CML532的生长曲线。
图3为本发明分离的贝莱斯芽孢杆菌CML532生长的pH值曲线。
图4为本发明分离的贝莱斯芽孢杆菌CML532发酵上清液对产气荚膜梭菌ATCC13124的抑菌效果。
图5为本发明分离的贝莱斯芽孢杆菌CML532发酵上清液对蛋白质的分解效果。
图6为本发明分离的贝莱斯芽孢杆菌CML532发酵上清液对淀粉的分解效果。
图7为本发明分离的贝莱斯芽孢杆菌CML532发酵上清液对羧甲基纤维钠的分解效果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)来源于美国菌种保藏中心ATCC(American Type Culture Collection，简称ATCC)，菌株编号为ATCC 13124，下文简称ATCC 13124。
本发明实施例中培养基的组成如下：
胰
Figure BDA0004107893510000051
-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂基础(TSC固体培养基)：胰/>
Figure BDA0004107893510000052
15.0g/L，大豆胨5.0g/L，酵母膏5.0g/L，偏亚硫酸氢钠1.0g/L，柠檬酸铁铵1.0g/L，琼脂20.0g/L，其余为水。
液体硫乙醇酸盐液体培养基(FTG液体培养基)：酪胨(胰酶水解)15.0g/L，酵母浸出粉5.0g/L，葡萄糖5.0g/L，硫乙醇酸钠0.5g/L，L-胱氨酸0.5g/L，氯化钠2.5g/L，其余为水。
LB液体培养基：酵母浸出粉5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，氯化钠10.0g/L，，其余为水。
LB固体培养基：酵母浸出粉5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，氯化钠10.0g/L，琼脂20.0g/L，其余为水。
胆盐浓度为0.30％或0.40％的LB液体培养基：在LB液体培养基的基础上添加0.30％或0.40％的猪胆盐，其余为水。
不同pH值(pH＝6、pH＝3和pH＝2)的LB液体培养基：用1mol/L的NaOH溶液和1mol/L盐酸溶液把LB液体培养基的pH调到pH＝6、pH＝3和pH＝2。
含10％脱脂奶粉的LB固体培养基：在LB固体培养基的基础上添加10％的脱脂奶粉。
含1％可溶性淀粉的LB固体培养基：在LB固体培养基的基础上添加1％的可溶性淀粉。
含1％羧甲基纤维素钠的LB固体培养基：在LB固体培养基的基础上添加1％的羧甲基纤维素钠。
产芽孢液体培养基：葡萄糖10g/L，硫酸铵20g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.5g/L，磷酸氢二钾1g/L，磷酸二氢钾2g/L，碳酸钙3g/L，其余为水。
本发明实施例1～5中的实验均设置三个重复，实施例6中的动物实验设置6个重复，实验数据使用SPSS 24.0软件进行统计分析,采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
实施例1、贝莱斯芽孢杆菌CML532菌株的分离和鉴定
1.菌株的分离
采集来自安徽省宣城市散养山中鲜土鸡的盲肠内容物，将盲肠内容物与无菌PBS磷酸缓冲液按1:9的比例混匀，于80℃恒温水浴锅中孵育20min，将静置冷却后的液体继续用无菌PBS磷酸缓冲液梯度稀释，涂于LB固体培养基上，置于37℃恒温培养箱中培养12～24h。
挑取培养基上形态疑似芽孢杆菌的菌落于另一LB固体培养基上，用四区划线法将疑似菌株进行纯化，37℃培养24h，可重复操作直至得到纯菌株。挑取其中一株编号为CML532的纯化后的单菌落菌株(菌株CML532)，接种到LB液体培养基中，37℃，200r/min摇床培养12h，得到菌株CML532的菌液，然后进行下述步骤2的鉴定。
2.分离菌株的鉴定
2.1分离菌株基因组提取
参照试剂盒(DNeasyR Blood&Tissue Kit,QIAGEN)对菌株CML532进行基因组DNA的提取，以0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测，无弥散或拖尾现象；并用酶标仪对提取的DNA进行质量检测和浓度测定。将A260/A280比值在1.8～2.0，浓度不低于20ng/μL的DNA样品判定为合格样品。
2.2PCR扩增
采用细菌的16S rRNA基因扩增通用引物将合格的菌株DNA样品进行PCR扩增反应。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，具体序列如下：
上游引物27F：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'；
下游引物1492R：5'-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3'。
反应体系(30μL)：DNA模板1.5μL，上游引物27F 1.5μL，下游引物1492R 1.5μL，金牌Mix 25.5μL(北京擎科新业生物技术有限公司)。
反应程序：98℃预变性10min；98℃变性10s，48℃退火15s，72℃延伸25s，10个循环；98℃变性10s，52℃退火15s，72℃延伸25s，20个循环；72℃延伸5min，4℃终止反应，保存。
2.3菌株16S rRNA基因的测序及鉴定
取上述PCR产物在0.8％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。PCR产物经电泳检测出目的扩增条带后送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，获得序列表中SEQ ID NO.1所示的菌株CML532的16S rRNA基因序列，将CML532的16S rRNA基因序列在EZ biocloud数据库上(https://www.ezbiocloud.net/identify)进行序列比对，分析菌株同源性，获得与CML532同源性最高的菌是贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，相似度为100％。
2.4菌落形态及特征
分离得到的贝莱斯芽孢杆菌CML532的最佳生长条件为37℃、有氧，在LB固体培养基上培养24h形成较大的白色圆形菌落，表面粗糙有褶皱，被覆菌膜中间凸起，菌膜下有黏液(图1)。
2.5菌株生长曲线绘制
绘制菌株CML532 48小时的生长曲线(图2)可以看出，菌株CML532在2h进入对数生长期，10h进入平台期，16h开始出现下降。
绘制CML532 48小时的pH值曲线可以看出，前2h的pH略微降低，之后一直升高。具体实验过程如下：
1)将菌株CML532从-80℃冰箱取出，平板划线，37℃生化培养箱中培养12h；
2)挑取单菌落接种至30mL LB液体培养基中，37℃，200r/min摇床过夜培养得到种子液；
3)将种子液按10％的接种量接入装有30mL LB液体培养基的100mL锥形瓶中，37℃，200r/min摇床培养；
4)前16h每隔2h取一次样，用酶标仪(Epoch2，美国BioTek公司)监测OD600nm值，以时间为横坐标，OD600nm值为纵坐标，绘制CML532的生长曲线(图2)；用pH计测定pH值，以时间为横坐标，pH值为纵坐标，绘制CML532的pH值曲线(图3)。
综合菌株CML532的以上特性，将其鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)，菌株编号为CML532，以下简称贝莱斯芽孢杆菌CML532。
贝莱斯芽孢杆菌CML532已于2022年04月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.24752。
实施例2、贝莱斯芽孢杆菌CML532对产气荚膜梭菌的抑制作用
以对家禽危害较大的病原菌产气荚膜梭菌ATCC 13124为致病菌指示菌，研究贝莱斯芽孢杆菌CML532的抑菌作用。
1.菌种活化及发酵上清液制备
产气荚膜梭菌ATCC 13124的活化：将冻存菌株从-80℃超低温冰箱中取出，置于37℃恒温生化培养箱溶解，用一次性接种环蘸取菌液在TSC固体培养基划线，37℃厌氧培养箱培养12～24h，挑取单菌落接种到FTG液体培养基中，37℃厌氧培养箱培养12～18h，使其菌液OD600nm值为1.0左右。
贝莱斯芽孢杆菌CML532的活化：用一次性接种环挑取单菌落，接种于LB液体培养基中，37℃，200rmp恒温摇床培养8h，使其菌液OD600nm值为0.8左右，得到贝莱斯芽孢杆菌CML532的培养物。
贝莱斯芽孢杆菌CML532发酵上清液制备：将贝莱斯芽孢杆菌CML532菌液(即贝莱斯芽孢杆菌CML532的培养物)12000rpm离心1min，吸取上清液并用孔径0.22μm水系过滤膜过滤得到无菌的贝莱斯芽孢杆菌CML532发酵上清液。
2.双层抑菌平板制备
下层平板：配制琼脂含量为2％的LB固体培养基，121℃高压灭菌15min，冷却到65℃时倾倒于一次性无菌培养皿中，每个培养基15ml，待凝固后备用。
上层平板：配制琼脂含量为0.7％的FTG固体培养基，121℃高压灭菌15min，冷却到50℃时以1％的接种量将病原菌产气荚膜梭菌菌液加入培养基并充分混匀。用移液枪向上述下层平板上加入5mL混有病原菌的培养基，待凝固后直径用6μm的无菌打孔器在培养基上打孔，配制完成后立即使用。
3.抑菌试验
将50μL贝莱斯芽孢杆菌CML532发酵液上清液加到上述配制的双层平板中，立即放入37℃厌氧培养箱培养24h，观察抑菌圈的有无。
试验结果如图4所示，添加贝莱斯芽孢杆菌CML532发酵上清液的孔(图4中CML532所代表)周围产生了抑菌圈，而不添加贝莱斯芽孢杆菌CML532发酵上清液的对照(LB液体培养基)周围没有产生抑菌圈，说明贝莱斯芽孢杆菌CML532对产气荚膜梭菌有抑制作用。
实施例3、贝莱斯芽孢杆菌CML532的抗逆特性
1.胆盐耐受性试验
将贝莱斯芽孢杆菌CML532按实施例2的步骤活化后，将菌液以10％的接种量分别接种到猪胆盐(北京奥博星生物技术有限公司)浓度分别为0.00％、0.30％和0.40％的LB液体培养基中。37℃，200rmp恒温摇床培养2h后从中取100μL菌液，梯度稀释到10-5～10-7，取100μL涂于LB固体培养基，每组做3个重复，37℃培养12h后观察生长情况并进行菌落计数。结果显示(表1)贝莱斯芽孢杆菌CML532在胆盐浓度为0.30％(质量百分含量)和0.40％(质量百分含量)的液体中耐受2h后，其活菌数和零胆盐组(胆盐浓度为0.00％)仍在同一数量级即107以上，说明贝莱斯芽孢杆菌CML532能够耐受高胆盐环境。
表1.贝莱斯芽孢杆菌CML532对胆盐的耐受性
Figure BDA0004107893510000091
2.耐酸性试验
将活化后的贝莱斯芽孢杆菌CML532菌液以10％的接种量分别接种到不同pH值(pH＝6、pH＝3和pH＝2)的LB液体培养基中。37℃，200rmp恒温摇床培养2h后从中取100μL菌液，梯度稀释到10-5～10-7，取100μL涂于LB固体培养基，每组做3个重复，37℃培养12h后观察生长情况并进行菌落计数。由试验结果显示(表2)，贝莱斯芽孢杆菌CML532在低pH(pH＝2和pH＝3)环境下2h后活菌数仍和pH＝6环境下2h后的活菌数在同一数量级即107以上，结果表明本发明中的贝莱斯芽孢杆菌CML532在低pH值胃酸环境下存活率很高，能够有足够多的活菌能通过胃顺利到达肠道发挥作用。
表2.贝莱斯芽孢杆菌CML532对不同pH值的耐受性
Figure BDA0004107893510000092
3.耐热性试验
取1mL活化后的贝莱斯芽孢杆菌CML532菌液分别于37℃、85℃和90℃水浴10min，取出冷却至室温，取100μL冷却至室温的菌液梯度稀释到10-5～10-7，取100μL涂于LB固体培养基，每组做3个重复，37℃培养12h后观察生长情况并进行菌落计数。贝莱斯芽孢杆菌CML532经高温处理后，与37℃处理相比，其活菌数的数量级不但没有下降还上升了一个数量级(表3)，由此可见贝莱斯芽孢杆菌CML532具有极强的耐受高温的能力，可以耐受饲料熟化和制粒的高温，为其作为饲料添加剂应用提供了便利。
表3.贝莱斯芽孢杆菌CML532对高温的耐受性
Figure BDA0004107893510000101
实施例4、贝莱斯芽孢杆菌CML532的产酶能力
1.蛋白酶
配制含10％脱脂奶粉的LB固体培养基，用直径6μm的无菌打孔器在培养基中打孔，再用无菌针头挑出打孔的培养基，将50μL贝莱斯芽孢杆菌CML532发酵液上清液加到孔中，对照组在孔中加入50μL LB液体培养基，37℃培养24h，观察是否有水解透明圈。结果如图5所示，加了贝莱斯芽孢杆菌CML532发酵上清液的孔(图5中CML532所代表)周围出现了较大的透明圈，而对照组的孔周围没有出现透明圈，说明贝莱斯芽孢杆菌CML532发酵液上清液对蛋白质有分解作用，能产生蛋白酶。
2.淀粉酶
配制含1％可溶性淀粉(生工生物工程(上海)股份有限公司)的LB固体培养基，用直径6μm的无菌打孔器在培养基中打孔，再用无菌针头挑出打孔的培养基。将50μL贝莱斯芽孢杆菌CML532发酵液上清液加到孔中，对照组在孔中加入50μL LB液体培养基，37℃培养24h。加入2mL碘液，观察是否有透明圈。如图6所示，添加贝莱斯芽孢杆菌CML532发酵液上清液的孔(图6中CML532所代表)周围有较大的透明圈，而对照组的孔周围没有出现透明圈，说明贝莱斯芽孢杆菌CML532能分泌淀粉酶。
3.纤维素酶
配制含1％羧甲基纤维素钠(生工生物工程(上海)股份有限公司)的LB固体培养基，用直径6μm的无菌打孔器在培养基中打孔，再用无菌针头挑出打孔的培养基。将50μL贝莱斯芽孢杆菌CML532发酵液上清液加到孔中，对照组在孔中加入50μLLB液体培养基，37℃培养24h。加入2mL 0.2％刚果红(上海麦克林生化科技有限公司)溶液，显色30min，倒出刚果红溶液，加入3mL 1M NaCl溶液，洗脱15min，观察是否有透明圈。结果如图7所示，添加贝莱斯芽孢杆菌CML532发酵液上清液的孔(图7中CML532所代表)周围出现了明显的透明圈，而对照组的孔周围没有出现透明圈，说明贝莱斯芽孢杆菌CML532对羧甲基纤维素钠有分解作用，有分泌纤维素酶的能力。
实施例5、贝莱斯芽孢杆菌CML532菌粉(干粉菌剂)的制备
将贝莱斯芽孢杆菌CML532活化后，挑取单菌落接种到LB液体培养基中，37℃，200rpm培养12h，得到种子液。将种子液按照10％的比例接入产芽孢液体培养基中，发酵罐培养12h(温度：37℃：pH：6.5±0.2；转速：200rpm；通气量：8m3/h)。发酵结束后，将发酵液离心得到菌体沉淀，55℃烘干12h，再将烘干后的菌体粉碎后即可获得贝莱斯芽孢杆菌CML532菌粉，即干粉菌剂(该菌剂的CML532的含量即有效活菌数＞1.0×1011CFU/g)。
实施例6、贝莱斯芽孢杆菌CML532作为微生物添加剂的应用实例：AA肉鸡饲喂试验
1.试验动物鸡分组
试验肉鸡为120只1日龄的AA白羽肉鸡(北京家禽育种有限公司)，平均体重：39.715±2.190g，随机分为2组：对照组(CON)和贝莱斯芽孢杆菌CML532组(CML532)，每组6个重复，一个重复10只鸡。采用双层笼养，自由采食、饮水，试验期间免疫接种程序按肉鸡常规养殖程序进行。试验期为42天(分为生长前期和生长后期)。
2.试验日粮
试验日粮参照中国肉鸡饲养标准(NY/T 33-2004)并结合AA肉仔鸡饲养手册配制玉米-豆粕型基础日粮(表4)，以颗粒形式饲喂。CML532组在对照CON组的基础上添加10g/kg的贝莱斯芽孢杆菌CML532菌粉(CML532的含量即有效活菌数＞1.0×1011CFU/g)，最终配制的日粮中CML532的含量＞1.0×106CFU/g。
表4.基础日粮组成及营养水平(风干基础)
Figure BDA0004107893510000111
/>
Figure BDA0004107893510000121
3.测定指标
3.1生产性能
以重复为单位，于21d和42d对所有肉仔鸡进行空腹称重，记录1～21d和22～42d的采食量，计算平均体重(BW)、平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料肉比(F/G)。
平均体重(BW)＝试验末期体重/每组鸡数；
平均日增重(ADG)＝(试验末期体重－试验初期体重)/(试验天数×每组鸡数)；
平均日采食量(ADFI)＝试验期采食量/(试验天数×每组鸡数)
料肉比(F/G)＝平均日增重/平均日采食量
3.2肠道形态结构
42d每个重复选取一只和平均体重接近的肉仔鸡，取空肠中段约0.5cm左右的肠道组织浸泡于4％多聚甲醛溶液中固定，24h后换液，固定半个月后进行石蜡包埋切片处理，HE染色，显微镜下观察并测定空肠绒毛高度(VH)和隐窝深度(CD)，并计算绒毛高度和隐窝深度的比值(V/C)。
3.3空肠消化吸收酶活性
42d每个重复选取一只和平均体重接近的肉仔鸡，取空肠中段约0.1cm肠道组织，在液氮中速冻后保存于-80℃超低温冰箱。测定前取出一截肠道组织，解冻后制备组织匀浆，取上清液根据南京建成生物工程研究所的试剂盒操作方法测定空肠组织麦芽糖酶(Maltase)、蔗糖酶(Sucrase)、Na+/K+-ATP酶(Na+/K+-ATPase)和碱性磷酸酶(AKP)活性。
3.4血清抗氧化性能
42d每个重复选取一只和平均体重接近的肉仔鸡，禁食8h后翅下静脉采血，静置6h析出血清后，3000rpm离心15min，将上层血清吸出，分装至1.5mL EP管中，于-20℃保存。测定前取出一管血清，解冻后根据南京建成生物工程研究所试剂盒操作方法测定血清谷胱甘肽硫转移酶(GST)、过氧化氢酶(CAT)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)的活性。
4.结果
由表5可知，在42日龄时，相比较于对照组，CML532组的肉鸡体重(BW)显著提高(P<0.05)，CML532组的肉鸡比CON组增重143g。在肉鸡生长后期和生长全期，CML532组肉鸡的平均日增重(ADG)和平均日采食量(ADFI)显著提高(P<0.05)。
表5.贝莱斯芽孢杆菌CML532对AA肉鸡生产性能的影响
Figure BDA0004107893510000131
注：SEM代表平均值的标准误差。
表6结果所示，相比较于对照组，饲粮中添加贝莱斯芽孢杆菌CML532能显著提高空肠绒毛高度以及绒毛高度和隐窝深度的比值(V/C)(P<0.05)。
同时，表7结果显示，相比较于对照组，CML532组可以显著增高空肠麦芽糖酶(Maltase)和碱性磷酸酶(AKP)的活性(P<0.05)。
绒毛高度越高，V/C值越大，肠道的消化吸收功能越强，而麦芽糖酶和碱性磷酸酶作为肠道基本消化吸收功能的标志性关键酶，活性越高代表肠道消化吸收功能越强。综上可知，在日粮中添加贝莱斯芽孢杆菌CML532可以增强空肠消化吸收的能力。
表6.贝莱斯芽孢杆菌CML532对肉鸡空肠形态的影响
Figure BDA0004107893510000132
注：SEM代表平均值的标准误差。
表7.贝莱斯芽孢杆菌CML532对空肠消化吸收酶活性的影响
Figure BDA0004107893510000133
/>
Figure BDA0004107893510000141
注：SEM代表平均值的标准误差。
由表8可知，相比较于对照组，饲粮中添加贝莱斯芽孢杆菌CML532能极显著提高血清中总超氧化物歧化酶(T-SOD)的含量(P<0.01)，这表示贝莱斯芽孢杆菌CML532能提高肉鸡的抗氧化能力，减少氧化应激带来的不利影响。
表8.芽孢杆菌CML532对血清氧化性能的影响
Figure BDA0004107893510000142
注：SEM代表平均值的标准误差。
综上所述，添加本发明的贝莱斯芽孢杆菌CML532能显著提高AA肉鸡的生产性能，并且能增强肉鸡空肠消化吸收的能力，提高机体抗氧化能力。因此，可将贝莱斯芽孢杆菌CML532作为一种饲用微生物添加剂在肉鸡养殖业中应用，推荐在肉仔鸡日粮中本发明贝莱斯芽孢杆菌CML532的制剂的添加量为1.0×106CFU/g。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)，其菌株号为CML532，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.24752。
2.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于：所述贝莱斯芽孢杆菌的16SrRNA基因的核苷酸序列含有序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA分子。
3.权利要求1或2所述的贝莱斯芽孢杆菌的培养物，是将权利要求1或2所述的贝莱斯芽孢杆菌在微生物培养基中培养得到的物质。
4.一种菌剂，其特征在于：所述菌剂含有权利要求1或2所述的贝莱斯芽孢杆菌或/和权利要求1或2所述的贝莱斯芽孢杆菌的代谢物或/和权利要求3所述的培养物。
5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂具有下述至少一种特性：
A1)耐受高胆盐环境；
A2)耐低pH值环境；
A3)耐高温环境；
A4)产蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶；
A5)提高家禽生产性能和/或提高家禽体重；
A6)增强家禽空肠消化吸收能力；
A7)提高家禽机体抗氧化能力；
A8)抑制病原菌生长。
6.权利要求1或2所述的贝莱斯芽孢杆菌的下述至少一种应用：
B1)权利要求1或2中所述的贝莱斯芽孢杆菌在制备提高家禽生产性能和/或提高家禽体重的产品中的应用；
B2)权利要求1或2中所述的贝莱斯芽孢杆菌在制备增强家禽空肠消化吸收能力的产品中的应用；
B3)权利要求1或2中所述的贝莱斯芽孢杆菌在制备提高家禽机体抗氧化能力的产品中的应用；
B4)权利要求1或2中所述的贝莱斯芽孢杆菌在制备提高家禽抗病原菌能力的产品中的应用；
B5)权利要求1或2中所述的贝莱斯芽孢杆菌在制备饲用微生物添加剂中的应用；
B6)权利要求1或2中所述的贝莱斯芽孢杆菌在制备家禽饲料中的应用。
7.权利要求4或5所述菌剂的下述至少一种应用：
C1)权利要求4或5所述菌剂在制备提高家禽生产性能和/或提高家禽体重的产品中的应用；
C2)权利要求4或5所述菌剂在制备增强家禽空肠消化吸收能力的产品中的应用；
C3)权利要求4或5所述菌剂在制备提高家禽机体抗氧化能力的产品中的应用；
C4)权利要求4或5所述菌剂在制备提高家禽抗病原菌能力的产品中的应用；
C5)权利要求4或5所述菌剂在制备饲用微生物添加剂中的应用；
C6)权利要求4或5所述菌剂在制备家禽饲料中的应用。
8.根据权利要求5所述的菌剂或权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述家禽为鸡。
9.根据权利要求5或8所述的菌剂或权利要求6或7或8所述的应用，其特征在于：所述产品为饲料或药物。
10.制备权利要求4或5所述的菌剂的方法，包括将权利要求1或2所述的贝莱斯芽孢杆菌在微生物培养基中培养的步骤。
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