CN114134075A - 一株高产复合酶同时高效降解霉菌毒素的贝莱斯芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
一株高产复合酶同时高效降解霉菌毒素的贝莱斯芽孢杆菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株高产复合酶同时高效降解霉菌毒素的贝莱斯芽孢杆菌及其应用。所述贝莱斯芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LB‑Y‑1，该菌株不仅可有效降解AFB1，还具备高产蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶的能力。肉鸡在体试验表明该菌株具有安全性高、抗逆性强，易于肠内定植，改善肠道菌群结构和提高生长性能等潜在益生特性。此外，该菌可通过发酵处理降解霉变花生粕中的AFB1、提高酸溶蛋白含量，实现对花生粕的生物脱毒及品质改善。对于消除和抑制饲料及原料中霉菌毒素污染，降低原料粗纤维含量，提高小肽含量等方面有综合效果。
Description
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)及其应用，特别涉及一株高产复合酶同时高效降解霉菌毒素的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LB-Y-1及其应用。
背景技术
霉菌毒素是真菌产生的次级代谢物，是食品和饲料中普遍存在且不可避免的污染物，人类和动物食用霉菌毒素会导致疾病和死亡。曲霉属、青霉菌属和镰刀菌属均能够产生多种霉菌毒素。例如，黄曲霉、寄生黄曲霉、诺氏黄曲霉和假黄曲霉是产生一系列剧毒物质黄曲霉毒素的罪魁祸首。自1960年黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)发现以来，已被验证具有高度的致癌、诱变、致畸和遗传毒性，广泛存在于如花生、玉米、大米和棉籽等农产品中。鉴于AFB1对人类和动物健康的不良影响，寻找安全、实用、廉价和有效的去污染策略是非常必要的。
目前已有的减少AFB1影响的方法主要包括去除、灭活、转化或降解，方式可分为物理、化学和生物三种。由于不可避免的局限性，这些方法大多低效或成本过高，而生物技术由于其安全性、经济性和稳定性等优良特点，为农业产品和动物饲料中AFB1的去除和降解提供了一种有吸引力的选择。一些菌株，如寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)、分枝杆菌(Mycobacterium fluoranthenivorans sp.)等已被验证有很好的AFB1降解效果，此外漆酶、辣根过氧化物酶、锰过氧化物酶，也有一定降解能力。综上所述，生物手段去除AFB1似乎是解决局限性的最佳手段。当前已报道的多为单菌株或复合菌对AFB1的单一降解，如专利CN110804570A所涉及的贝莱斯芽孢杆菌ANSB01E，只公开具有降解霉菌毒素的能力，鲜有发现某一菌株在降解AFB1的同时兼具其他功能，而饲料原料的品质改善往往是多方面的，如降低粗纤维水平、降解大分子蛋白或抗原蛋白等。
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)1999年被首次分离并于2005年正式命名，已经被验证可以防治多种类型的植物病原体感染、降低病情指数、抑制多种致病性真菌和细菌，是一种优良的生防菌株。但目前关于该菌株在降解霉菌毒素方面的研究鲜有报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LB-Y-1。
本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LB-Y-1的保藏编号为CGMCC No.21344。该菌株已于2020年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)。该贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LB-Y-1是发明人经过复杂的驯化、比对、筛选等流程，从健康动物消化道食糜中分离得到的，具有同时降解AFB1且高产淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶的功能，体内和体外试验证明该菌株安全性高、可改善肉鸡肠道菌群结构和提高生长性能。
本发明的另一个目的是提供一种菌剂。
本发明提供的菌剂的活性成分为上述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LB-Y-1或其菌悬液或其培养物或其培养液或其发酵液。
上述菌剂中，所述菌悬液或所述培养物的浓度可为1.0×107-1.0×109CFU/mL，优选为1.0×108CFU/mL。
本发明还有一个目的是提供上述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LB-Y-1或菌剂的新用途。
本发明提供了上述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LB-Y-1或菌剂在如下1)-9)中任一种中的应用：
1)降解或脱除AFB1；
2)产复合酶；
3)降解大分子物质或增加小肽含量；
4)改善动物肠道菌群结构；
5)提高动物生长性能；
6)消除或抑制原料或饲料中AFB1污染；
7)提高原料或饲料中酸溶蛋白和/或小肽含量；
8)原料或饲料脱毒；
9)改善原料或饲料品质。
本发明的最后一个目的是提供如下c1)-c6)任一所述的方法：
c1)一种降解或脱除AFB1的方法，包括如下步骤：用上述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LB-Y-1或菌剂发酵处理原料或饲料，实现AFB1的降解或脱除；
c2)一种消除或抑制原料或饲料中AFB1污染的方法，包括如下步骤：用上述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LB-Y-1或菌剂发酵处理原料或饲料，实现消除或抑制原料或饲料中AFB1污染；
c3)一种原料或饲料脱毒的方法，包括如下步骤：用上述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LB-Y-1或菌剂发酵处理原料或饲料，实现原料或饲料脱毒；
c4)一种改善原料或饲料品质的方法，包括如下步骤：用上述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LB-Y-1或菌剂发酵处理原料或饲料，实现原料或饲料品质的改善；
c5)一种改善动物肠道菌群结构的方法，包括如下步骤：用上述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LB-Y-1或菌剂饲喂动物，实现动物肠道菌群结构的改善；
c6)一种提高动物生长性能的方法，包括如下步骤：用上述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LB-Y-1或菌剂饲喂动物，实现动物生长性能的提高。
上述应用或方法中，所述复合酶为蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶。
上述应用或方法中，所述提高动物生长性能体现在如下a1)-a2)中的任一种：
a1)提高动物体重(如末重、平均日增重)；
a2)降低料重比。
上述应用或方法中，所述改善动物肠道菌群结构体现在如下b1)-b3)中任一种：
b1)增加动物肠道的菌群丰度；
b2)增加动物肠道中有益菌(如Lactobacillus、Alistipes、Lachnospiraceae菌群)的比例；
b3)降低动物肠道中有害菌(如不利于营养物质吸收和降低免疫性能的Escherichia-Shigella菌群)的比例。
上述应用或方法中，所述菌悬液的制备方法包括如下步骤：将分离纯化后的LB-Y-1菌株接种于LB固体培养基中，固体培养(培养时间可为24h)后，挑取单菌落至LB液体培养基中，在37℃、160r/min条件下进行培养(培养时间可为18-24h)，使培养体系中的菌体浓度达到1.0×107～1.0×109CFU/mL，离心(离心条件可为4000rpm离心10min)，收集菌体，用无菌生理盐水将所述菌体依次进行洗涤(洗涤次数可为三次)和重悬，得到所述菌悬液(菌悬液中菌体浓度为1.0×107～1.0×109CFU/mL)。
所述培养物的制备方法包括如下步骤：将分离纯化后的LB-Y-1菌株接种于LB固体培养基中，挑取对数生长期的单菌落至LB液体培养基中，在37℃、160rpm/min条件下进行培养(培养时间可为24h)，得到种子液，将所述种子液接种(接种量可为1％)至LB液体培养基中，在37℃、160rpm/min条件下进行培养(培养时间可为14h)，得到发酵液，即为所述培养物(培养物中菌体浓度为1.0×107～1.0×109CFU/mL)。
上述应用或方法中，所述动物为鸡，具体为肉鸡(如AA肉鸡)。
上述应用或方法中，所述原料或饲料可为受或未受AFB1污染的花生、玉米、大米和棉籽等农产品。在本发明的具体实施例中，所述原料为受AFB1污染的花生粕。
本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LB-Y-1可应用于以下方面：(1)由于其具有较强的AFB1降解能力，可以用于处理AFB1污染原料(如花生粕)；(2)由于其可降解大分子蛋白、纤维素及淀粉，可采用其制备发酵原料(如花生粕)，提高原料品质；(3)由于该菌可产复合酶、安全性高、改善肠道菌群结构，可直接饲喂动物(如肉鸡)改善生长性能。
本发明提供了一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LB-Y-1，该菌株不仅可有效降解AFB1，还具备高产蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶的能力，其酶活分别为345.47U/mL、429.72U/mL、34.75U/mL。肉鸡在体试验表明该菌株具有安全性高、抗逆性强，易于肠内定植，改善肠道菌群结构和提高生长性能等潜在益生特性。此外，该菌可通过发酵处理降解霉变花生粕中的AFB1，提高酸溶蛋白(小肽+氨基酸)含量，实现对花生粕的生物脱毒及品质改善。对于消除和抑制饲料及原料中霉菌毒素污染，降低原料粗纤维含量，提高小肽含量等方面有综合效果。
附图说明
图1为本发明菌株LB-Y-1初筛降解酪蛋白、羧甲基纤维素钠和可溶性淀粉的效果。A为产蛋白酶能力；B为产纤维素酶能力；C为产淀粉酶能力。
图2为本发明菌株LB-Y-1的菌落特征及菌体形态(革兰氏染色×100)。A为菌落特征；B为菌体形态。
图3为本发明菌株LB-Y-1采用API 20NE的分析结果。
图4为本发明菌株LB-Y-1构建的系统发育树。
图5为本发明菌株LB-Y-1的生长曲线。
图6为本发明菌株LB-Y-1对肉鸡肠道菌群结构的影响。
图7为发酵时间对菌株LB-Y-1降解自然霉变花生粕中AFB1含量的影响。
图8为发酵时间对菌株LB-Y-1提高自然霉变花生粕中酸溶蛋白含量的影响。
保藏说明
中文名：贝莱斯芽孢杆菌
拉丁名：Bacillus velezensis
菌株编号：LB-Y-1
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2020年12月10日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.21344
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明所涉及到的培养基(溶剂均为蒸馏水，使用前均121℃灭菌20min)如下：
营养肉汤(NB)培养基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏3，氯化钠5，pH调整为7.2～7.4，固体培养基加入2％琼脂粉。
Hormisch培养基(g/L)：磷酸氢二钾0.25，七水硫酸镁0.25，硝酸钾0.5，硫酸铵0.5，氯化钙0.005，氯化铁0.003，pH调整为7.0，灭菌后按需加入1～3g香豆素，固体培养基加入2％琼脂粉。
酪蛋白培养基(g/L)：酪蛋白10，牛肉浸粉3，琼脂粉15，氯化钠5，磷酸二氢钾2，pH调整为7.0，固体培养基加入2％琼脂粉。
纤维素酶选择培养基(g/L)：酵母提取物5，氯化钠5，胰蛋白胨10，羧甲基纤维素钠10，磷酸二氢钾1，pH调整为7.2～7.4，固体培养基加入2％琼脂粉。
淀粉酶选择培养基(g/L)：可溶性淀粉10，葡萄糖5，胰蛋白胨10，牛肉膏5，氯化钠5，pH调整为7.2～7.4，固体培养基加入2％琼脂粉。
LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10，pH调整为7.2～7.4，固体培养基加入2％琼脂粉。
发酵培养基A(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏3，氯化钠5，磷酸氢二钾1，葡萄糖1，pH调整为6.5，固体培养基加入2％琼脂粉。
发酵培养基B(g/L)：葡萄糖5，胰蛋白胨10，酵母提取物5，磷酸二氢钾1，氯化钠5，硫酸镁0.5，硫酸锰0.005，羧甲基纤维素钠5，pH调整为5.5，固体培养基加入2％琼脂粉。
发酵培养基C(g/L)：可溶性淀粉5，葡萄糖5，胰蛋白胨10，酵母提取物5，磷酸二氢钾1，氯化钠5，硫酸镁0.5，硫酸锰0.005，pH调整为5.5，固体培养基加入2％琼脂粉。
本发明所涉及到的检测方法如下：AFB1浓度的检测采用HPLC法；蛋白酶活力的检测采用Folin-酚法；纤维素酶活的检测采用DNS法；淀粉酶活力的检测采用DNS法；酸溶蛋白含量参照(GB/T 22492-2008)的方法测定。
下面实施例将对本发明进一步阐述：
实施例1、贝莱斯芽孢杆菌LB-Y-1的筛选及鉴定
一、菌株LB-Y-1的筛选
1、菌株的初筛
收集健康且生长状况良好的若干奶牛瘤胃、鸡盲肠、猪回肠、家兔盲肠食糜样品35例，用于筛选目的菌株。具体方法为：各取上述样品10g，溶于90mL无菌的PBS溶液中，在160rpm条件下恒温震荡20min，吸取500μL转入5.5mL NB液体培养基中，37℃恒温160rpm培养24小时，随后再吸取100μL菌液，接种于5.5mL Hormisch液体培养基中，由1～3mg/mL逐步提高香豆素的含量，在37℃和160rpm条件下培养48h，进行菌株的富集。在5次富集之后，将培养液稀释涂布于NB固体培养基(稀释倍数从10-1～10-6)，37℃静置培养24h，通过判断菌落的形态、颜色、边缘光滑度、湿度等方面作为鉴别标准，挑选单菌落在NB固体培养基进行三代纯化，纯化菌株保存于50％甘油中，-80℃保藏。
2、菌株的复筛
取初筛菌株接种于发酵培养基A，37℃培养48h，备以AFB1标准品，990μL发酵培养液，与10μL AFB1标准品(浓度为10μg/mL)，在37℃条件下培养48h，反应结束后加入1mL二氯甲烷，重复3次，合并有机相，随后再加入1mL甲醇复溶，过0.22μm滤膜后，HPLC上机，检测条件：C18色谱柱：SB-C18，4.6mm×250mm，5μm；流动相：V(甲醇):V(水)＝60:40，流速0.8mL/min，柱温32℃，运行时间为11min；检测波长365nm，光电二极管阵列(PDA)。降解率计算公式：AFB1的降解率/％＝(A－B)/A×100％，其中A、B分别表示添加AFB1的对照峰面积和处理后的峰面积。
挑选AFB1降解效果较佳的前20株菌进一步筛选；取1μL发酵种子液，接种于酪蛋白固体培养基，培养24h后，测量并计算酪蛋白降解圈面积(S1)与菌落面积(s1)的比值，选择降解效率最佳的若干菌株进行下一步纤维素降解能力判定；取上述挑选出的发酵种子液接种于纤维素酶选择固体培养基，培养24h后，通过刚果红染色测量并计算纤维素降解圈面积(S2)与菌落面积(s2)的比值，挑选降解效率最佳的若干菌株，进行下一步淀粉降解能力的判定；取上述菌株的发酵种子液接种于淀粉酶选择固体培养基，培养24h后，通过碘液对培养基染色测量并计算淀粉降解圈面积(S3)与菌落面积(s3)的比值，判定最佳的降解菌株，降解结果如图1所示。
试验结果表明：菌株LB-Y-1具有降解AFB1的能力，降解效率为81.56％，同时兼有产蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶的能力，降解圈与菌落大小的面积比(S/s)分别为：3.67、4.06、2.68。
二、菌株LB-Y-1的鉴定
1、菌株LB-Y-1的形态观察
将菌株LB-Y-1划线接种于LB固体培养基中，观察菌落生长形态(图2A)，其特征为：乳白色菌落，不透明，形态变化由最初圆形(饱满)逐渐转为不规则(褶皱)，边缘不整齐向四周以云雾状扩散开，菌落中间凸起形成火山口样，挑开后有粘性液体；取生长对数期菌体涂板，固定并用用革兰氏染液染色，在油镜下观察形态拍照(图2B)，菌体为短杆状，可形成芽孢，革兰氏染色阳性。
2、菌株LB-Y-1的生化鉴定
首先采用API 20NE试剂条分析菌株LB-Y-1，具体结果如图3所示，进一步采用BIOLOG分析菌株LB-Y-1的碳源利用情况，阳性反应碳源如表1所示。
表1、BIOLOG GENⅢ分析贝莱斯芽孢杆菌LB-Y-1碳源利用
3、菌株LB-Y-1的分子生物学鉴定
采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株LB-Y-1DNA，进行16S rDNA及持家基因gyrB扩增与测序。测序结果表明：菌株LB-Y-1的16S rDNA PCR产物共得到大小为1476bp的基因片段，其核苷酸序列如序列1所示。该菌株被鉴定为Bacillus(杆菌属)，为Bacillusvelezensis(贝莱斯芽孢杆菌)。
将菌株LB-Y-1的16S rDNA基因序列在NCBI进行同源性比对，分析亲缘关系，构建系统发育树(图4)。
4、菌株LB-Y-1的生长曲线
将菌株LB-Y-1接种于LB固体培养基，挑取对数生长期的单菌落至10mL LB液体培养基中，于37℃、160rpm/min的条件下培养24h作为种子液，精确吸取1％接种量的上述种子液，接种于100mLLB液体培养基中，37℃，160rpm/min培养24h，期间每间隔1h取样一次，在紫外可见分光光度计600nm处测其光密度(OD)值，并绘制OD600与时间的关系曲线图(图5)。
综合菌落及菌体形态特征、BIOLOG碳源利用情况、API 20NE的分析结果、分子生物学鉴定等手段，确定菌株LB-Y-1的分类单元为：Bacteria；Firmicutes；Bacilli；Bacillales；Bacillaceae；Bacillus，属于贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。
三、菌株LB-Y-1的保藏
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LB-Y-1已于2020年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCC No.21344。
实施例2、贝莱斯芽孢杆菌LB-Y-1产蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶的能力
一、贝莱斯芽孢杆菌LB-Y-1产蛋白酶的能力
1、绘制L-酪氨酸标准曲线：预先配置好0.1mol/L的HCL溶液作为溶剂，分别以10μg/mL为梯度差，配成浓度为0～70μg/mL的酪氨酸标准溶液。各取1mL的上述标准液与5mL0.4mol/L的Na2CO3溶液和1mL的Folon-Phenol试剂混合，40℃水浴20min后在紫外分光光度计680nm的波长下，测定吸光度，绘制L-酪氨酸OD680与浓度的关系曲线。
2、按照实施例1中的方法制备种子液，将种子液接种于发酵培养基A，在37℃、160rpm/min的条件下培养36h。
3、完成步骤2之后，4℃、8000rpm条件离心15min，分离上清液即为粗酶液。
4、酶活测定：将1mL步骤3取得的粗酶液1mL，在40℃条件下水浴20min，依次加入1mL底物(1g酪蛋白溶解于pH7.5的缓冲溶液并定容至100mL)和2mL 0.4mol/L三氯乙酸，混合均匀，静置10min，慢速过滤收集滤液，再将上述滤液1mL转移至新试管，与5mL 0.4mol/L的Na2CO3溶液和1mL的Folon-Phenol试剂混合，40℃水浴孵育20min后在紫外分光光度计680nm的波长下，测定吸光度，每次测定均设三个平行，并采用蒸馏水作为空白对照。
计算公式：吸光度＝吸光度(试验组)-吸光度(对照组)。
对照标准曲线，得到酪氨酸产量，计算粗酶液酶活，以每毫升酶液催化酪蛋白生成1μg酪氨酸所需酶量为1个酶活力为计量单位(U/mL)。
计算结果表明：贝莱斯芽孢杆菌LB-Y-1产蛋白酶粗酶液酶活为345.47U/mL。
二、贝莱斯芽孢杆菌LB-Y-1产纤维素酶的能力
1、绘制葡萄糖标准曲线
以蒸馏水为溶剂，分别以0.1mg/mL为梯度差，配成浓度为0.1～0.7mg/mL的葡萄糖标准溶液。各取3mL的上述标准液与1mL DNS试剂加到试管中充分混合，沸水浴5min后，立即转入冰浴终止反应，加16mL蒸馏水充分混合，在紫外分光光度计540nm的波长下测定吸光度，绘制吸光度与葡萄糖浓度的关系曲线。
2、按照实施例1中的方法制备种子液，将种子液接种于发酵培养基B，在37℃、160rpm/min的条件下培养36h。
3、完成步骤2之后，在4℃、8000rpm条件离心15min，分离上清液即为粗酶液。
4、酶活测定：将步骤3得到的粗酶液用蒸馏水适度稀释，得到待测溶液。对照组依次在试管中加入2mL底物(0.5g羧甲基纤维素钠溶于pH7.5的磷酸缓冲液并定容至100mL)、1mL DNS和1mL待测溶液混合均匀，沸水浴5min后冰浴终止反应，加16mL蒸馏水充分混合，在紫外分光光度计540nm的波长下测定吸光度；试验组依次加入2mL底物和1mL待测溶液混合均匀，置于50℃水浴1h，此后加入1mL DNS混合均匀，沸水浴5min后冰浴终止反应，加16mL蒸馏水，在紫外分光光度计540nm的波长下测定吸光度，对照组及试验组每次测定均设三个平行。
计算公式：吸光度＝吸光度(试验组)-吸光度(对照组)。
对照标准曲线，根据葡萄糖的生成量及稀释倍数，计算粗酶液酶活，以每毫升酶液催化羧甲基纤维素钠生成1μg葡萄糖所需的酶量为计量单位(U/mL)。
计算结果表明：贝莱斯芽孢杆菌LB-Y-1产纤维素酶粗酶液酶活为429.72U/mL。
三、贝莱斯芽孢杆菌LB-Y-1产淀粉酶的能力
1、绘制麦芽糖标准曲线
以蒸馏水为溶剂，分别以0.1mg/mL为梯度差，配成浓度为0.1～0.7mg/mL的麦芽糖标准溶液。各取2mL的上述标准液与2mL DNS试剂加到试管中充分混合，沸水浴5min后立即转入冰浴终止反应，加16mL蒸馏水充分混合，在紫外分光光度计540nm的波长下测定吸光度，绘制吸光度与麦芽糖浓度的关系曲线。
2、按照实施例1中的方法制备种子液，将种子液接种于发酵培养基C，在37℃、160rpm/min的条件下培养36h。
3、完成步骤2之后，4℃、8000rpm条件离心15min，分离上清液即为粗酶液。
4、酶活测定：将步骤3得到的粗酶液用蒸馏水适度稀释，得到待测溶液。对照组依次在试管中加入1mL底物(0.5g可溶性淀粉溶于pH6.5的磷酸缓冲液并定容至100mL)、2mLDNS和1mL待测溶液混合均匀，沸水浴5min后冰浴终止反应，加16mL蒸馏水充分混合，在紫外分光光度计540nm的波长下测定吸光度；试验组依次加入1mL底物、1mL待测溶液混合均匀，置于50℃水浴1h，此后加入2mL DNS混合均匀，沸水浴5min后冰浴终止反应，加16mL蒸馏水，在紫外分光光度计540nm的波长下测定吸光度，对照组及试验组每次测定均设三个平行。
计算公式：吸光度＝吸光度(试验组)-吸光度(对照组)。
对照标准曲线，根据麦芽糖的生成量及稀释倍数，计算粗酶液酶活，以每30min每毫升酶液催化淀粉生成1mg麦芽糖所需的酶量为计量单位(U/mL)。
计算结果表明：贝莱斯芽孢杆菌LB-Y-1产淀粉酶粗酶液酶活为34.75U/mL。
实施例3、贝莱斯芽孢杆菌LB-Y-1对肉鸡生长性能及肠道微生物多样性的影响
一、不同梯度贝莱斯芽孢杆菌LB-Y-1对肉鸡饲养试验
选择300只1日龄的健康艾拔益加肉鸡(AA肉鸡)，随机分为5个处理组，每个处理组6个重复，每个重复10只鸡，各组分别为对照组CON、贝莱斯芽孢杆菌组BV1、BV2、BV3和抗生素AGPs组。CON组饲喂基础日粮；BV1、2、3组分别在基础日粮中喷洒贝莱斯芽孢杆菌悬液，使基础日粮中的菌浓度分别为1.0×107CFU/kg、1.0×108CFU/kg、1.0×109CFU/kg；AGPs组在基础日粮中添加组合抗生素(金霉素100mg/kg、吉他霉素20mg/kg)。基础日粮为玉米-豆粕型日粮，配方设计参考《鸡饲养标准》(NY/T33-2004)，试验周期为42d，分析对肉鸡生长性能和肠道菌群结构的影响。
贝莱斯芽孢杆菌悬液的制备方法如下：将分离纯化后的贝莱斯芽孢杆菌LB-Y-1接种于LB固体培养基中，固体培养24h后，挑取单菌落接种至10mL LB液体培养基中，在37℃、160r/min条件下振荡培养18-24h，使培养体系中的菌体浓度达到1.0×109CFU/mL，4000rpm离心10min，收集菌体，先用无菌生理盐水洗涤3次再用无菌生理盐水重悬得到菌悬液(菌体浓度为1.0×109CFU/mL)。
二、贝莱斯芽孢杆菌LB-Y-1对肉鸡生长性能的影响
分别在试验前期(1～21天)和试验后期(22～42天)统计各组肉鸡的如下指标：末重、平均日增重、平均日采食量和料重比。
结果表明：在肉鸡饲养全期，添加1.0×108CFU/kg的贝莱斯芽孢杆菌可显著改善肉鸡生长性能(表2)。具体表现为试验前期(1～21天)，BV2组末重及平均日增重均显著高于对照组(P＜0.05)；在试验后期(22～42天)，BV2组末重及饲料转化率(料重比)均显著优于对照组(P＜0.05)，与应用抗生素无显著差异(P＞0.05)。
表2、饲粮添加贝莱斯芽孢杆菌LB-Y-1对肉鸡生长性能的影响
注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，相同或无字母表示差异不显著(P＞0.05)。
三、贝莱斯芽孢杆菌LB-Y-1对肠道菌群结构的影响
在肉鸡42日龄时，取回肠食糜，通过16S扩增子测序及生物信息学方法，分析肠道菌群结构。
结果表明：添加1.0×108CFU/kg的贝莱斯芽孢杆菌组的肉鸡肠道菌群丰度显著增加，其中有益菌群Lactobacillus、Alistipes、Lachnospiraceae比例增加、不利于营养物质吸收及降低肉鸡免疫性能的菌群Escherichia-Shigella比例显著降低，同时Bacteroides菌群丰度的减少也有利于肉鸡的增重(图6)。
实施例4、应用贝莱斯芽孢杆菌LB-Y-1发酵花生粕对AFB1及酸溶蛋白含量的影响
一、制备发酵培养基及发酵液
1、发酵培养基：花生粕50g，灭菌蒸馏水50mL，105℃灭菌15min(AFB1含量为103.47μg/kg)。
2、将菌株LB-Y-1接种于LB固体培养基，挑取对数生长期的单菌落至10mL LB液体培养基中，于37℃、160rpm/min的条件下培养24h作为种子液，将种子液按照1％接种于LB液体培养基，在37℃、160rpm/min的条件下培养14h，取对数期发酵液(菌体浓度为1.0×109CFU/mL)备以接种发酵。
二、贝莱斯芽孢杆菌LB-Y-1发酵花生粕
取步骤一的2中制得的发酵液，按照10％的接种量接种至步骤一的1中制得的发酵培养基中，37℃恒温发酵60h，分别在发酵0h、12h、24h、36h、48h、60h取样并于50℃烘干粉碎，测定其中AFB1及酸溶蛋白含量。
结果表明：随着发酵时间的不断增加，AFB1含量逐渐减少(图7)，酸溶蛋白含量逐渐增加(图8)，在发酵48h即达到较佳水平，其中AFB1的降解率为60.73％，酸溶蛋白含量由2.89％提高至21.75％。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 天津博菲德科技有限公司
<120> 一株高产复合酶同时高效降解霉菌毒素的贝莱斯芽孢杆菌及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1476
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
caggacgaac gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg agcggacaga tgggagcttg 60
ctccctgatg ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgcct gtaagactgg 120
gataactccg ggaaaccggg gctaataccg gatggttgtt tgaaccgcat ggttcagaca 180
taaaaggtgg cttcggctac cacttacaga tggacccgcg gcgcattagc tagttggtga 240
ggtaacggct caccaaggcg acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg 300
ggactgagac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga 360
cgaaagtctg acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggt tttcggatcg taaagctctg 420
ttgttaggga agaacaagtg ccgttcaaat agggcggcac cttgacggta cctaaccaga 480
aagccacggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg 540
gaattattgg gcgtaaaggg ctcgcaggcg gtttcttaag tctgatgtga aagcccccgg 600
ctcaaccggg gagggtcatt ggaaactggg gaacttgagt gcagaagagg agagtggaat 660
tccacgtgta gcggtgaaat gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg aaggcgactc 720
tctggtctgt aactgacgct gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc 780
tggtagtcca cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttagg gggtttccgc cccttagtgc 840
tgcagctaac gcattaagca ctccgcctgg ggagtacggt cgcaagactg aaactcaaag 900
gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag 960
aaccttacca ggtcttgaca tcctctgaca atcctagaga taggacgtcc ccttcggggg 1020
cagagtgaca ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc 1080
ccgcaacgag cgcaaccctt gatcttagtt gccagcattc agttgggcac tctaaggtga 1140
ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac 1200
ctgggctaca cacgtgctac aatgggcaga acaaagggca gcgaaaccgc gaggttaagc 1260
caatcccaca aatctgttct cagttcggat cgcagtctgc aactcgactg cgtgaagctg 1320
gaatcgctag taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac 1380
accgcccgtc acaccacgag agtttgtaac acccgaagtc ggtgaggtaa ccttttagga 1440
gccagccgcc gaaggtggga cagatgattg gggtga 1476
Claims (10)
1.贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LB-Y-1，其保藏编号为CGMCC No.21344。
2.一种菌剂，其活性成分为权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LB-Y-1或其菌悬液或其培养物或其培养液或其发酵液。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于：所述菌悬液的浓度为1.0×107～1.0×109CFU/mL。
4.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于：所述培养物的浓度为1.0×107～1.0×109CFU/mL。
5.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LB-Y-1或权利要求2-4任一所述的菌剂在如下1)-9)中任一种中的应用：
1)降解或脱除AFB1；
2)产复合酶；
3)降解大分子物质或增加小肽含量；
4)改善动物肠道菌群结构；
5)提高动物生长性能；
6)消除或抑制原料或饲料中AFB1污染；
7)提高原料或饲料中酸溶蛋白和/或小肽含量；
8)原料或饲料脱毒；
9)改善原料或饲料品质。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述复合酶为蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述提高动物生长性能体现在如下a1)-a2)中的任一种：
a1)增加动物体重；
a2)降低料重比。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述改善动物肠道菌群结构体现在如下b1)-b3)中任一种：
b1)增加动物肠道的菌群丰度；
b2)增加动物肠道中有益菌的比例；
b3)降低动物肠道中有害菌的比例。
9.如下c1)-c6)任一所述的方法：
c1)一种降解或脱除AFB1的方法，包括如下步骤：用权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LB-Y-1或权利要求2-4任一所述的菌剂发酵处理原料或饲料，实现AFB1的降解或脱除；
c2)一种消除或抑制原料或饲料中AFB1污染的方法，包括如下步骤：用权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LB-Y-1或权利要求2-4任一所述的菌剂发酵处理原料或饲料，实现消除或抑制原料或饲料中AFB1污染；
c3)一种原料或饲料脱毒的方法，包括如下步骤：用权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LB-Y-1或权利要求2-4任一所述的菌剂发酵处理原料或饲料，实现原料或饲料脱毒；
c4)一种改善原料或饲料品质的方法，包括如下步骤：用权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LB-Y-1或权利要求2所述的菌剂发酵处理原料或饲料，实现原料或饲料品质的改善；
c5)一种改善动物肠道菌群结构的方法，包括如下步骤：用权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LB-Y-1或权利要求2-4任一所述的菌剂饲喂动物，实现动物肠道菌群结构的改善；
c6)一种提高动物生长性能的方法，包括如下步骤：用权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LB-Y-1或权利要求2-4任一所述的菌剂饲喂动物，实现动物生长性能的提高。
10.根据权利要求5-8任一所述的应用或权利要求9所述的方法，其特征在于：所述原料或饲料为花生粕。
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