CN112980751A - 一种贝莱斯芽孢杆菌及用途 - Google Patents

一种贝莱斯芽孢杆菌及用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种贝莱斯芽孢杆菌及用途，配方包括：贝莱斯芽孢杆菌；组分的质量百分比是：100％的贝莱斯芽孢杆菌；包括具有产纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、β‑葡聚糖酶和过氧化氢能力的贝莱斯芽孢杆菌，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、齐整小核菌、链格孢菌、青枯雷尔氏菌、根癌农杆菌、胡萝卜软腐欧文式杆菌、橘青霉菌、霜霉菌等食源性病原菌和植物病原菌具有良好的拮抗作用，有效抑制了病原菌的滋生，在植物促生、病害防控、环境保护、食品生产等方面具有广泛用途；该发明通过两道拮抗筛选，从而提高了制备过程中的筛选力度，增强了培育产品的拮抗活性，有效抑制了病原菌的滋生，提升了贝莱斯芽孢杆菌的质量。

Description

一种贝莱斯芽孢杆菌及用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为一种贝莱斯芽孢杆菌及用途。
背景技术
酸菜作为我国传统的蔬菜发酵制品，具有清脆爽口，开胃促消化等优点，深受广大民众喜爱。酸菜中微生物种群繁多，其中主要包括乳酸球菌属、乳酸链球菌属、乳杆菌属、双歧杆菌属和芽孢杆菌属等，其中，贝莱斯芽孢杆菌广泛存在于自然界中，人畜无害并对很多病原微生物有良好的拮抗作用，具有抗菌谱广、生长迅速、易分离培养、抗逆性强和生物安全性高等优点，主要应用于农业、食品、工业、医学、冶金、林业、环保以及军事等领域。
然而，现有的贝莱斯芽孢杆菌制备方法大多筛选力度不足，培育的贝莱斯芽孢杆菌拮抗活性较低，无法有效抑制病原菌的滋生，影响了贝莱斯芽孢杆菌的质量，且生理生化鉴定和分子鉴定不全面，制备精度低，影响了贝莱斯芽孢杆菌的纯度，降低了贝莱斯芽孢杆菌的抑菌率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种贝莱斯芽孢杆菌及用途，以解决上述背景技术中提出筛选力度不足、鉴定不全面以及制备纯度低的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种贝莱斯芽孢杆菌，配方包括：贝莱斯芽孢杆菌；组分的质量百分比是：100％的贝莱斯芽孢杆菌。
一种贝莱斯芽孢杆菌的制备方法，包括以下步骤：步骤一，取液稀释；步骤二，涂布培养；步骤三，形态鉴定；步骤四，分离纯化；步骤五，拮抗初筛；步骤六，拮抗复筛；步骤七，生理鉴定；步骤八，分子鉴定；步骤九，扩增培育；
其中上述步骤一中，取适量的酸菜汁，用倍比稀释法分别稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6，等量称取后得到多个稀释液；
其中上述步骤二中，用无菌玻璃涂布棒对步骤一中得到的多个稀释液分别进行等量蘸取，并均匀涂布到固体培养平板上，恒温培养，得到多个单菌落；
其中上述步骤三中，用接种环从步骤二中得到的单菌落里挑取适量的细菌，分别在固体培养平板上划线，恒温培养，观察菌落形状，并经革兰氏染色后在显微镜下观察，对菌落进行形态鉴定；
其中上述步骤四中，根据步骤三的鉴定结果，从步骤二中得到的多个单菌落里挑取出不同形态的，分别用划线平板法接种到固体培养平板上，纯化两次，得到纯化菌株；
其中上述步骤五中，以病原细菌为指示菌，接种到液体培养摇瓶中，恒温振荡培养，并使OD600为0.6～0.8，得到指示菌液，再按照1∶100的体积比量取对应量的指示菌液，倒在煮融后冷却至50℃的固体培养平板上混匀，用牛津杯点接上步骤四中得到的纯化菌株，凝固后恒温培养，测其抑菌圈直径，并以不点接纯化菌株为空白对照，筛选出对指示菌抑菌效果好的初筛拮抗菌；
其中上述步骤六中，挑取一环步骤五中得到的初筛拮抗菌，接种到液体培养摇瓶中，进行初次恒温振荡培养，并使OD600为0.6～0.8，得到拮抗菌液，再按照1∶100的体积比量取对应量的拮抗菌液，接种到液体培养摇瓶中，进行二次恒温振荡培养，接着转入离心机中，高速离心后取上清液，并经0.22μm孔径的滤膜过滤后放冰箱中4℃冷藏备用，得到抗菌发酵液，然后按照1∶100的体积比量取对应量的步骤五中得到的指示菌液，倒在煮融后冷却至50℃的固体培养平板上混匀，用牛津杯点接上备好的抗菌发酵液，凝固后恒温培养，测其抑菌圈直径，并以点接无菌水为空白对照，筛选出对指示菌抑菌效果好的复筛拮抗菌；
其中上述步骤七中，从步骤六中得到的复筛拮抗菌里挑取适量的细菌，分别用可溶性淀粉、甲基红、产氨、唯一碳源利用、唯一氮源利用、明胶液化、渗透压和柠檬酸盐共八项生理指标，对菌落进行生理生化鉴定；
其中上述步骤八中，从步骤六中得到的复筛拮抗菌里挑取适量的细菌接种到马铃薯液体培养基上，收集菌体并提取DNA，采用16SrDNA通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行PCR扩增，再对扩增产物进行测序，接着将得到的序列在NCBI网站上进行BLAST比对查找相似序列，选择相似性不小于99％的序列，再用MEGA软件N-J法构建系统发育树；
其中上述步骤九中，根据步骤七和步骤八的鉴定结果，从步骤六中得到的复筛拮抗菌里挑取出芽孢杆菌属的细菌，接种到固体培养平板上，恒温培养，得到贝莱斯芽孢杆菌。
优选的，所述步骤二中，固体培养平板选用牛肉膏蛋白胨固体培养基和马铃薯固体培养基中的任意一种，牛肉膏蛋白胨固体培养基由重量比为3∶10∶5∶20∶1000的牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂和水混合制备而成，马铃薯固体培养基由量比为10∶1∶1∶50的马铃薯、葡萄糖、琼脂和水混合制备而成。
优选的，所述步骤二中，恒温培养的温度为30℃，培养时间为2d。
优选的，所述步骤五中，病原菌选用金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、齐整小核菌、链格孢菌、青枯雷尔氏菌、根癌农杆菌、胡萝卜软腐欧文式杆菌、橘青霉菌和霜霉菌中的任意一种。
优选的，所述步骤五中，液体培养摇瓶选用牛肉膏蛋白胨液体培养基和马铃薯液体培养基中的任意一种，牛肉膏蛋白胨液体培养基由重量比为3∶10∶5∶1000的牛肉膏、蛋白胨、氯化钠和水混合制备而成，马铃薯液体培养基由重量比为10∶1∶50的马铃薯、葡萄糖和水混合制备而成。
优选的，所述步骤五中，恒温振荡培养的温度为30℃，振荡转速为150r/min，培养时间为24h。
优选的，所述步骤六中，初次恒温振荡培养的温度为30℃，振荡转速为150r/min，培养时间为24h。
优选的，所述步骤六中，二次恒温振荡培养的温度为30℃，振荡转速为150r/min，培养时间为2d。
优选的，所述步骤六中，离心机的转速为8000r/min，离心时间为10min。
一种贝莱斯芽孢杆菌的用途，包括具有产纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶和过氧化氢能力的贝莱斯芽孢杆菌，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、齐整小核菌、链格孢菌、青枯雷尔氏菌、根癌农杆菌、胡萝卜软腐欧文式杆菌、橘青霉菌、霜霉菌等食源性病原菌和植物病原菌具有良好的拮抗作用，有效抑制了病原菌的滋生，在植物促生、病害防控、环境保护、食品生产等方面具有广泛用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：该贝莱斯芽孢杆菌及用途，通过两道拮抗筛选，从而提高了制备过程中的筛选力度，增强了培育产品的拮抗活性，有效抑制了病原菌的滋生，提升了贝莱斯芽孢杆菌的质量；通过可溶性淀粉、甲基红、产氨、唯一碳源利用、唯一氮源利用、明胶液化、渗透压和柠檬酸盐共八项生理指标进行生理生化鉴定，并通过DNA提取、PCR扩增进行分子测序，制备精度高，提高了贝莱斯芽孢杆菌的纯度，提升了贝莱斯芽孢杆菌的抑菌率。
附图说明
图1为本发明的方法流程图；
图2为本发明实施例的系统发育树图；
图3为本发明实施例对金黄色葡萄球菌的拮抗初筛图；
图4为本发明实施例对金黄色葡萄球菌的拮抗复筛图；
图5为本发明实施例对大肠杆菌、根癌农杆菌、青枯雷尔氏菌、胡萝卜软腐欧文式杆菌的抑菌活性图；
图6为本发明实施例对霜霉菌、橘青霉菌、齐整小核菌、链格孢菌的抑菌活性图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-6，本发明提供一种技术方案：一种贝莱斯芽孢杆菌，配方包括：贝莱斯芽孢杆菌；组分的质量百分比是：100％的贝莱斯芽孢杆菌。
一种贝莱斯芽孢杆菌的制备方法，包括以下步骤：步骤一，取液稀释；步骤二，涂布培养；步骤三，形态鉴定；步骤四，分离纯化；步骤五，拮抗初筛；步骤六，拮抗复筛；步骤七，生理鉴定；步骤八，分子鉴定；步骤九，扩增培育；
其中上述步骤一中，取1mL酸菜汁，用倍比稀释法分别稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6，等量称取后得到多个稀释液；
其中上述步骤二中，用无菌玻璃涂布棒对步骤一中得到的多个稀释液分别进行等量蘸取0.1mL，并均匀涂布到固体培养平板上，30℃恒温培养2d，得到多个单菌落；
其中上述步骤三中，用接种环从步骤二中得到的单菌落里挑取适量的细菌，分别在固体培养平板上划线，30℃恒温培养2d，固体培养平板选用牛肉膏蛋白胨固体培养基和马铃薯固体培养基中的任意一种，牛肉膏蛋白胨固体培养基由重量比为3∶10∶5∶20∶1000的牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂和水混合制备而成，马铃薯固体培养基由量比为10∶1∶1∶50的马铃薯、葡萄糖、琼脂和水混合制备而成，观察菌落形状，并经革兰氏染色后在显微镜下观察，对菌落进行形态鉴定；
其中上述步骤四中，根据步骤三的鉴定结果，从步骤二中得到的多个单菌落里挑取出不同形态的，分别用划线平板法接种到固体培养平板上，纯化两次，得到纯化菌株；
其中上述步骤五中，以金黄色葡萄球菌(PJ-1)、大肠杆菌(DQ-1)、齐整小核菌(R-67)、链格孢菌(A-3)、青枯雷尔氏菌(CQ-1)、根癌农杆菌(T-37)、胡萝卜软腐欧文式杆菌(EC-1)、橘青霉菌(QM-1)和霜霉菌(SM-1)为指示菌，分别接种到液体培养摇瓶中，30℃恒温150r/min振荡培养24h，液体培养摇瓶选用牛肉膏蛋白胨液体培养基和马铃薯液体培养基中的任意一种，牛肉膏蛋白胨液体培养基由重量比为3∶10∶5∶1000的牛肉膏、蛋白胨、氯化钠和水混合制备而成，马铃薯液体培养基由重量比为10∶1∶50的马铃薯、葡萄糖和水混合制备而成，并使OD600为0.6～0.8，得到多个指示菌液，再按照1∶100的体积比量取对应量的指示菌液，倒在煮融后冷却至50℃的固体培养平板上混匀，用牛津杯点接上步骤四中得到的纯化菌株，凝固后恒温培养，测其抑菌圈直径，并以不点接纯化菌株为空白对照，筛选出对指示菌抑菌效果好的初筛拮抗菌；
其中上述步骤六中，挑取一环步骤五中得到的初筛拮抗菌，接种到液体培养摇瓶中，30℃恒温150r/min振荡培养24h，并使OD600为0.6～0.8，得到拮抗菌液，再按照1∶100的体积比量取对应量的拮抗菌液，接种到液体培养摇瓶中，30℃恒温150r/min振荡培养2d，接着转入离心机中，8000r/min高速离心10min后取上清液，并经0.22μm孔径的滤膜过滤后放冰箱中4℃冷藏备用，得到抗菌发酵液，然后按照1∶100的体积比量取对应量的步骤五中得到的指示菌液，倒在煮融后冷却至50℃的固体培养平板上混匀，用牛津杯点接上备好的抗菌发酵液，凝固后恒温培养，测其抑菌圈直径，并以点接无菌水为空白对照，筛选出对指示菌抑菌效果好的复筛拮抗菌；
其中上述步骤七中，从步骤六中得到的复筛拮抗菌里挑取适量的细菌，分别用可溶性淀粉、甲基红、产氨、唯一碳源利用、唯一氮源利用、明胶液化、渗透压和柠檬酸盐共八项生理指标，对菌落进行生理生化鉴定，鉴定结果如下表；
Figure BDA0003057605440000071
其中上述步骤八中，从步骤六中得到的复筛拮抗菌里挑取适量的细菌接种到马铃薯液体培养基上，收集菌体并提取DNA，采用16SrDNA通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行PCR扩增，再对扩增产物进行测序，接着将得到的序列在NCBI网站上进行BLAST比对查找相似序列，选择相似性不小于99％的序列，再用MEGA软件N-J法构建系统发育树；
其中上述步骤九中，根据步骤七和步骤八的鉴定结果，从步骤六中得到的复筛拮抗菌里挑取出芽孢杆菌属的细菌，接种到固体培养平板上，恒温培养，得到贝莱斯芽孢杆菌。
一种贝莱斯芽孢杆菌的用途，包括具有产纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶和过氧化氢能力的贝莱斯芽孢杆菌，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、齐整小核菌、链格孢菌、青枯雷尔氏菌、根癌农杆菌、胡萝卜软腐欧文式杆菌、橘青霉菌、霜霉菌等食源性病原菌和植物病原菌具有良好的拮抗作用，有效抑制了病原菌的滋生，在植物促生、病害防控、环境保护、食品生产等方面具有广泛用途。
基于上述，本发明的优点在于，本发明通过可溶性淀粉、甲基红、产氨、唯一碳源利用、唯一氮源利用、明胶液化、渗透压和柠檬酸盐共八项生理指标进行生理生化鉴定，并通过DNA提取、PCR扩增进行分子测序，制备精度高，提高了贝莱斯芽孢杆菌的纯度，提升了贝莱斯芽孢杆菌的抑菌率，且通过两道拮抗筛选，从而提高了制备过程中的筛选力度，增强了培育产品的拮抗活性，有效抑制了病原菌的滋生，提升了贝莱斯芽孢杆菌的质量。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

Claims (11)

1.一种贝莱斯芽孢杆菌，配方包括：贝莱斯芽孢杆菌；其特征在于：组分的质量百分比是：100％的贝莱斯芽孢杆菌。
2.一种贝莱斯芽孢杆菌的制备方法，包括以下步骤：步骤一，取液稀释；步骤二，涂布培养；步骤三，形态鉴定；步骤四，分离纯化；步骤五，拮抗初筛；步骤六，拮抗复筛；步骤七，生理鉴定；步骤八，分子鉴定；步骤九，扩增培育；其特征在于：
其中上述步骤一中，取适量的酸菜汁，用倍比稀释法分别稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6，等量称取后得到多个稀释液；
其中上述步骤二中，用无菌玻璃涂布棒对步骤一中得到的多个稀释液分别进行等量蘸取，并均匀涂布到固体培养平板上，恒温培养，得到多个单菌落；
其中上述步骤三中，用接种环从步骤二中得到的单菌落里挑取适量的细菌，分别在固体培养平板上划线，恒温培养，观察菌落形状，并经革兰氏染色后在显微镜下观察，对菌落进行形态鉴定；
其中上述步骤四中，根据步骤三的鉴定结果，从步骤二中得到的多个单菌落里挑取出不同形态的，分别用划线平板法接种到固体培养平板上，纯化两次，得到纯化菌株；
其中上述步骤五中，以病原细菌为指示菌，接种到液体培养摇瓶中，恒温振荡培养，并使OD600为0.6～0.8，得到指示菌液，再按照1∶100的体积比量取对应量的指示菌液，倒在煮融后冷却至50℃的固体培养平板上混匀，用牛津杯点接上步骤四中得到的纯化菌株，凝固后恒温培养，测其抑菌圈直径，并以不点接纯化菌株为空白对照，筛选出对指示菌抑菌效果好的初筛拮抗菌；
其中上述步骤六中，挑取一环步骤五中得到的初筛拮抗菌，接种到液体培养摇瓶中，进行初次恒温振荡培养，并使OD600为0.6～0.8，得到拮抗菌液，再按照1∶100的体积比量取对应量的拮抗菌液，接种到液体培养摇瓶中，进行二次恒温振荡培养，接着转入离心机中，高速离心后取上清液，并经0.22μm孔径的滤膜过滤后放冰箱中4℃冷藏备用，得到抗菌发酵液，然后按照1∶100的体积比量取对应量的步骤五中得到的指示菌液，倒在煮融后冷却至50℃的固体培养平板上混匀，用牛津杯点接上备好的抗菌发酵液，凝固后恒温培养，测其抑菌圈直径，并以点接无菌水为空白对照，筛选出对指示菌抑菌效果好的复筛拮抗菌；
其中上述步骤七中，从步骤六中得到的复筛拮抗菌里挑取适量的细菌，分别用可溶性淀粉、甲基红、产氨、唯一碳源利用、唯一氮源利用、明胶液化、渗透压和柠檬酸盐共八项生理指标，对菌落进行生理生化鉴定；
其中上述步骤八中，从步骤六中得到的复筛拮抗菌里挑取适量的细菌接种到马铃薯液体培养基上，收集菌体并提取DNA，采用16SrDNA通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行PCR扩增，再对扩增产物进行测序，接着将得到的序列在NCBI网站上进行BLAST比对查找相似序列，选择相似性不小于99％的序列，再用MEGA软件N-J法构建系统发育树；
其中上述步骤九中，根据步骤七和步骤八的鉴定结果，从步骤六中得到的复筛拮抗菌里挑取出芽孢杆菌属的细菌，接种到固体培养平板上，恒温培养，得到贝莱斯芽孢杆菌。
3.根据权利要求2所述的一种贝莱斯芽孢杆菌的制备方法，其特征在于：所述步骤二中，固体培养平板选用牛肉膏蛋白胨固体培养基和马铃薯固体培养基中的任意一种，牛肉膏蛋白胨固体培养基由重量比为3∶10∶5∶20∶1000的牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂和水混合制备而成，马铃薯固体培养基由量比为10∶1∶1∶50的马铃薯、葡萄糖、琼脂和水混合制备而成。
4.根据权利要求2所述的一种贝莱斯芽孢杆菌的制备方法，其特征在于：所述步骤二中，恒温培养的温度为30℃，培养时间为2d。
5.根据权利要求2所述的一种贝莱斯芽孢杆菌的制备方法，其特征在于：所述步骤五中，病原细菌选用金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、齐整小核菌、链格孢菌、青枯雷尔氏菌、根癌农杆菌、胡萝卜软腐欧文式杆菌、橘青霉菌和霜霉菌中的任意一种。
6.根据权利要求2所述的一种贝莱斯芽孢杆菌的制备方法，其特征在于：所述步骤五中，液体培养摇瓶选用牛肉膏蛋白胨液体培养基和马铃薯液体培养基中的任意一种，牛肉膏蛋白胨液体培养基由重量比为3∶10∶5∶1000的牛肉膏、蛋白胨、氯化钠和水混合制备而成，马铃薯液体培养基由重量比为10∶1∶50的马铃薯、葡萄糖和水混合制备而成。
7.根据权利要求2所述的一种贝莱斯芽孢杆菌的制备方法，其特征在于：所述步骤五中，恒温振荡培养的温度为30℃，振荡转速为150r/min，培养时间为24h。
8.根据权利要求2所述的一种贝莱斯芽孢杆菌的制备方法，其特征在于：所述步骤六中，初次恒温振荡培养的温度为30℃，振荡转速为150r/min，培养时间为24h。
9.根据权利要求2所述的一种贝莱斯芽孢杆菌的制备方法，其特征在于：所述步骤六中，二次恒温振荡培养的温度为30℃，振荡转速为150r/min，培养时间为2d。
10.根据权利要求2所述的一种贝莱斯芽孢杆菌的制备方法，其特征在于：所述步骤六中，离心机的转速为8000r/min，离心时间为10min。
11.一种贝莱斯芽孢杆菌的用途，包括具有产纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶和过氧化氢能力的贝莱斯芽孢杆菌，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、齐整小核菌、链格孢菌、青枯雷尔氏菌、根癌农杆菌、胡萝卜软腐欧文式杆菌、橘青霉菌、霜霉菌等食源性病原菌和植物病原菌具有良好的拮抗作用，有效抑制了病原菌的滋生，在植物促生、病害防控、环境保护、食品生产等方面具有广泛用途。
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